CN102755651A - 一种抗皮肤鳞状细胞癌药物antagomir-365-2 - Google Patents
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Abstract
本发明公开了一种抗皮肤鳞状细胞癌药物antagomir-365-2，所述antagomir-365-2是一种经化学修饰的反义寡核苷酸，其核苷酸序列见SEQIDNO:1，序列的5'端连续2个碱基以及3'端连续4个碱基经硫代磷酸修饰，3'末端经胆固醇标记，全部碱基经甲基化修饰。本发明的抗皮肤鳞状细胞癌药物antagomir-365-2可以克服细胞膜、组织等障碍富集于靶细胞，能直接进入体外培养的细胞以及体内成瘤的组织中，是进行体外和体内治疗皮肤鳞状细胞癌实验的理想药物，在体外能有效地抑制肿瘤细胞的侵袭和转移，在体内能有效抑制肿瘤的生长和消除瘤块。本发明的antagomir-365-2对抗皮肤鳞状细胞癌效果显著，是皮肤癌治疗的靶基因药物。
Description
技术领域
本发明属于生物医药领域，具体涉及一种抗皮肤鳞状细胞癌药物antagomir-365-2。
背景技术
皮肤癌作为白色人种中常见的恶性肿瘤之一，其发病率在白人中超过其他所有恶性肿瘤的总和，而近年来其发病率在我国出现了逐年上升的趋势并且呈现年轻化。根据最初的关于限制消耗臭氧物质的国际协议预测，到2100年，欧洲的西北地区和美国皮肤癌发病率可能会增加一倍，2060年将导致一个10%的增长高峰。
目前，对皮肤癌的临床治疗仍以手术、放疗、激光等综合治疗为主，在已经对后基因组计划进行研究的今天，皮肤癌的致病基因已经较成功的在分子水平上得到了确认，但是如何找到肿瘤的靶向治疗基因，并对其进行基因治疗仍是一大难题。
近年来，在小分子RNA中新发现了一类与调节基因表达密切相关的小分子非编码单链RNA即微小RNA（microRNAs，miRNAs）。随着研究的深入，越来越多的miRNA被发现，它不仅参与细胞分化成熟障碍、增殖失控，而且与细胞永生化为本质的肿瘤疾病密切相关，人类肿瘤细胞和肿瘤组织内miRNA的表达水平和类型都与正常细胞和组织明显不同，并且已经发现的人类miRNA大部分(52%) 都位于已知的肿瘤相关基因组区域内或已知的基因脆性位点。最近的证据表明，miRNA 突变或者异位表达与多种人类癌症相关，miRNAs 可以起到肿瘤抑制基因或者癌基因的功能。
在人类基因组序列中，我们发现miR-365是 UVB敏感的miRNA，是引起皮肤癌的一个重要的环境因素。miR-365为一种成熟的miRNA，它由两种前体pre-miR-365-1和pre-miR-365-2剪切而来。但是经RT-qPCR在皮肤癌细胞中检测发现成熟miR-365来自前体pre-miR-365-2。antagomir是经过特殊化学修饰的miRNA拮抗剂，通过与体内的成熟miRNA强竞争性结合，阻止miRNA与其靶基因mRNA的互补配对，抑制miRNA发挥作用。
发明内容
本发明的目的在于提供一种抗皮肤鳞状细胞癌药物antagomir-365-2。
本发明所采取的技术方案为：
一种抗皮肤鳞状细胞癌药物antagomir-365-2，所述antagomir-365-2是一种经化学修饰的反义寡核苷酸，其核苷酸序列为：5’-AUUACGGGGAUUUUUAGGAAUA-3’ （SEQ ID NO:1），序列的5'末端连续2个碱基以及3'末端连续4个碱基经硫代磷酸修饰，3'末端经胆固醇标记，全部碱基经甲基化修饰。
优选的，所述antagomir-365-2分子量为8828.2。
上述的antagomir-365-2在制备治疗皮肤鳞状细胞癌药物中的应用。
本发明设计合成的antagomir-365-2可以有效抑制体内成熟体miR-365功能。本发明设计合成的antagomir-365-2经过特殊的化学修饰连接，能直接进入细胞内，故在细胞实验中不需要转染试剂，从而避免了转染试剂包装过程的复杂步骤及其对实验的影响。本发明的antagomir-365-2可直接涂覆于患处，其可克服细胞膜、组织等障碍富集于靶细胞，故在动物实验中可局部直接给药，作用效果持续时间可长达6周，稳定性效果好。
本发明的有益效果是：
本发明的抗皮肤鳞状细胞癌药物antagomir-365-2可以克服细胞膜、组织等障碍富集于靶细胞，直接进入体外培养以及体内成瘤的细胞内，进行体外和体内治疗皮肤鳞状细胞癌，在体外能有效地抑制肿瘤细胞的侵袭和转移，在体内能有效抑制肿瘤的生长和消除瘤块。本发明的antagomir-365-2对抗皮肤鳞状细胞癌效果显著，有望成为皮肤癌基因治疗的药物。
附图说明
图1是antagomir-365-2的结构图；
图2是antagomir-365-2的质谱图；
图3是antagomir-365-2的体外抑制肿瘤增殖结果；
图4是antagomir-365-2的体外抑制肿瘤侵袭结果；
图5是antagomir-365-2的体外抑制肿瘤迁移结果；
图6是antagomir-365-2体内抑制肿瘤生长和消除肿块结果图；
图7是antagomir-365-2促进肿瘤凋亡的TUNEL荧光图。
具体实施方式
一种抗皮肤鳞状细胞癌药物antagomir-365-2的设计及克隆：
antagomir-365-2 的核苷酸序列（SEQ ID NO:1）可以人工合成也可以克隆得到。其中，克隆方法：以miR-365单链相反序列为模板，PCR扩增得到该片段。克隆中所用的技术方法皆为分子生物学通用的分子克隆技术方法。
antagomir-365-2 的核苷酸序列的修饰及鉴定：核苷酸序列（SEQ ID NO:1）的全部碱基甲基化修饰，5'末端连续2个碱基以及3'末端连续4个碱基硫代磷酸修饰，以及3'末端胆固醇连接。antagomir-365-2的组成见图1所示，由图也可知，antagomir-365-2的核苷酸序列全链经2’-甲氧基修饰，3’-末端的AAUA4个碱基和5’-末端AU2个碱基硫代磷酸修饰，3'末端胆固醇连接。
采用人工合成的核苷酸序列进行以上修饰，得到的antagomir-365-2采用液相质谱（LC-MS）鉴定，得到的质谱图见图2，由图2可知antagomir-365-2分子量为8828.2。
下面结合具体的实施例对本发明作进一步的说明，但并不局限如此。
实施例中所述培养基均为DMEM培养基，所述完全培养基均为含10%新生牛血清和双抗的DMEM。
实施例1
本实施例涉及本发明的基因片段抑制皮肤鳞状细胞癌细胞增殖、侵袭和迁移实验。
以下各实验分组：（1）阴性对照组；（2）antagomir-365-2干预组；二组实验均使用皮肤鳞状细胞癌细胞系A431，干预后分别检测肿瘤细胞的增殖、侵袭和迁移实验。
采用平板克隆形成实验检测皮肤鳞状细胞癌增殖能力：
收集对数生长且状态良好的A431细胞，用D-Hanks液洗3次，0.25%（w/v）胰酶消化，细胞悬液反复吹打，使细胞充分分散，将细胞浓度调整为（1～2）×106/mL，接种到12孔培养板中，每孔加入100μL细胞悬液，轻轻晃动培养板，使细胞分散均匀，37℃、5%CO2培养箱中培养2周。当细胞长到30～50%密度时，吸去完全培养基，antagomir-365-2干预组每孔加入125μL浓度为20 nM的antagomir-365-2（其溶剂为去除核酸酶的去离子水），并加入无双抗的完全培养基混合至1mL，同时阴性对照组仅加入1mL的无双抗的完全培养基。出现肉眼可见的细胞克隆时，终止培养，弃去培养液，D-Hanks液洗2次后，空气干燥，苏木素染色15min，流水缓慢洗去染液，空气干燥后显微镜下计数形成的克隆数(≥50个细胞为一个克隆)。平板克隆形成率=形成克隆数/接种细胞数×100%。实验重复三次。
实验结果：采用平板克隆形成实验法对直接在培养基中加入antagomir-365-2后对皮肤鳞状细胞癌细胞系A431体外增殖能力的改变进行检测，结果见图3，由图可知，阴性对照组、antagomir-365-2干预组的体外增殖能力具有显著性差异(F=30.077，P<0.001)，双侧t检验之后发现，与阴性对照（P=0.000）相比，加入antagomir-365-2的皮肤鳞状细胞癌细胞系的增殖速度显著减慢。该实验结果表明antagomir-365-2显著抑制了皮肤鳞状细胞癌细胞的体外增殖。
Boyden小室皮肤鳞状细胞癌侵袭实验：
实验用的Boyden小室购自美国chemicon公司，该小室是利用ECMatrixTM，即利用EHS(Engel breth Holm-Swarm)肿瘤组织成分重新构建的人工基底膜，评价肿瘤细胞的侵袭能力，小室孔径为8.0 μm。实验前将Boyden小室从冰箱中取出，置于培养箱中，使之温度恢复到37℃。在内室中加300μL无血清培养基，置于培养箱中孵育1～2h，使ECMatrix层亲水。胰酶消化后制成单细胞悬液，无血清培养基洗涤细胞2次后，细胞计数，调整细胞浓度为(0.5～1.0)×106/mL。小心吸出内室中培养基后，加300μL细胞悬液于内室，其中antagomir-365-2干预组中加入了25μl浓度为20nM的antagomir-365-2，阴性对照组不加任何药物，然后各组分别加500μL完全培养基于下室，37℃培养18h。取出小室，用棉签轻轻擦掉未穿过膜的细胞，然后将小室浸入结晶紫染液中染色20min，用蒸馏水轻轻地冲洗数次，空气中风干。显微镜下随机选取5个高倍视野计数穿过ECMatrix膜的细胞数。实验重复三次。
实验结果：采用Boyden小室方法分析，在培养基中加入antagomir-365-2药物干预后对皮肤鳞状细胞癌细胞系A431体外侵袭能力的变化，结果见图4，可见在肿瘤细胞侵袭18h后，二组细胞均穿透基底膜向下侵袭。统计学分析结果显示，二组细胞侵袭能力的差异具有显著性(F=111.709, P< 0.001)，双侧t检验比较之后发现，实验组和阴性对照（P=0.000）相比，直接在培养基中加入antagomir-365-2的皮肤鳞状细胞癌细胞系A431穿过基底膜的细胞数显著减少，说明其显著抑制了皮肤癌鳞状细胞系体外侵袭。
Transwell小室皮肤鳞状细胞癌运动迁移实验：
实验用Transwell小室购自美国Corning公司，小室内的膜材料为聚碳酸酯(polycarbonate，PC)，小室孔径为8.0μm。生长状态良好的培养细胞，胰酶消化后制成单细胞悬液，无血清培养基洗涤细胞2次后，细胞计数，调整细胞浓度为(l～2)×106/mL。加100μL A431细胞悬液于内室，其中antagomir-365-2干预组加入10μl浓度为20nM的antagomir-365-2，阴性对照组不加任何药物，然后各组分别加500μL完全培养基于下室，37℃培养18h。取出小室，用棉签轻轻擦掉未穿过膜的细胞，然后苏木素复染15min，用蒸馏水轻轻地冲洗数次，空气中风干显微镜下随机选取5个高倍视野计数穿过膜的细胞数。实验重复三次。
采用Transwell小室的方法检测加入antagomir-365-2药物干预后对皮肤鳞状细胞癌细胞系A431体外迁移运动能力的变化，结果见图5，由图可知，二组细胞运动能力的差异具有显著性(F=41.732，P<0.001)。双侧t检验比较之后发现，实验组与阴性对照（P=0.000）相比，在培养基中加入antagomir-365-2的皮肤鳞状细胞癌细胞系穿过膜的细胞数显著减少，说明其显著抑制了皮肤癌鳞状细胞系运动迁移。
实施例2
本实施例涉及瘤体内直接注射antagomir-365-2抑制肿瘤的生长和消除瘤块实验。
皮肤鳞状细胞癌动物模型的建立：收集皮肤鳞状细胞癌细胞系A431细胞 (2×108个)，注射BALB/c裸鼠右背部皮下；4～5天长出瘤块，并计算其瘤块大小。（瘤块大小（mm3）=D×d2×π/6（D为瘤块最长的直径长，d为瘤块最短的直径长）。
实验分组：（1）阴性对照组；（2）antagomir-365-2干预组。
实验动物建模：C57BL裸鼠右背部皮下注射A431细胞，每只裸鼠注射2×108 细胞，约5天后成瘤。实验干预组antagomir-365-2干预措施：当裸鼠瘤块长到150 mm3，在瘤体内多位点注射antagomir-365-2，每次注射剂量0.2mg/kg小鼠体重，每周注射3次。每次注射时用100μLPBS溶解。阴性对照组注射等量PBS溶液。观察瘤块大小变化。
肿瘤细胞的凋亡检测：
取肿瘤组织石蜡包埋，TUNEL荧光检测凋亡：二甲苯脱蜡2次，每次10分钟；依次经100%，95%，85%，75%，50%（体积）乙醇和纯水各1次，每次5分钟；4%浓度甲醛溶液室温固定15分钟；PBS洗涤2次，每次5分钟；20 μg/ml Proteinase K室温孵育15分钟；PBS洗涤5分钟；4%浓度甲醛溶液室温固定5分钟；PBS溶液室温洗涤2次，每次5分钟；加100μl Equilibration Buffer室温平衡10分钟；加入50μl TdT工作液37℃湿盒避光孵育60分钟；2× SSC溶液洗涤15分钟；PBS溶液室温洗涤3次，每次5分钟；DAPI染液室温湿盒避光孵育10分钟；去离子水室温洗涤3次，每次5分钟；荧光抗淬灭剂封片（避光，4℃保存）；荧光显微镜镜检。TdT工作液（荧光标记）配制：Equilibration buffer 45μl；Nucleotide mix 5μl；rTdT Enzyme 1μl。
实验结果：所有裸鼠在A431细胞诱导后，肿瘤大小在第10天后达到150mm3以上，然后在瘤体内多点注射antagomir-365-2药物。干预21天后，肿瘤生长情况显示：实验组裸鼠皮下肿块大小显著性低于对照组瘤块大小约500mm3，有的裸鼠皮下瘤块甚至完全消除（P＜0.001）。具体可见图6中，左图为阴性对照组与注射antagomir-365-2组21天后的肿瘤大小比较，右图为21天后两组裸鼠典型照片。
肿瘤细胞凋亡检测结果见图7，凋亡细胞呈现核发出绿色荧光，由图可知，注射antagomir-365-2药物治疗的小鼠凋亡状况明显高于阴性对照组。以上结果表明：在瘤体内直接注射antagomir-365-2能够促进肿瘤细胞凋亡，具有良好的抗皮肤鳞状细胞癌的作用。
<110> 南方医科大学
<120> 一种抗皮肤鳞状细胞癌药物antagomir-365-2
<130>
<160> 1
<170> PatentIn version 3.5
<210> 1
<211> 22
<212> RNA
<213> 人工合成/homo sapiens
<400> 1
auuacgggga uuuuuaggaa ua 22
Claims (3)
1.一种抗皮肤鳞状细胞癌药物antagomir-365-2，所述antagomir-365-2是一种经化学修饰的反义寡核苷酸，其核苷酸序列为：5’-AUUACGGGGAUUUUUAGGAAUA-3’ （SEQ ID NO:1），序列的5'末端连续2个碱基以及3'末端连续4个碱基经硫代磷酸修饰，3'末端经胆固醇标记，全部碱基经甲基化修饰。
2.根据权利要求1所述的一种抗皮肤鳞状细胞癌药物antagomir-365-2，其特征在于：所述antagomir-365-2分子量为8828.2。
3.权利要求1所述的antagomir-365-2在制备治疗皮肤鳞状细胞癌药物中的应用。
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