CN102676560B

CN102676560B - 苏云金芽孢杆菌yb-03中的六价铬还原基因、其表达产物及其应用

Info

Publication number: CN102676560B
Application number: CN201210072949.3A
Authority: CN
Inventors: 薛保国; 魏斐; 杨丽荣
Original assignee: Henan Academy of Agricultural Sciences
Current assignee: Henan Academy of Agricultural Sciences
Priority date: 2012-03-20
Filing date: 2012-03-20
Publication date: 2014-04-02
Anticipated expiration: 2032-03-20
Also published as: CN102676560A

Abstract

本发明涉及一种苏云金芽孢杆菌YB-03中的六价铬还原基因、其表达产物及其应用。本发明从具有还原Cr⁶⁺作用的苏云金芽孢杆菌YB-03菌株CGMCCNO.5653中克隆出了六价铬还原基因，并成功转化、诱导表达出具有很高活性的蛋白酶，该蛋白酶对六价铬具有很强的还原性，在铬污染的处理中具有重要的应用价值。

Description

苏云金芽孢杆菌YB-03中的六价铬还原基因、其表达产物及其应用

技术领域

本发明涉及一种抗铬菌基因，具体涉及一种苏云金芽孢杆菌YB-03中的六价铬还原基因、其表达产物及其应用。

背景技术

铬虽然是人体必须的微量元素，但是过量的铬尤其是六价铬具有很强的毒性，对人体具有强烈的致病性。我国每年的铬盐产量已经超过16万吨，而铬渣的排放量却在35～42万吨，其含有的六价铬约有3500吨。六价铬生物毒性极大，是造成环境污染的主要重金属之一。因此，铬污染的治理引起了人们广泛的关注。传统的物理和化学治理法包括调节pH、絮凝沉淀、离子交换和活性炭吸附等，但这些方法需要消耗其他能源或使用大量的化学试剂，处理成本较昂贵，且存在着二次污染的可能。因此，铬污染的生物治理被看作是一个可以替代的治理策略，具有很大的潜力，比如Evns，吴乾菁，Dermou等人都曾用微生物模拟处理铬污染水，取得一定的效果。如今国内外筛选出的具有还原六价铬的微生物很多，国外学者也已有研究报道称在大肠杆菌、假单胞菌中均发现了含有还原六价铬的基因，分别为YieF基因、NfsA基因。另外在哈维氏弧菌中同样发现了还原六价铬的基因，这些基因表达的蛋白酶均具能在一定条件下将六价铬进行还原，但是国内学者对六价铬还原基因鲜有报道。

现有的这些微生物或六价铬抗性较小，或六价铬还原能力较低，或所需还原时间较长，普遍离工业应用还有一定距离。

发明内容

本发明要解决的技术问题是提供一种六价铬还原基因及其重组表达载体、表达盒或重组菌，并成功将其成功转化，获得了具有对六价铬具有很强的还原性的高活性的蛋白酶。

为解决上述技术问题，本发明采用的技术方案是：

一种苏云金芽孢杆菌YB-03中的六价铬还原基因，具有SEQ ID NO.1所示的核苷酸序列。

一种由上述苏云金芽孢杆菌YB-03中的六价铬还原基因表达出的蛋白酶。

上述蛋白酶具有SEQ ID NO.2所示的氨基酸序列。

所述蛋白酶可在还原六价铬中应用。

含有上述苏云金芽孢杆菌YB-03中的六价铬还原基因的重组表达载体、表达盒或重组菌。

扩增上述苏云金芽孢杆菌YB-03中的六价铬还原基因的全长或其任意片段的引物对。

本发明具有积极有益的效果：

本发明从具有还原Cr⁶⁺作用的苏云金芽孢杆菌YB-03菌株CGMCC NO.5653中克隆出了六价铬还原基因，并成功转化、诱导表达出具有很高活性的蛋白酶，该蛋白酶对六价铬具有很强的还原性，在铬污染的处理中具有重要的应用价值。

本发明所涉及的苏云金芽孢杆菌YB-03菌株（Bacillus thuringiensis），已于2011年12月26日保藏在中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，其简称为CGMCC，地址：北京市朝阳区北辰西路1号院3号中国科学院微生物研究所，该苏云金芽孢杆菌YB-03菌株（Bacillus thuringiensis）的保藏编号为CGMCC NO.5653。

附图说明

图1为本发明六价铬还原基因PCR结果电泳图谱；

图2为本发明PMD19-T+目的基因双酶切结果电泳图谱；

图3为ET-28载体+目的基因双酶切验证结果电泳图谱；

图4为SDS-PAGE蛋白质电泳图；

图5为SDS-PAGE蛋白质电泳图；

图6为在2mmol/L NADH下，本发明蛋白酶还原六价铬结果；

图7为无NADH下，本发明蛋白酶还原六价铬结果；

图8为目的蛋白还原六价铬结果图。

具体实施方式

为了使本发明更加容易理解，下面结合具体实施例，进一步阐述本发明。应理解，这些实施例仅用于说明本发明而不用于限止本发明的范围，下列实施例中六价铬的测定方法采用二苯碳酰二肼分光光度法；总铬的测定方法采用高锰酸钾—二苯碳酰二肼分光光度法，其它未提及的具体实验方法，通常按常规实验方法进行。

实施例1 六价铬还原细菌的分离、筛选

取活性污泥（采集时间：2010年9月；采集地点：郑州市五龙口污水处理厂；采集人：魏斐）10g于90ml的无菌水中，分别稀释为10^-1～10^-6六个梯度。从每个梯度中取溶液1ml，涂布于含有适量浓度Cr⁶⁺的LB固体培养基中，放入37℃培养24h。

抗铬细菌的还原性鉴定：从培养基中挑选菌落于含有100mg/L Cr⁶⁺的LB液体培养基中，37℃，150r/min培养24h，取出适量溶液离心取上清，测定溶液中剩余Cr⁶⁺含量。

本次采集经初步筛选得到了两株不同形态的菌株，分别定名为YB-01，YB-03。两株菌株对六价铬的还原效果见表1。

表1： 24小时后，六价铬和总铬的情况

Figure 2012100729493100002DEST_PATH_IMAGE002

从表1可以看出两种菌均可以还原Cr⁶⁺，24h后，YB-01菌还原率为19%，YB-03菌还原率为28%，可以看出YB-03菌还原六价铬的效果最好，因此本发明将YB-03菌选为研究菌种。

通过生理生化试验和16srDNA鉴定，对比《伯杰氏细菌鉴定手册》鉴定YB-03菌为苏云金芽孢杆菌（Bacillus thuringiensis YB-03）。

实施例2 六价铬还原基因的PCR、与PMD19-T的连接、转化、鉴定

（1）引物的设计

用Primer 5软件进行设计，引物如下：

CR- EcoRⅠ-F: gcgaattcATGAATGAGATGATACAT（如SEQ ID NO.3所示）

CR- XholⅠ-R: gcctcgagTCACTTCTTATTAAATCC（如SEQ ID NO.4所示）

PCR 体系(50ul)：Mix：25ul；上引物：1ul；下引物：1ul；dd H₂O 22ul；（YB-03菌总DNA）DNA模板：1ul；

首先94℃预变性5min，然后进入循环：94℃使DNA变性40秒，56℃退火30秒，72℃延伸70s，循环30次，最后在72℃延伸7min。

（2）PCR产物的电泳与切胶回收

将PCR的产物在1%的琼脂糖电泳后，经EB浸泡30min，后在凝胶成像系统中观察结果。后将条带切下，用DNA凝胶回收试剂盒回收产物。PCR后电泳结果见图1，六价铬还原基因的大小在750bp左右。

（3）六价铬还原基因与PMD19-T的连接

体系(10ul)：载体：1ul

目的片段：4ul

SolutionⅠ：5ul

在16度连接6h。

（4）转化：取连接产物加入TG1感受态细胞中（Ⅰ）放于冰上30min，（Ⅱ）于42℃水浴90s，（Ⅲ）冰上放置2min，（Ⅳ）加入800ul LB液体培养基与37℃、150r/min培养1h，（Ⅴ）将培养的菌液均匀涂布于含有Amp⁺的LB固体培养平板上，（Ⅵ）将培养皿放于37℃恒温培养14～16小时，观察结果。

（5）阳性克隆子的鉴定

（Ⅰ）挑取培养基上长出的单克隆菌落，进行菌液PCR。

体系(20ul)如下：引物采用M-13通用引物

Mix：10ul

上引物：0.5ul

下引物：0.5ul

dd H₂O：8ul

DNA模板：1ul

PCR条件：首先94℃预变性5min，然后进入循环；94℃使DNA变性30秒，在58℃退火30秒，72℃延伸60s，循环30次，最后在72℃延伸7min。

（Ⅱ）DNA电泳：将PCR产物进行电泳，EB浸染后，在凝胶成像系统中观察结果，保存阳性克隆子。

实施例3 六价铬还原基因与PET-28的连接、转化、鉴定

（1）将胶回收后的六价铬目的基因与PMD19-T进行连接，转化于TG1感受态后得到阳性克隆子，过夜摇菌后，提取质粒，双酶切得到目的基因。

PMD19-T+目的基因质粒双酶切电泳结果见图2。

由图2看出双酶切过后出现了两条条带，其中一条条带在2500bp之上，为PMD19-T片段，另一条即为目的片段，条带大小约在750bp处。

（2）将上述750bp处目的片段胶回收后与PET-28载体连接、转化于BL21(DE3)感受态后得到阳性克隆子，过夜摇菌后，提取质粒，双酶切验证。

将PET-28载体+目的基因质粒双酶切验证电泳结果见图3：

由图3可知质粒经过双酶切后，在750bp处出现了条带，这说明目的基因与PET-28连接成功。

实施例4 重组子的蛋白质诱导表达

（1）蛋白的诱导表达与条件优化

（Ⅰ）蛋白诱导表达的方法：将PET-28载体+目的基因质粒重组子在含有K⁺的液体LB中过夜培养后，取1ml菌液于100ml含有K⁺的液体LB中，在一定温度、一定转速下培养至OD₆₀₀值为0.6-0.8时，加入IPTG进行诱导，最后收集菌体，用超声波破碎细胞得到粗酶液；

（Ⅱ）蛋白诱导表达的条件优化：通过不断改变培养的培养温度，转速，以及IPTG的浓度和诱导时间，经SDS-PAGE电泳观察蛋白表达情况，得出能在菌体内进行可溶性表达的最适诱导条件；

（2）SDS-PAGE电泳

重组子诱导表达蛋白后，提取粗酶液后在15%分离胶、5%浓缩胶条件下进行SDS-PAGE蛋白质电泳。

经过试验得出，在诱导温度为30℃，转速为150r/min、IPTG终浓度为0.2mmol/L，诱导时间为5h的情况下，诱导效果最好，经SDS-PAGE电泳，结果显示目的蛋白的大小在29KD附近，与预测的蛋白的大小相符，结果见图4。

（3）目的蛋白的纯化

在50 mmol/L，80 mmol/L，100 mmol/L，150 mmol/L，200 mmol/L，250 mmol/L，300mmol/L，400 mmol/L八个不同咪唑浓度下，将粗酶液过镍柱，得到纯化目的蛋白，后进行SDS-PAGE电泳检测（所用产品为Ni-NTA His纯化试剂盒，上海宝曼生物科技有限公司）。

将粗酶液过镍柱，通过试验得知，在咪唑洗脱浓度为150mmol/L时获得的目蛋白中含有杂质最少，结果如图5：

（4）表达蛋白的酶活测定

（Ⅰ）将含空载PET-28的表达菌株的粗酶液作为对照组；将连接有目的基因的PET-28表达菌株诱导后的粗酶液作为实验组，分别加入一定浓度的Cr⁶⁺离子和NADH，在37℃条件下每隔一定时间取样测定剩余Cr⁶⁺浓度。

（Ⅱ）将纯化后的目的蛋白中加入一定浓度的Cr⁶⁺离子和NADH，一定时间后测定剩余Cr⁶⁺浓度，以50mmol/L咪唑溶液为对照。

本实验将含有目的蛋白的酶液分为两等分，一份加入NADH，终浓度为2mmol/L，另一份不加NADH，分别测定还原效果，与原始BL21(DE3)粗酶液对比还原速率，结果如见图6、图7：

由图6、图7可知，NADH可以有效的促进六价铬的还原，有NADH的目的蛋白粗酶液在11小时就可完全还原65mg/L的六价铬离子，而不含有NADH的11小时内只还原了42.99mg的六价铬，还原率仅为66.14%。

从图6、图7中可看出，含有目的蛋白的粗酶液还原六价铬的速率明显高于不含目的蛋白的粗酶液，PET-28+Cr目的基因的酶液还原速率均快于空PET-28酶液，由此可以证明表达的目的蛋白有一定的还原活性。

（5）纯化目的蛋白的还原性测定

将纯化的目的蛋白中加入一定浓度六价铬离子和NADH，终浓度分别为20mg/L，2mmol/L，在37℃下反应8h，测定剩余六价铬含量，结果见图8：

由图8可知，在反应8h后，对照中六价铬离子浓度基本上没有变化，而目的蛋白将20mg/L的六价铬还原到了3.4mg/L，还原率达到83%，说明目的蛋白具有很高的活性。

虽然，上文中已经用一般性说明及具体实施方案对本发明作了详尽的描述，但在本发明基础上，可以对之作一些修改或改进，这对本领域技术人员而言是显而易见的。因此，在不偏离本发明精神的基础上所做的这些修改或改进，均属于本发明要求保护的范围。

SEQUENCE LISTING

<110> 河南省农业科学院

<120> 苏云金芽孢杆菌YB-03中的六价铬还原基因、其表达产物及其应用

<130> /

<160> 4

<170> PatentIn version 3.2

<210> 1

<211> 735

<212> DNA

<213> 苏云金芽孢杆菌YB-03

<400> 1

atgaatgaga tgatacatga aatggagcaa cacgtttcag ttcgtaaata taaagaagag 60

tccattccga gagatgtagt agaaagaatg gtgcaagcag ggcagcatgc tgcttcctct 120

cattttgtac aggcctattc tgttatatat gtaaccgatc aagacttaaa ggctaaacta 180

gcagagttgt ctggaaatcg acatgtgaaa gattgcgcag cattctttgt ttgttgtgca 240

gatttaaaac gacttgaaat ggcatgtgaa aaacatggta cagagataaa gcatgaagga 300

gtggaagact ttatcgtagc aacggtggat gcttcacttt ttgcgcaaaa cttagcgtta 360

gcagcagaat cgttaggata cggtatttgt tatattggtg gtattcgtaa taatccgaga 420

gaagtgagcg aattgcttca tttaccggat aaagtatatc ctgtattcgg aatgacagtc 480

ggtgtaccag atgaagatca tggagtaaaa ccacgcttac cagtagcagc aatccttcat 540

gaaaatggct atgatgaaaa gaaatatgat gaattactaa acgaatacga tgaaacgatg 600

agcgcgtatt ataaagaaag atcatcaaac aagaaaagcg taacatggac ggaatcaatg 660

agttcgttta tgtctaaaga aaaaagaatg cacatgaaag agtttttaaa tgagaaagga 720

tttaataaga agtga 735

<210> 2

<211> 244

<212> PRT

<213> 人工合成

<400> 2

Met Asn Glu Met Ile His Glu Met Glu Gln His Val Ser Val Arg Lys

1 5 10 15

Tyr Lys Glu Glu Ser Ile Pro Arg Asp Val Val Glu Arg Met Val Gln

20 25 30

Ala Gly Gln His Ala Ala Ser Ser His Phe Val Gln Ala Tyr Ser Val

35 40 45

Ile Tyr Val Thr Asp Gln Asp Leu Lys Ala Lys Leu Ala Glu Leu Ser

50 55 60

Gly Asn Arg His Val Lys Asp Cys Ala Ala Phe Phe Val Cys Cys Ala

65 70 75 80

Asp Leu Lys Arg Leu Glu Met Ala Cys Glu Lys His Gly Thr Glu Ile

85 90 95

Lys His Glu Gly Val Glu Asp Phe Ile Val Ala Thr Val Asp Ala Ser

100 105 110

Leu Phe Ala Gln Asn Leu Ala Leu Ala Ala Glu Ser Leu Gly Tyr Gly

115 120 125

Ile Cys Tyr Ile Gly Gly Ile Arg Asn Asn Pro Arg Glu Val Ser Glu

130 135 140

Leu Leu His Leu Pro Asp Lys Val Tyr Pro Val Phe Gly Met Thr Val

145 150 155 160

Gly Val Pro Asp Glu Asp His Gly Val Lys Pro Arg Leu Pro Val Ala

165 170 175

Ala Ile Leu His Glu Asn Gly Tyr Asp Glu Lys Lys Tyr Asp Glu Leu

180 185 190

Leu Asn Glu Tyr Asp Glu Thr Met Ser Ala Tyr Tyr Lys Glu Arg Ser

195 200 205

Ser Asn Lys Lys Ser Val Thr Trp Thr Glu Ser Met Ser Ser Phe Met

210 215 220

Ser Lys Glu Lys Arg Met His Met Lys Glu Phe Leu Asn Glu Lys Gly

225 230 235 240

Phe Asn Lys Lys

<210> 3

<211> 26

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 3

gcgaattcat gaatgagatg atacat 26

<210> 4

<211> 26

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 4

gcctcgagtc acttcttatt aaatcc 26

Claims

1.一种苏云金芽孢杆菌YB-03菌株CGMCC NO.5653中的六价铬还原基因，其核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示。

2.一种由权利要求1所述苏云金芽孢杆菌YB-03菌株CGMCC NO.5653中的六价铬还原基因表达出的蛋白酶。

3.根据权利要求2所述的蛋白酶，其特征在于，其氨基酸序列如SEQ ID NO.2所示。

4.权利要求2所述蛋白酶在还原六价铬中的应用。

5.含有权利要求1所述苏云金芽孢杆菌YB-03菌株CGMCC NO.5653中的六价铬还原基因的重组表达载体。

6.含有权利要求1所述苏云金芽孢杆菌YB-03菌株CGMCC NO.5653中的六价铬还原基因的表达盒。

7.含有权利要求1所述苏云金芽孢杆菌YB-03菌株CGMCC NO.5653中的六价铬还原基因的重组菌。

8.扩增权利要求1所述苏云金芽孢杆菌YB-03菌株CGMCC NO.5653中的六价铬还原基因的全长引物对。