CN102732607A - 一种检测高度近视的试剂盒 - Google Patents

Abstract

本发明提供了一种检测高度近视的试剂盒，包括任选的用于检测ZNF644基因1901位，2156位，2180位，2238位，4138位，4718位中的一个或者多个位点变异的试剂。还提供了ZNF644基因1901位，2156位，2180位，2238位，4138位，4718位中的一个或者多个位点变异在制备检测高度近视的试剂中的用途。本发明提供的试剂盒可以预测待检样本对高度近视的易感性，可用于早期监控、检测高度近视的高危人群，实施早期预防和治疗，减少其视力损害。

Description

一种检测高度近视的试剂盒

技术领域

本发明涉及一种检测高度近视的试剂盒，具体地说检测与高度近视疾病相关ZNF644基因变异的试剂盒。

背景技术

高度近视(high myopia，HM)又称为病理性近视、恶性近视，是指屈光度在-6.00D以上的近视，有眼轴延长、眼后极部的变形改变，巩膜变薄、脉络膜萎缩变薄等病理性改变，并伴有弱视、青光眼、白内障、玻璃体混浊、视网膜脱离等多种并发症。

高度近视是一种致盲性眼病，其病因、发病机制非常复杂。高度近视有家族性并有明显的遗传倾向，且患病率高，有种族差异。在我国，高度近视是常染色体隐性遗传，表现为儿童学龄(前)期出现近视，近视度数进行性增加，眼底视网膜脉络膜病变逐年加重。

到目前为止，对高度近视的治疗方法很有限且效果不显著。光学矫正如戴眼镜或接触镜矫正近视眼的屈光缺陷，虽然有助于暂时恢复正常或接近正常的视力，却不能有效地控制近视进展；针对部分高度近视伴有黄斑病变所采用的玻璃体手术与激光治疗，以及通过手术控制眼轴延长延缓眼底病变出现的时间并减轻其病变程度，是临床上最常采用的干预方法，这些治疗手段能使术后视力提高或保持稳定，屈光度稳定或减少，眼轴增长趋于缓慢，对功能性改变有轻度改善作用，但这些治疗并不能对所有患者有效，且手术存在一定的风险性，手术并发症主要有术后视网膜脱离和涡静脉、睫状动脉损伤，其远期效果也还尚待考证。另外有报道通过药物控制眼轴增长和高度近视的病理改变，但仍处于实验阶段，还有待进一步研究。

因此，早期诊断发现，及早干预，延缓病程，减少病人的视力丧失是非常重要的。

发明内容

为了解决上述问题，本发明提供了一种新的试剂盒。

本发明提供了一种检测高度近视的试剂盒，包括任选的用于检测ZNF644基因1901位，2156位，2180位，2238位，4138位，4718位中的一个或者多个基因位点变异的试剂。

所述的1901位变异为A→G变异，2156位变异为A→G变异，2180位变异为C→G变异，2238位变异为G→A变异，4138位变异为C→G变异，4718位为G→A变异。

上述试剂盒中的试剂为测序用试剂。该测序用试剂包括：

引物1：ACCAGGAGAGAAGACAGAAG；

和/或引物2：CCCTATGGTCACTTCTGATA；

和/或引物3：TTTTGAAATGCACAGGATAT；

和/或引物4：TGAATTGGGAGTTTTGATGT

和/或引物5：CCCCACAAGACTTGCATAGA。

上述试剂盒中的试剂为限制性内切酶酶切方法用试剂、限制性片段长度多态方法用试剂、SnaPshot用试剂、基因芯片用试剂。

上述试剂盒还包括任选的用于扩增包含ZNF644基因1901位，2156位，2180位，2238位，4138位，4718位中的一个或者多个基因位点的基因片段的试剂。该试剂为：

引物对A：

上游引物：ACCAGGAGAGAAGACAGAAG

下游引物：TTTTGAAATGCACAGGATAT；

和/或引物对B：

上游引物：TGAATTGGGAGTTTTGATGT

下游引物：CCCATTTTCCTGCTTTAGTA；

和/或引物对C：

上游引物：CCCCACAAGACTTGCATAGA

下游引物：CCTGTCCTGTAAGCATGTCA。

本发明上述试剂盒含有本发明特异性扩增目的片段的PCR引物对和特异性测定目的基因的碱基的引物，以及用于PCR扩增和进行测序的试剂盒的常规组件、试剂、缓冲液等，本领域技术人员熟知这些常规组件和检测方法。

用本发明上述试剂盒检测待检样品，确定ZNF644基因1901位，2156位，2180位，2238位，4138位，4718位六个SNP位点的多态性，样品没有限制，如体液(血液、腹水和尿液)、组织细胞(如肝组织)等，通过提取和纯化这些样品均可制备基因组DNA。

本发明还提供了一种检测高度近视的试剂盒，包括任选的用于检测ZNF644基因编码的蛋白质的第587位变异、第672位变异、第680位变异、第699位变异中的一个或者多个氨基酸变异的试剂。所述的第587位变异是第587位I→V变异，第672位变异是672位S→G变异，第680位变异是672位R→G变异，第699位变异是699位C→Y变异。所述的试剂为检测氨基酸序列用试剂。

本发明又提供了ZNF644基因在制备检测高度近视的试剂中的用途。所述用途是指ZNF644基因1901位，2156位，2180位，2238位，4138位，4718位中的一个或者多个基因位点变异在制备检测高度近视的试剂中的用途。所述的1901位变异为A→G变异，2156位变异为A→G变异，2180位变异为C→G变异，2238位变异为G→A变异，4138位变异为C→G变异，4718位为G→A变异。

上述用途中所述的试剂为测序用试剂。该测序用试剂包括：

所述的测序用试剂包括：

引物1：ACCAGGAGAGAAGACAGAAG；

和/或引物2：CCCTATGGTCACTTCTGATA；

和/或引物3：TTTTGAAATGCACAGGATAT；

和/或引物4：TGAATTGGGAGTTTTGATGT；

和/或引物5：CCCCACAAGACTTGCATAGA。

上述用途中所述的试剂为限制性内切酶酶切方法用试剂、限制性片段长度多态方法用试剂、SnaPshot用试剂、基因芯片用试剂。

上述用途中的试剂还包括任选的用于扩增包含ZNF644基因1901位，2156位，2180位，2238位，4138位，4718位中的一个或者多个基因位点的基因片段的试剂。所述的试剂为：

引物对A：

上游引物：ACCAGGAGAGAAGACAGAAG

下游引物：TTTTGAAATGCACAGGATAT；

和/或引物对B：

上游引物：TGAATTGGGAGTTTTGATGT

下游引物：CCCATTTTCCTGCTTTAGTA；

和/或引物对C：

上游引物C：CCCCACAAGACTTGCATAGA

下游引物C：CCTGTCCTGTAAGCATGTCA。

本发明还提供了ZNF644基因编码的蛋白质在制备检测高度近视的试剂中的用途。

所述用途是指ZNF644基因编码的蛋白质的第587位变异、第672位变异、第680位变异、第699位变异中的一个或者多个氨基酸变异在制备检测高度近视的试剂中的用途。所述的第587位变异是第587位I→V变异，第672位变异是672位S→G变异，第680位变异是672位R→G变异，第699位变异是699位C→Y变异。所述的试剂为检测氨基酸序列用试剂。待检样品组织可以是待检者的肝组织、胎盘、视网膜或者视网膜色素上皮细胞。

本发明公开了ZNF644基因的上述多态性位点与高度近视的相关性，提供了一种预测病理性近视易感性的方法，该方法可用于高度近视的早期筛查、辅助诊断，为易患者实施早期预防和治疗提供依据，具有良好的市场应用前景。

附图说明

图1高度近视家系(951)的家系图谱

图2高度近视家系(951)的家系(III：2)的临床眼底照片

图3PCR产物直接测序检测2156位A→G突变的序列图谱

图4PCR产物直接测序检测1901位A→G突变的序列图谱

图5PCR产物直接测序检测2180位C→G突变的序列图谱

图6PCR产物直接测序检测2238位G→A突变的序列图谱

图7PCR产物直接测序检测4138位C→G突变的序列图谱

图8PCR产物直接测序检测4718位G→A突变的序列图谱

图9散发高度近视患者的临床眼底照片

图10ZNF644基因在人体肝组织、胎盘、视网膜和视网膜色素上皮细胞中的表达情况。

具体实施方式

以下通过实施例形式的具体实施方式，对本发明的上述内容作进一步的详细说明。但不应将此理解为本发明上述主题的范围仅限于以下的实施例。凡基于本发明上述内容所实现的技术均属于本发明的范围。

实施例1样本收集和基因组DNA的提取

家系及病例样本均来自由四川省医学科学院·四川省人民医院人类疾病基因研究四川省重点实验室承担的国家自然科学基金(课题号：30900809，81170883)、国家杰出青年基金(81025006)、973项目子课题(2011CB504604)以及四川省科技厅课题(2010SZ0138)收集的样本。高度近视家系(951)成员共计30人(20人存活)，其中高度近视患者10人(6人存活)；散发高度近视患者300例，平均年龄33.6±12.6岁，其中男性占46.3％，正常对照600例(入选标准为：40岁以上，长期从事近距离工作，屈光度＞-1.0D)，平均年龄55.8±9.2岁，其中男性占47.8％(表1)。所有受检者均为汉族，且签署知情同意书，这一研究也得到了伦理委员会批准。

表1散发高度近视病例和正常对照的基本临床资料

临床资料	正常对照	高度近视患者
			人数	600	300
年龄	55.8±9.2	33.6±12.6**
			男性比例	287(47.8％)	139(46.3％)
屈光度(D)	-0.27±0.53	-10.36±4.03**
			眼轴(mm)	23.91±1.98	27.95±2.02**

注：**，P＜0.01。

每人采集EDTA抗凝血样5～10ml，酚-氯仿法提取基因组DNA，具体步骤为：在抗凝剂EDTA存在下，将收集的5ml人外周血在3000rpm离心分离30分钟除去血清；接着加入0.2％NaCl溶液，使总体积为30ml；轻轻振荡溶液5-6次，并使其放置于冰上15分钟；此后，在3000rpm离心分离30分钟，借此收集沉淀物；用0.2％的NaCl溶液，以类似于前面的方式再进行洗涤；在如此获得的沉淀物中，加入10mM Tris-HCl(pH8.0)和10mM EDTA(4ml)，以悬浮该沉淀物；将10％SDS，25mg/ml的蛋白酶K和10mg/ml的RNaseA加入悬液中，其加入量分别为4ml、16μl和20μl，接着上下颠倒悬液轻轻混合；然后，在37℃过夜温育悬液；过夜后，加入4ml酚/Tris溶液，上下颠倒混合物混合所得的混合物；以3000rpm离心分离10分钟除去水层；将水层与4ml酚/氯仿溶液混合，接着逆混合并以3000rpm离心分离10分钟，除去水层；最后，用氯仿提取两次，以获得水相，往其中加1/10，3M NaAC(pH5.2)，两倍量的冷无水乙醇，使DNA沉淀；用70％的乙醇洗涤以获得基因组DNA。

将所得的基因组DNA溶解于TE中，定量测定混合物在260nm的吸收率，DNA工作液浓度校正至30ng/μl，置-20℃冰箱保存。

实施例2ZNF644基因2156位A→G突变位点的检测

一、检测方法

1、提取高度近视家系(951)存活成员的的血液基因组DNA

2、ZNF644基因2156位A→G突变位点的检测

(1)PCR扩增：

以步骤1得到的基因组DNA为模板，以SEQ ID NO.1～2所示引物对A(上游引物：ACCAGGAGAGAAGACAGAAG；下游引物：TTTTGAAATGCACAGGATAT)为引物，采用天根公司的PCRmix试剂盒进行PCR扩增。

体系：2×PCRmix 10μl，上下游引物(5pm)各1μl，模板DNA(30ng/μl)1μl，ddH₂O 7μl。

程序：95℃变性5分钟；95℃30秒、52℃退火30秒、72℃延伸1分钟，35个循环；72℃延伸7分钟，12℃保温。

扩增产物是如SEQ ID NO.3～4所示的序列(879bp)：

ACCAGGAGAGAAGACAGAAGttgatggaggaaattcgtgaattgaaagaacttcaggatgaaggaagaagtgcacgattacagtgtcctcagtgtgtgtttggtaccaattgccctaaaacatttgtgcaacatgctaaaacccatgaaaaagataaaaggtactactgctgtgaagagtgtaacttcatggcagtgacagaaaatgaattggaatgccatcgaggcattgcacatggggcagtggtaaaatgccctatggtcacttctgatattgcccagagaaaaacacaaaaaaagactttcatgaaagactctgtagtaggatcatccaaaaaatcagctacctacatatgtaagatgtgtccttttactacttcagccaaaagtgttttaaaaaagcacacggagtacttgcattcatcatcatgtgttgattcatttggtagtcctcttggacttgataaaagaaaaaatgacatccttgaagaacctgtagatagtgatagcactaaaacattaactaaacaacagtcaaccacatttccaaagaactctgctttaaaacaagatgtgaagcgaacatttggatcaacctcacaatcagtagtttttcaaaaattcataagcggccacacagaatacagaaagctcggaaaagcattgcccaatcaggtgtaaacatgtgcaatcaaaacagctctcctcataagaatgttacaattaaaagcagcgttgaccaaaaacctaagtatttccatcaagcagcaaaagaaaagtctaatgccaaggcaaatagccactatttgtatagacacaaatatgaaaactataggatgatcaaaaaatcaggtgaatcATATCCTGTGCATTTCAAAA

(2)PCR产物纯化：取步骤(1)的PCR产物5μl，加入USB公司ExoSAP-IT(US PCR纯化试剂)1μl。

程序：37℃20分钟，75℃15分钟，12℃保温。

(3)测序反应：以步骤(2)的产物为模板，以SEQ ID NO.5所示的序列(引物1)：CCCTATGGTCACTTCTGATA为引物，采用ABI公司DNA片段测序试剂盒测序。

反应体系：纯化好的PCR产物1μl，5×Buffer1μl，测序引物(2pm)0.5μl(或5pm 0.2μl)，seq-RP100 0.5μl，ddH₂O 2μl(或2.3μl)。程序：96℃15秒，50℃10秒，60℃4分钟，30个循环；12℃保温。

(4)测序反应产物纯化：每个反应加入70％乙醇25μl，避光静置15分钟，4000转/分钟离心30分钟，吸弃上清液，沉淀静置20分钟晾干，加入9μl上机缓冲液溶解，上机测序。

(5)上机测序分析：采用ABI 3130XL测序仪进行测序分析。

二、检测结果

2156位A→G突变的测序图谱如图3所示，根据测序图和951家系成员基本情况绘制表2：

表2951家系成员基本情况及ZNF644基因测序结果

高度近视家系(951)成员共计30人(20人存活)，其中高度近视患者10人(6人存活)，其家系图谱如图1所示，高度近视家系(951)的家系(III：2)的临床眼底呈豹纹状，照片如图2所示。由表2结合图1、图2可知，高度近视家系(951)成员中，凡ZNF644基因2156位的基因型为A/G杂合子，即发生A→G变异的待测样本为高度近视患者，而ZNF644基因2156位的基因型为A/A，即未发生A→G变异的待测样本为非高度近视患者。

实验证明，待检人群的ZNF644基因2156位是否发生A→G变异与其患高度近视的风险高低紧密相关。

实施例3ZNF644基因1901位A→G变异、2180位C→G变异、2238位G→A变异、4138位的C→G变异和4718位的G→A变异中的检测

一、检测方法

1、提取300例散发高度近视患者和600例正常对照的血液基因组DNA

2、ZNF644基因1901位A→G突变位点、2180位C→G突变位点、2238位G→A突变位点、4138位的C→G突变位点和4718位的G→A突变位点的检测，这5个突变位点的检测方法与实施例2中ZNF644基因2156位A→G突变位点的检测方法相同，它们的PCR扩增引物、扩增产物和测序引物分别为：

1901位A→G突变位点：

PCR扩增引物：SEQ ID NO.1～2所示的序列(引物对A)，同2156位扩增引物；

扩增产物：SEQ ID NO.6～7所示的序列(879bp)

ACCAGGAGAGAAGACAGAAGttgatggaggaaattcgtgaattgaaagaacttcaggatgaaggaagaagtgcacgattacagtgtcctcagtgtgtgtttggtaccaattgccctaaaacatttgtgcaacatgctaaaacccatgaaaaagataaaaggtactactgctgtgaagagtgtaacttcatggcagtgacagaaaatgaattggaatgccatcgaggcattgcacatggggcagtggtaaaatgccctatggtcacttctgatattgcccagagaaaaacacaaaaaaagactttcatgaaagactctgtagtaggatcatccaaaaaatcagctacctacA/GtatgtaagatgtgtccttttactacttcagccaaaagtgttttaaaaaagcacacggagtacttgcattcatcatcatgtgttgattcatttggtagtcctcttggacttgataaaagaaaaaatgacatccttgaagaacctgtagatagtgatagcactaaaacattaactaaacaacagtcaaccacatttccaaagaactctgctttaaaacaagatgtgaagcgaacatttggatcaacctcacaatcaagtagtttttcaaaaattcataagCggccacacagaatacagaaagctcggaaaagcattgcccaatcaggtgtaaacatgtGcaatcaaaacagctctcctcataagaatgttacaattaaaagcagcgttgaccaaaaacctaagtatttccatcaagcagcaaaagaaaagtctaatgccaaggcaaatagccactatttgtatagacacaaatatgaaaactataggatgatcaaaaaatcaggtgaatcATATCCTGTGCATTTCAAAA；

测序引物2是SEQ ID NO.8所示序列：ACCAGGAGAGAAGACAGAAG。

2180位C→G突变位点：

PCR扩增引物：SEQ ID NO.1～2所示的序列(引物对A)，同2156位扩增引物；

扩增产物：SEQ ID NO.9～10所示的序列(879bp)：

ACCAGGAGAGAAGACAGAAGttgatggaggaaattcgtgaattgaaagaacttcaggatgaaggaagaagtgcacgattacagtgtcctcagtgtgtgtttggtaccaattgccctaaaacatttgtgcaacatgctaaaacccatgaaaaagataaaaggtactactgctgtgaagagtgtaacttcatggcagtgacagaaaatgaattggaatgccatcgaggcattgcacatggggcagtggtaaaatgccctatggtcacttctgatattgcccagagaaaaacacaaaaaaagactttcatgaaagactctgtagtaggatcatccaaaaaatcagctacctacAtatgtaagatgtgtccttttactacttcagccaaaagtgttttaaaaaagcacacggagtacttgcattcatcatcatgtgttgattcatttggtagtcctcttggacttgataaaagaaaaaatgacatccttgaagaacctgtagatagtgatagcactaaaacattaactaaacaacagtcaaccacatttccaaagaactctgctttaaaacaagatgtgaagcgaacatttggatcaacctcacaatcaagtagtttttcaaaaattcataagC/GggccacacagaatacagaaagctcggaaaagcattgcccaatcaggtgtaaacatgtGcaatcaaaacagctctcctcataagaatgttacaattaaaagcagcgttgaccaaaaacctaagtatttccatcaagcagcaaaagaaaagtctaatgccaaggcaaatagccactatttgtatagacacaaatatgaaaactataggatgatcaaaaaatcaggtgaatcATATCCTGTGCATTTCAAAA；

测序引物3是SEQ ID NO.11所示序列：TTTTGAAATGCACAGGATAT。

2238位G→A突变位点

PCR扩增引物：SEQ ID NO.1～2所示的序列(引物对A)，同2156位扩增引物；

扩增产物：SEQ ID NO.12～13所示的序列(879bp)，同2156位A→G扩增产物

ACCAGGAGAGAAGACAGAAGttgatggaggaaattcgtgaattgaaagaacttcaggatgaaggaagaagtgcacgattacagtgtcctcagtgtgtgtttggtaccaattgccctaaaacatttgtgcaacatgctaaaacccatgaaaaagataaaaggtactactgctgtgaagagtgtaacttcatggcagtgacagaaaatgaattggaatgccatcgaggcattgcacatggggcagtggtaaaatgccctatggtcacttctgatattgcccagagaaaaacacaaaaaaagactttcatgaaagactctgtagtaggatcatccaaaaaatcagctacctacAtatgtaagatgtgtccttttactacttcagccaaaagtgttttaaaaaagcacacggagtacttgcattcatcatcatgtgttgattcatttggtagtcctcttggacttgataaaagaaaaaatgacatccttgaagaacctgtagatagtgatagcactaaaacattaactaaacaacagtcaaccacatttccaaagaactctgctttaaaacaagatgtgaagcgaacatttggatcaacctcacaatcaagtagtttttcaaaaattcataagCggccacacagaatacagaaagctcggaaaagcattgcccaatcaggtgtaaacatgtG/AcaatcaaaacagctctcctcataagaatgttacaattaaaagcagcgttgaccaaaaacctaagtatttccatcaagcagcaaaagaaaagtctaatgccaaggcaaatagccactatttgtatagacacaaatatgaaaactataggatgatcaaaaaatcaggtgaatcATATCCTGTGCATTTCAAAA；

测序引物3是SEQ ID NO.11所示序列：TTTTGAAATGCACAGGATAT，同2180位G→A的测序引物。

4138位的C→G突变位点：

PCR扩增引物：SEQ ID NO.14～15所示序列(引物对B)，其上游引物：TGAATTGGGAGTTTTGATGT，下游引物：CCCATTTTCCTGCTTTAGTA；

所得到的扩增产物的序列：SEQ ID NO.16～17所示的序列(470bp)：

TGAATTGGGAGTTTTGATGTtttattaaatcatttgactttagaaactttatcaattgctgtctttaaaatatgataaagtttattccttatgttttaggattttgtgtgaattagttttaaagaaagagaattggtcatgttaagagaattgttatctttctgtaggttttgtggcctagtctttcgaggacccttgtctgttcaggaagactggattaagcacttacaacgacatattgtaaacgctaatcttccacggactggagctggcatggtggaagtcacgtcactacttaaaaagcctgcctccattacagaaacttcattttctctactaatggccgaagcagcttcatagaaccaggaaacC/GttttaaatagccagtttgaattggatgtaaatttgaaattctttttttttaagccacattaaattatctgtttataaaTACTAAAGCAGGAAAATGGG

测序引物4是SEQ ID NO.18所示序列：TGAATTGGGAGTTTTGATGT。

4718位的G→A突变位点：

PCR扩增引物：SEQ ID NO.19～20所示序列(引物对C)，其上游引物：CCCCACAAGACTTGCATAGA，下游引物：CCTGTCCTGTAAGCATGTCA；

所得到的扩增产物的序列：SEQ ID NO.21～22所示的序列(517bp)：CCCCACAAGACTTGCATAGAaaaataagatattatattttgtttgtatgtatttagtgttttgtataataccaagaaccgctgactaaatttactcaaattagggcattaaatatcatgtacttcatagtttgagactgttcactcaaatagggcagagtactattctatctagatgtgtaagtgttttttttaaaatcacatggaacggttttttttatactaaaaagtgG/AagggagatttgtttaaacaagtatttctaaaagaaatatgtacatagttctggaaattatttgtggtaaggaaatattctttactccagttgcatttctcagacaataaagtggtgcatccatgctacctcctactttgtcaacaaagatgctatttaccctttacatttttgtatcataatagattttaaaaatctaatgttctttattgcaagacattcttttgttaacaggtttgtttctttttaatgttttacctaaaattTGACATGCTTACAGGACAGG

测序引物5是SEQ ID NO.23所示序列：CCCCACAAGACTTGCATAGA。

二、检测结果

1901位A→G突变、2180位C→G突变、2238位G→A突变、4138位C→G突变和4718位G→A突变的测序图谱依次如图4、5、6、7和8所示。图9为散发高度近视患者的临床眼底照片，根据上述图4～图9和待检样本的基本情况绘制表3：

表3携带有ZNF644基因突变的高度近视患者基本情况

注：CA，脉络膜血管萎缩；CNV，脉络膜新生血管；3’UTR，3’末端非翻译区。

如表3所示，检结果显示，11例散发高度近视患者的ZNF644基因存在基因位点突变，突变分别为1901位A→G变异杂合子，2180位C→G变异杂合子，2238位G→A变异杂合子，4138位C→G变异杂合子，4718位G→A变异杂合子，而600例正常对照的ZNF644基因5个位点均未突变。

实验证明，待检人群ZNF644基因中1901位的A→G变异、2180位的C→G变异、2238位的G→A变异，4138位的C→G变异或者4718位的G→A变异与其患高度近视的风险高低紧密相关。

实施例4ZNF644基因的基因序列及其在人体组织中的表达情况分析

1、ZNF644基因，大小为5648bp，其基因序列如下：

CTGGAGGCGA AAAGCGGGGA GCGGAGGGGG GCCGCTGGAG CCGAGTAGCG   50

TACAGAGCGG CGTGTGACGC GGGGACGCCG CGTGCTCCCA ACGTCGCCCC  100

GGTTTGACGC ACACGGCACC AAACTGTTTG ATTTAATTTT GGATGAGATC   150

GTTCTTGCAG CAAGATGTTA ATAAGACAAA ATCTAGACTA AATGTGTTAA   200

ATGGGCTTGC CAACAATATG GATGATTTGA AGATAAACAC CGATATTACT   250

GGTGCTAAAG AAGAACTCCT AGATGACAAC AATTTTATCT CAGACAAAGA   300

GAGCGGAGTT CATAAGCCAA AAGATTGTCA AACATCATTT CAGAAAAATA   350

ATACGTTGAC TCTGCCTGAA GAACTGTCAA AGGACAAATC TGAAAACGCC   400

TTAAGTGGAG GCCAGTCTAG TCTATTTATA CATGCTGGTG CTCCTACTGT   450

TTCTAGTGAA AACTTTATCT TGCCTAAAGG AGCTGCTGTT AATGGACCAG   500

TTTCACACTC CTCCTTAACT AAGACTTCCA ATATGAATAA AGGCAGTGTT   550

TCATTAACCA CTGGACAGCC TGTGGATCAG CCAACAACAG AATCTTGTTC   600

AACTTTGAAG GTAGCAGCTG ATCTTCAGCT GTCTACACCA CAGAAAGCAA   650

GTCAACACCA AGTTTTATTT TTGTTATCAG ATGTAGCACA TGCTAAGAAT   700

CCCACCCATT CCAATAAAAA ACTACCTACC TCTGCTTCAG TTGGTTGTGA   750

CATTCAGAAT TCAGTAGGGA GTAATATAAA GTCAGATGGC ACTTTAATAA   800

ATCAAGTAGA GGTGGGTGAG GATGGTGAAG ATTTATTGGT GAAAGATGAT   850

TGTGTCAATA CAGTAACGGG AATTTCCTCA GGTACAGATG GATTTAGGTC   900

AGAAAATGAT ACAAACTGGG ATCCCCAAAA AGAGTTCATT CAATTTCTTA   950

TGACTAATGA GGAAACAGTA GATAAAGCTC CACCTCATTC TAAAATAGGT  1000

CTAGAAAAAA AAAGAAAGCG AAAAATGGAT GTAAGCAAGA TAACTCGTTA  1050

TACCGAGGAT TGCTTTAGTG ATTCTAATTG TGTACCCAAT AAATCAAAAA  1100

TGCAAGAAGT AGACTTTCTA GAACAAAATG AAGAGCTACA AGCAGTAGAC  1150

TCACAGAAAT ATGCATTATC AAAAGTGAAG CCTGAATCAA CTGATGAAGA  1200

CTTAGAATCT GTGGATGCCT TCCAACATCT AATTTATAAC CCAGATAAGT  1250

GTGGAGAAGA GAGTTCACCT GTTCATACTA GCACTTTTCT TTCAAATACC  1300

TTAAAAAAGA AATGTGAAGA GAGTGATTCT GAGTCACCTG CTACTTTCAG  1350

TACCGAAGAG CCATCATTCT ACCCCTGTAC AAAGTGCAAT GTGAATTTTA  1400

GGGAGAAGAA GCACCTCCAC AGGCATATGA TGTATCATTT AGATGGGAAT  1450

AGTCACTTTC GCCATCTTAA TGTCCCAAGG CCATATGCTT GTAGAGAATG  1500

TGGACGGACA TTTCGAGATC GCAATTCACT TCTAAAACAT ATGATTATTC  1550

ACCAGGAGAG AAGACAGAAG TTGATGGAGG AAATTCGTGA ATTGAAAGAA  1600

CTTCAGGATG AAGGAAGAAG TGCACGATTA CAGTGTCCTC AGTGTGTGTT  1650

TGGTACCAAT TGCCCTAAAA CATTTGTGCA ACATGCTAAA ACCCATGAAA  1700

AAGATAAAAG GTACTACTGC TGTGAAGAGT GTAACTTCAT GGCAGTGACA  1750

GAAAATGAAT TGGAATGCCA TCGAGGCATT GCACATGGGG CAGTGGTAAA  1800

ATGCCCTATG GTCACTTCTG ATATTGCCCA GAGAAAAACA CAAAAAAAGA  1850

CTTTCATGAA AGACTCTGTA GTAGGATCAT CCAAAAAATC AGCTACCTAC  1900

TATGTAAGA TGTGTCCTTT TACTACTTCA GCCAAAAGTG TTTTAAAAAA  1950

GCACACGGAG TACTTGCATT CATCATCATG TGTTGATTCA TTTGGTAGTC  2000

CTCTTGGACT TGATAAAAGA AAAAATGACA TCCTTGAAGA ACCTGTAGAT  2050

AGTGATAGCA CTAAAACATT AACTAAACAA CAGTCAACCA CATTTCCAAA  2100

GAACTCTGCT TTAAAACAAG ATGTGAAGCG AACATTTGGA TCAACCTCAC  2150

AATCAGTAG TTTTTCAAAA ATTCATAAGGGCCACACAG AATACAGAAA  2200

GCTCGGAAAA GCATTGCCCA ATCAGGTGTA AACATGT

CA ATCAAAACAG  2250

CTCTCCTCAT AAGAATGTTA CAATTAAAAG CAGCGTTGAC CAAAAACCTA  2300

AGTATTTCCA TCAAGCAGCA AAAGAAAAGT CTAATGCCAA GGCAAATAGC  2350

CACTATTTGT ATAGACACAA ATATGAAAAC TATAGGATGA TCAAAAAATC  2400

AGGTGAATCA TATCCTGTGC ATTTCAAAAA AGAAGAAGCT AGTTCATTAA  2450

ATTCTTTACA CCTGTTTTCA TCATCAAGTA ATTCTCACAA CAATTTTATT  2500

TCAGACCCTC ATAAGCCTGA CGCCAAAAGG CCTGAAAGCT TCAAAGATCA  2550

CAGACGTGTA GCTGTAAAGA GAGTAATTAA GGAATCTAAG AAGGAAAGTT  2600

CTGTTGGAGG GGAAGACTTG GATAGCTATC CAGATTTTTT GCATAAAATG  2650

ACTGTTGTCG TTTTGCAAAA ACTTAATTCT GCTGAAAAGA AAGATAGTTA  2700

TGAAACAGAA GATGAAAGTT CCTGGGATAA TGTTGAGTTA GGAGACTACA  2750

CTACACAGGC CATAGAAGAT GAAACCTATA GTGATATTAA TCAAGAGCAT  2800

GTAAATTTAT TCCCTTTATT TAAGAGCAAA GTGGAAGGTC AGGAGCCTGG  2850

AGAAAATGCT ACTCTTAGTT ATGACCAAAA CGATGGCTTT TATTTTGAAT  2900

ACTATGAAGA TACTGGAAGT AACAACTTTT TGCATGAGAT ACATGATCCT  2950

CAGCATTTAG AAACTGCAGA TGCTTCATTG TCAAAGCATA GTTCTGTTTT  3000

TCATTGGACT GATTTGTCTC TTGAGAAGAA ATCGTGTCCT TACTGCCCAG  3050

CAACATTTGA AACAGGTGTT GGGTTATCAA ATCATGTCAG GGGGCATCTT  3100

CACAGAGCAG GATTAAGCTA TGAAGCCCGT CATGTTGTAT CACCAGAACA  3150

AATAGCCACA AGTGACAAAA TGCAGCATTT CAAAAGAACT GGCACAGGAA  3200

CACCTGTTAA ACGAGTTAGA AAAGCTATAG AGAAGTCTGA AACCACTTCT  3250

GAACACACTT GTCAGCTCTG TGGTGGTTGG TTTGATACTA AAATTGGATT  3300

ATCAAATCAT GTTAGAGGCC ACTTGAAAAG ACTTGGAAAG ACGAAATGGG  3350

ATGCTCACAA ATCTCCAATC TGTGTTCTGA ATGAGATGAT GCAAAATGAA  3400

GAAAAATATG AAAAAATCTT AAAGGCATTG AACAGTCGTC GTATTATTCC  3450

CAGACCATTT GTAGCTCAAA AACTTGCATC AAGTGATGAC TTTATATCTC  3500

AAAATGTTAT ACCTCTTGAA GCATACCGTA ATGGCCTAAA GACTGAAGCT  3550

CTGTCAGTGT CTGCATCAGA AGAAGAAGGG CTGAATTTCT TAAATGAATA  3600

TGATGAAACA AAACCAGAAC TGCCCAGTGG GAAAAAGAAT CAGTCTCTTA  3650

CACTCATAGA ACTTCTTAAA AATAAAAGGA TGGGAGAAGA AAGGAATTCT  3700

GCTATTTCTC CTCAAAAGAT CCATAATCAG ACAGCAAGAA AGAGATTCGT  3750

TCAGAAATGC GTTCTTCCAT TAAATGAGGA TAGTCCGTTG ATGTATCAGC  3800

CACAAAAAAT GGACTTGACT ATGCACTCAG CCTTAGATTG TAAGCAAAAG  3850

AAATCAAGGT CAAGATCTGG AAGCAAGAAG AAAATGCTAA CATTACCTCA  3900

TGGTGCTGAC GAGGTTTACA TTCTCCGATG CAGGTTTTGT GGCCTAGTCT  3950

TTCGAGGACC CTTGTCTGTT CAGGAAGACT GGATTAAGCA CTTACAACGA  4000

CATATTGTAA ACGCTAATCT TCCACGGACT GGAGCTGGCA TGGTGGAAGT  4050

CACGTCACTA CTTAAAAAGC CTGCCTCCAT TACAGAAACT TCATTTTCTC  4100

TACTAATGGC CGAAGCAGCT TCATAGAACC AGGAAAC

TT TTAAATAGCC  4150

AGTTTGAATT GGATGTAAAT TTGAAATTCT TTTTTTTTAA GCCACATTAA  4200

ATTATCTGTT TATAAATACT AAAGCAGGAA AATGGGGGGA AAGTGAATTA  4250

CAGTGACATC AGAGCAAATT GAATACTTAA AACAGTAAGT AGTCTATATA  4300

TTTTATATAG GGTGGAAGAT GTGTTTTTAA GGTTTATGAA GTTTTGTTGG  4350

TTAACTGTGT TCACTCAGTA AAAGAGCAGT ACATGTAAGC AGCCATTAAT  4400

AAACTGTTGC ACATGGATAC TTATAGACAG ACTTATTGGA CAATTATGTT  4450

TTTTGCAGTG TTACCAGAAT CAAGGCTCTG TTTATTCCCC ACAAGACTTG  4500

CATAGAAAAA TAAGATATTA TATTTTGTTT GTATGTATTT AGTGTTTTGT  4550

ATAATACCAA GAACCGCTGA CTAAATTTAC TCAAATTAGG GCATTAAATA  4600

TCATGTACTT CATAGTTTGA GACTGTTCAC TCAAATAGGG CAGAGTACTA  4650

TTCTATCTAG ATGTGTAAGT GTTTTTTTTA AAATCACATG GAACGGTTTT  4700

TTTTATACTA AAAAGTG

AG GGAGATTTGT TTAAACAAGT ATTTCTAAAA  4750

GAAATATGTA CATAGTTCTG GAAATTATTT GTGGTAAGGA AATATTCTTT  4800

ACTCCAGTTG CATTTCTCAG ACAATAAAGT GGTGCATCCA TGCTACCTCC  4850

TACTTTGTCA ACAAAGATGC TATTTACCCT TTACATTTTT GTATCATAAT  4900

AGATTTTAAA AATCTAATGT TCTTTATTGC AAGACATTCT TTTGTTAACA  4950

GGTTTGTTTC TTTTTAATGT TTTACCTAAA ATTTGACATG CTTACAGGAC  5000

AGGTTTGCCT CTTACTTTAT TTAACATTGT AGAAATGTAA TTAATAAACA  5050

ATGCTCACTA CACAGTTTAG AATAGACGTT CTCATTTATA TTATCTTCCA  5100

AATTTGATCA GTTAGCAAAA CTTAATACAC CAATTAAAAT ATTTCTACAT  5150

ATGAGAATGT TTACAATTTA AATTTTAGAA CTTGTTTTGG ATGTGATTAT  5200

ATGTACGAAA ATCGTGTAAC ACTATGCTCA TGCTAAGAAC CGACATAACA  5250

GAATTACTGA AATAAATGTG CTGTGAGGAA TGGAAAATAT GGTGCAGGTG  5300

TCTTGGTCAT GATAAATTGT GATTCTTTTT AAAAATTTTT TCCAAAAACA  5350

ATTAGGTATT TTAATCTGAA ATCAGATTCC TTTACAAACA ACAAGTTTTT  5400

GTATGCAAGC ACCATTTTAT TTCATGTAGT ATGGCTAATA CTATAGTTGA  5450

ACCAAGGATA TGCATTGATT CTTTGCTTCG TATGTAAATA AAGTTAAAAA  5500

CAGTTAAAAT AAGGAGTATT TTGGTAGAGT ATATACATAC CTCACTGCCA  5550

GTGAAATTGC TTTCCTATGG TATATCTCCT TACCAGAAAA ATCTCTAAAT  5600

AAAAAAAGGT TTAAAGAAAA TTAAAAaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaa

序列中的加粗斜体碱基表示发生突变的6个碱基位置及变异，1901位A→G，2156位A→G，2180位C→G和2238位G→A这四个突变位于第3号外显子；而4138位C→G和4718位G→A这两个突变位于第6号外显子。

其中1901位A→G，2156位A→G，2180位C→G和2238位G→A这四个突变会导致该基因编码的蛋白质分子序列发生改变，依次为：587位I→V(异亮氨酸→缬氨酸)，672位S→G(丝氨酸→甘氨酸)，680位R→G(精氨酸→甘氨酸)，699位C→Y(半胱氨酸→酪氨酸)。

2、基因(ZNF644)编码蛋白质分子，长度为1328个氨基酸，其氨基酸序列如下所示：

MRSFLQQDVNKTKSRLNVLNGLANNMDDLKINTDITGAKEELLDDNNFISDKESGVHKPKDCQTSFQKNNTLTLPEELSKDKSENALSGGQSSLFIHAGAPTVSSENFILPKGAAVNGPVSHSSLTKTSNMNKGSVSLTTGQPVDQPTTESCSTLKVAADLQLSTPQKASQHQVLFLLSDVAHAKNPTHSNKKLPTSASVGCDIQNSVGSNIKSDGTLINQVEVGEDGEDLLVKDDCVNTVTGISSGTDGFRSENDTNWDPQKEFIQFLMTNEETVDKAPPHSKIGLEKKRKRKMDVSKITRYTEDCFSDSNCVPNKSKMQEVDFLEQNEELQAVDSQKYALSKVKPESTDEDLESVDAFQHLIYNPDKCGEESSPVHTSTFLSNTLKKKCEESDSESPATFSTEEPSFYPCTKCNVNFREKKHLHRHMMYHLDGNSHFRHLNVPRPYACRECGRTFRDRNSLLKHMIIHQERRQKLMEEIRELKELQDEGRSARLQCPQCVFGTNCPKTFVQHAKTHEKDKRYYCCEECNFMAVTENELECHRGIAHGAVVKCPMVTSDIAQRKTQKKTFMKDSVVGSSKKSATY

CKMCPFTTSAKSVLKKHTEYLHSSSCVDSFGSPLGLDKRKNDILEEPVDSDSTKTLTKQQSTTFPKNSALKQDVKRTFGSTSQSSFSKIHK

PHRIQKARKSIAQSGVNM

NQNSSPHKNVTIKSSVDQKPKYFHQAAKEKSNAKANSHYLYRHKYENYRMIKKSGESYPVHFKKEEASSLNSLHLFSSSSNSHNNFISDPHKPDAKRPESFKDHRRVAVKRVIKESKKESSVGGEDLDSYPDFLHKMTVVVLQKLNSAEKKDSYETEDESSWDNVELGDYTTQAIEDETYSDINQEHVNLFPLFKSKVEGQEPGENATLSYDQNDGFYFEYYEDTGSNNFLHEIHDPQHLETADASLSKHSSVFHWTDLSLEKKSCPYCPATFETGVGLSNHVRGHLHRAGLSYEARHVVSPEQIATSDKMQHFKRTGTGTPVKRVRKAIEKSETTSEHTCQLCGGWFDTKIGLSNHVRGHLKRLGKTKWDAHKSPICVLNEMMQNEEKYEKILKALNSRRIIPRPFVAQKLASSDDFISQNVIPLEAYRNGLKTEALSVSASEEEGLNFLNEYDETKPELPSGKKNQSLTLIELLKNKRMGEERNSAISPQKIHNQTARKRFVQKCVLPLNEDSPLMYQPQKMDLTMHSALDCKQKKSRSRSGSKKKMLTLPHGADEVYILRCRFCGLVFRGPLSVQEDWIKHLQRHIVNANLPRTGAGMVEVTSLLKKPASITETSFSL

序列中的加粗斜体碱基表示发生突变的4个氨基酸位置及变异，587位变异为I→V(异亮氨酸→缬氨酸)，672位变异为S→G(丝氨酸→甘氨酸)，680位变异为R→G(精氨酸→甘氨酸)，699位变异为C→Y(半胱氨酸→酪氨酸)。

3、利用RT-PCR的方法对ZNF644基因在人肝组织、胎盘、视网膜、视网膜色素上皮细胞中的表达情况进行检测。RNA提取采用Invitrogen公司的trizol RNA提取试剂盒，按照说明书进行操作。RT-PCR采用伯乐(Bio-rad)公司的试剂盒，管家基因-GAPDH作为内参，按照说明书进行操作。结果如图10所示。

从图10中可以看出，ZNF644基因在人体肝组织、胎盘、视网膜、视网膜色素上皮细胞中均有表达，可以通过检测上述组织中ZNF644基因表达产物的氨基酸变异，确定待检样本患高度近视的风险。

实施例5检测试剂盒

本发明试剂盒中的全部组分、含量和使用方法如下：

一、试剂盒的组成

PCR扩增试剂(50人份)：

纯化用试剂(50人份)

测序用试剂(50人份)

标准DNA样品(50人份)

二、试剂盒使用方法

1)DNA提取

取患者全血(EDTA抗凝)2ml，提取其基因组DNA。

2)通过PCR扩增含有所检测的SNP位点的DNA片段

PCR扩增(20μl体系)

反应条件：95℃变性5分钟；95℃30秒、52℃退火30秒、72℃延伸1分钟，35个循环；72℃延伸7分钟，12℃保温。

PCR产物检测：用2％的琼脂糖凝胶电泳检测PCR产物，观察PCR反应的效果，并确定其作为模板在后续反应中加入的量。

3)测序检测

①PCR产物纯化：

取步骤2)的PCR产物5μl，加入上述纯化液中。

反应条件：37℃20分钟，75℃15分钟，12℃保温。

②测序反应：

以步骤①的产物为模板，用上表所述试剂测序。

反应条件：96℃15秒，50℃10秒，60℃4分钟，30个循环；12℃保温。

③测序反应产物纯化：每个反应加入70％乙醇25μl，避光静置15分钟，4000转/分钟离心30分钟，吸弃上清液，沉淀静置20分钟晾干，加入9μl上机缓冲液溶解，上机测序。

④上机测序分析：采用ABI 3130XL测序仪进行测序分析。

本试剂盒用于：1、病理性近视患者的早期诊断和分型参考；2、病理性近视易感人群的基因检测和风险评估。

1)本发明的检测方法可用于分析ZNF644基因1901位，2156位，2180位，2238位，4138位，4718位六个SNP位点的多态性，应用在对高度近视的辅助性诊断和对个体患高度近视的风险进行评估，以利于开展高度近视的早期干预和治疗。

2)利用本发明阐述的高度近视易感基因/位点的多态性，作为生物标志物之一，可用作药物设计的分子靶标的筛选，以帮助寻找具有调节这些基因表达的活性分子，促进新药开发。

3)本发明建立的检测SNP位点多态性的核酸序列和高度近视相关基因/位点，可高灵敏度、特异性地应用于病理性近视基因诊断用的试剂盒。

综上，ZNF644基因1901位，2156位，2180位，2238位，4138位，4718位六个SNP位点的多态性与高度近视的相关性显著，测定其多态性可用于进行基因诊断。本发明提供了这些位点在制备用于高度近视筛查试剂中的应用以及包含这些试剂的试剂盒，本发明试剂盒灵敏度高，只需要少量DNA样品就足以测定所述位点的变异，达到早期筛查的目的，具有良好的市场应用前景。

Claims (16)

1.一种检测高度近视的试剂盒，其特征在于：包括任选的用于检测ZNF644基因1901位，2156位，2180位，2238位，4138位，4718位中的一个或者多个位点变异的试剂。

2.根据权利要求1所述的试剂盒，其特征在于：所述的1901位变异为A→G变异，2156位变异为A→G变异，2180位变异为C→G变异，2238位变异为G→A变异，4138位变异为C→G变异，4718位为G→A变异。

3.根据权利要求1所述的试剂盒，其特征在于：所述的试剂为测序用试剂、限制性内切酶酶切方法用试剂、限制性片段长度多态方法用试剂、Snapshot用试剂或者基因芯片用试剂。

4.根据权利要求3所述的试剂盒，其特征在于：所述的测序用试剂包括：

引物1：ACCAGGAGAGAAGACAGAAG；

和/或引物2：CCCTATGGTCACTTCTGATA；

和/或引物3：TTTTGAAATGCACAGGATAT；

和/或引物4：TGAATTGGGAGTTTTGATGT；

和/或引物5：CCCCACAAGACTTGCATAGA。

5.根据权利要求1所述的试剂盒，其特征在于：还包括任选的用于扩增包含ZNF644基因1901位，2156位，2180位，2238位，4138位，4718位中的一个或者多个基因位点的基因片段的试剂。

6.根据权利要求5所述的试剂盒，其特征在于：所述的用于扩增的试剂包括：

引物对A：

上游引物：ACCAGGAGAGAAGACAGAAG

下游引物：TTTTGAAATGCACAGGATAT；

和/或引物对B：

上游引物：TGAATTGGGAGTTTTGATGT

下游引物：CCCATTTTCCTGCTTTAGTA；

和/或引物对C：

上游引物：CCCCACAAGACTTGCATAGA

下游引物：CCTGTCCTGTAAGCATGTCA。

7.一种检测高度近视的试剂盒，其特征在于：包括任选的用于检测ZNF644基因编码的蛋白质的第587位变异、第672位变异、第680位变异、第699位变异中的一个或者多个氨基酸变异的试剂。

8.根据权利要求7所述的试剂盒，其特征在于：所述的第587位变异是第587位I→V变异，第672位变异是672位S→G变异，第680位变异是680位R→G变异，第699位变异是699位C→Y变异。

9.ZNF644基因1901位，2156位，2180位，2238位，4138位，4718位中的一个或者多个基因位点变异在制备检测高度近视的试剂中的用途。

10.根据权利要求9所述的用途，其特征在于：所述的1901位变异为A→G变异，2156位变异为A→G变异，2180位变异为C→G变异，2238位变异为G→A变异，4138位变异为C→G变异，4718位为G→A变异。

11.根据权利要求10所述的用途，其特征在于：所述的试剂为测序用试剂、限制性内切酶酶切方法用试剂、限制性片段长度多态方法用试剂、Snapshot用试剂或者基因芯片用试剂。

12.根据权利要求11所述的用途，其特征在于：所述的测序用试剂包括

引物1：ACCAGGAGAGAAGACAGAAG；

和/或引物2：CCCTATGGTCACTTCTGATA；

和/或引物3：TTTTGAAATGCACAGGATAT；

和/或引物4：TGAATTGGGAGTTTTGATGT

和/或引物5：CCCCACAAGACTTGCATAGA。

13.根据权利要求9所述的用途，其特征在于：还包括任选的用于扩增包含ZNF644基因1901位，2156位，2180位，2238位，4138位，4718位中的一个或者多个基因位点的基因片段的试剂。

14.根据权利要求13所述的用途，其特征在于：所述的用于扩增的试剂包括：

引物对A：

上游引物：ACCAGGAGAGAAGACAGAAG

下游引物：TTTTGAAATGCACAGGATAT；

和/或引物对B：

上游引物：TGAATTGGGAGTTTTGATGT

下游引物：CCCATTTTCCTGCTTTAGTA；

和/或引物对C：

上游引物：CCCCACAAGACTTGCATAGA

下游引物：CCTGTCCTGTAAGCATGTCA。

15.ZNF644基因编码的蛋白质的第587位变异、第672位变异、第680位变异、第699位变异中的一个或者多个氨基酸变异在制备检测高度近视的试剂中的用途。

16.根据权利要求15所述的用途，其特征在于：所述的第587位变异是第587位I→V变异，第672位变异是672位S→G变异，第680位变异是680位R→G变异，第699位变异是699位C→Y变异。

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