CN102755651A - 一种抗皮肤鳞状细胞癌药物antagomir-365-2 - Google Patents
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Abstract
本发明公开了一种抗皮肤鳞状细胞癌药物antagomir-365-2,所述antagomir-365-2是一种经化学修饰的反义寡核苷酸,其核苷酸序列见SEQIDNO:1,序列的5'端连续2个碱基以及3'端连续4个碱基经硫代磷酸修饰,3'末端经胆固醇标记,全部碱基经甲基化修饰。本发明的抗皮肤鳞状细胞癌药物antagomir-365-2可以克服细胞膜、组织等障碍富集于靶细胞,能直接进入体外培养的细胞以及体内成瘤的组织中,是进行体外和体内治疗皮肤鳞状细胞癌实验的理想药物,在体外能有效地抑制肿瘤细胞的侵袭和转移,在体内能有效抑制肿瘤的生长和消除瘤块。本发明的antagomir-365-2对抗皮肤鳞状细胞癌效果显著,是皮肤癌治疗的靶基因药物。
Description
技术领域
本发明属于生物医药领域,具体涉及一种抗皮肤鳞状细胞癌药物antagomir-365-2。
背景技术
皮肤癌作为白色人种中常见的恶性肿瘤之一,其发病率在白人中超过其他所有恶性肿瘤的总和,而近年来其发病率在我国出现了逐年上升的趋势并且呈现年轻化。根据最初的关于限制消耗臭氧物质的国际协议预测,到2100年,欧洲的西北地区和美国皮肤癌发病率可能会增加一倍,2060年将导致一个10%的增长高峰。
目前,对皮肤癌的临床治疗仍以手术、放疗、激光等综合治疗为主,在已经对后基因组计划进行研究的今天,皮肤癌的致病基因已经较成功的在分子水平上得到了确认,但是如何找到肿瘤的靶向治疗基因,并对其进行基因治疗仍是一大难题。
近年来,在小分子RNA中新发现了一类与调节基因表达密切相关的小分子非编码单链RNA即微小RNA(microRNAs,miRNAs)。随着研究的深入,越来越多的miRNA被发现,它不仅参与细胞分化成熟障碍、增殖失控,而且与细胞永生化为本质的肿瘤疾病密切相关,人类肿瘤细胞和肿瘤组织内miRNA的表达水平和类型都与正常细胞和组织明显不同,并且已经发现的人类miRNA大部分(52%) 都位于已知的肿瘤相关基因组区域内或已知的基因脆性位点。最近的证据表明,miRNA 突变或者异位表达与多种人类癌症相关,miRNAs 可以起到肿瘤抑制基因或者癌基因的功能。
在人类基因组序列中,我们发现miR-365是 UVB敏感的miRNA,是引起皮肤癌的一个重要的环境因素。miR-365为一种成熟的miRNA,它由两种前体pre-miR-365-1和pre-miR-365-2剪切而来。但是经RT-qPCR在皮肤癌细胞中检测发现成熟miR-365来自前体pre-miR-365-2。antagomir是经过特殊化学修饰的miRNA拮抗剂,通过与体内的成熟miRNA强竞争性结合,阻止miRNA与其靶基因mRNA的互补配对,抑制miRNA发挥作用。
发明内容
本发明的目的在于提供一种抗皮肤鳞状细胞癌药物antagomir-365-2。
本发明所采取的技术方案为:
一种抗皮肤鳞状细胞癌药物antagomir-365-2,所述antagomir-365-2是一种经化学修饰的反义寡核苷酸,其核苷酸序列为:5’-AUUACGGGGAUUUUUAGGAAUA-3’ (SEQ ID NO:1),序列的5'末端连续2个碱基以及3'末端连续4个碱基经硫代磷酸修饰,3'末端经胆固醇标记,全部碱基经甲基化修饰。
优选的,所述antagomir-365-2分子量为8828.2。
上述的antagomir-365-2在制备治疗皮肤鳞状细胞癌药物中的应用。
本发明设计合成的antagomir-365-2可以有效抑制体内成熟体miR-365功能。本发明设计合成的antagomir-365-2经过特殊的化学修饰连接,能直接进入细胞内,故在细胞实验中不需要转染试剂,从而避免了转染试剂包装过程的复杂步骤及其对实验的影响。本发明的antagomir-365-2可直接涂覆于患处,其可克服细胞膜、组织等障碍富集于靶细胞,故在动物实验中可局部直接给药,作用效果持续时间可长达6周,稳定性效果好。
本发明的有益效果是:
本发明的抗皮肤鳞状细胞癌药物antagomir-365-2可以克服细胞膜、组织等障碍富集于靶细胞,直接进入体外培养以及体内成瘤的细胞内,进行体外和体内治疗皮肤鳞状细胞癌,在体外能有效地抑制肿瘤细胞的侵袭和转移,在体内能有效抑制肿瘤的生长和消除瘤块。本发明的antagomir-365-2对抗皮肤鳞状细胞癌效果显著,有望成为皮肤癌基因治疗的药物。
附图说明
图1是antagomir-365-2的结构图;
图2是antagomir-365-2的质谱图;
图3是antagomir-365-2的体外抑制肿瘤增殖结果;
图4是antagomir-365-2的体外抑制肿瘤侵袭结果;
图5是antagomir-365-2的体外抑制肿瘤迁移结果;
图6是antagomir-365-2体内抑制肿瘤生长和消除肿块结果图;
图7是antagomir-365-2促进肿瘤凋亡的TUNEL荧光图。
具体实施方式
一种抗皮肤鳞状细胞癌药物antagomir-365-2的设计及克隆:
antagomir-365-2 的核苷酸序列(SEQ ID NO:1)可以人工合成也可以克隆得到。其中,克隆方法:以miR-365单链相反序列为模板,PCR扩增得到该片段。克隆中所用的技术方法皆为分子生物学通用的分子克隆技术方法。
antagomir-365-2 的核苷酸序列的修饰及鉴定:核苷酸序列(SEQ ID NO:1)的全部碱基甲基化修饰,5'末端连续2个碱基以及3'末端连续4个碱基硫代磷酸修饰,以及3'末端胆固醇连接。antagomir-365-2的组成见图1所示,由图也可知,antagomir-365-2的核苷酸序列全链经2’-甲氧基修饰,3’-末端的AAUA4个碱基和5’-末端AU2个碱基硫代磷酸修饰,3'末端胆固醇连接。
采用人工合成的核苷酸序列进行以上修饰,得到的antagomir-365-2采用液相质谱(LC-MS)鉴定,得到的质谱图见图2,由图2可知antagomir-365-2分子量为8828.2。
下面结合具体的实施例对本发明作进一步的说明,但并不局限如此。
实施例中所述培养基均为DMEM培养基,所述完全培养基均为含10%新生牛血清和双抗的DMEM。
实施例1
本实施例涉及本发明的基因片段抑制皮肤鳞状细胞癌细胞增殖、侵袭和迁移实验。
以下各实验分组:(1)阴性对照组;(2)antagomir-365-2干预组;二组实验均使用皮肤鳞状细胞癌细胞系A431,干预后分别检测肿瘤细胞的增殖、侵袭和迁移实验。
采用平板克隆形成实验检测皮肤鳞状细胞癌增殖能力:
收集对数生长且状态良好的A431细胞,用D-Hanks液洗3次,0.25%(w/v)胰酶消化,细胞悬液反复吹打,使细胞充分分散,将细胞浓度调整为(1~2)×106/mL,接种到12孔培养板中,每孔加入100μL细胞悬液,轻轻晃动培养板,使细胞分散均匀,37℃、5%CO2培养箱中培养2周。当细胞长到30~50%密度时,吸去完全培养基,antagomir-365-2干预组每孔加入125μL浓度为20 nM的antagomir-365-2(其溶剂为去除核酸酶的去离子水),并加入无双抗的完全培养基混合至1mL,同时阴性对照组仅加入1mL的无双抗的完全培养基。出现肉眼可见的细胞克隆时,终止培养,弃去培养液,D-Hanks液洗2次后,空气干燥,苏木素染色15min,流水缓慢洗去染液,空气干燥后显微镜下计数形成的克隆数(≥50个细胞为一个克隆)。平板克隆形成率=形成克隆数/接种细胞数×100%。实验重复三次。
实验结果:采用平板克隆形成实验法对直接在培养基中加入antagomir-365-2后对皮肤鳞状细胞癌细胞系A431体外增殖能力的改变进行检测,结果见图3,由图可知,阴性对照组、antagomir-365-2干预组的体外增殖能力具有显著性差异(F=30.077,P<0.001),双侧t检验之后发现,与阴性对照(P=0.000)相比,加入antagomir-365-2的皮肤鳞状细胞癌细胞系的增殖速度显著减慢。该实验结果表明antagomir-365-2显著抑制了皮肤鳞状细胞癌细胞的体外增殖。
Boyden小室皮肤鳞状细胞癌侵袭实验:
实验用的Boyden小室购自美国chemicon公司,该小室是利用ECMatrixTM,即利用EHS(Engel breth Holm-Swarm)肿瘤组织成分重新构建的人工基底膜,评价肿瘤细胞的侵袭能力,小室孔径为8.0 μm。实验前将Boyden小室从冰箱中取出,置于培养箱中,使之温度恢复到37℃。在内室中加300μL无血清培养基,置于培养箱中孵育1~2h,使ECMatrix层亲水。胰酶消化后制成单细胞悬液,无血清培养基洗涤细胞2次后,细胞计数,调整细胞浓度为(0.5~1.0)×106/mL。小心吸出内室中培养基后,加300μL细胞悬液于内室,其中antagomir-365-2干预组中加入了25μl浓度为20nM的antagomir-365-2,阴性对照组不加任何药物,然后各组分别加500μL完全培养基于下室,37℃培养18h。取出小室,用棉签轻轻擦掉未穿过膜的细胞,然后将小室浸入结晶紫染液中染色20min,用蒸馏水轻轻地冲洗数次,空气中风干。显微镜下随机选取5个高倍视野计数穿过ECMatrix膜的细胞数。实验重复三次。
实验结果:采用Boyden小室方法分析,在培养基中加入antagomir-365-2药物干预后对皮肤鳞状细胞癌细胞系A431体外侵袭能力的变化,结果见图4,可见在肿瘤细胞侵袭18h后,二组细胞均穿透基底膜向下侵袭。统计学分析结果显示,二组细胞侵袭能力的差异具有显著性(F=111.709, P< 0.001),双侧t检验比较之后发现,实验组和阴性对照(P=0.000)相比,直接在培养基中加入antagomir-365-2的皮肤鳞状细胞癌细胞系A431穿过基底膜的细胞数显著减少,说明其显著抑制了皮肤癌鳞状细胞系体外侵袭。
Transwell小室皮肤鳞状细胞癌运动迁移实验:
实验用Transwell小室购自美国Corning公司,小室内的膜材料为聚碳酸酯(polycarbonate,PC),小室孔径为8.0μm。生长状态良好的培养细胞,胰酶消化后制成单细胞悬液,无血清培养基洗涤细胞2次后,细胞计数,调整细胞浓度为(l~2)×106/mL。加100μL A431细胞悬液于内室,其中antagomir-365-2干预组加入10μl浓度为20nM的antagomir-365-2,阴性对照组不加任何药物,然后各组分别加500μL完全培养基于下室,37℃培养18h。取出小室,用棉签轻轻擦掉未穿过膜的细胞,然后苏木素复染15min,用蒸馏水轻轻地冲洗数次,空气中风干显微镜下随机选取5个高倍视野计数穿过膜的细胞数。实验重复三次。
采用Transwell小室的方法检测加入antagomir-365-2药物干预后对皮肤鳞状细胞癌细胞系A431体外迁移运动能力的变化,结果见图5,由图可知,二组细胞运动能力的差异具有显著性(F=41.732,P<0.001)。双侧t检验比较之后发现,实验组与阴性对照(P=0.000)相比,在培养基中加入antagomir-365-2的皮肤鳞状细胞癌细胞系穿过膜的细胞数显著减少,说明其显著抑制了皮肤癌鳞状细胞系运动迁移。
实施例2
本实施例涉及瘤体内直接注射antagomir-365-2抑制肿瘤的生长和消除瘤块实验。
皮肤鳞状细胞癌动物模型的建立:收集皮肤鳞状细胞癌细胞系A431细胞 (2×108个),注射BALB/c裸鼠右背部皮下;4~5天长出瘤块,并计算其瘤块大小。(瘤块大小(mm3)=D×d2×π/6(D为瘤块最长的直径长,d为瘤块最短的直径长)。
实验分组:(1)阴性对照组;(2)antagomir-365-2干预组。
实验动物建模:C57BL裸鼠右背部皮下注射A431细胞,每只裸鼠注射2×108 细胞,约5天后成瘤。实验干预组antagomir-365-2干预措施:当裸鼠瘤块长到150 mm3,在瘤体内多位点注射antagomir-365-2,每次注射剂量0.2mg/kg小鼠体重,每周注射3次。每次注射时用100μLPBS溶解。阴性对照组注射等量PBS溶液。观察瘤块大小变化。
肿瘤细胞的凋亡检测:
取肿瘤组织石蜡包埋,TUNEL荧光检测凋亡:二甲苯脱蜡2次,每次10分钟;依次经100%,95%,85%,75%,50%(体积)乙醇和纯水各1次,每次5分钟;4%浓度甲醛溶液室温固定15分钟;PBS洗涤2次,每次5分钟;20 μg/ml Proteinase K室温孵育15分钟;PBS洗涤5分钟;4%浓度甲醛溶液室温固定5分钟;PBS溶液室温洗涤2次,每次5分钟;加100μl Equilibration Buffer室温平衡10分钟;加入50μl TdT工作液37℃湿盒避光孵育60分钟;2× SSC溶液洗涤15分钟;PBS溶液室温洗涤3次,每次5分钟;DAPI染液室温湿盒避光孵育10分钟;去离子水室温洗涤3次,每次5分钟;荧光抗淬灭剂封片(避光,4℃保存);荧光显微镜镜检。TdT工作液(荧光标记)配制:Equilibration buffer 45μl;Nucleotide mix 5μl;rTdT Enzyme 1μl。
实验结果:所有裸鼠在A431细胞诱导后,肿瘤大小在第10天后达到150mm3以上,然后在瘤体内多点注射antagomir-365-2药物。干预21天后,肿瘤生长情况显示:实验组裸鼠皮下肿块大小显著性低于对照组瘤块大小约500mm3,有的裸鼠皮下瘤块甚至完全消除(P<0.001)。具体可见图6中,左图为阴性对照组与注射antagomir-365-2组21天后的肿瘤大小比较,右图为21天后两组裸鼠典型照片。
肿瘤细胞凋亡检测结果见图7,凋亡细胞呈现核发出绿色荧光,由图可知,注射antagomir-365-2药物治疗的小鼠凋亡状况明显高于阴性对照组。以上结果表明:在瘤体内直接注射antagomir-365-2能够促进肿瘤细胞凋亡,具有良好的抗皮肤鳞状细胞癌的作用。
<110> 南方医科大学
<120> 一种抗皮肤鳞状细胞癌药物antagomir-365-2
<130>
<160> 1
<170> PatentIn version 3.5
<210> 1
<211> 22
<212> RNA
<213> 人工合成/homo sapiens
<400> 1
auuacgggga uuuuuaggaa ua 22
Claims (3)
1.一种抗皮肤鳞状细胞癌药物antagomir-365-2,所述antagomir-365-2是一种经化学修饰的反义寡核苷酸,其核苷酸序列为:5’-AUUACGGGGAUUUUUAGGAAUA-3’ (SEQ ID NO:1),序列的5'末端连续2个碱基以及3'末端连续4个碱基经硫代磷酸修饰,3'末端经胆固醇标记,全部碱基经甲基化修饰。
2.根据权利要求1所述的一种抗皮肤鳞状细胞癌药物antagomir-365-2,其特征在于:所述antagomir-365-2分子量为8828.2。
3.权利要求1所述的antagomir-365-2在制备治疗皮肤鳞状细胞癌药物中的应用。
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