CN102695787A - 用于从木素纤维素原料产生trichodiene的丝状真菌和方法 - Google Patents

用于从木素纤维素原料产生trichodiene的丝状真菌和方法 Download PDF

Info

Publication number
CN102695787A
CN102695787A CN2010800446544A CN201080044654A CN102695787A CN 102695787 A CN102695787 A CN 102695787A CN 2010800446544 A CN2010800446544 A CN 2010800446544A CN 201080044654 A CN201080044654 A CN 201080044654A CN 102695787 A CN102695787 A CN 102695787A
Authority
CN
China
Prior art keywords
gene
filamentous fungus
trichodiene
tri4
tri6
Prior art date
Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
Pending
Application number
CN2010800446544A
Other languages
English (en)
Inventor
T·M·霍恩
Current Assignee (The listed assignees may be inaccurate. Google has not performed a legal analysis and makes no representation or warranty as to the accuracy of the list.)
Novo Nordisk AS
Original Assignee
Novo Nordisk AS
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by Novo Nordisk AS filed Critical Novo Nordisk AS
Publication of CN102695787A publication Critical patent/CN102695787A/zh
Pending legal-status Critical Current

Links

Images

Classifications

    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
    • C12N15/09—Recombinant DNA-technology
    • C12N15/11—DNA or RNA fragments; Modified forms thereof; Non-coding nucleic acids having a biological activity
    • C12N15/52—Genes encoding for enzymes or proenzymes
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N1/00—Microorganisms, e.g. protozoa; Compositions thereof; Processes of propagating, maintaining or preserving microorganisms or compositions thereof; Processes of preparing or isolating a composition containing a microorganism; Culture media therefor
    • C12N1/14—Fungi; Culture media therefor
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12P—FERMENTATION OR ENZYME-USING PROCESSES TO SYNTHESISE A DESIRED CHEMICAL COMPOUND OR COMPOSITION OR TO SEPARATE OPTICAL ISOMERS FROM A RACEMIC MIXTURE
    • C12P5/00—Preparation of hydrocarbons or halogenated hydrocarbons
    • C12P5/007—Preparation of hydrocarbons or halogenated hydrocarbons containing one or more isoprene units, i.e. terpenes

Landscapes

  • Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
  • Health & Medical Sciences (AREA)
  • Engineering & Computer Science (AREA)
  • Genetics & Genomics (AREA)
  • Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Organic Chemistry (AREA)
  • Wood Science & Technology (AREA)
  • Zoology (AREA)
  • Biotechnology (AREA)
  • Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
  • General Engineering & Computer Science (AREA)
  • Biomedical Technology (AREA)
  • General Health & Medical Sciences (AREA)
  • Biochemistry (AREA)
  • Microbiology (AREA)
  • Molecular Biology (AREA)
  • Medicinal Chemistry (AREA)
  • Virology (AREA)
  • Tropical Medicine & Parasitology (AREA)
  • Mycology (AREA)
  • Chemical Kinetics & Catalysis (AREA)
  • General Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Botany (AREA)
  • Physics & Mathematics (AREA)
  • Biophysics (AREA)
  • Plant Pathology (AREA)
  • Micro-Organisms Or Cultivation Processes Thereof (AREA)
  • Preparation Of Compounds By Using Micro-Organisms (AREA)
  • Solid Fuels And Fuel-Associated Substances (AREA)

Abstract

本发明涉及从木素纤维素或其他原料产生C-15燃料。特别是具有类异戊二烯途径的丝状真菌的至少双重突变体导致trichodiene以商业量产生。本发明的一个实施方案涉及在木素纤维素原料的原位产生燃料以减少运输原料的成本。

Description

用于从木素纤维素原料产生trichodiene的丝状真菌和方法
本申请要求2009年8月5日提交的美国临时申请号61/231,374(通过提述以其整体并入本文)的优先权。
著作权通告
本专利的公开的一部分含有受著作权保护的材料。著作权所有人不反对任何人将本专利文件或专利公开按其出现在专利和商标局专利文件或记录中的形式复制，但在其他情况下保留所有著作权权利。
发明背景
发明领域
本发明涉及使用生物质原料如木素纤维素原料从丝状真菌产生trichodiene。具体而言，本发明涉及具有单端孢霉烯(trichothecenes)途径的丝状真菌，和使用生物质原料产生trichodiene的方法，其中所述真菌是不具有或具有低Tri4表达，或Tri4抑制，和Tri5、Tri6或Tri10中至少一种的表达增加的突变体真菌。
背景技术
目前世界对于使用石油燃料用于运输的依赖性呈现以增加的CO2水平的形式的对全球环境的威胁和许多国家的能源安全性减少。从植物材料产生液体运输燃料提供了对于基于石油的燃料的可再生的备选形式。
随着过去数年中生物燃料工业的发展，显然对于可持续性和经济可行性的两个关键要素是原料的选择和产生的燃料的性质。例如，在美国，由于利益竞争，将玉米用作供燃料乙醇生产的原料被视为对食物和饲料商品价格具有直接和间接的负面作用。这些作用加速了开发非食物相关原料如木素纤维素以供生物燃料生产的努力。对于生物燃料的主要研究和开发在于乙醇生产，尽管将木素纤维素用于乙醇生产的重要技术和经济障碍尚未得到解决(remainunadressed)。
还公认选择的生物燃料的化学性质可对生物燃料的经济学有显著影响。如此，仍有对乙醇的备选燃料的商业需求，所述燃料在加工方面需要较低能量输入，更加适于管道运输，且与石油运输燃料具有更佳的相容性。
trichodiene是最初从真菌粉红单端孢霉(Trichothecium roseum)分离的环烃[S.Nozoe和Y.Machida,Tetrahedron 28:5105-5111(1972)]。目前供大规模通过真菌产生trichodiene和其他萜类化合物(terpenoids)的技术常常涉及导入异源生物合成途径或使用靶向或非靶向的遗传改变机理通过诱变来操纵天然途径。然而，大量产生trichodiene先前在经济上是不可行的。
能够累积大量倍半萜烃类如trichodiene的真菌，代表了供商业产生生物燃料和其他有价值的类异戊二烯如类胡萝卜素的有吸引力的系统。已经对于几种镰孢属(Fusarium)菌种如拟分枝孢镰孢(Fusarium sporotrichioides)、禾本科镰孢(Fusarium graminearum)和接骨木镰孢(Fusarium sambucinum)观察到了大量倍半萜真菌毒素如单端孢霉烯的产生。其中最多产之一的是拟分枝孢镰孢，据报道，其产生多至2.9g单端孢霉烯/升培养基(Fusarium sporotrichioidesCurr.Genet.24:291-295)。在单端孢霉烯途径中设计用于抑制途径中第二个酶步骤或导致其丧失功能(Tri4基因产物)的化学或遗传阻断的引入导致倍半萜烃trichodiene的累积。Tri4基因产物的几种化学抑制剂，包括植物生长调节化合物嘧啶醇(ancymidol)，已知导致trichodiene累积，而来源于NRRL3299(NRRL 18340)(MB5493)(T-0927)的拟分枝孢镰孢的突变株仅产生trichodiene而不产生其他单端孢霉烯途径中间物。通过导致Tri4功能丧失的分子遗传方法在拟分枝孢镰孢中破坏Tri4基因，亦导致trichodiene的累积。
发明内容
本发明涉及下述发现：具有Tri4基因本身降低、不发挥功能或受(化学或生物)抑制并具有一种或多种来自Tri5，Tri6和Tri10的组的基因产物升高的单端孢霉烯生物合成途径的丝状真菌产生trichodiene产生的改进，并改进生物质原料利用的效率，即产生酶，减少成本，并提供小规模生产的机会。
因此，在本发明的一个实施方案中，存在产生trichodiene的突变体丝状真菌，其具有单端孢霉烯途径，所述途径包含：
a)经破坏的Tri4基因或具有低P450单加氧酶产生的突变体Tri4基因；和
b)经修饰的核酸序列，其编码至少一种选自下组的基因：Tri5，Tri6和Tri10，所述序列经修饰使得所述丝状真菌与亲本丝状真菌细胞相比，当在相同条件下培养时，多产生至少10%的trichodiene。
在本发明的另一个实施方案中，公开了产生trichodiene的突变体丝状真菌，其具有单端孢霉烯途径，所述途径包含：
a)经修饰的核酸序列，其编码至少一种选自下组的基因：Tri5，Tri6和Tri10，所述序列经修饰而增加基因产物的产生；和
b)足以抑制至少一部分Tri4基因产物的Tri4抑制剂的存在；
其中所述丝状真菌与亲本丝状真菌细胞相比，当在相同条件下培养时，多产生至少10%的trichodiene。
还在本发明的另一个实施方案中，公开了产生trichodiene的方法，包括：
a)选择突变体丝状真菌，其具有单端孢霉烯途径，所述途径包含：
i.一种或多种经破坏的Tri4基因，具有低P450单加氧酶产生的突变体Tri4基因，以及所述真菌，与Tri4基因产物抑制剂组合；
ii.修饰的核酸序列，其编码至少一种选自下组的基因：Tri5，Tri6和Tri10，所述序列经修饰而增加基因产物的产生；
b)使用选自下组的生长培养基培养所述突变体丝状真菌：糖、淀粉、纤维素和半纤维素；和
c)从生长培养基分离trichodiene，
其中所述丝状真菌与亲本丝状真菌相比，当在相同条件下使用相同生长培养基培养时，多产生至少10%的trichodiene。
附图说明
图1是供产生异戊烯焦磷酸(“IPP”)的甲羟戊酸(“MEV”)途径的概略表示。
图2是在Tri4突变体中将异戊烯焦磷酸(“IPP”)转化为法尼焦磷酸(“FPP”)和trichodiene的概略表示。
图3显示表达质粒基因的图谱。
图4显示表达质粒pDOR311的图谱。
图5显示表达质粒pDOR312的图谱。
图6显示表达质粒pDOR313的图谱。
图6显示表达质粒pDOR313的图谱。
图8显示表达质粒pDOR315的图谱。
本发明的详述
尽管本发明具有多种不同形式的实施方案，其示于附图并在本文中在具体特定实施方案中描述，应理解此类实施方案的本公开应视为原理的实例，而并非旨在将本发明限制于显示并描述的特定实施方案。在下文描述中，使相同的参照数字(reference numeral)用于在附图的多幅图像中描述相同、类似或对应的部分。该具体描述限定本文中使用的术语的意义，并具体描述了实施方案使得本领域技术人员实施本发明。
定义
术语“一个”或“一种”(“a or an”)，如用于本文，定义为一个(种)或多于一个(种)。术语“复数(plurality)”，如用于本文，定义为两个(种)或大于两个(种)。术语“另一个(种)(another)”，如用于本文，定义为至少第二或第更多个(种)。术语“含有(including)”和/或“具有(having)”如用于本文，定义为包含/包括(comprising)(即开放式语言)。术语“偶联的(coupled)”如用于本文，定义为连接的，尽管无需直接连接且无需机械连接。
本文全文中对“一个实施方案(one embodiment)”，“某些实施方案(certainembodiments)”和“一个实施方案(an embodiment)”或类似的术语意指针对该实施方案所述的具体特征、结构或特性包含于本发明的至少一个实施方案中。因此，在本说明书中在多处此类短语的出现并不需要均指同一个实施方案。此外，可以以任何合适的方式在一个或多个实施方案中不加限制地组合所述具体特征、结构和特性。
术语“或”，如用于本文，应解释为包含性(inclusive)，或意指任一或任意组合。因此，“A、B或C”意指任何下述含义中：“A；B；C；A和B；A和C；B和C；A、B和C”。仅当要素、功能、步骤或作用的组合在一些方面固有地相互排斥时，才会出现对该定义的例外。
附图中显示的图仅为说明本发明的某些方便的实施方案的目的，且不应视作对其的限制。术语“手段(means)”之前为动作的现在分词时，表示期望的功能，且存在一种或多种实施方案，即一种或多种方法、装置(device)或设备(apparatus)，以供实现该期望的功能，且本领域技术人员可根据本文的公开来从这些或其等同方式选择，而且，术语“手段”的使用并非意欲为限制性的。
术语“可操作地连接”指在同一DNA分子上生物组件的并置，处于允许它们以它们的意欲连接方式起作用的关系。例如，当启动子影响核苷酸序列的转录或表达时，该启动子可操作地连接于该核苷酸序列。
术语“突变体”指通过涉及单端孢霉烯产生的一种或多种基因的修饰(例如破坏或缺失Tri4基因使得Tri4基因不再起作用)而与亲本细胞相关的细胞。适于本发明目的的物理或化学诱变剂的实例包括紫外线(UV)照射，羟胺，N-甲基-N’-硝基-N-亚硝基胍(MNNG)，O-甲基羟胺，亚硝酸，甲磺酸乙酯(EMS)，亚硫酸氢钠，甲酸和核苷酸类似物。当使用此类试剂时，诱变通常通过将待诱变的亲本细胞在所选诱变剂存在下在合适条件下温育，并选择呈现基因表达减少或无基因表达的突变体细胞来进行。
基因的修饰或失活亦可通过在基因或其转录或翻译所需的调节元件中导入、取代或去除一个或多个核苷酸来达成。例如，可插入或去除核苷酸从而导致终止密码子的导入，起始密码子的去除或开读框的改变。此种修饰或失活可依照本领域已知方法通过定位诱变或PCR生成的诱变来达成。虽然原理上修饰可在体内进行，即直接对表达待修饰的基因的细胞进行，但优选该修饰如下文例示在体外进行。
或者，基因的修饰或失活可通过已确立的反义技术使用与所述基因核酸序列互补的核苷酸序列来进行。更具体而言，丝状真菌细胞对该基因的表达可通过导入与所述基因的核酸序列互补的核苷酸序列(其可在细胞中转录，并能够与细胞中产生的mRNA杂交)来减少或消除。在允许互补的反义核苷酸序列与mRNA杂交的条件下，翻译得到的蛋白的量由此减少或消除。
术语“丝状真菌”包括真菌门(Eumycota)和卵菌门(Oomycota)亚门的所有丝状形式(如由Hawksworth等,于Ainsworth and Bisby's Dictionary of The Fungi,第8版,1995,CAB International,University Press,Cambridge,UK所定义)。丝状真菌通常的特征在于由壳多糖(chitin)、纤维素、葡聚糖、壳聚糖(chitosan)、甘露聚糖和其它复杂多糖组成的菌丝体壁。通过菌丝延伸进行营养生长，而碳分解代谢是专性需氧的。相反，酵母例如酿酒酵母的营养生长通过单细胞菌体的出芽生殖(budding)进行，而碳分解代谢可以是发酵的。在本发明的方法中，所述丝状真菌细胞可为野生型细胞或其突变体。此外，所述丝状真菌细胞可为不产生任何可检测的单端孢霉烯，但含有编码单端孢霉烯的基因的细胞。优选地，所述丝状真菌细胞为枝顶孢霉属(Acremonium)、曲霉属(Aspergillus)、短梗霉属(Aureobasidium)、隐球菌属(Cryptococcus)、Filibasidium、镰孢属(Fusarium)(例如禾本科镰孢、拟分枝孢镰孢、镶片镰孢)、赤霉属(Gibberella)、腐质霉属(Humicola)、梨孢菌属(Magnaporthe)、毛霉属(Mucor)、毁丝霉属(Myceliophthora)、漆斑菌属(Myrothecium)、新考玛脂霉属(Neocallimastix)、脉孢菌属(Neurospora)、拟青霉属(Paecilomyces)、青霉属(Penicillium)、瘤胃壶菌属(Piromyces)、葡萄穗霉属(Stachybotrys)、裂褶菌属(Schizophyllum)、踝节菌属(Talaromyces)、嗜热子囊菌属(Thermoascus)、梭孢壳属(Thielavia)、弯颈霉属(Tolypocladium)、木霉属(Trichoderma)、或单端孢霉(Trichothecium)属细胞。
术语“单端孢霉烯”在本文中定义为通过一系列加氧、异构化、环化和酯化从trichodiene得到更复杂的单端孢霉烯而产生的倍半萜环氧化物家族。单端孢霉烯包括但不限于：2-羟基trichodiene，12,13-环氧-9,10-trichoene-2-醇、isotrichodiol、isotrichotriol、trichotriol、isotrichodermol、isotrichodermin、15-decalonectrin、3,15-didecalonectrin、脱氧雪腐镰孢烯醇(deoxynivalenol)、3-乙酰脱氧雪腐镰孢烯醇、calonectrin、3,15-二乙酰氧藨草镰孢烯醇(3,15-diacetoxyscirpenol)、3,4,15-三乙酰氧藨草镰孢烯醇(3,4,15-triacetoxyscirpenol)、4,15-二乙酰氧藨草镰孢烯醇(4,15-diacetoxyscirpenol)、3-乙酰新茄病镰孢烯醇(3-acetylneosolaniol)、乙酰T-2毒素和T-2毒素；及其衍生物。单端孢霉烯生物合成途径显示于图2(Microbiol.Rev.,57:595-604)。
术语“组成型活性”指表达的且未知其受调节而完全停止表达的启动子，即其总是开启的，且并不完全依赖于被某些其他生物系统的激活。
术语“诱导型”或“诱导型活性”指其活性水平响应于用外源信号或试剂的处理而增加的启动子。
术语“不可回复的位点选择缺失(nonrevertable site-selected deletion)”指缺失显著量的Tri4 DNA序列使得生物无法回复至野生型。对于，回复是以天然出现或诱导的点突变存在的随时间的有限可能性，其中单个突变可容易地在用于产生活性基因产物的产生过程中天然突变回来(mutate back)。本发明的缺失包括大缺失或活性位点缺失，后者涉及活性位点残基的单个密码子。
术语“基因产物”指由DNA编码的RNA(或反之)，或者由RNA或DNA编码的蛋白，其中基因通常会包含一个或多个编码蛋白的核苷酸序列，且亦可包含内含子和其他非编码核苷酸序列。
术语“多至少10%的trichodiene”指当将修饰的菌株与亲本株或野生型株相比时，如通过化学分析方法测量并表示为克trichodiene每升培养物或克trichodiene每克真菌培养物干重的由真菌细胞产生的trichodiene的量的增加。
术语“酶或催化活性”指Tri4基因产物催化用于产生加氧的trichodiene产物所需的trichodiene化学转化的能力。
术语“低P450单加氧酶产生”指使得与通过化学分析在相同生长条件下在亲本株或野生型株中观察到的水平相比，产生的trichodiene的水平高超过10%的在Tri4突变株或Tri4抑制株中产生的具有酶活性的Tri4基因产物的量。
术语“自主维持(autonomous maintenance)”指在丝状真菌细胞内独立于染色体DNA而复制的DNA或载体。对于自主复制，所述DNA或载体可进一步包含使得载体能够在讨论的丝状真菌细胞中自主复制的复制起点。
术语“启动子”指含有基因的DNA序列中提供RNA聚合酶结合和转录起始的部分，且因此指能够控制编码序列或功能性RNA的表达的DNA序列。启动子序列通常但非总是见于基因的5’非编码区，在编码多肽的一个或多个开读框上游。在启动子内在转录起始中发挥功能的序列元件通常由共有核苷酸序列所表征。启动子序列可包含近端和更远端的上游元件。启动子可例如为组成型、诱导型或环境应答的(environmentally responsive)。
术语“终止子”指由丝状真菌细胞识别以终止转录的序列。Tri5终止子序列可操作地连接于编码Tri6或Tri10多肽的核酸序列的3’端。任何在丝状真菌细胞中起作用的终止子可用于本发明。
就本发明而言，术语“抑制剂”指由于该物质与酶相互作用从而减少反应速率而阻止酶过程的物质。
术语“单端孢霉烯途径”在本文中用于指将法尼焦磷酸(FPP)转化为单端孢霉烯的生物合成途径。单端孢霉烯途径的最先两步概略性图示于图2。
术语“葡萄糖当量”用于描述淀粉或纤维素水解为葡萄糖单体的水解程度或已经或潜在地可转化为还原糖的总固形物的百分比。
术语“生物质”指任何可用于生物燃料或生物产品工业工艺的生物材料，包括但不限于木素纤维素、藻类、藻工艺废物、壳多糖、壳聚糖、果胶(包括甜菜工艺残余物)和蛋白(包括油籽压榨残余物)。其他材料在本领域中是已知的，且可由本领域技术人员鉴定。
术语“木素纤维素原料”指使用由木素纤维素(纤维素、半纤维素和木质素)组成的植物生物质作为原料以供生物燃料和生物产品工业工艺。木素纤维素(纤维素和半纤维素)的糖聚合物紧密结合于木质素，并不易受酶水解接近。木素纤维素原料包括但不限于农业残余物(包括玉米秸秆、麦秆和甘蔗渣)，能量作物(包括高粱、柳枝稷和芒草属)、木质残余物(包括锯木厂和造纸厂丢弃物)、林业废物、工业废物(包括造纸厂污泥(paper sludge))和城市纸和园林废物(municipalpaper and landscape waste)。其他材料是已知的，且可由本领域技术人员鉴定。
术语“载体”指转导、转化或感染宿主株，由此导致细胞产生除了对于细胞是天然的那些之外的核酸和/或蛋白，或以对于细胞非天然的方式表达核酸和/或蛋白的核酸序列或分子(例如质粒)。或者，所述载体可含有其他核酸序列以供指导通过同源重组整合入丝状真菌细胞的基因组。所述其他的核酸序列使得载体能够在染色体上的精确位置整合入基因组。为了增加在精确位置处整合的可能性，整合元件应优选含有合适数量的核酸，如100至1500碱基对，优选400至1500碱基对，且最优选800至1500碱基对，其与对应的靶序列高度同源以增强同源重组的可能性。所述整合元件可为任何与丝状真菌细胞基因组中的靶序列同源的序列。此外，所述整合元件可为非编码或编码核酸序列。另一方面，所述载体可通过非同源重组整合入细胞基因组。
术语“生长培养基培养”指在适于使用本领域已知方法产生trichodiene的营养培养基中进行的培养。例如，所述细胞可用合适的培养基和在允许分泌和/或分离trichodiene的条件下通过摇瓶培养，或者在实验室或工业发酵器中的小规模或大规模发酵(包括连续、分批、补料分批或固态发酵)进行培养。包含碳源和氮源和无机盐的合适的营养培养基和无机盐可从商业供应商获得，或可使用生物质作为培养基碳源来制备。根据本发明，本领域技术人员可使用最少的实验产生适当的培养物。
术语“亲本株”指经突变、电穿孔，或者以其他方式改变以提供本发明的株或宿主株的微生物株，或者在经突变、电穿孔，或者以其他方式改变以提供本发明的株或宿主株的株原先的株。
术语“修饰核酸序列”指从天然存在的基因分离，或经修饰而含有以自然界中本不存在的方式缺失、组合和/或并置的核酸区段的单链或双链核酸分子。
词语“焦磷酸”在本文中可与“二磷酸”互换使用。
术语“亲本株”在本文中用于指可插入或已经插入异源核酸的任何古菌(archae)、细菌或真核活细胞。该术语亦指起始细胞的后代，其可能由于天然的、偶然的或故意的突变而无需在形态或基因组或总DNA互补方面与起始亲本完全相同。
术语“转化”指在导入新核酸之后在细胞中诱导的永久性或暂时性遗传变化。遗传变化(“修饰”)可通过将新DNA并入宿主株的基因组，或通过将新DNA作为附加体元件暂时或稳定维持来达成。在真核细胞中，永久性遗传变化一般通过将DNA导入细胞基因组来达成。
丝状真菌中的单端孢霉烯生物合成途径对于本领域技术人员是较为公知的。图1和图2的描述概述了单端孢霉烯合成途径以及其在类异戊二烯合成途径中的位置。图2亦描述了使用本文关注的途径的已知燃料产物生产。该途径存在于多种丝状真菌，包括但不限于如枝顶孢霉属(Acremonium)、曲霉属(Aspergillus)、短梗霉属(Aureobasidium)、隐球菌属(Cryptococcus)、Filibasidium、镰孢属(Fusarium)、赤霉属(Gibberella)、腐质霉属(Humicola)、梨孢菌属(Magnaporthe)、毛霉属(Mucor)、毁丝霉属(Myceliophthora)、漆斑菌属(Myrothecium)、新考玛脂霉属(Neocallimastix)、脉孢菌属(Neurospora)、拟青霉属(Paecilomyces)、青霉属(Penicillium)、瘤胃壶菌属(Piromyces)、葡萄穗霉属(Stachybotrys)、裂褶菌属(Schizophyllum)、踝节菌属(Talaromyces)、嗜热子囊菌属(Thermoascus)、梭孢壳属(Thielavia)、弯颈霉属(Tolypocladium)、木霉属(Trichoderma)、或单端孢属(Trichothecium)的种。
在一个实施方案中，所述丝状真菌是拟分枝孢镰孢如NRRL3299。在该途径中，法尼焦磷酸的产生在这些真菌中是保守的，而Tri5基因产物，trichodiene合酶，在该途径中负责将FPP转化为trichodiene。trichodiene是C-15(15个碳原子)的二环烃类，其若以大于0.1g、0.22g或0.25g每克消耗的葡萄糖或葡萄糖当量的充足量产生，可考虑用作C-15烃燃料的商业来源。在一个实施方案中，所述C-15燃料是柴油和/或喷气燃料。Tri5基因产物的产生至少部分是由Tri6基因产物调节的，后者是在类异戊二烯途径中控制FPP合酶和Tri5基因产物的表达的正转录因子。Tri10基因产生对于类异戊二烯途径中的Tri5、Tri6和FPP合酶为正调节剂的产物。Tri6和Tri10两者表现对FPP合酶、HMG CoA还原酶合酶和甲羟戊酸激酶和其余类异戊二烯途径的途径酶的表达的控制，并负责中间产物进入单端孢霉烯途径的流动的上调。此外，Tri6和Tri10均已知具有调节Tri4和Tri5的活性。将这些基因的多个拷贝导入天然株背景导致“单端孢霉烯”的高水平产生，而在本发明之前未显示Tri6、Tri5和Tri10基因的中断或增强，更不用说显示其与Tri4突变体的组合。在本发明之前，并未表明这些修饰的组合会共同作用，更不用说产生对trichodiene产生的改善的或协同的效果。
Tri4基因编码在单端孢霉烯生物合成途径中用于从trichodiene转化为2-羟基trichodiene的酶的产生。酶P450单加氧酶成为trichodiene转化中的限速步骤。Tri4基因还由Tri6和Tri10调节。Tri4、Tri5、Tri6和Tri10的分离和表征显示其均位于拟分枝孢镰孢中的基因簇中的10kb DNA片段上。已知其位于与其他产生单端孢霉烯的丝状真菌中的类似位置处。
本发明涉及在具有类异戊二烯途径的丝状真菌中以足以具有商业意义的量产生C-15烃(其可用于喷气燃料和柴油燃料生产)。通过将Tri4的(生物或化学)破坏或部分阻断与导致增加的trichodiene产生或减少的trichodiene转化为2-羟基trichodiene(通过减少Tri6或Tri10对Tri4的调节)Tri5、Tri6或Tri10中的至少一种其他修饰相组合，可在丝状真菌中产生并分离商业量的trichodiene用于类异戊二烯途径。该修饰可为基因全部或部分的添加或缺失，其他基因的取代，例如，发现具有组成型活性的基因或其他任何本领域中已知的根据需要增加基因的产生或活性或其他性质的修饰。然后，该菌种中的产生会代表相对于生产细菌或其他物种的巨大改善，因为其可在有氧条件下进行，且燃料产物与水发生相分离，使该工艺在配置于小规模生产设施如农场中(on-farm)的trichodiene生产设施或糖或木素纤维素材料(生物质)所处于的其他位置时更加合算。此外，由于这些真菌菌种的大多数能够利用多种不同生物质原料如纤维素、半纤维素糖源、藻类蛋白、藻类多糖等以供产生，其代表允许使用木素纤维素原料而无需通常使得其他工艺过于昂贵和费力的大量添加加工酶以供向组分糖或木素纤维素原料的转化的实际改善。丝状真菌生产系统即使未消除，也极大地减少了对酶的需求，因此提供了燃料的生物生产的新型实际方案，因为其可以以小规模在当地生产，且其可方便地提供对于原料运输成本和后勤问题的有效解决方案，所述问题对于任何方法在一些情况下可为比燃料生产自身更大的障碍。
本发明的丝状真菌具有经修饰以减少或消除Tri4基因产物P450单加氧酶产生的Tri4基因。若无该酶，trichodiene即无法在转化步骤的下一步中转化。显然阻断该酶的效用或其产生的化学修饰会实现相同目的，并视作用于阻断酶产生或活性的手段的部分。
然后将Tri4修饰/处理与至少一种对Tri5、Tri6或Tri10基因/基因产物的修饰相组合，使得可产生甚至更大量的trichodiene。已确定至少双重突变体与任何单一突变体相比产生更多trichodiene，且在一些情况下为协同增加。产生这些突变体是困难的，且除非申请人公开，不会有人得知可获得此类突变体，不会有人付出劳动以将trichodiene产生改善至商业水平。显然，同样可组合基因中的多重突变以给出甚至更高的trichodiene产生。
对Tri4基因的修饰是已知的。对其他基因序列的修饰可通过任何已知用于基因修饰以增加或减少基因产物等的活性的方法来获得。具有产生双重突变体的知识的本领域技术人员可容易地制备此类双重突变体而无需不必要的实验。
现参见附图。图2是选择在具有类异戊二烯产生途径的丝状真菌中trichodiene产生途径的流程图。由其可见，法尼焦磷酸仅由Tri5基因产物反应以产生trichodiene。然后Tri4基因产物与trichodiene反应以产生2-羟基trichodiene，其进一步被代谢为单端孢霉烯。Tri6和Tri10基因产物在该途径中作为调节控制起作用，并因此其与对Tri4产物的产生的修饰的组合导致产生了商业数量的trichodiene。
在图1中，为类异戊二烯生物合成途径的一般流程图。尽管在该途径中产生了汽油、柴油、喷气燃料，本发明主要涉及柴油和喷气燃料的产生。
实施例
列出了下述实施例以提供本领域一般技术人员如何制备和使用本发明的完整公开和描述，且并不旨在限制发明人认为是其发明的范围，亦不旨在代表下述实验是进行的所有或仅有的实验。进行了努力以确保对于使用的数字(例如量、温度等)的精确度，然而应允许一些实验误差和偏差。除非另行指明，份是重量份，分子量是重均分子量，温度是℃，压力是大气压或接近大气压。可使用标准缩写，例如bp，碱基对；kb，千碱基；pl，皮升；s或sec，秒：min，分钟；h或hr，小时；aa，氨基酸；nt，核苷酸；i.m.，肌肉内；i.p.，腹膜内；s.c.，皮下；等等。
实施例1
选择了具有Tri4序列缺失的丝状真菌拟分枝孢镰孢NRRL3299，因此其无法产生Tri4基因产物。观察到了trichodiene的累积。处理该生物体以修饰Tri6基因以具有组成型活性，因此增加FPP的产生和进一步增加trichodiene产生。
实施例2
再次修饰NRRL 3299，这次修饰了Tri6和Tri10基因使得Tri5基因产物的产生增加。在相关的实施例中，使得Tri6、Tri10或两种基因组成型活化。
实施例3
丝状真菌拟分枝孢镰孢NRRL 18340是Tri4突变体，并累积trichodiene。处理该生物体以修饰Tri6以具有组成型活性，由此增加FPP的产生，并进一步增加trichodiene产生。
实施例4
再次修饰NRRL 18340，这次修饰了Tri6和Tri10基因使得Tri5基因产物的产生增加。在相关的实施例中，使得Tri6、Tri10或两种基因组成型活化。
实施例5
再次修饰NRRL 3299，这次修饰了Tri6和Tri10基因，并导入了一个或多个额外的Tri5拷贝使得Tri5基因产物的产生增加。在相关的实施例中，使得Tri6、Tri10或两种基因组成型活化。
实施例6
再次修饰NRRL 3299，这次使用来自另一个真菌菌种的Tri6和/或Tri10基因。修饰了Tri6和Tri10基因两者使得Tri5基因产物的产生增加。在相关的实施例中，使得Tri6、Tri10或两种基因组成型活化。
实施例7
生成编码Tri6-PK和Tri10-P1的表达质粒
通过将Tri6-PK-Th10-P1基因片段插入pDOR101载体来生成表达质粒pDOR311。通过将包含Hyg-P1基因的DNA合成构建体插入pUC57(GenBank登录号Y14837)的EcoRV限制位点来生成载体pDOR101(图3)。Hyg-P1由三个基因元件组成(表1)，包括具有异旋孢腔菌(Cochliobolus heterostrophus)P1启动子序列(GenBank登录号CCLPROA REGION:1..645)和玉米赤霉(Gibberella zeae)Ti5终止子序列(GenBank登录号AF359361 REGION:32132..32484)的编码大肠杆菌潮霉素磷酸转移酶(GenBank登录号V01499)的潮霉素抗性选择性标记基因。Ti6-PK基因(SEQ ID NO:1)通过DNA合成生成，并作为钝端片段克隆入pUC57的EcoRV限制位点以生成pDOR102。Th6-P1由玉米赤霉，Tri6编码区(GenBank登录号AF359361 REGION:27401..28057)，玉米赤霉Th5终止子序列，和玉米赤霉丙酮酸激酶启动子序列(GenBank登录号FG10743.1 REGION:3790933..3792134)组成。Tri10-P1基因(SEQ ID NO:2)通过DNA合成生成，并作为钝端片段克隆入pUC57的EcoRV限制位点以生成pDOR103。TM10-P1由玉米赤霉，Tri10编码区(GenBank登录号AF359361 REGION:32799..34151)，玉米赤霉Tri5终止子序列，和异旋孢腔菌P1启动子序列组成，其中在所述Tri10编码区中在编码序列的位置570和771导入两个保守的C至T核苷酸变化，设计用于消除两个共有Tri6 DNA结合位点(YNAGGCC)，认为其在Tri10基因表达的负调节中起作用(Tag,A G.,Gaifullina.G.F.,Peplow，A.W.,Ake Jr,C;Phillips,T.D.,Hohn,T.M.&Beremand,M.N.(2001)A Novel Regulatory Gene,Tri10,ControlsTichothecene Toxin Production and Gene Expression,Appl.Environ.Microbiology,67:5294-5302)。为了构建Tri6-PK-Ti10-P1片段，用限制酶XbaI和MluI将pDOR102 DNA消化至完全，并通过凝胶电泳解析反应混合物，并凝胶提取1.7kbTri6-PK片段。将分离的片段与经限制酶SpeI和MluI消化的pDOR103 DNA相连接以生成质粒pDOR203。用限制酶XhoI和NheI将pDOR203 DNA消化至完全，并通过凝胶电泳解析反应混合物，并凝胶提取4.9kb Tri6-PK-Tri10-P1片段。将分离的片段连接入经XhoI XbaI消化的pDOR101，得到表达质粒pDOR311。pDOR311的核苷酸序列在SEQ ID NO:3中给出，而质粒图在图4中给出。
表1
表达质粒基因元件
Figure BDA00001503874100131
Figure BDA00001503874100141
通过去除pDOR311中的Tri10-P1基因来生成表达质粒pDOR312。用SpeI和XbaI限制酶将pDOR311质粒DNA消化至完全，通过凝胶过滤解析反应混合物，并凝胶提取7.3kb片段。分离的片段自连接得到表达质粒pDOR312。pDOR312的核苷酸序列在SEQ ID NO:4中给出，而质粒图在图5中给出。
通过去除pDOR311中的Tri6-PK基因来生成表达质粒pDOR313。用HpaI限制酶将pDOR311质粒DNA消化至完全，通过凝胶过滤解析反应混合物，并凝胶提取7.2kb片段。分离的片段自连接得到表达质粒pDOR313。pDOR313的核苷酸序列在SEQ ID NO:5中给出，而质粒图在图6中给出。
通过将Tri6-P1基因(SEQ ID NO:6)插入pDOR101载体来生成表达质粒pDOR314。使用引物DOR123(SEQ ID NO:7)和DOR107(SEQ ID NO:8)通过从质粒pDOR102中的合成Tri6-PK基因进行PCR扩增来生成Tri6-P1基因(图3)。用于扩增Tri6编码序列的上游引物包括第二个氨基酸的密码子中的变化(从Ile残基变为Val)，并导入了NcoI限制位点。使用NcoI和BsrGI限制酶将PCR产物消化至完全，通过凝胶过滤解析反应混合物，凝胶提取1.0kb DNA片段，并将分离的DNA片段连接入pDOR103的NcoI BsrGI限制酶位点以生成质粒pDOR202。用限制酶SpeI和SacI将pDOR202DNA消化至完全，并通过凝胶过滤解析反应混合物，并凝胶提取1.7kb Tri6-P1片段。将分离的片段连接入XbaI SacI消化的pDOR101，得到表达载体pDOR314。pDOR314的核苷酸序列在SEQ ID NO:9中给出，而质粒图在图7中给出。
通过将编码拟分枝孢镰孢trichodiene合成酶基因(Tri5)的核苷酸序列插入表达质粒pDOR312来生成表达质粒pDO315。所述Tri5基因包括Tri5启动子、编码序列和终止子序列，且会预期其复制增加trichodiene产生中此关键酶的表达。使用引物DOR121(SEQ ID NO:10)和DOR122(SEQ ID NO:11)通过从拟分枝孢镰孢T-0926(NRRL 3299，从Pennsylvania State University，Fusarium ResearchCenter获得)基因组DNA PCR扩增Tri5基因(GenBank登录号AF359360REGION:26809..29642)来生成Tri5基因片段。上游引物构建了NheI限制位点，而下游引物构建了XmaI限制位点。使用NheI和XmaI限制酶将PCR产物消化至完全，通过凝胶过滤解析反应混合物，凝胶提取2.8kb DNA片段，并将分离的DNA片段连接入表达质粒pDOR313的AvrII XmaI限制酶位点。pDOR315的核苷酸序列在SEQ ID NO:12中给出，而质粒图在图8中给出。
实施例8
该实施例描述了可用于本发明的拟分枝孢镰孢宿主株的生成。
通过用实施例1的表达质粒之一转化拟分枝孢镰孢T-0927(NRRL 18340，从Pennsylvania State University，Fusarium Research Center获得)亲本细胞来构建宿主株。DNA介导的进入拟分枝孢镰孢T-0927原生质体的转化是使用由(Royer,J.C,Moyer,D.L.,Reiwitch,S.G.,Madden,M.S.,Jensen,E.B.,Brown,S.H.,Yonker,CC,Johnstone,J.A.,Golightly,E.J.,Yoder,W.T.和Shuster,J.R.1995.Fusarium graminearum A 3/5as a novel host for heterologous proteinproduction.Nature Biotechnology 13:1479-1483)所述的聚乙二醇方法进行的。转化的宿主细胞起初在琼脂培养基(0.1%酪蛋白酶水解物，0.1%酵母提取物，1.6%琼脂和1M蔗糖)培养皿中生长，并在24小时之后，添加含有50μg/mL抗生素潮霉素的1%水琼脂覆盖物(overlay)以选择整合了表达质粒DNA的转化体。将在3至10日之后生长穿过覆盖物的单菌落转移至含有潮霉素(150μg/mL)的V8汁液琼脂(juice agar)(每升：180mL V8汁液，800mL水，2gCaCO3和15g细菌用琼脂)，并将培养物在28℃生长7至10日，然后在灭菌水中收获分生孢子。将分生孢子在冷冻小瓶中以由200μL灭菌50%甘油和800μL分生孢子悬液制成的1mL储备等分试样储藏于-80℃。转化体中的所有基因整合通过表型分析和基因组DNA对于代表整合的基因元件的DNA片段的聚合酶链式反应(“PCR”)分析来确证。表达质粒pDOR311、pDOR312、pDOR313、pDOR314、pDOR315使用pUC57载体构建，并概略性描述于图4-8和表1。质粒DNA的繁殖在大肠杆菌菌株DH5α中进行。
实施例9
该实施例说明亲本株拟分枝孢镰孢T-0926中trichodiene的产生相对于宿主株拟分枝孢镰孢T-0927增加。
拟分枝孢镰孢T-0927是来源于分离株拟分枝孢镰孢T-0926的UV突变株(Tri4-)，其在单端孢霉烯途径的Tri4步骤中阻断，并累积trichodiene。在V8琼脂培养基上构建拟分枝孢镰孢菌株T-0926和菌株T-0927的接种培养物。在7日之后，使用细胞刮具收获分生孢子，并用于以1x105个孢子/mL的起始数接种于各含有45mL的GYEP培养基(0.1%细菌用酵母提取物，0.1%细菌用蛋白胨和5%葡萄糖)的250mL烧瓶中。将培养物在28℃以200RPM在旋转振荡器上温育24小时，在此时点将其用5mL十二烷覆盖。在48小时，添加0.45ml的YEP培养基(5%细菌用蛋白胨和1%细菌用酵母提取物)，并在120小时之后将培养材料转移至50mL离心管，并在5000xg离心5分钟，之后对有机覆盖物层进行取样。确定真菌菌丝体的干重量，即在预干燥和预称重的过滤器上过滤培养材料，其在80℃干燥3日并称重以生成培养物干重(CDW)。
在分析之前，将体积为4μL的有机覆盖物样品添加至干净玻璃小瓶中作为内标的996μL含有β-或反式石竹烯(Sigma-Aldrich,St.Louis,Mo.)的异丙醇。将样品在偶联于配有7683系列注入器和自动取样器的5973质量选择性检测器，和配有Zebron ZB-Wax Plus蜡毛细管柱(0.25mm i.d.x 30m，具有0.25mm薄膜)(可从Agilent Technologies获得)的Hewlett-Packard 6890气相色谱上进行分析。对于所有实验，针取样深度设为8mm。将GC以2mL min-1的He流速进行操作，并将MSD在70eV进行操作。以250℃的注入器温度进行无分流注入(2μL)。对GC设置下述程序：起始加热器(oven)温度为50℃(5分钟维持)，然后增加10℃min-1至180℃(4分钟维持)，然后以100℃min-1急速上升(ramp)直至240℃(1分钟维持)。在获得MS数据之前包括了8.5分钟的溶剂延迟。通过使用Enhanced Chemstation (版本B.01.00,AgilentTechnologies)峰面积积分来对产物峰进行定量。基于其公开的trichodiene质量片段化谱(Desjardins AE,Plattner RD&Beremand MN.(1987)Ancymidolblocks trichothecene biosynthesis and leads to accumulation of trichodiene inFusarium sporotrichioides and Gibberella pulicaris.Appl.Environ.Microbiol.,53:1860-1865)鉴定trichodiene，且其使用该GC实验方案具有18.48分钟的保留时间。石竹烯用作定量标样，并具有15.92分钟的保留时间。基于GC峰面积/mg/mL确立了对石竹烯的响应因子(response factor)，其中对应于1.0mg/mL的浓度的石竹烯峰面积等于1.0CP单位。trichodiene效价计算为trichodiene的峰面积对石竹烯响应因子的峰面积的比例，并以CP单位报道。
在120小时生长之后，发现两个拟分枝孢镰孢T-0927培养物产生11和17CP单位trichodiene/g CDW，并发现两个拟分枝孢镰孢T-0926培养物均产生0.00CP单位trichodiene/g CDW。
实施例10
该实施例说明了表达Tri6-PK和Tri10-P1的宿主株中trichodiene的产生相对于亲本株拟分枝孢镰孢T-0927的产生增加。
通过将每种株的储备物等分试样在含潮霉素(150μg/mL)的V8琼脂培养基上生长7至10日来建立宿主株B01和B07(表2)的接种培养物。使用细胞刮具从接种培养物收获分生孢子，并用于以1x105个孢子/mL的起始数接种于不同的含有45mL的GYEP培养基(0.1%细菌用酵母提取物，0.1%细菌用蛋白胨和5%葡萄糖)的250mL烧瓶中。将培养物在28℃以200RPM在旋转振荡器上温育24小时，在此时点将其用5mL十二烷覆盖。在48小时，添加0.45ml的YEP培养基(5%细菌用蛋白胨和1%细菌用酵母提取物)，并在120小时之后将培养材料转移至50mL离心管，并在5000xg离心5分钟，之后对有机覆盖物层进行取样。确定真菌菌丝体的干重量，即在预干燥和预称重的过滤器上过滤培养材料，其在80℃干燥3日并称重以生成培养物干重(CDW)。
在分析之前，将体积为4μL的有机覆盖物样品添加至干净玻璃小瓶中作为内标的996μL含有石竹烯的异丙醇。将稀释的有机覆盖物样品如实施例3中所述在Hewlett-Packard 6890气相色谱/质谱仪(GC/MS)上进行分析。对每个宿主株使用两次重复进行实验，并将结果平均。
在120小时生长之后，发现宿主株B01和B07产生111CP单位trichodiene/g CDW trichodiene和103CP单位trichodiene/g CDW。发现亲本株拟分枝孢镰孢T-0927培养物产生14CP单位trichodiene g CDW。
表2
宿主株质粒来源
  宿主株   亲本株   表达质粒   真菌抗生素选择
  B01   拟分枝孢镰孢T-0927   pDOR311   潮霉素
  B07   拟分枝孢镰孢T-0927   pDOR311   潮霉素
  G08   拟分枝孢镰孢T-0927   pDOR312   潮霉素
  H03   拟分枝孢镰孢T-0927   pDOR313   潮霉素
  H07   拟分枝孢镰孢T-0927   pDOR313   潮霉素
  J01   拟分枝孢镰孢T-0927   pDOR314   潮霉素
  J10   拟分枝孢镰孢T-0927   pDOR314   潮霉素
  I01   拟分枝孢镰孢T-0927   pDOR315   潮霉素
实施例11
该实施例说明了表达Tri6-PK的宿主株中trichodiene的产生相对于亲本株拟分枝孢镰孢T-0927的产生增加。
通过将每种株的储备等分试样在含潮霉素(150μg/mL)的V8琼脂培养基上生长7至10日来建立宿主株G08的接种培养物。使用细胞刮具从接种培养物收获分生孢子，并用于以1x105个孢子/mL的起始数接种于不同的含有62.5mL的GYEP培养基(0.1%细菌用酵母提取物，0.1%细菌用蛋白胨和5%葡萄糖)的125mL烧瓶中。将培养物在28℃以200RPM在旋转振荡器上温育24小时，在此时点将其用6.25mL十二烷覆盖。在168小时之后，将45mL富集了有机层的培养材料转移至50mL离心管，并在5000xg离心5分钟，之后对有机覆盖物层进行取样。确定真菌菌丝体的干重量，即在预干燥和预称重的过滤器上过滤培养材料，其在80℃干燥3日并称重以生成培养物干重(CDW)。
在分析之前，将体积为4μL的有机覆盖物样品添加至干净玻璃小瓶中作为内标的996μL含有石竹烯的异丙醇。将稀释的有机覆盖物样品如实施例3中所述在Hewlett-Packard 6890气相色谱/质谱仪(GC/MS)上进行分析。
在168小时生长之后，发现宿主株G08产生268CP单位trichodiene/gCDW。发现亲本株拟分枝孢镰孢T-0927培养物产生27CP单位trichodiene gCDW。
实施例12
该实施例说明了表达Tri10-P1的宿主株中trichodiene的产生相对于亲本株拟分枝孢镰孢T-0927的产生增加。
通过将每种株的储备等分试样在含潮霉素(150μg/mL)的V8琼脂培养基上生长7至10日来建立宿主株H03和H07的接种培养物。使用细胞刮具从接种培养物收获分生孢子，并用于以1x105个孢子/mL的起始数接种于不同的含有62.5mL的GYEP培养基(0.1%细菌用酵母提取物，0.1%细菌用蛋白胨和5%葡萄糖)的125mL烧瓶中。将培养物在28℃以200RPM在旋转振荡器上温育24小时，在此时点将其用6.25mL十二烷覆盖。在168小时之后，将45mL富集了有机层的培养材料转移至50mL离心管，并在5000xg离心5分钟，之后对有机覆盖物层进行取样分析。确定真菌菌丝体的干重量，即在预干燥和预称重的过滤器上过滤培养材料，其在80℃干燥3日并称重以生成培养物干重(CDW)。
在分析之前，将体积为4μL的有机覆盖物样品添加至干净玻璃小瓶中作为内标的996μL含有石竹烯的异丙醇。将稀释的有机覆盖物样品如实施例3中所述在Hewlett-Packard 6890气相色谱/质谱仪(GC/MS)上进行分析。
在168小时生长之后，发现宿主株H03和H07产生143CP单位trichodiene/g CDW和150CP单位trichodiene/g CDW。发现亲本株拟分枝孢镰孢T-0927培养物产生27CP单位trichodiene g CDW。
实施例13
该实施例说明了表达Tri10-P1和多个Tri5的宿主株中trichodiene的产生相对于亲本株拟分枝孢镰孢T-0927的产生增加。
通过将每种株的储备等分试样在含潮霉素(150μg/mL)的V8琼脂培养基上生长7至10日来建立宿主株J01和J10的接种培养物。使用细胞刮具从接种培养物收获分生孢子，并用于以1x105个孢子/mL的起始数接种于不同的含有45mL的GYEP培养基(0.1%细菌用酵母提取物，0.1%细菌用蛋白胨和5%葡萄糖)的250mL烧瓶中。将培养物在28℃以200RPM在旋转振荡器上温育24小时，在此时点将其用5mL十二烷覆盖。在48小时，添加0.45ml的YEP培养基(5%细菌用蛋白胨和1%细菌用酵母提取物)，并在120小时之后将培养材料转移至50mL离心管，并在5000xg离心5分钟，之后对有机覆盖物层进行取样分析。确定真菌菌丝体的干重量，即在预干燥和预称重的过滤器上过滤培养材料，其在80℃干燥3日并称重以生成培养物干重(CDW)。
在分析之前，将体积为4μL的有机覆盖物样品添加至干净玻璃小瓶中作为内标的996μL含有石竹烯的异丙醇。将稀释的有机覆盖物样品如实施例3中所述在Hewlett-Packard 6890气相色谱/质谱仪(GC/MS)上进行分析。对每个宿主株使用两次重复进行实验，并将结果平均。
在120小时生长之后，发现宿主株J01和J10产生141CP单位trichodiene/gCDW和151CP单位trichodiene/g CDW。发现亲本株拟分枝孢镰孢T-0927培养物产生14CP单位trichodiene g CDW。
实施例14
该实施例说明了表达Tri6-P1的宿主株中trichodiene的产生相对于亲本株拟分枝孢镰孢T-0927的产生增加。
通过将每种株的储备等分试样在含潮霉素(150μg/mL)的V8琼脂培养基上生长7至10日来建立宿主株I01的接种培养物。使用细胞刮具从接种培养物收获分生孢子，并用于以1x105个孢子/mL的起始数接种于不同的含有62.5mL的GYEP培养基(0.1%细菌用酵母提取物，0.1%细菌用蛋白胨和5%葡萄糖)的125mL烧瓶中。将培养物在28℃以200RPM在旋转振荡器上温育24小时，在此时点将其用6.25mL十二烷覆盖。在168小时之后，将45mL富集了有机层的培养材料转移至50mL离心管，并在5000xg离心5分钟，之后对有机覆盖物层进行取样。确定真菌菌丝体的干重量，即在预干燥和预称重的过滤器上过滤培养材料，其在80℃干燥3日并称重以生成培养物干重(CDW)。
在分析之前，将体积为4μL的有机覆盖物样品添加至干净玻璃小瓶中作为内标的996μL含有石竹烯的异丙醇。将稀释的有机覆盖物样品如实施例3中所述在Hewlett-Packard 6890气相色谱/质谱仪(GC/MS)上进行分析。
在168小时生长之后，发现宿主株I01产生117CP单位trichodiene/gCDW。发现亲本株拟分枝孢镰孢T-0927培养物产生27CP单位trichodiene gCDW。
Figure IDA00001503874800011
Figure IDA00001503874800021
Figure IDA00001503874800031
Figure IDA00001503874800041
Figure IDA00001503874800051
Figure IDA00001503874800061
Figure IDA00001503874800071
Figure IDA00001503874800091
Figure IDA00001503874800101
Figure IDA00001503874800111
Figure IDA00001503874800121
Figure IDA00001503874800131
Figure IDA00001503874800141

Claims (22)

1.一种产生trichodiene的突变体丝状真菌，其具有单端孢霉烯途径，所述途径包含：
a)经破坏的Tri4基因或具有低P450单加氧酶产生的突变体Tri4基因；和
b)经修饰的核酸序列，其编码至少一种选自下组的基因：Tri5，Tri6和Tri10，所述序列经修饰使得所述丝状真菌与亲本丝状真菌细胞相比，当在相同条件下培养时，多产生至少10%的trichodiene。
2.权利要求1的突变体真菌，其中Tri5、Tri6或Tri10核酸序列中的至少一种经修饰而给予所述基因在产生基因产物方面的组成型活性。
3.权利要求1的突变体丝状真菌，其中所述丝状真菌选自下组：枝顶孢霉属(Acremonium)、曲霉属(Aspergillus)、短梗霉属(Aureobasidium)、隐球菌属(Cryptococcus)、Filibasidium、镰孢属(Fusarium)、赤霉属(Gibberella)、腐质霉属(Humicola)、梨孢菌属(Magnaporthe)、毛霉属(Mucor)、毁丝霉属(Myceliophthora)、漆斑菌属(Myrothecium)、新考玛脂霉属(Neocallimastix)、脉孢菌属(Neurospora)、拟青霉属(Paecilomyces)、青霉属(Penicillium)、瘤胃壶菌属(Piromyces)、葡萄穗霉属(Stachybotrys)、裂褶菌属(Schizophyllum)、踝节菌属(Talaromyces)、嗜热子囊菌属(Thermoascus)、梭孢壳属(Thielavia)、弯颈霉属(Tolypocladium)、木霉属(Trichoderma)、或单端孢属(Trichothecium)菌株。
4.权利要求3的突变体丝状真菌，其中所述丝状真菌是镰孢属菌种。
5.权利要求4的突变体丝状真菌，其中所述镰孢属菌种是拟分枝孢镰孢(Fusarium sporotrichioides)NRRL 3299。
6.权利要求1的突变体丝状真菌，其中Tri5、Tri6或Tri10核酸序列中的至少两个经修饰。
7.权利要求1的突变体丝状真菌，其中编码Tri4的核酸的部分或全部经非回复性位点选择性缺失使得Tri4基因失活。
8.权利要求1的突变体丝状真菌，其中编码Tri4的核酸的部分或全部经非回复性位点选择性缺失或修饰，使得在相同条件下与亲本株相比，Tri4基因产物的酶或催化活性减少至少10%。
9.权利要求1的突变体丝状真菌，其中b)的修饰序列包含多于一个拷贝的编码至少一种选自Tri5、Tri6和Tri10的基因的核酸序列。
10.权利要求9的突变体丝状真菌，其中至少一个额外拷贝的编码至少一种选自Tri5、Tri6和Tri10的基因的核酸序列处于能够在所述丝状真菌中自主维持的载体中。
11.权利要求1的突变体丝状真菌，其中b)的经修饰的序列包含可操作连接于来自组成型活性的丝状真菌基因的启动子的基因的编码。
12.一种产生trichodiene的突变体丝状真菌，其具有单端孢霉烯途径，所述途径包含：
a)经修饰的核酸序列，其编码至少一种选自下组的基因：Tri5，Tri6和Tri10，所述序列经修饰而增加基因产物的产生；和
b)足以抑制至少一部分Tri4基因产物的Tri4抑制剂的存在；
其中所述丝状真菌与亲本丝状真菌细胞相比，当在相同条件下培养时，多产生至少10%的trichodiene。
13.权利要求1或12的突变体丝状真菌，其中所述Tri5、Tri6或Tri10基因经修饰而增加FPP的产生。
14.权利要求1或12的突变体丝状真菌，其中所述Tri5、Tri6或Tri10基因经修饰而增加FPP至trichodiene的转化。
15.权利要求1或12的突变体丝状真菌，其中所述Tri6和/或Tri10基因经修饰以至少减少Tri4基因产物的产生。
16.产生trichodiene的方法，包括：
a)选择突变体丝状真菌，其具有单端孢霉烯途径，所述途径包含：
i.一种或多种经破坏的Tri4基因，具有低P450单加氧酶产生的突变体Tri4基因，以及所述真菌，与Tri4基因产物抑制剂组合；
ii.修饰的核酸序列，其编码至少一种选自下组的基因：Tri5，Tri6和Tri10，所述序列经修饰以增加基因产物的产生；
b)使用选自下组的生物质生长培养基培养所述突变体丝状真菌：糖、淀粉、纤维素和半纤维素；和
c)从生长培养基分离trichodiene，
其中所述丝状真菌与亲本丝状真菌细胞相比，当在相同条件下培养时，多产生至少10%的trichodiene。
17.权利要求16的产生trichodiene的方法，其中所述生物质生长培养基选自下组：果胶、半乳糖醛酸、糖、淀粉、纤维素和半纤维素。
18.权利要求16的方法，其中所述方法基本上是在生长培养基的产生源处进行。
19.权利要求16的方法，其中所述丝状真菌产生至少0.25g trichodiene每克消耗的葡萄糖或葡萄糖当量。
20.权利要求16的方法，其中所述培养基包含木素纤维素原料。
21.权利要求16的方法，其中所述丝状真菌选自下组：枝顶孢霉属(Acremonium)、曲霉属(Aspergillus)、短梗霉属(Aureobasidium)、隐球菌属(Cryptococcus)、Filibasidium、镰孢属(Fusarium)、赤霉属(Gibberella)、腐质霉属(Humicola)、梨孢菌属(Magnaporthe)、毛霉属(Mucor)、毁丝霉属(Myceliophthora)、漆斑菌属(Myrothecium)、新考玛脂霉属(Neocallimastix)、脉孢菌属(Neurospora)、拟青霉属(Paecilomyces)、青霉属(Penicillium)、瘤胃壶菌属(Piromyces)、葡萄穗霉属(Stachybotrys)、裂褶菌属(Schizophyllum)、踝节菌属(Talaromyces)、嗜热子囊菌属(Thermoascus)、梭孢壳属(Thielavia)、弯颈霉属(Tolypocladium)、木霉属(Trichoderma)、或单端孢属(Trichothecium)菌株。
22.权利要求20的方法，其中所述丝状真菌是拟分枝孢镰孢NRRL3299。
CN2010800446544A 2009-08-05 2010-08-05 用于从木素纤维素原料产生trichodiene的丝状真菌和方法 Pending CN102695787A (zh)

Applications Claiming Priority (3)

Application Number Priority Date Filing Date Title
US23137409P 2009-08-05 2009-08-05
US61/231,374 2009-08-05
PCT/US2010/044595 WO2011017549A2 (en) 2009-08-05 2010-08-05 Filamentous fungi and methods for producing trichodiene from lignocellulosic feedstocks

Publications (1)

Publication Number Publication Date
CN102695787A true CN102695787A (zh) 2012-09-26

Family

ID=43544947

Family Applications (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
CN2010800446544A Pending CN102695787A (zh) 2009-08-05 2010-08-05 用于从木素纤维素原料产生trichodiene的丝状真菌和方法

Country Status (5)

Country Link
US (1) US20120184008A1 (zh)
EP (1) EP2462220A4 (zh)
CN (1) CN102695787A (zh)
BR (1) BR112012002354A2 (zh)
WO (1) WO2011017549A2 (zh)

Families Citing this family (5)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN103282484A (zh) * 2010-11-01 2013-09-04 诺维信公司 用于产生类异戊二烯的丝状真菌和方法
WO2012064740A1 (en) * 2010-11-08 2012-05-18 The Regents Of The University Of California Isoprenoid based alternative diesel fuel
WO2013167812A1 (en) * 2012-05-11 2013-11-14 Teknologian Tutkimuskeskus Vtt Method for producing terpenes
CN104004659B (zh) * 2014-04-02 2016-06-22 浙江大学 一种拟枝孢镰刀菌及其应用
CN110713939B (zh) * 2019-10-29 2021-01-22 华东理工大学 一种极低pH条件下降解木质纤维素来源抑制物的菌株及应用

Citations (1)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN1190495C (zh) * 1998-05-20 2005-02-23 诺沃奇梅兹生物技术有限公司 在单端孢菌毒素缺陷的丝状真菌突变细胞中生产异源多肽的方法

Family Cites Families (1)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US4994383A (en) * 1988-03-28 1991-02-19 The United States Of America As Represented By The Secretary Of Agriculture Method for producing trichothecenes and related materials

Patent Citations (1)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN1190495C (zh) * 1998-05-20 2005-02-23 诺沃奇梅兹生物技术有限公司 在单端孢菌毒素缺陷的丝状真菌突变细胞中生产异源多肽的方法

Non-Patent Citations (2)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Title
ANNE E.DESJARDINS ET AL.: "ancymidol blocks trichothecene biosynthesis and leads to accumulation of trichodiene in fusarium sporotrichioides and gibberella pulicaris", 《APPLIED AND ENVIRONMENTAL MICROBIOLOGY》, vol. 53, no. 8, 31 December 1987 (1987-12-31) *
ROBERT H. PROCTOR ET AL.: "Tri6 encodes an unusual zinc finger protein involved in regulation of trichothecene biosynthesis in fusarium sporotrichioides", 《APPLIED AND ENVIRONMENTAL MOCROBIOLOGY》, vol. 61, no. 5, 31 December 1995 (1995-12-31) *

Also Published As

Publication number Publication date
EP2462220A4 (en) 2013-05-01
WO2011017549A2 (en) 2011-02-10
US20120184008A1 (en) 2012-07-19
WO2011017549A3 (en) 2011-07-07
EP2462220A2 (en) 2012-06-13
BR112012002354A2 (pt) 2017-07-04

Similar Documents

Publication Publication Date Title
EP3214168B1 (en) Saccharomyces cerevisiae capable of being co-fermented by multiple carbon sources and application thereof
CN1231588C (zh) 丝状真菌的形态突变体
CN1977042B (zh) 生长于木糖的非重组酵母属菌株
CN107075532A (zh) 嗜酸性尖镰孢菌株及其生产和使用方法
CN102199556B (zh) 一种高产酯酿酒酵母基因工程菌及其构建方法
CN104822823A (zh) 重组代谢微生物及其用途
CN107709540A (zh) 新型库德里阿兹威氏毕赤酵母菌种ng7及其用途
CN102245779A (zh) 大宗化学品的生物合成
CN102695787A (zh) 用于从木素纤维素原料产生trichodiene的丝状真菌和方法
KR20170137237A (ko) 당화 및 발효능이 우수한 전통주 발효 효모 사카로마이콥시스 피브리게라 kjj81 균주 및 이를 이용한 막걸리 제조방법
Lueangjaroenkit et al. Morphological characteristic regulation of ligninolytic enzyme produced by Trametes polyzona
Elhussiny et al. Assessment of waste frying oil transesterification capacities of local isolated Aspergilli species and mutants
Watanabe et al. A strategy to prevent the occurrence of Lactobacillus strains using lactate-tolerant yeast Candida glabrata in bioethanol production
CN103282484A (zh) 用于产生类异戊二烯的丝状真菌和方法
CN117701548A (zh) 一种檀香烯合成酶突变体以及应用
CN111712576A (zh) 微生物菌株及其用途
CN103781899B (zh) 用酸预处理的生物质进行丁醇发酵
Naumova et al. Molecular genetic characteristics of Saccharomyces cerevisiae distillers’ yeasts
Walker et al. Selecting new distilling yeasts for improved fermentation and for sustainability
CN115725632B (zh) 一种Aomsn2过表达米曲霉工程菌及其构建方法与应用
Ramos-Martinez et al. Secretion of acetylxylan esterase from Chlamydomonas reinhardtii enables utilization of lignocellulosic biomass as a carbon source
Sukmawati et al. Molds isolated from chicken feed as potential amylase resources
Yuan et al. Agrobacterium tumefaciens-mediated transformation of Coniella granati
Bechem et al. Characterization of palm wine yeasts using osmotic, ethanol tolerance and the isozyme polymorphism of alcohol dehydrogenase
Utama et al. Species identification of stress resistance yeasts isolated from banana waste for ethanol production

Legal Events

Date Code Title Description
C06 Publication
PB01 Publication
C10 Entry into substantive examination
SE01 Entry into force of request for substantive examination
C02 Deemed withdrawal of patent application after publication (patent law 2001)
WD01 Invention patent application deemed withdrawn after publication

Application publication date: 20120926