CN102732562A

CN102732562A - 抑制cyp2c8基因表达的方法

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Publication number: CN102732562A
Application number: CN2012102158449A
Authority: CN
Inventors: 倪兵; 黄泽民; 吴玉章; 唐艳; 田志强; 田易; 张轶; 倪东京
Original assignee: Third Military Medical University TMMU
Current assignee: Third Military Medical University TMMU
Priority date: 2012-06-27
Filing date: 2012-06-27
Publication date: 2012-10-17

Abstract

本发明涉及基因领域，特别涉及抑制CYP2C8基因表达的方法，具体为：将RIP140的siRNA转染入靶细胞中，所述RIP140的干扰片段如SEQ ID NO：1、SEQ ID NO：2和SEQ ID NO：3中任一所示，所述RIP140的核苷酸序列如SEQ IDNO：10所示；本发明证实：RIP140和HSP90蛋白是真正的RORγ相互作用蛋白，进一步通过RNA干扰证实RIP140和HSP90蛋白能上调RORγ介导的CYP2C8基因的表达。这些结果支持了RORγ与其相互作用蛋白结合形成复合体，进而发挥转录下游靶基因的作用。

Description

抑制CYP2C8基因表达的方法

技术领域

本发明属于蛋白质和基因领域，特别涉及CYP2C8基因的调控。

背景技术

RORγ高表达于肝脏脂肪组织、心脏和骨骼肌，在发育、免疫和代谢过程中发挥重要的作用。除了在脂类和类固醇等代谢途径中起重要调节作用外，在肝脏RORγ通过结合到CYP2C8启动子上其特异性原件RORE上，进而激活CYP2C8基因的转录，并最终调控许多当前正在临床使用药物的代谢。

细胞功能几乎总是生物大分子在组装和通路上协同作用的结果，而蛋白复合物是乱中有序的动态结构，能将生物信息变成细胞的功能。已经发现了一些内源性或合成的RORγ配体，比如7-oxygenated sterol、SR1078、T0901317和24S-OHC，这些配体经证实都能调节RORγ的转录活性；Mi-2β是唯一与RORγ相互作用进而发挥抑制作用的蛋白。是否还存在其他相互作用蛋白且参与调控CYP2C8基因的表达至今未有报道，

发明内容

本发明的目的之一在于提供提供一种抑制CYP2C8基因表达的方法，以及RIP140基因和HSP90的新应用，该方法和新应用为临床用药的作用靶标提供了新的思路。

为实现上述目的，本发明的技术方案为：

抑制CYP2C8基因表达的方法，将RIP140的siRNA转染入靶细胞I中，所述RIP140的干扰片段如SEQID NO：1、SEQ ID NO：2和SEQ ID NO：3中任一所示。所述RIP140的核苷酸序列如NCBI Reference Sequence：NM 003489.3

进一步，将HSP90的siRNA转染入靶细胞II中，所述RIP140的干扰片段如SEQ ID NO：4、SEQ ID NO：5或SEQ ID NO：6中任一所示，所述HSP90的核苷酸序列如NCBI Reference Sequence：NP 031381.2。

进一步，所述靶细胞为HepG2细胞。

进一步，所述方法还包括阳性对照组，所述阳性对照组具体为：将RORγ的siRNA转染入HepG2细胞中，所述RIP140的干扰片段如SEQ ID NO：7、SEQ IDNO：8或SEQ ID NO：9中任一所示，所述ROR γ的核苷酸序列如NCBI ReferenceSequence：NM_005060.3。

进一步，在转染HepG2细胞后，还包括鉴定步骤，具体为：

1)提取未转染siRNA的HepG2细胞中的总RNA，再逆转录成cDNA为模板；以CYP2C8基因特异Q-PCR引物，进行PCR扩增；同时以人管家基因GAPDH作为参照物，进行相对定量分析；

2)用双Delta法进行相对定量分析，其计算公式为：

其中，对照组目的基因指未转染的HepG2细胞样品，实验组目的基因指CYP2C8，管家基因指GAPDH基因。

进一步，所述CYP2C8基因特异Q-PCR引物，其上游引物为5’-agatcagaattttctcaccc-3’，其下游引物为：5’-aacttcgtgtaagagcaaca-3’。

进一步，步骤1)中，PCR扩增条件为：95℃，5秒；57.5℃，15秒；72℃，20秒；80℃，5秒；40个循环。

RIP140基因和/或HSP90在制备CYP2C8基因的介导基因中的应用。

本发明的有益效果在于：本发明用免疫共沉淀方法鉴定了TAP/MS策略获得的7个候选蛋白中只有RIP140和HSP90蛋白是真正的RORγ相互作用蛋白，并进一步通过RNA干扰证实RIP140和HSP90蛋白能上调RORγ介导的CYP2C8基因的表达。这些结果支持了RORγ与其相互作用蛋白结合形成复合体，进而发挥转录下游靶基因的作用。HSP90可能作为分子伴侣通过结合到RORγ蛋白上，帮助RORγ蛋白在肝脏代谢和其他生物活动中执行调节作用，而RIP140在HepG2细胞中则可能充当RORγ蛋白的转录辅活化因子。在某些病理条件下，对获得的RORγ相互作用蛋白进行干扰或过表达，有可能成为临床用药的作用靶标，具有良好的推广应用价值。

附图说明

图1为质谱测得的RIP140(上)和HSP90(下)蛋白m/z图谱。

图2为co-IP对候选RORγ相互作用蛋白的验证。

图3为针对RORγ、RIP140和HSP90基因各设计3个siRNA分子，转染HepG2细胞后通过蛋白印迹分析检测的各siRNA分子对靶基因RORγ、RIP140和HSP90的抑制情况，C：HepG2细胞(-)；NC：irrelevant siRNA as negtive control；#1，#2，和#3：分别代表RORγ、RIP140和HSP90基因对应的3个siRNA双链；tubulin：为核蛋白表达内参对照。

图4为当RIP140或/和HSP90的表达被抑制后，对CYP2C8基因mRNA水平的表达影响的分析图。

具体实施方式

试剂配制

1.5×裂解缓冲液(200ml)：250mM Tris pH7.5，25％甘油，1％NP40，7.5mM氯化镁，625mM氯化钠，125mM氟化钠，5mM钒酸钠。先在71ml超纯水中溶解氟化钠和钒酸钠，然后再溶解除了甘油外的其他试剂。然后每支50ml容量的塑料试管盛装10ml该缓冲液置于-80℃保存。使用前，加超纯水到50ml，加入蛋白酶抑制剂，1mM DTT。

2.10×TEV酶切缓冲液：100mM Tris pH7.5，1M氯化钠，1％NP40，5mM EDTA。过滤，保存于4℃冰箱。使用前，加1mM DTT。

大规模扩增细胞

第1天，细胞复苏后培养于2只100mm培养皿中；第3天，培养的细胞更换新鲜完全培养基。在换液过程中，首先洗弃旧培养，接着用滴管吸取预孵热的PBS轻轻冲刷细胞表面，去掉结合不牢的细胞及其他残渣，最后加入新鲜的完全培养基；第4天，将2只100mm培养皿中的细胞传代至8只100mm培养皿中；第6天，8只培养皿中的细胞换液。同样用PBS冲刷残渣；第7天，将8只100mm培养皿中的细胞传代至32只100mm培养皿中；第10天准备收获细胞，可以获得总量6×10⁸个细胞。

裂解细胞

1)准备细胞裂解液：融解5×裂解缓冲液，加4倍体积的超纯水使裂解液稀释成1×裂解缓冲液。加入终浓度为1mM DTT到1×裂解缓冲液中，同时加入蛋白酶抑制剂药片，4℃旋转混匀；2)经过大规模扩增并收获的细胞，每2×10⁸个细胞给予10ml 1×裂解缓冲液，用滴管吹吸轻柔混匀；3)冰上孵育30min，间或用滴管吹吸轻柔混匀；4)20000g离心20min；5)上清即为裂解的总蛋白，冰上小心吸取上清到干净的50ml EP管中。如不立刻使用，液氮或-80℃中冻存，直到用TAP方法操作前取出。

串联亲和纯化

1)预冷下列试剂、材料和仪器到4℃：超速离心机，低温旋转孵育仪，足够用来洗涤IgG珠子量的5×裂解缓冲液，超纯水，超速离心管；准备4×SDS和2×SDS上样缓冲液；2)室温融解液氮中取出的细胞总蛋白，当融解到仅存少量冰冻状态的总蛋白时，将整个总蛋白置于冰上继续解冻；3)融解完全的总蛋白倒入一只30ml的超速离心管中，4℃120000g超速离心40min；4)在15ml离心管中用含1mM DTT和1mM EDTA的1×裂解缓冲液洗IgG珠子，×3次；5)离心的总蛋白加到200μl IgG琼脂糖珠子(用裂解缓冲液配成50％悬浆)中，4℃旋转结合2hr；6)300g离心3min，吸取100μl上清做后续WesternBlotting分析；7)将IgG琼脂糖珠子转移到一个小的过滤柱里。取下柱子上端塞子，接上一只10ml的注射器。往里加10ml裂解缓冲液，然后取下下端塞子，依靠重力流动排掉柱子里的缓冲液；8)用5ml的酶切缓冲液洗IgG琼脂糖珠子；9)当酶切缓冲液依靠重力流动从过滤柱中排尽后，重新合上柱子下端塞子。用400μl含有100units TEV蛋白酶的酶切缓冲液重悬IgG琼脂糖珠子。合上柱子上端的塞子，于16℃旋转结合1hr；10)在15ml离心管中用含1mM DTT的1×TAE缓冲液洗Streptavi din珠子，×3次；11)收集通过重力流动洗脱下的柱子里的液体；12)用400μl的裂解缓冲液重悬IgG琼脂糖珠子。4℃，300g离心柱子3分钟。吸取上清，和先前洗脱的液体混合。取其中20μl做后续分析；13)向上一步所得混合洗脱液中加入50μl洗过的Streptavidin珠子，4℃旋转孵育2hr；14)用10ml含1mM DTT的1×TAE缓冲液洗Streptavidin珠子，×3次；15)产物用在SDS上样缓冲液中水煮洗脱。

蛋白印迹(Western Blot)

1)胞浆蛋白和核蛋白的提取：

①胰酶消化培养的HepG2细胞，计数；②按细胞数加入预冷的CERI(含蛋白酶抑制剂)，轻柔混匀，冰浴10min；③往上步反应液中加入11μl预冷的CER II，涡旋5sec，冰浴1min；④涡旋5sec，16000g离心5min；⑤将上清(浆蛋白)迅速转移至干净的预冷的EP管中，冰浴待用或分装-80℃冻存；⑥用100μl预冷的NER重悬沉淀，涡旋15sec充分重悬沉淀，冰浴40min。每10min涡旋反应液15sec；⑦16000g离心10min；⑧上清为核蛋白，转移至预冷的EP管中，冰浴待用或分装-80℃冻存；⑨蛋白浓度检测。

2)蛋白质凝胶电泳：

①电泳凝胶为

Novex 4-12％Bis-Tris Gel；②在样品蛋白中加入上样缓冲液，水煮10min；③12000g离心5min，取上清蛋白；④在凝胶加样孔中按实验分组要求加上蛋白样品和预染分子量标准蛋白；⑤电泳。条件为：恒压200V，1小时；⑥电泳结束，卸下凝胶，用镊子撬开塑料夹板，取出凝胶；

3)电转膜：

①取出的凝胶置于电转缓冲液中平衡15min；②PVDF膜依次处理：甲醇，浸泡15sec；超纯水，漂洗3min；电转缓冲液中平衡15min；③电转“三明治”由正极向负极依次叠放顺序为：滤纸→凝胶→PVDF膜→滤纸；④电转条件：30V，1hr；⑤电转结束，取出PVDF膜，甲醇短暂漂洗后再在超纯水中漂洗1min去掉电转缓冲液。

4)封闭：PVDF膜放入塑料封闭袋中，加入封闭液(含0.05％Tween 20的Blocking Buffer)，室温摇床上缓慢孵育1.5-2hr或4℃过夜；

5)孵一抗：用封闭液按最适比例稀释一抗后，在封闭袋中对PVDF膜进行一抗结合孵育，室温2hr或或4℃过夜；

6)洗一抗：取出PVDF膜，于平皿中用TBST(含0.05％Tween20的TBS)洗涤6min/次×5次；

7)孵二抗：用封闭液按1∶20000比例稀释二抗后，在封闭袋中对PVDF膜进行二抗结合孵育，室温1hr；

8)洗二抗：取出PVDF膜，于平皿中用TBST(含0.05％Tween20的TBS)洗涤6min/次×5次；

9)显色：将结合有一抗二抗的PVDF膜置于显色底物ECL发光液中，避光孵育5min；

10)曝光：挤除发光液，在暗室内用X光片曝光。一般曝光时间点设为8sec，30sec，1min，5min等，具体曝光时间随条带的荧光强度改变；

11)显影定影：曝光过的X光片于首先置于显影液中显影2min，经过自来水充分漂洗，最后置于定影液中定影2min。自来水漂洗后，挂于通风处晾干，扫描胶片结果。

银染

1)固定：50％甲醇、5％乙酸固定20min；2)洗涤：50％甲醇洗涤10min，然后超纯水洗涤2h或O.N.；3)致敏：0.02％硫代硫酸钠致敏1min；4)洗涤：超纯水洗涤2×1min；5)银染：0.1％AgNO3(冰硝酸银溶液)4℃染色20min；6)洗涤：超纯水洗涤2×1min(第二次水洗前换盘)；7)显色：0.04％甲醛、2％Na2CO3显色；显色过程中显色液变浑浊后更换1次显色液以降低背景；8)终止：5％乙酸终止显色，中途更换液体一次。

最终的捕获产物为蛋白复合物，利用SDS-PAGE对其进行分离，电泳过程中尽可能扩大这些复合物蛋白中的各蛋白成分在凝胶上的间距。对分离后的蛋白，用银染方法在凝胶中将差异显著的蛋白条带显示出来。结果如图2-2显示，通过TAP方法捕获到HepG2细胞中8个差异显著的候选RORγ相互作用蛋白条带。

免疫共沉淀

1)正常培养的HepG2细胞用胰酶消化后，计数取5×10⁶个细胞；2)配置RIPA裂解液：往裂解液中加入蛋白酶抑制剂和磷酸酶抑制剂，使抑制剂在裂解液中完全溶解；3)冰上裂解细胞，30min，间或涡旋混匀；4)细胞裂解物4℃，10000g离心20min，取上清即为提取的总蛋白；5)BCA方法进行总蛋白定量；6)取2×500μg蛋白总量(其中一个为同型IgG对照组)，用加了各种蛋白酶抑制剂的裂解液或PBS补足到500μl，使总蛋白浓度为1μg/μl；7)结合RORγ抗体的ProteinA/G琼脂糖珠的准备：

7.1ProteinA/G琼脂糖珠洗涤

①取ProteinA/G琼脂糖珠50μl(50％悬浆)×2，用于预清除蛋白样品；

②取该琼脂糖珠90μl×2，用于结合一抗；

③每样用1ml预冷PBS洗琼脂糖珠3次：4℃旋转混合10min/次，3000g离心2min。最后一次净弃上清；

7.2结合RORγ抗体ProteinA/G琼脂糖珠的制备

①加500μl预冷PBS和5μl RORγ抗体(浓度为0.2μg/μl，每管一抗总量约0.5-2μg)到洗好的45μl ProteinA/G琼脂糖珠中，室温旋转结合1hr；

②1ml预冷PBS洗珠子4次：4℃旋转混合10min/次，接着3000g离心2min。最后一次尽弃上清；

8)总蛋白中非特异结合蛋白预清除：

①将500μl浓度为1μg/μl的总蛋白×2，加入到约22.5μL洗过的Protein A/G琼脂糖珠×2中，4℃旋转结合1小时；

②4℃，3000g离心2min，上清为预清除的总蛋白；

9)经过预清除的总蛋白溶液加入到结合RORγ抗体的ProteinA/G琼脂糖珠中，4℃旋转结合过夜。

10)1ml预冷PBS洗珠子4次：4℃旋转混合10min/次，接着3000g离心2min。

11)用干净的微量注射器彻底吸弃上清，琼脂糖珠上结合的蛋白即为RORγ抗体最终捕获的产物。

RNA干扰

1)干扰引物的设计：上海英俊生物公司设计并合成RORγ、RIP140和HSP90小干扰RNA双链，每个基因设计3个干扰片段，如下：

2)siRNA双链转染入HepG2细胞：

①转染前一天，细胞按2×10⁴个/孔接种到24孔培养板中，这样的接种密度可以保证HepG2细胞在转染时细胞有30％-40％的融合；转染方法可通过电穿孔法、磷酸钙共沉淀法、DEAE-葡聚糖和polybrene法、机械法等方法实现均可。

②按照转染试剂Lipofectamine2000说明书要求准备实验试剂的用量，如下：

培养板

表面积

培养基量

Opti-MEM

RNA

Lipo2000

24孔

2cm²

500μl

2×50μl

20pmol

1μl

③取50μl Opti-MEM缓冲液稀释20pmol siRNA双链，轻柔混合；

④再取50μl Opti-MEM缓冲液稀释1μl Lipofectamine2000，轻柔混合，室温孵育5min；

⑤将上两步Opti-MEM缓冲液稀释的siRNA双链和Lipofectamine2000置于同一Ep管中，轻柔混合，室温孵育20min；

⑥将100μl体积的转染复合物加到培养在24孔板的HepG2细胞中，来回轻柔晃动培养板使混合物均匀分布；

⑦细胞培养于含5％CO₂，37℃的孵箱中；

⑧4-6hr后，更换完全培养基；

蛋白印迹筛选优势s iRNA双链

1)转染后3天收获细胞，用含蛋白酶抑制剂的RIPA裂解液抽提干扰了相应mRNA表达的HepG2细胞；

2)测定蛋白浓度；

3)蛋白印迹检测RORγ，RIP140和HSP90表达情况；

4)具体蛋白印迹方法(同前略)。

Q-PCR

1.提取HepG2细胞中的总RNA，再用Ex Taq HS PCR试剂盒逆转录成cDNA(方法同前略)；

2.设计Q-PCR引物，原则如下：

①上、下游引物的长度最好在18bp-30bp之间；

②扩增产物长度最好在80bp-200bp之间，但最大不要超过250bp；

③Tm值在58℃-62℃之间，上、下游引物的Tm值最好相差不超过2℃；

④确保引物中GC含量在30％-80％。尽量避免引物中多个重复碱基的出现，尤其要避免4个或以上的G碱基出现。引物的3’端最好不为C或/和G，引物3’端的5个碱基不应出现2个C或/和G；

⑤尽量避免引物内出现反向重复序列形成发夹结构，同时还须避免形成引物二聚体；

⑥尽量跨外显子设计引物，可以用来消除或区别DNA的扩增；

3.根据Q-PCR引物设计原则，应用Primer 5.0软件设计引物，由英骏公司合成CYP2C8基因特异Q-PCR引物：F5’-agatcagaattttctcaccc-3’，R5’-aacttcgtgtaagagcaaca-3’；

4.配制Q-PCR反应体系如下：

5.Q-PCR反应条件如下：

6.Q-PCR结果分析：

①Q-PCR相对定量分析方法的选择：在本部分实验中，我们选择了人管家基因GAPDH作为参照物，进行相对定量分析。

②应用同一反转录产物，按倍比稀释，建立标准曲线，通过对GAPDH引物和FOXP3基因特异性引物PCR扩增效率的比较，确定相对定量分析的方法。

③通过对GAPDH和我们自行设计的CYP2C8基因特异性引物的比较，得出二者M值之差|M_CYP2C8-M_GAPDH|＜0.1，表示这两对引物在本PCR反应体系中扩增效率极为接近，可以选择双Delta法进行相对定量分析。其计算公式为：

本实验中采用双Delta法检测各样本中CYP2C8mRNA的表达，每个样本做3个复孔。

实验结果

我们用TAP方法纯化出RORγ蛋白复合物后，用SDS-PAGE和银染方法对该复合物进行分离和显示，产生的8个差异显著的候选蛋白条带，经质谱分析后，每个条带均检测出很多不同的蛋白序列。其中，有些是不真实的蛋白序列，需要进行筛选。通过对测序结果进行综合评分，我们找到除了诱饵蛋白RORγ以外的7个候选RORγ相互作用蛋白，代表性的候选蛋白RIP140和HSP90见图1。

将HepG2细胞中提取的总蛋白，同型对照组的免疫沉淀产物和抗RORγ抗体免疫沉淀的产物，分别用RORγ7个候选蛋白相应的抗体进行蛋白印迹检测。结果如图2所示，以上这8个蛋白均存在于HepG2细胞提取的总蛋白中，但最终的捕获产物中只有RIP140和HSP90蛋白；而对照组用同型IgG抗体却没有捕获到任一候选蛋白。以上结果充分证明，在这些候选RORγ相互作用蛋白中，只有RIP140和HSP90蛋白是真正的RORγ相互作用蛋白。

我们设计RORγsiRNA、RIP140 siRNA和HSP90 siRNA并分别将其转染入HepG2细胞中，抑制相应的RORγ、RIP140和HSP90基因的表达，再通过Q-PCR方法检验下调RORγ、RIP140和HSP90蛋白后对RORγ下游靶基因CYP2C8转录的影响。RORγ作为核内重要的转录因子，调控着许多基因的转录，已报道的其中一个重要的RORγ靶基因就是与肝内众多物质代谢密切相关的CYP2C8基因。我们首先证明了HepG2细胞中RORγ表达被干扰后，其调控的下游CYP2C8基因mRNA水平的表达确实显著下调，而用作为阴性对照的无关siRNA转染的HepG2细胞中CYP2C8基因mRNA水平的表达没有改变。用RIP140 siRNA或/和HSP90siRNA分别转染入HepG2细胞中，当RIP140或/和HSP90的表达被抑制后，能显著下调RORγ介导的CYP2C8基因mRNA水平的表达(图4)，

针对RORγ、RIP140和HSP90基因各设计3个siRNA分子，转染HepG2细胞后通过蛋白印迹分析检测的各siRNA分子对靶基因RORγ、RIP140和HSP90的抑制情况。其中，平行设计一条无关的siRNA序列作为对照，并进行平行转染及蛋白印迹分析。结果如图3所示，将RORγ siRNA#2、RIP140 siRNA#3和HSP90 siRNA#1转染入HepG2细胞中，能分别显著下调其中RORγ、RIP140和HSP90蛋白的表达；而其他siRNA则没有这样明显的抑制效应。最终，选择RIP140siRNA#3和HSP90 siRNA#1来观察RORγ介导的CYP2C8基因表达的影响，同时RORγ siRNA#2验证其对CYP2C8基因表达的抑制效应。

在本申请发明中，我们用免疫共沉淀方法鉴定了TAP/MS策略获得的7个候选蛋白中只有RIP140和HSP90蛋白是真正的RORγ相互作用蛋白，并进一步通过RNA干扰证实RIP140和HSP90蛋白能上调RORγ介导的CYP2C8基因的表达。这些结果支持了RORγ与其相互作用蛋白结合形成复合体，进而发挥转录下游靶基因的作用。HSP90可能作为分子伴侣通过结合到RORγ蛋白上，帮助RORγ蛋白在肝脏代谢和其他生物活动中执行调节作用，而RIP140在HepG2细胞中则可能充当RORγ蛋白的转录辅活化因子。在某些病理条件下，对获得的RORγ相互作用蛋白进行干扰或过表达，有可能成为临床用药的作用靶标，具有良好的推广应用价值。

最后说明的是，以上实施例仅用以说明本发明的技术方案而非限制，尽管参照较佳实施例对本发明进行了详细说明，本领域的普通技术人员应当理解，可以对本发明的技术方案进行修改或者等同替换，而不脱离本发明技术方案的宗旨和范围，其均应涵盖在本发明的权利要求范围当中。

Claims

1.抑制CYP2C8基因表达的方法，其特征在于：将RIP140的siRNA转染入靶细胞I中，所述RIP140的干扰片段如SEQ ID NO：1、SEQ ID NO：2和SEQ IDNO：3中任一所示。

2.根据权利要求1所述的方法，其特征在于：将HSP90的siRNA转染入靶细胞II中，所述RIP140的干扰片段如SEQ ID NO：4、SEQ ID NO：5或SEQ ID NO：6中任一所示。

3.根据权利要求1或2所述的方法，其特征在于：所述靶细胞为HepG2细胞。

4.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述方法还包括阳性对照组，所述阳性对照组具体为：将RORγ的siRNA转染入HepG2细胞中，所述RIP140的干扰片段如SEQ ID NO：7、SEQ ID NO：8或SEQ ID NO：9中任一所示。

5.根据权利要求1所述的方法，其特征在于：在转染HepG2细胞后，还包括鉴定步骤，具体为：

2)用双Delta法进行相对定量分析，其计算公式为：

6.根据权利要求4所述的方法，其特征在于，所述CYP2C8基因特异Q-PCR引物，其上游引物为5’-agatcagaattttctcaccc-3’，其下游引物为：5’-aacttcgtgtaagagcaaca-3’。

7.根据权利要求5所述的方法，其特征在于，步骤1)中，PCR扩增条件为：95℃，5秒；57.5℃，15秒；72℃，20秒；80℃，5秒；40个循环。

8.RIP140基因和/或HSP90在制备CYP2C8基因的介导基因中的应用。