CN102657897A - 一种载TGF-β3的缓释组织工程膜的制备方法 - Google Patents
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Abstract
本发明公开了一种载TGF-β3的缓释组织工程膜的制备方法，包括（1）壳聚糖不对称膜的制备；（2）壳聚糖微球的制备；（3）载TGF-β3的壳聚糖缓释膜制备。本发明载TGF-β3的缓释组织工程膜，能够达到很好的缓释效果，持续释放TGF-β3，具有持续很好的抗粘连作用，同时由于是膜状应用范围很广也很灵活，用于骨科中抗粘连的治疗效果非常好。
Description
技术领域
本发明属于医疗领域，具体的说，涉及从一种医疗用的缓释抗粘连的组织工程膜的制备方法。
背景技术
手指屈指肌腱损伤后发生粘连愈合，导致手指的功能恢复效果不理想，是手外科领域亟待解决的一大难题。在肌腱愈合过程释放的细胞因子中，TGF-β（Transforming Growth Factor beta）认为是组织纤维化，瘢痕形成、肌腱粘连的关键因子。TGF-β3做为体内TGF-β1的同分异构体，可以下调TGF-β1和TGF-β2的水平，起到TGF-β1抗体的效果，达到抑制瘢痕的形成的作用。但是TGF-β3在体内肌腱局部含量少，肌腱愈合环境内TGF-β3的浓度无法保持，无法起到明显抗粘连作用。
发明内容
为解决以上技术问题，本发明的目的在于提供一种具有缓释作用的抑制组织愈合处粘连形成的载TGF-β3的缓释组织工程膜的制备方法。
本发明目的是这样实现的：一种载TGF-β3的缓释组织工程膜的制备方法，其关键在于：按如下步骤进行：
（1）壳聚糖不对称膜
a、致密层的形成
壳聚糖溶于1％的醋酸水溶液，配制成2％的壳聚糖溶液，4℃离心5min，去除杂质，静置除气泡后待用；将1.0ml上述溶液浇入直径9cm培养皿中，室温放置24h自然晾干形成致密层；
b、多孔层的形成
再将3m1的壳聚糖溶液倾入放置致密层的培养皿中，-20℃预冻1h后冷冻干燥形成多孔层得到壳聚糖不对称膜；
（2）壳聚糖微球的制备
壳聚糖120mg溶于2％的醋酸水溶液4-6ml，配成2％的壳聚糖溶液，静置除气泡后待用；150ml烧杯中加入80mI液体石蜡，调整搅拌速度至1000rpm，滴加乳化剂Span-804ml；用无菌注射器将壳聚糖溶液逐滴加至液体石蜡中，搅拌乳化至颜色呈均一稳定乳白色；加入0.4ml的50％戊二醛溶液与壳聚糖交联固化，搅拌固化1小时，静置固化20分钟，淡黄色微球沉淀于杯底；倾去上层油相，大量石油醚反复清洗，倒去上层石油醚，得微球，石油醚室温挥发30分钟，得较干燥微球；
（3）载TGF-β3的壳聚糖缓释膜制备：
将步骤（1）壳聚糖不对称膜裁成直径为1cm的圆片，准确称量TGF-β3，按壳聚糖微球0.5mg含TGF-β3 10mg悬于100ul的90％酒精，加入壳聚糖膜多孔层，使微球均匀吸附到壳聚糖膜的孔隙中得到载TGF-β3的壳聚糖缓释膜。
上述用无菌注射器将壳聚糖溶液逐滴加至液体石蜡中，在37度水浴下1000rpm搅拌乳化至颜色呈均一稳定乳白色。
上述加入0.4ml的50％戊二醛溶液与壳聚糖交联固化，在37度水浴下1000rpm搅拌固化1小时。
载TGF-β3的壳聚糖微球的体外缓释实验，如图2所示
精确称量TGF-β3，壳聚糖微球20mg，置于Ep管，加入1ml的PBS,EP管置于摇床，1小时后离心，取上清液，-20℃保存离心液，将微球重悬于1ml的PBS中，继续置于摇床。于实验开始后2h,4h,6h,12h,24h,36h,2d,3d,4d,5d,6d,7d重复上述操作。将各次离心后的液体作为待测样品，用ELISA试剂盒检测样品OD值，通过标准曲线计算各样品中TGF-β3的含量，绘制TGF-β3的累计释放曲线，前12小时缓释较快，于24小时基本达到平衡。
有益效果：本发明载TGF-β3的缓释组织工程膜，能够达到很好的缓释效果，持续释放TGF-β3，具有持续很好的抗菌作用，同时由于是膜状应用范围很广也很灵活，用于骨科中肌腱粘连的防治效果非常好。
说明书附图
图1为本发明载TGF-β3的缓释组织工程膜结构示意图；
图2为TGF-β3的累计释放曲线图；
图3为本发明载TGF-β3的缓释组织工程膜电镜图。
具体实施方式
实施例
一种载TGF-β3的缓释组织工程膜的制备方法，按如下步骤进行：
（1）壳聚糖不对称膜
a、致密层的形成
壳聚糖溶于1％的醋酸水溶液，配制成2％的壳聚糖溶液，4℃离心5min，去除杂质，静置除气泡后待用；将1.0ml上述溶液浇入直径9cm培养皿中，室温放置24h自然晾干形成致密层；
b、多孔层的形成
再将3m1的壳聚糖溶液倾入放置致密层的培养皿中，-20℃预冻1h后冷冻干燥形成多孔层2得到壳聚糖不对称膜；
（2）壳聚糖微球的制备
壳聚糖120mg溶于2％的醋酸水溶液4-6ml，配成2％的壳聚糖溶液，静置除气泡后待用；150ml烧杯中加入80mI液体石蜡，调整搅拌速度至1000rpm，滴加乳化剂Span-804ml；用无菌注射器将壳聚糖溶液逐滴加至液体石蜡中，搅拌乳化至颜色呈均一稳定乳白色（搅拌1小时，1000rpm，37度水浴）；加入0.4ml的50％戊二醛溶液与壳聚糖交联固化，搅拌固化1小时（1000rpm，37度水浴），静置固化20分钟，淡黄色微球沉淀于杯底；倾去上层油相，大量石油醚反复清洗，倒去上层石油醚，得微球，石油醚室温挥发30分钟，得较干燥壳聚糖微球；
（3）载TGF-β3的壳聚糖缓释膜制备：
将步骤（1）壳聚糖不对称膜裁成直径为1cm的圆片，准确称量TGF-β3，按壳聚糖微球0.5mg含TGF-β3 10mg悬于100ul的90％酒精，加入壳聚糖膜多孔层，使微球均匀吸附到壳聚糖膜的孔隙中得到载TGF-β3的壳聚糖缓释膜，如图1所示，1为致密层、2为多孔层、3为壳聚糖微球。电镜扫描如图3所示。
Claims (3)
1.一种载TGF-β3的缓释组织工程膜的制备方法，其特征在于：按如下步骤进行：
（1）壳聚糖不对称膜的制备
a、致密层的形成
壳聚糖溶于1％的醋酸水溶液，配制成2％的壳聚糖溶液，4℃离心5min，去除杂质，静置除气泡后待用；将1.0ml上述溶液浇入直径9cm培养皿中，室温放置24h自然晾干形成致密层；
b、多孔层的形成
再将3m1的壳聚糖溶液倾入放置致密层的培养皿中，-20℃预冻1h后冷冻干燥形成多孔层得到壳聚糖不对称膜；
（2）壳聚糖微球的制备
壳聚糖120mg溶于2％的醋酸水溶液4-6ml，配成2％的壳聚糖溶液，静置除气泡后待用；150ml烧杯中加入80mI液体石蜡，调整搅拌速度至1000rpm，滴加乳化剂Span-80 4ml；用无菌注射器将壳聚糖溶液逐滴加至液体石蜡中，搅拌乳化至颜色呈均一稳定乳白色；加入0.4ml的50％戊二醛溶液与壳聚糖交联固化，搅拌固化1小时，静置固化20分钟，淡黄色微球沉淀于杯底；倾去上层油相，大量石油醚反复清洗，倒去上层石油醚，得微球，石油醚室温挥发30分钟，得较干燥微球；
（3）载TGF-β3的壳聚糖缓释膜制备：
将步骤（1）壳聚糖不对称膜裁成直径为1cm的圆片，准确称量TGF-β3，按壳聚糖微球0.5mg含TGF-β3 10mg悬于100ul的90％酒精，加入壳聚糖膜多孔层，使微球均匀吸附到壳聚糖膜的孔隙中得到载TGF-β3的壳聚糖缓释膜。
2.根据权利要求1所述载TGF-β3的缓释组织工程膜的制备方法，其特征在于：所述用无菌注射器将壳聚糖溶液逐滴加至液体石蜡中，在37度水浴下1000rpm搅拌乳化至颜色呈均一稳定乳白色。
3.根据权利要求1或2所述载TGF-β3的缓释组织工程膜的制备方法，其特征在于：所述加入0.4ml的50％戊二醛溶液与壳聚糖交联固化，在37度水浴下1000rpm搅拌固化1小时。
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