CN102719518A

CN102719518A - 一种检测dna主动去甲基化的方法

Info

Publication number: CN102719518A
Application number: CN2011100770027A
Authority: CN
Inventors: 马端; 张进; 王慧君; 杨璐
Original assignee: Fudan University
Current assignee: Nantong Zhongke Medical Laboratory Co., Ltd
Priority date: 2011-03-29
Filing date: 2011-03-29
Publication date: 2012-10-10
Anticipated expiration: 2031-03-29
Also published as: CN102719518B

Abstract

本发明属生物技术领域，涉及一种基因诱导DNA去甲基化的检测方法。本发明利用筛选的已确定甲基化状态的细胞株为基础，收集基因与细胞株的混合克隆并测定其DNA甲基化的状态，对比未转基因的细胞株甲基化状态，得到检测结果。本发明还通过构建人工CpG岛报告基因载体PCBS-luc，体外使用甲基转移酶M.SssI对载体进行甲基化处理，并与anti-hygromycin基因表达载体共转HEK293细胞，使用潮酶素B筛选出完全甲基化、部分甲基化和非甲基化的PCBS稳定整合细胞株。本发明可用于观察目标蛋白去甲基化的功能、检测DNA甲基化或去甲基化的功能、观察组蛋白修饰与DNA甲基化之间的关系，还可用于研究环境因子对于细胞DNA甲基化的影响。

Description

一种检测DNA主动去甲基化的方法

技术领域

本发明属生物技术领域，涉及一种检测DNA主动去甲基化的方法，该方法通过构建人工CpG岛报告基因载体并在体外进行甲基化，通过转染细胞并利用细胞的抗药性筛选出单克隆稳定转染细胞株，进一步检测基因诱导DNA去甲基化。

背景技术

表观遗传学指DNA序列不发生变化但基因表达却发生了可遗传的改变。本世纪初数例大规模单卵双生双胞胎的前瞻性流行病学研究发现，遗传学变异只在一些少见的遗传性肿瘤发生上发挥关键作用，而占全部肿瘤95％以上的散发性肿瘤的发生则主要由环境因素决定。目前，表观遗传学的研究范畴主要包括DNA甲基化，组蛋白修饰，染色质重组等，其目的是揭示与DNA序列变异无关的基因表达可遗传性现象的本质、功能、形成机制及其在疾病发生、发展过程中的作用。

DNA甲基化是指基因组DNA 5-胞嘧啶甲基化（5-mC)，它是一种在哺乳动物中稳定而且广泛存在的表观遗传修饰方式。研究报道，哺乳动物中，CpG二核苷酸序列在基因组中出现的频率（仅1%）远低于基因组中的其它双核苷酸序列，但在基因组的某些区域，CpG序列密度很高，形成CpG岛，它们通常位于基因的启动子或第一个外显子区,据统计哺乳动物基因组中共约有4万个CpG岛。哺乳动物中，5-胞嘧啶甲基化（5-mC)仅发生在CpG二核苷酸序列内，而且这种修饰方式能够在细胞分裂的过程中稳定的保留下来。脊椎动物基因的甲基化状态有三种：低甲基化状态,如管家基因；非甲基化状态；高度甲基化状态,如女性的一条失活的X染色体和印记基因。DNA甲基化在维持正常细胞功能、遗传印记、细胞分化和胚胎发育过程中起着极其重要的作用。胚胎发育过程中DNA甲基化的异常将导致基因的异常表达，可引发多种人类疾病。例如，脐疝-巨舌-巨大发育综合征(Beckwith-Wiedemann Syndrome, BWS)和Prader-Willi/Angelman综合征， Albright遗传性骨发育不全症(AHO)，假性副甲状腺功能减退症Ia型/Ib型等。另外，DNA甲基化酶的突变也会导致一系列遗传性疾病，例如DNMT1表达的降低可导致系统性红斑狼疮（SLE）,DNMT3b的突变可导致免疫缺陷性着丝粒不稳定性面部异常综合征（ICF）。肿瘤的发生发展过程中也伴随着基因组DNA整体甲基化水平的降低和CpG岛局部甲基化水平的异常升高,从而导致基因组的不稳定(如染色体的不稳定、可移动遗传因子的激活、原癌基因的表达)和抑癌基因的不表达。

基于DNA甲基化的重要性，本领域的研究者关注于研究检测DNA甲基化的方法。随着技术的进步，检测甲基化的手段逐渐丰富。目前，现有技术不仅可以探测某段DNA序列的甲基化分布，而且还能大通量地了解整个基因组甲基化的程度。通常DNA去甲基化有两种形式，主动去除和被动去除。研究DNA被动去除甲基化通常可以使用5-Aza，TSA，RNAi，甚至通过miRNA下调DNMT来实现。但是使用DNA去甲基化试剂往往会引起细胞毒性，并且DNA甲基化去除之后很难恢复。有文献报道，可以通过DNA结合结构域特异的引入DNMT来实现DNA定点的甲基化，但是该方法存在的缺陷是瞬时转染细胞很难长期观察细胞DNA的自然状态。因此，目前研究DNA主动去除的机制目前还没有一种通用方法能够实现。

综上，迄今尚无一个实验细胞模型能够提供对于相关基因DNA甲基化或DNA去甲基化的功能研究；而研究DNA甲基化或者DNA去甲基化的机制对于解决由DNA甲基化异常而引起的疾病有着非常重要的意义。

发明内容

本发明的目的是和克服现有技术的缺陷和不足，提供一种新的DNA去甲基化的检测方法，具体涉及一种检测DNA主动去甲基化的方法，该方法通过构建人工CpG岛报告基因载体并在体外进行甲基化，通过转染细胞并利用细胞的抗药性筛选出单克隆稳定转染细胞株，进一步检测基因诱导DNA去甲基化。

具体而言，本发明的检测DNA主动去甲基化的方法，其特征在于，该方法利用筛选的已确定甲基化状态的细胞株为基础，收集基因与细胞株的混合克隆并测定其DNA甲基化的状态，对比未转基因的细胞株甲基化状态，得到检测结果；其包括以下步骤：

1）构建人工CpG岛报告基因载体PCBS-luc并体外甲基化处理；

2）筛选单克隆稳转细胞株；

3）鉴定步骤2）获得的单克隆稳转细胞株。

4）检测DNA主动去甲基化。

本发明中，所述的鉴定后的细胞株分别为，稳定整合了体外完全甲基化、部分甲基化和非甲基化的人工CpG岛报告基因载体。

本发明中，所述的人工CpG岛报告基因载体是以PCDNA3.1作为骨架，依次插入luciferase报告基因、SV40启动子、BD结构域结合位点和一段高CpG片段制得（本发明将所述的载体命名为PCBS-luc）；

其中，

所述的一段高CpG片段，来源于天蓝链霉菌，作为一段CpG岛，在人类基因组中没有同源序列，可排除基因组序列干扰，方便检测；

所述的人工CpG岛报告基因载体插入luciferase报告基因，检测基因转录活性；插入SV40启动子，提供一个活性适中的启动子；插入BD结构域结合位点，为在该位点特异引入蛋白提供位点。

本发明还提供上述三种已知甲基化数量及位点的单克隆稳转细胞株；所述的单克隆稳转细胞株只要按常规细胞筛选方法就可以得到。

本发明进一步提供了一种新的研究DNA甲基化及DNA去甲基化功能的方法。

本发明中，通过构建人工CpG岛报告基因载体PCBS-luc，体外使用甲基转移酶M.SssI对载体进行甲基化处理，并与anti-hygromycin基因表达载体共转HEK293细胞，使用潮酶素B筛选出完全甲基化、部分甲基化和非甲基化的PCBS稳定整合细胞株。

所述的细胞株通过下述方法筛选得出：首先运用大肠杆菌重组质粒构建的方法，以PCDNA3.1为骨架，依次插入luciferase报告基因，SV40启动子，BD结构域结合位点，和一段来源天蓝链霉菌的高CpG片段，构建载体（本发明将此载体命名为PCBS-luc）；之后在体外对该载体（质粒）进行人工甲基化处理，与anti-hygromycin基因表达载体共转HEK293细胞，最后加潮酶素B筛选出单克隆细胞株。

本发明中所述的细胞模型是整合人工CpG岛报告基因载体PCBS-luc的单克隆稳转细胞株；可通过转染该细胞株，收集转染后细胞并进行BSP分析，观察DNA甲基化数量及位点的改变，最终通过有效的辅助实验进行判断目的基因或者蛋白是否具有DNA甲基化或者去甲基化的功能。

本发明结合BSP分析可精确、有效、方便的应用于DNA甲基化或DNA去甲基化的功能研究；其中，所述的BSP是指DNA经亚硫酸氢钠处理后，非甲基化的胞嘧啶转变为尿嘧啶，而甲基化的胞嘧啶保持不变，PCR扩增克隆，然后进行DNA的测序；根据核苷酸序列中C—T转化的情况来判断样本中的甲基化状态：如果与原序列比较，发生了C—T的转变则表示该处未发生甲基化，如果没有这一转变，则该处发生甲基化。所述的测序法可获得样本DNA序列中全部的甲基化信息。

本检测方法综合应用表观遗传学、细胞生物学、分子生物学等技术，提供了一种具可有效应用于DNA甲基化或DNA去甲基化的单克隆稳转细胞株，基于该细胞株，可进一步检测基因诱导DNA去甲基化，在表观遗传学领域发挥重要作用。

本发明方法可用于观察目标蛋白去甲基化的功能，寻找去甲基化酶；检测相关基因是否有DNA甲基化或去甲基化的功能，辅助研究基因功能；通过控制细胞株甲基化程度，灵活观察组蛋白修饰与DNA甲基化之间的关系；还可研究环境因子对于细胞DNA甲基化的影响，是新的研究DNA主动去甲基化或DNA甲基化的方法。

附图说明

图1是重组质粒——人工CpG岛报告基因载体PCBS-luc的质粒图。

图2是通过软件分析的该质粒中各部分CpG岛分布及CG位点的含量情况，其中，深色横线表示CpG岛，深色竖线表示每一个CG位点。

图3是用于检测该细胞株转录活性的四种载体质粒，其中，A为质粒PM，作为阴性对照，其中没有可与图1重组质粒中的BD结构域相结合的位点，从而不能激活启动子而激发转录活性；B为质粒PMVP16，其中的VP16是一个很强的激活结构域，可与图1重组质粒中的BD结构域相结合的位点，从而激活启动子而激发转录活性；C为质粒PMIP，是PM添加IP（嘌呤酶素抗性标签）的质粒；D为质粒PMIPVP16，是PMVP16添加IP（嘌呤酶素抗性标签）的质粒，IP标签用于持续加压筛选。

图4中A为HpaII酶切鉴定质粒甲基化程度；B为荧光素酶报告基因活性检测甲基化质粒及非甲基化质粒活性；C为甲基化细胞株转染应答PMVP16荧光素酶报告基因活性检测结果；D为非甲基化细胞株转染应答PMVP16荧光素酶报告基因活性检测结果。

图5是甲基化细胞株7#BSP结果图，其中，黑色方框表示甲基化位点，白色方框表示非甲基化位点，灰色方框表示未测出的位点。

图6是非甲基化细胞株8#BSP结果图，其中，黑色方框表示甲基化位点，白色方框表示非甲基化位点，灰色方框表示未测出的位点。

图7是甲基化细胞株9#BSP结果图，其中，黑色方框表示甲基化位点，白色方框表示非甲基化位点，灰色方框表示未测出的位点。

图8是甲基化细胞株7#传至15代后BSP结果图，其中，黑色方框表示甲基化位点，白色方框表示非甲基化位点，灰色方框表示未测出的位点。

图9是非甲基化细胞株8#传至15代后BSP结果图，其中，黑色方框表示甲基化位点，白色方框表示非甲基化位点，灰色方框表示未测出的位点。

图10表明应用本发明的细胞模型首次发现的VP16激活结构域在哺乳动物细胞中具有DNA去甲基化的功能，其中，A为PMIP加压筛选72小时后的细胞甲基化情况，B为PMIPVP16加压筛选72小时后的细胞甲基化情况，C为PMIP加压筛选7天后的细胞甲基化情况，D为PMIPVP16加压筛选7天后的细胞甲基化情况，黑色方框表示甲基化位点，白色方框表示非甲基化位点，灰色方框表示未测出的位点。

具体实施方式

下面通过实施例更具体的说明本发明。

实施例1.人工CpG岛报告基因载体PCBS-luc的构建及体外甲基化

1．PCBS-luc的设计

运用大肠杆菌重组质粒构建的方法，以PCDNA3.1为骨架，依次插入了luciferase报告基因， SV40启动子， BD结构域结合位点，一段来源天蓝链霉菌的高CpG片段，制得（命名为PCBS-luc）。

2．PCBS-luc的体外甲基化

将PCBS-luc用限制性内切酶PstI进行单酶切线性化，37度温育，2小时。之后对产物进行纯化（使用Axygen凝胶回收试剂盒），将回收后的产物一半用于甲基化处理，一半不处理作为非甲基化的对照。体外甲基化处理使用M.SssI（NEB公司）。甲基化处理后产物再次进行纯化，方法与前相同。最后用限制型内切酶HpaII验证甲基化的程度，见图4中的A。HpaII识别位点CCGG，当其中的C被甲基化修饰之后HpaII将不能将其切开。如图4A所示，甲基化质粒为弥散条带，未被HpaII切开，而对照非甲基化质粒明显被切开。所有酶切反应均按照其说明书严格操作。

3．构建PMVP16

片段VP16来源于质粒PVP16，设计引物VP16F，VP16T（见引物表）扩增出片段，插入载体PM。

实施例2：单克隆稳转细胞株的筛选

1、确定筛选的最佳药物浓度

最佳药物浓度是指可以使细胞全部死亡的最低浓度。所选药物为潮霉素B（Hygromycin B），其浓度为50mg/ml。所用细胞为HEK293。具体步骤如下：

（1）复苏HEK293细胞入6cm dish，待长满时传代，3ml中按照每孔18-20ul传入96孔板中，补足100ul/孔。

（2）文献中有关此种药物对于HEK293细胞的最佳使用浓度为200ug/ml，也有推荐为100ug/ml。因此选择预实验药物浓度分别为80 ug/ml，100 ug/ml，150 ug/ml，200ug/ml，以确定本实验最终适合的药物浓度。

（3）待96孔板中细胞传好，加压筛选，经过6天时间，观察到100ug/ml为最佳浓度。

2、确认甲基化PCBS-luc质粒及非甲基化PCBS-luc质粒的活性

（1）将293细胞传入96孔板内，12-16小时内进行转染；

（2）共转甲基化PCBS-luc（40ng）与PM（160ng）；甲基化PCBS-luc（40ng）与PMVP16（160ng），看甲基化质粒的结合情况；共转非甲基化PCBS-luc（40ng）与PM（160ng）；非甲基化PCBS-luc（40ng）与PMVP16（160ng），看非甲基化质粒的结合情况。由于PCBS-luc质粒上含有BD结合位点，PM中没有可以结合BD的部分，但是PMVP16含有可结合BD的VP16激活结构域，因此可激活启动子获得较高的转录活性，转录后72小时测萤光素酶活性，见图4B。PM未对细胞产生激活效应，而PMVP16可以对细胞产生激活作用，说明构建的质粒是具有活性的，可用于后续的实验转染细胞并筛选单克隆；而明显可见非甲基化质粒的活性远高于甲基化质粒的活性，推测甲基化会影响VP16与BD结构域的结和从而影响基因的转录激活。

3．转染细胞并筛选单克隆稳转细胞株

anti-hygromycin基因表达载体PMSCV-Hyg（200ng）与甲基化PCBS-luc（900ng），非甲基化PCBS-luc（900ng）分别共同转染入HEK293细胞中（24孔板），用终浓度为100ug/ml的潮酶素B对细胞进行加压并传代筛选（10cm dish）。观察细胞。

（1）加压5天后control细胞全死。

（2）加药后第7天，用终浓度100ug/ml潮酶素B的DMEM对甲基化细胞株及非甲基化细胞株换液。

（3）再过10天，单克隆长成，肉眼可看到白色小点。

挑细胞单克隆步骤：

吸出培养基；

加胰酶洗一遍，2ml，吸出；

再加一次胰酶，2ml，吸出；

取1ml胰酶于EP管中；

每次10ul胰酶小心滴加入圈出的克隆中，反复吹吸，吸入加好培养基的48孔板中（每孔300ul培养基），再吸孔内培养基10ul入圈内，反复吹吸，放入48孔内；

吹匀孔内细胞；

观察后放入培养箱，最终挑到甲基化细胞单克隆15个，非甲基化细胞单克隆13个。

（4）观察48孔板内的细胞生长状况。

（5）48孔内长满的和约90%的细胞传入12孔板，用带药培养基（潮酶素B 50ug/ml）培养。

（6）继续观察细胞，如同上步骤，长满的传入12孔板，12孔板内长满的细胞传入6孔板，此时均用50ug/ml的潮酶素B培养基进行维持培养。

（7）待6孔板内细胞长满后，分批冻存细胞，保存-80度。最后获得甲基化细胞株1#，2#，4#，5#，6#，7#，8#，9#，10#，11#，12#，13#，14#；非甲基化细胞株1#，2#，3#，5#，6#，7#，8#，9#。

实施例3：甲基化单克隆稳转细胞株的鉴定

1．鉴定甲基化及非甲基化单克隆稳转细胞株的荧光素酶活性

（1）分别将所筛稳转单克隆细胞株传入96孔板，12-16小时进行转染，PM为空载对照。

（2）72小时后测定luciferase值，进行计算。

（3）结果如图4C，D所示，C为甲基化各单克隆细胞对于PMVP16的转染应答萤光素酶活性情况，D为非甲基化各单克隆细胞对于PMVP16的转染应答萤光素酶活性情况；选择荧光素酶活性较高的甲基化细胞克隆7#,荧光素酶活性较低的甲基化细胞克隆9#，及非甲基化细胞8#进行下一步的鉴定。

2．鉴定甲基化细胞株及非甲基化细胞株的甲基化程度

（1）提取甲基化7#、9#，非甲基化8#细胞全基因组DNA（TIANGEN BIOTECH Beijing CO., LTD），并进行亚硫酸氢钠处理（Zymo Research, Orange, CA, USA）。

（2）用两对引物进行BSP测序（两对BSP引物CBSBwF/wT，CBSBF/T见引物表），检测具体的甲基化状态。如图5，图6，图7所示，分别为甲基化细胞株7#的甲基化状态，非甲基化细胞株8#的甲基化状态及甲基化细胞株9#的甲基化状态，非甲基化8#为完全非甲基化状态，而甲基化7#为部分甲基化状态，甲基化9#为全甲基化状态。结合细胞株对PMVP16转染应答的荧光素酶活性及细胞株的甲基化状态，发现甲基化程度与荧光素酶活性呈负相关，所以推论甲基化位点可能会影响VP16与BD结构域的结合从而导致转录活性的降低；因此，甲基化细胞株7#既具有较好的荧光素酶活性，又具有甲基化位点，适用于研究能够与BD结合的基因的DNA甲基化或去甲基化的功能，而甲基化9#细胞株可能会影响基因与BD结构域的结合，所以不适合用于基因功能的研究，但是可用作环境因素对于DNA甲基化影响的细胞模型；而非甲基化细胞株8#可很好的用于研究相关基因或环境因素对DNA甲基化功能影响的研究。

3．鉴定细胞株的甲基化状态稳定性

对甲基化7#及非甲基化8#细胞株进行传代培养，收取传至第15代的细胞，方法同上，进行BSP测序（引物与之前相同），如图8、9所示，结果表明所述的两株细胞甲基化或非甲基化状态稳定，其甲基化或非甲基化状态不会随着传代培养而改变。

实施例4：甲基化细胞模型的应用

1．构建实验所需质粒PMIP及PMIPVP16

在原有的PM质粒上插入嘌呤酶素抗性的片段IP，在PMIP的基础上插入片段VP16，这两个质粒由于含有嘌呤酶素抗性因此可以用来持续刺激甲基化细胞，加压筛选出混合细胞株（如图3中的C，D）。

2．转染

将PMIP，PMIPVP16分别转染入甲基化细胞株7#（6孔板），转染后24小时加嘌呤酶素并传代，72小时后收部分细胞，其余细胞持续加药筛选至7天收集细胞。-80度冻存。

3．将转染PMIP 72小时，PMIPVP16 72小时，PMIP 7天，PMIPVP16 7天的细胞提取全基因组DNA，亚硫酸氢钠处理后，用与之前相同的BSP引物进行PCR扩增，并测序观察结果。

如图10所示，A为PMIP 筛选72小时，B为PMIPVP16 筛选72小时，C为PMIP 筛选7天，D为PMIPVP16 筛选7天，结果表明，阴性对照PMIP无论是瞬时转染还是稳定转染都含有稳定的甲基化状态，稳定转染的细胞株甲基化程度更为规则，而PMIPVP16筛选到的细胞株则明显几乎不存在甲基化位点，说明VP16可诱导促进DNA去甲基化。

以上实施例的结果表明，利用本发明的测试方法首次发现VP16在哺乳细胞中的DNA去甲基化功能，同时也表明所述的细胞株具有预期的功能；本测试方法利用细胞株测试基因对DNA去甲基化，与现有技术相比更加容易、明确和方便。

SEQUENCE LISTING

<110> 复旦大学

<120> 一种检测DNA主动去甲基化的方法

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taaaaacaat tattccaaaa acca 24

Claims

1.一种检测DNA主动去甲基化的方法，其特征在于，利用筛选的已确定甲基化状态的细胞株为基础，收集基因与细胞株的混合克隆并测定其DNA甲基化的状态，对比未转基因的细胞株甲基化状态，得到检测结果；其包括以下步骤：

1）构建人工CpG岛报告基因载体PCBS-luc并体外甲基化处理；

2）筛选单克隆稳转细胞株；

3）鉴定步骤2）获得的单克隆稳转细胞株；

4）检测DNA主动去甲基化。

2.按权利要求1所述的方法，其特征在于，所述的已确定甲基化状态的细胞株为，稳定整合了体外完全甲基化、部分甲基化或非甲基化的人工CpG岛报告基因载体。

3.按权利要求1或2所述的方法，其特征在于，所述的人工CpG岛报告基因载体是以PCDNA3.1作为骨架，依次插入luciferase报告基因、SV40启动子、BD结构域结合位点和一段高CpG片段制得，命名为PCBS-luc。

4.按权利要求3所述的方法，其特征在于，所述的一段高CpG片段源自天蓝链霉菌。

5.按权利要求3所述的方法，其特征在于，所述的人工CpG岛报告基因载体插入luciferase报告基因检测基因转录活性；插入BD结构域结合位点特异引入蛋白提供位点。

6.按权利要求1所述的方法，其特征在于，所述的步骤2）的单克隆稳转细胞株，通过下述方法筛选：

以PCDNA3.1为骨架，依次插入luciferase报告基因，SV40启动子，BD结构域结合位点，和一段源自天蓝链霉菌的高CpG片段，构建载体PCBS-luc后；在体外对该载体进行人工甲基化处理，与anti-hygromycin基因表达载体共转HEK293细胞，最后加潮酶素B筛选出单克隆稳转细胞株。