CN102702309A - 蛋白质微量透析装置及使用方法 - Google Patents

Abstract

本发明提出了一种蛋白质微量透析装置及使用方法。该装置包括浮板1、微透析管组件14、半透膜11和磁力搅拌子8四部分。其中，微透析管组件由外套管9和内套管10组成，外套管9为上大下小的套筒形，内套管10为直筒形，内套管10顶部有外螺纹，与管盖13的内螺纹相配。浮板1为圆形带孔塑料板，每个圆孔的底部有一圈围裙5，浮板1中下部还有可拉伸的轴杆6。该装置的使用方法为：内套管10底部先用半透膜11包裹并用橡皮圈12扎紧，插入外套管9内；然后将蛋白质样品加入到内套管底部的半透膜11上；盖上管盖13，将整个组件14插入到浮板的相应插孔2，3或4中；从浮板底部拉出轴杆6，根据缓冲溶液高度调节轴杆长度并在吸附罩7下吸附一只磁力搅拌子8；最后整个装置浮于缓冲液表面进行微透析操作。

Description

蛋白质微量透析装置及使用方法

技术领域

本发明属于蛋白质纯化的实验技术领域，具体地说涉及一种新的蛋白质微量透析装置及其使用。

背景技术

蛋白质的纯化一直是生物化学研究中十分重要的技术内容，其中，蛋白质的分离和脱盐等涉及一系列重要的实验技术。通常情况下，在实验室里，蛋白质的纯化通过以下方法脱盐，如透析，Sephadex G-25柱层析，反相柱层析，超滤等，然而，这些实验方法各有优缺点。

具体地，用Sephadex G-25层析柱脱盐，速度快，处理样品量大，但是会带来洗脱液体积大量增加的问题，因此，脱盐后的浓缩和冻干处理时常是需要的，这对于大批量蛋白质样品的处理也许可行，但对于微量蛋白质样品的纯化就很不利。与此不同的，反相柱层析脱盐虽然适合于微量蛋白质样品的纯化，但是由于在纯化过程中经常使用一定浓度的有机溶剂进行洗脱，有可能会使某些水溶性蛋白质发生构象变化，失去生物化学活性；另外，该实验方法还需要昂贵的HPLC仪器及反相层析柱进行操作，设备条件昂贵且要求较高。超滤法是目前实验室里纯化微量蛋白质的简易方法，但是从市场上购买的超滤管所纯化的蛋白质分子量范围是预先固定的，不能适应变化的实验需求。由此可见，上述种种脱盐方法，在蛋白质纯化过程中都不是普遍适用的。相比而言，透析法具有简单和普适的优点，借助半透膜的选择透过性原理，透析袋中的蛋白质溶液相对于外界100-1000倍的低盐缓冲液进行透析，蛋白质分子因不能通过半透膜而被截留在透析袋内，大量的小分子物质及无机盐离子则通过半透膜进入外部的低盐缓冲溶液中，经过充分的渗透作用后，半透膜内外的离子浓度最终会达到一种电化学的平衡状态，即道南平衡(Donnan Equilibrium)。对大多数水溶性蛋白质而言，在这一过程中，其空间构象几乎不受影响，能够保持绝大多数蛋白质的天然活性。因此，在时间充裕，蛋白质量较大的情况下，透析法脱盐往往是蛋白质纯化的可靠之选。然而，问题在于这种技术在应用过程中也有它的不足之处。在实验室中，研究人员常有这样的体会，即把蛋白质样品加入到透析袋内或从中取出是一个十分费时和头疼的操作。因为透析袋没有任何刚性可以支撑，对于不熟练的操作者，加入、取出样品，或用线扎紧透析袋口的过程中，一不小心就可能造成样品损失。实验中甚至还常常出现因透析袋的一端没有扎紧而渗漏的现象，所以，如果需要透析的蛋白质样品十分珍贵，体积小，还需要保持蛋白质的天然活性(例如小于1毫升)的情况时，用传统的透析方法进行脱盐，蛋白质将难以回收。由此可见，对于生物化学家和技术人员来说，微量蛋白质样品的脱盐纯化，仍然是一个需要考虑解决的问题。

为了解决上述种种问题，本发明提出了一种新的蛋白质微量透析装置，该装置可以对微量的蛋白质样品进行简单可靠地脱盐纯化或更换缓冲溶液操作，有利于保持蛋白质的空间构象和天然活性，拆卸组装容易，适合于不同大小和类型的蛋白质纯化。

发明内容

本发明的目的是设计一种能够对50μl-2000μl体积的蛋白质样品进行微量透析和高效可靠回收的实验装置。

为了实现这一目的，本发明设计了三套大小不同的微透析管组件，I型、II型和III型，分别能够对50μl-200μl，200μl-500μl以及500μl-2000μl的蛋白质样品进行微透析。每套微透析管组件包括外套管、内套管和管盖三个部分，外套管起保护作用，为上大下小的圆形套筒，上半部分的纵剖面为梯形，下半部分的纵剖面为矩形。外套管的内径刚刚大于内套管的外径，使得底部包有半透膜的内套管可以紧密地嵌入外套管内(如图3)。外套管底有四个支撑脚，在组装微透析管组件时，可以轻松地将外套管立于实验桌上操作。

内套管为上下连通的直筒形，上端口附近有外螺纹，与管盖内壁上的内螺纹正好匹配。使用时，内套管的底部用经过处理的半透膜包裹，再用一只橡胶圈从下向上把半透膜紧紧绑定在内套管的外壁上(如图3)。然后，把该部件插入外套管内，直至接近外套管底，在此组装过程中，确保内套管底部的半透膜十分平整，不发生破裂和液体渗漏。

用可调微量移液器向内套管的管底加入一定量的蛋白质样品。

在内套管上部盖上管盖并旋紧。

拉出浮板正下方的轴杆，参照容器中所盛的缓冲溶液的高度调节轴杆的长度。然后，将一只磁力搅拌子吸附在在半圆管形的金属吸附罩下(如图2)，此时，搅拌子的底部应当距离容器的底部大约1-2mm，整个装置以刚好可以漂浮在透析缓冲溶液中为佳。

在平衡状态下，小心地将微透析管组件插入到浮板上相应的I、II或III型插孔中(如图1)。

使整个透析装置漂浮于透析溶液表面，细心查看外套管的底部有无任何气泡驻留，如果需要，可以用实验室的滴管吹打除去。打开常用的磁力搅拌器，缓慢加速，使整个透析装置缓慢旋转，进行微透析。

透析实验结束后，取下微透析管组件，旋开管盖，用微量移液器取出全部的蛋白质溶液，转入干净的微量容器(如Eppendorf管)中。

在上述技术方案中，缓冲溶液、微量移液器、磁力搅拌器、滴管等均为生物化学研究领域的技术人员所公知的实验试剂、设备和器材。

使用上述微透析装置，经过适当长的时间后，大量的盐离子或小分子物质将通过半透膜渗透到周围的低盐缓冲溶液中，从而使蛋白质样品将得到纯化。理论计算表明，与常规的透析袋透析相比，用该实验装置进行蛋白质的脱盐纯化，在化学特征和透析效果上没有本质的区别，唯一的不同仅在于用该装置进行蛋白质透析所需时间比用常规的透析袋透析所需时间要长一些(相同实验条件下，达到道南平衡时，微量透析装置所需时间为后者的数倍时间，样品高度与内套管直径的比值越大，所用的时间越长)。然而，由于在透析过程中，透析装置内自由盐离子的浓度随着时间的延长呈指数递减，所以透析的实际效果与常规实验相比区别很小。另外，由于微量透析实验装置的样品处理量极少，且有不同类型的微量透析管组件可供选择，因此，透析实验所用的时间与常规实验所用的时间相比亦没有太大的区别，均在通常实验要求的时间范围之内。

另一方面，该蛋白质微量透析装置的优点是不言而喻的，例如，它使用方便，操作简单且过程可靠，对于微量蛋白质样品的透析不仅不必担心实验操作上的问题，而且能最大程度地保持蛋白质的天然构象和生物活性，所以，该实验装置一旦应用，必定会很好地满足通常生物化学实验中对蛋白质的纯化需求。除此之外，该装置还容许对它进行灭菌和表面硅化处理，因此，对于极微量的蛋白质样品，其回收率也几近100％，而这是常规的蛋白质纯化技术所不易达到的。

以下结合附图和具体实施方式对本发明作进一步地说明。

附图说明

图1，微量透析装置浮板顶视图

图2，微量透析装置浮板和磁力搅拌子侧视图

图3，微量透析管组件拆分和组合侧视图

图1所示为微量透析装置的浮板1的顶视图，浮板1有三种类型的插孔，I型插孔2，II型插孔3和III型插孔4，另外，每种类型的插孔底部均有一圈围裙5。

图2所示为微量透析装置的浮板1和磁力搅拌子8的侧视图，浮板1的正中下方有可拉伸的轴杆6，轴杆的末端连接有半圆管状的金属吸附罩7。

图3所示为微量透析管组件14拆分和组合的侧视图，微量透析管组件14包括外套管9和内套管10，内套管有一管盖13，在微量透析管组件14的组装过程中，内套管10的底端先用透析膜11包裹，再用橡胶圈12自下而上捆扎，然后内套管10紧密地插入外套管9中，加好样品后，内套管10顶部盖上管盖13旋紧。

具体实施方式

实施例1，微量透析装置的结构组成

微量透析装置包括以下组成部分：微透析管组件、半透膜、橡胶圈、浮板和磁力搅拌子。

(1)微透析管组件包括I、II、III三种型号，分别由以下几部分组成：外套管(内径φ分别为：I型17.0mm，II型11.0mm，III型8.0mm，高度h均为30.0mm)，与外套管相适配的内套管(外径φ分别为：I型16.7mm，II型10.7mm，III型7.7mm，高度h均为38.0mm)，与各型内套管相适配的管盖。

(2)经过实验室预处理的正方形半透膜(边长l：50.0mm，目数：5500-30000MW)，固定半透膜的橡胶圈(直径小于内套管)。

(3)具有不同大小孔径的浮板，浮板上的插孔类型为：直径17.5mm的插孔两个，直径11.5mm的插孔四个和直径8.5mm的插孔四个。

(4)3节可拉伸轴杆(最大拉伸长度可达20cm)及轴杆底部的半圆管形金属吸附罩，金

属吸附罩可吸附磁力搅拌子。

实施例2，微量透析装置的使用方法

(1)选取两支I型微透析管的内套管，拾取两张半透膜，分别包裹住每支内套管的底部，将橡胶圈由下向上套入，把半透膜紧紧地绑定在内套管外壁上，注意内套管底部的半透膜膜面一定要平整且管壁外近端部无气泡贮留。

(2)将两支带半透膜的内套管分别插入相应的外套管内，塞紧使底部不渗漏，为了检验半透膜是否紧密且完整，可以从透析管上部加入少量缓冲液，观察膜底部有无液体渗出。

(3)将套管放置在干净的桌面上，分别向两支内套管的底部小心地加入800μl某种蛋白质样品(如含1％BSA的NaCl溶液)，样品高度约0.6cm。

(4)在内套管上盖上管盖并旋紧。

(5)将加入足够量透析缓冲溶液(如：800ml 0.1M的磷酸盐缓冲液，pH7.2)的玻璃烧杯置于磁力搅拌器上，并置于4℃环境下。

(6)根据烧杯内的缓冲溶液高度，拉出浮板下部的轴杆，调节至适当长度，使磁力搅拌子距烧杯底部约1mm，然后，把一个磁力搅拌子吸附在轴杆底部的金属吸附罩下。

(7)选择对称的浮板圆孔位置，将套管组件平稳地插入相应的插孔中。

(8)小心地使浮板漂浮在透析缓冲液的表面。

(9)用滴管吹吸，除去外套管底部任何可能驻留的气泡。

(10)开启磁力搅拌器，从静止开始，缓慢增大转速，使磁力搅拌子带动浮板上的所有组件缓慢转动为佳。

以上实施例中的数据仅供参考，略作改变，该微量透析装置就可以用于各种蛋白质或各种DNA样品(如质粒DNA等)的透析，另外，根据具体情况，透析的样品还可以按比例加大。

Claims (9)

1.一种蛋白质微量透析装置，其特征在于由浮板(1)、微量透析管组件(14)、半透膜(11)和磁力搅拌子(8)四部分组成，浮板(1)上具有对称设置的透析管插孔(2、3、4)，浮板的正中下方有一根轴杆(6)，轴杆的底端连有金属吸附罩(7)，微透析管组件由外套管(9)、内套管(10)和管盖(13)组成，外套管(9)的外径与浮板上相应插孔(2、3、4)的内径相适配，而每组外套管(9)的内径比对应的内套管(10)的外径略大。

2.根据权利要求1所述的微量透析装置，其特征在于浮板(1)每个透析管插孔(2、3、4)的底部有一圈有弹性的塑料围裙(5)。

3.根据权利要求1所述的微量透析装置，其特征在于浮板(1)正下方的轴杆(6)是可拉伸的。

4.根据权利要求1或3所述的微量透析装置，其特征还在于轴杆(6)术端的金属吸附罩(7)为半圆管形。

5.根据权利要求1所述的微量透析装置，其特征在于外套管(9)为上大下小的套筒形，敞口部分高度与直筒部分的高度比为1∶1至2∶1。

6.根据权利要求5所述的微量透析装置，其特征在于外套管(9)底部边沿具有3至4个对称设置的支撑脚。

7.根据权利要求1所述的微量透析装置，其特征在于内套管(10)为上下均匀的直筒形，其上端门附近有外螺纹。

8.根据权利要求1所述的微量透析装置，其特征在于管盖(13)内壁上有内螺纹，与内套管(10)的外螺纹正好相配。

9.一种蛋白质微量透析装置的使用方法，其特征在于按照以下步骤操作：

a)取一张大小适当的半透膜(11)，居中包裹住内套管底部，用一只橡胶圈(12)从下向上把半透膜(11)紧紧地捆扎在内套管(10)的外壁上；

b)在水平桌面上，把捆扎有半透膜(11)的内套管(10)紧密地插入相应大小的外套管(9)内；

c)向内套管(10)中加入适量的待透析的蛋白质样品；

d)盖上管盖(13)并旋紧；

e)根据外界缓冲溶液的高度拉出浮板下的轴杆(6)，至适当长度；

f)把两组相同的透析管组件(14)对称插入到浮板(1)的相应插孔(2、3、4)中；

g)在金属吸附罩(7)下吸附住一只磁力搅拌子(8)，小心地将整个微透析装置浮在缓冲溶液表面进行透析。

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