CN102719384B - 一株具有抑菌活性的寡养单孢菌 - Google Patents
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Abstract
一株具有抑菌活性的寡养单孢菌，涉及一株寡养单孢菌。本发明提供了一株寡养单孢菌，具有较强的抑菌活性，为开发新的抗菌药物提供依据。本发明具有抑菌活性的寡养单孢菌为寡养单孢菌WF28，保藏在中国典型培养物保藏中心(CCTCC)，保藏日期为2012年4月24日，保藏编号为CCTCC NO：M2012139。本发明寡养单孢菌WF28具有较强的抑菌活性，抑菌谱也较广，其代谢物中含有大量的抑菌活性成分。
Description
技术领域
本发明涉及一株寡养单孢菌。
背景技术
植物内生细菌能够产生多种生物活性物质，特别是能够产生具有抑菌活性的物质。现阶段，由于抗生素的使用，使环境中产生大量的耐药菌株，通常使用的抗生素已经对这些菌没有抑制作用，因此寻找对耐药菌株有抑制活性的新物质就迫在眉睫。
植物内生细菌具有多种生物学功能，能产生多种生物活性物质，特别是在寻找新的抗菌物质方面，为我们提供了一个新的资源库，并已在各个方面显现出其潜在的应用价值。
发明内容
本发明提供了一株寡养单孢菌(Stenotrophomonas rhizophila)，具有较强的抑菌活性，为开发新的抗菌药物提供依据。
本发明具有抑菌活性的寡养单孢菌为寡养单孢菌(Stenotrophomonas rhizophila)WF28，保藏在中国典型培养物保藏中心(CCTCC)，保藏地址是武汉市武汉大学，保藏日期为2012年4月24日，保藏编号为CCTCC NO：M2012139；本发明寡养单孢菌WF28为革兰氏阴性菌，细胞大小为(0.3μm～0.4μm)×(0.8μm～2.2μm)，有鞭毛，有菌膜。
本发明寡养单孢菌WF28淀粉水解试验呈阴性，明胶液化试验呈阴性，接触酶试验呈阳性，酯酶试验呈阴性，甲基红试验呈阴性，V.P试验呈阴性，运动性试验结果为具有运动性。
本发明寡养单孢菌(Stenotrophomonas rhizophila)WF28通过16S rDNA序列比对分析，与寡养单孢菌(Stenotrophomonas rhizophila)的16S rDNA序列的同源性最高，相似性为98％，通过结合菌体形态特征、生长条件、生理生化鉴定结果确定寡养单孢菌WF28属于假单胞菌科(Pseudomonadaceae)寡养单胞菌属(Stenotrophomonas)，为寡养单孢菌(Stenotrophomonas rhizophila)。
本发明寡养单孢菌WF28可在牛肉膏蛋白胨培养基上生长，寡养单孢菌WF28的最适生长温度为35℃，最适生长环境的pH值为7.2，最适盐浓度为2％，为好氧菌。
本发明寡养单孢菌WF28具有较强的抑菌活性，抑菌谱也较广，其代谢物中含有大量的抑菌活性成分。
本发明寡养单孢菌(Stenotrophomonas rhizophila)WF28属于假单胞菌科(Pseudomonadaceae)寡养单胞菌属(Stenotrophomonas)，保藏在中国典型培养物保藏中心(CCTCC)，保藏地址是武汉市武汉大学，保藏日期为2012年4月24日，保藏编号为CCTCC NO：M2012139。
附图说明
图1为本发明寡养单孢菌WF28和相近菌株的16S rDNA序列进行同源性比对构建的系统发育树。
具体实施方式
具体实施方式一：本实施方式具有抑菌活性的寡养单孢菌为寡养单孢菌(Stenotrophomonas rhizophila)WF28，保藏在中国典型培养物保藏中心(CCTCC)，保藏地址是武汉市武汉大学，保藏日期为2012年4月24日，保藏编号为CCTCC NO：M2012139。
本实施方式寡养单孢菌WF28为革兰氏阴性菌，细胞大小为(0.3μm～0.4μm)×(0.8μm～2.2μm)，有鞭毛，有菌膜。
参照《伯杰细菌鉴定手册》第八版和《常见细菌系统鉴定手册》对寡养单孢菌WF28进行生理生化鉴定：寡养单孢菌WF28淀粉水解试验呈阴性，明胶液化试验呈阴性，接触酶试验呈阳性，酯酶试验呈阴性，甲基红试验呈阴性，V.P试验呈阴性，运动性试验结果为具有运动性。
本发明寡养单孢菌WF28可在牛肉膏蛋白胨培养基上生长，寡养单孢菌WF28的最适生长温度为35℃，最适生长环境的pH值为7.2，最适盐浓度为2％，为好氧菌。
牛肉膏蛋白胨培养基(1000mL)由3.0g牛肉膏、10.0g蛋白胨、5.0g NaCl和余量的蒸馏水组成，调节pH至7.0～7.2，于121℃高压灭菌30min。牛肉膏蛋白胨琼脂培养基(1000mL)由3.0g牛肉膏、10.0g蛋白胨、5.0g NaCl、16.0g琼脂粉和余量的蒸馏水组成，调节pH至7.0～7.2，于121℃高压灭菌30min。
具体实施方式二：本实施方式寡养单孢菌(Stenotrophomonas rhizophila)WF28由中国黑龙江省帽儿山地区健康的北五味子的果实中筛选得到。筛选按以下步骤进行：取健康的北五味子的果实，用水冲洗干净；将清洗干净的北五味子的果实依下列顺序进行表面消毒：75％酒精漂洗1min，10％双氧水漂洗15min，75％酒精漂洗1min，无菌水冲洗4次；然后置于牛肉膏蛋白胨培养基中，于37℃恒温摇瓶培养1-3d，待培养基长出菌落后，挑取少量菌落转到牛肉膏蛋白胨琼脂培养基中进行倍比稀释纯化培养，即得到寡养单孢菌 WF28。
阴性对照：为了检查表面消毒是否彻底，把最后一次冲洗北五味子果实的无菌水用无菌的涂布棒涂布在牛肉膏蛋白胨琼脂培养基表面上，另将消毒后的北五味子果实在牛肉膏蛋白胨琼脂培养基上滚动一周，以此做为阴性对照，于相同的条件下培养。
经过多次重复，阴性对照平板均无任何菌落长出，证明北五味子果实表面消毒彻底，分离到的菌是北五味子内生细菌-寡养单孢菌WF28，而不是植株表面的附生菌。
对筛选得到的寡养单孢菌WF28进行分子鉴定，按以下步骤进行：用热破壁法提取菌株的基因组DNA，采用国际细菌鉴定通用引物进行，以基因组DNA为模板进行PCR扩增。然后利用胶回收试剂盒回收纯化PCR产物，之后进行克隆、转化，筛选阳性克隆的菌落，经扩大培养后委托上海生工生物工程技术服务有限公司测序公司进行测序。
寡养单孢菌WF28的16SrDNA序列长度为1540bp，其序列如SEQ ID NO：1所示，将测序结果与GenBank中的16S rDNA序列进行同源性比对，然后用软件构建系统发育树(如图1所示)，以确定菌株的种属关系。同源性分析结果表明，该序列与寡养单孢菌(Stenotrophomonas rhizophila)的16S rDNA序列的同源性最高，相似性为98％，通过结合菌体形态特征、生长条件、生理生化鉴定结果确定寡养单孢菌WF28属于假单胞菌科(Pseudomonadaceae)寡养单胞菌属(Stenotrophomonas)，为寡养单孢菌(Stenotrophomonas rhizophila)。
PCR引物购买自上海生工生物技术有限公司，其他试剂购自于大连宝生物工程有限公司。
对本实施方式寡养单孢菌WF28的发酵液进行抑菌活性测定，具体步骤如下：
1、寡养单孢菌WF28的活化：在超净工作台中无菌操作，用接种环挑取寡养单孢菌WF28，在平板培养基(牛肉膏蛋白胨琼脂培养基)上用接种环划线，在37℃培养箱中进行培养2d。
2、供试菌株的活化：用接种环挑取供试真菌--白假丝酵母菌，于无菌环境下，在斜面培养基(PDA固体培养基)上进行划线，于28℃恒温培养箱中培养7d。PDA固体培养基(1000mL)由200g马铃薯、20g蔗糖、16g琼脂粉和余量的蒸馏水组成。
用接种环分别挑取11株供试细菌(枯草芽孢杆菌、短小芽孢杆菌、金黄色葡萄球菌、粪肠球菌、屎肠球菌、单增李斯特菌、酿脓链球菌、大肠杆菌、铜绿假单孢菌、鲍曼不动杆菌、肺炎克雷伯氏菌)，于无菌环境下，在斜面培养基(牛肉膏蛋白胨琼脂培养基)上进行划线，于37℃恒温培养箱中培养2d。
3、寡养单孢菌WF28发酵样品的制备：将分离得到的寡养单孢菌WF28接种于50mL牛肉膏蛋白胨培养基中，作3个重复，置于120r/min 37℃空气浴摇床中，培养3天取出，作为种子液；将种子液按照20％的接种量接种到装有50mL牛肉膏蛋白胨培养基的三角瓶中，置于120r/min 37℃空气浴摇床中培养5天，得发酵液。将发酵液以2000r/min离心10min，取上层液体，加入等量的水饱和正丁醇超声1h。超声后取正丁醇层，于45℃进行旋转蒸发，向获得的残渣中加1mL甲醇溶解后作为寡养单孢菌WF28发酵样品。
4、含菌平板的制备：将按照上述步骤2活化2-3次的11株供试细菌，接种于斜面培养基(牛肉膏蛋白胨琼脂培养基)上，在37℃培养箱内培养1-2d，用血细胞计数板计数法，在11株供试细菌的斜面培养基试管中分别加入5mL生理盐水，充分振荡摇匀，取一滴滴于血细胞计数板载玻片与盖玻片之间的计数室中，在显微镜下进行计数，然后稀释到菌体浓度为1×107CFU/mL，得到11株供试细菌的菌悬液；将每个菌株的菌悬液按每100mL培养基中加入1mL菌悬液的比例加入到50℃左右牛肉膏蛋白胨琼脂培养基中，混匀后，迅速分装到灭菌后的空平板中，冷却，制成11株供试细菌的含菌平板。同法，取活化2-3次供试真菌--白假丝酵母菌，接种于斜面培养基(PDA固体培养基)上，在28℃培养箱内培养1-2d，用血细胞计数板计数法，在供试真菌的斜面培养基试管中分别加入5mL生理盐水，充分振荡摇匀，取一滴滴于血细胞计数板载玻片与盖玻片之间的计数室中，在显微镜下进行计数，然后稀释到菌体浓度为1×107CFU/mL，得到供试真菌的菌悬液；将菌悬液按每100mL培养基中加入1mL菌悬液的比例加入到50℃左右的PDA固体培养基中，混匀后，迅速分装到灭菌后的空平板中，冷却，制成供试真菌的含菌平板。
5、采用滤纸片法进行抑菌实验，每个含菌平板内放置3组双层滤纸片(Φ＝0.6cm)。每组滤纸片上加10μL寡养单孢菌WF28发酵样品，每株供试菌株的含菌平板作3个平行样。以链霉素溶液(100mg/mL)和制霉素溶液(100mg/mL)做阳性对照，将未接菌的牛肉膏蛋白胨固体培养基按同样的方法处理做阴性对照，然后将含菌平板置于37℃恒温培养24h后观察，测其抑菌圈直径(Φ)，测定结果如表1所示。
表1
表1中A为大肠杆菌；B为枯草芽孢杆菌；C为金黄色葡萄球菌；D为短小芽孢杆菌；E为铜绿假单孢菌；F为单增李斯特菌；G为肺炎克雷伯氏菌；H为鲍曼不动杆菌；I为酿脓链球菌；J为屎肠球菌；K为粪肠球菌；L为白假丝酵母；Str为链霉素；Nys为制霉素。
所述大肠杆菌(Escherichia coli)、枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilis)、金黄色葡萄球菌(Staphylococcus aureus)、短小芽孢杆菌(Bacillus pumilus)、铜绿假单孢菌(Pseudomonas aeruginosa)、单增李斯特菌(Listeria monocytogenes)、肺炎克雷伯氏菌(Klebsiella pneumoniae)、鲍曼不动杆菌(Acinetobacter baummanii)、酿脓链球菌(Streptococcus pyogenes)、屎肠球菌(Enterococcus faecium)、粪肠球菌(Enterococcus facalis)和白假丝酵母(Candida albicans)均购买自黑龙江省科学院微生物研究所。
表1中-表示无活性；+表示活性较弱，抑菌圈直径＜11mm；++表示活性中等，抑菌圈直径11～15mm；+++表示活性较强，抑菌圈直径＞15mm。
试验结果表明：寡养单孢菌WF28抑菌活性强，抑菌谱也较广。其代谢物中含有大量的抑菌活性成分，因此寡养单孢菌WF28具有深入开发应用价值。
Claims (1)
1.一株具有抑菌活性的寡养单孢菌(Stenotrophomonas rhizophila)，其特征在于具有抑菌活性的寡养单孢菌为寡养单孢菌WF28，保藏在中国典型培养物保藏中心(CCTCC)，保藏地址是武汉市武汉大学，保藏日期为2012年4月24日，保藏编号为CCTCC NO：M2012139。
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