CN102649949B - 利用桑黄发酵生产漆酶的方法 - Google Patents

Abstract

本发明涉及一种利用桑黄发酵生产漆酶的方法。分泌漆酶的真菌主要分布于担子菌、多孔菌、子囊菌、脉胞菌、柄孢壳菌和曲霉菌等属种，但大部分发酵周期长，工业化生产有局限。本发明取桑黄菌丝体接入发酵培养基，旋转频率150r/min，28℃培养60h，过滤得桑黄发酵液；取桑黄发酵液100mL，经4000r/min、4℃离心15min，弃去菌丝体，取得的上清液即为粗酶液；取4ml缓冲液和1ml粗酶液，混匀，30℃恒温水浴反应30min，得到目的酶。本发明所述的发酵方法发酵周期短并且获得的漆酶酶活力高，发酵周期60h，漆酶产量达126000U/L；在整个漆酶制备过程中无任何废物或排放物产生，符合节能环保要求。

Description

利用桑黄发酵生产漆酶的方法

技术领域

    本发明属于生物发酵制剂技术领域，具体涉及一种利用桑黄发酵生产漆酶的方法。

背景技术

漆酶（Laccases）是一种结合多个铜离子的蛋白质，属于铜蓝氧化酶，该酶最早是在漆树的汁液中发现的，故将其命名为漆酶。此后在多种植物、高等真菌、少数细菌及昆虫体内均有发现。漆酶可存活于空气中，发生反应后唯一的产物就是水，因此本质上是一种环保型酵素。由于这几年环保意识逐渐被人所重视，因此近年来漆酶也成为众多学者的研究对象。 

漆酶独特的催化特性使其在生物检测中有广泛的应用，作为高效的生物检测器而成为底物、辅酶、抑制剂等成分分析的有效工具和手段，在生物制浆、生物漂白、以及有毒化合物的降解等方面具有潜在应用价值，因而引起人们越来越多的研究兴趣，成为环境保护用酶研究的热点。近年来，人们对漆酶的研究越来越深入，其应用的范围也越来越广泛。

漆酶属于蓝-铜族氧化酶，其活性中心由4个铜原子组成，在氧化还原反应中起着决定作用。漆酶的Ⅰ型铜原子和氨基酸残基结合成为单核中心，是酶表现为明显的蓝色。另外，它还包含Ⅱ型和Ⅲ型铜原子，构成三核中心。Ⅰ型铜原子作为初级电子的接受者，参与分子内的电子传递，把电子从底物传递到其他铜原子上，然后电子结合于三核位点。该位点进一步把电子传递给结合活性中心的第二底物氧分子，使之还原为水，而铜的存在是形成复合体所必需的。它们催化的反应是利用分子氧，产生的副产物只有水，所以又称漆酶为“生态友善酶”。

尽管漆酶在自然界中广泛分布，但真正具有较高漆酶产量的菌株并不多，分泌漆酶的真菌主要分布于担子菌（Basidiom ycotina）、多孔菌、子囊菌、脉胞菌（NeurosPora）、柄孢壳菌和曲霉菌等属种，其中最主要的是担子菌亚门的白腐菌真菌，研究也较多。但是大部分真菌发酵周期较长，使得工业化生产具有一定的局限性。

发明内容

本发明的目的是提供一种发酵周期较短、能实现工业化生产的利用桑黄发酵生产漆酶的方法。

本发明所采用的技术方案是：

利用桑黄发酵生产漆酶的方法，其特征在于：

由以下步骤实现：

步骤一：配置发酵培养基，培养基的重量配方为：玉米粉0.5～1.5%、麸皮0.3～1.5%、葡萄糖0.5～2.0%、蛋白胨0.3～0.9%、酵母膏0.1～1.0%、KH₂PO₄0.05～0.15%、MgSO₄0.01～0.06%、添加Cu²⁺浓度30～60μmol/L、维生素B₁1mg/100mL；

步骤二：取生长在斜面上的桑黄菌丝体黄豆大小接入配制好的发酵培养基中，采用300mL三角瓶装发酵培养基，装液量为100mL，旋转频率150r/min，28℃培养60h，过滤得桑黄发酵液；

步骤三：取步骤二得到的桑黄发酵液100mL, 经4000r/min、4℃离心15min，弃去菌丝体，取得的上清液即为粗酶液；取4ml缓冲液和1ml粗酶液，混匀，30℃恒温水浴反应30min，得到目的酶。

步骤三中的缓冲液是指，每1L缓冲液中包含有1.0mmol的愈创木酚和50mmol的琥珀酸，其中琥珀酸的pH为4.5。

    本发明具有以下优点：

1、发酵周期短并且获得的漆酶酶活力高：该桑黄菌株与已报道的白腐真菌相比，具有发酵周期短且产漆酶酶活较高的优点，发酵周期96h，漆酶产量达126000U/L。

2、制备过程原料资源丰富，环保：目前发酵培养桑黄发酵液的原料主要是玉米粉、麸皮、白砂糖等，在整个漆酶制备过程中无任何废物或排放物产生，符合节能环保要求。

具体实施方式

下面结合具体实施方式对本发明进行详细的说明。

桑黄，俗称鲍氏层孔、火木层孔、针层孔等，属于担子菌纲、多孔菌目，多孔菌科，层孔菌属，是近几年开发的一种多年生药用真菌。通过对其产酶培养条件的初步研究，发现培养基组分对其产酶能力具有较大的影响，在优化后的培养基组分下发酵，漆酶酶活由优化前的7666U/L提高到126000U/L，提高了16倍，且发酵周期短，具有工业化生产的潜力。

本发明采用液体深层培养方法通过不同碳源、氮源、铜离子浓度等因素对桑黄产漆酶的影响，研究桑黄合成漆酶的最适发酵培养基组分。采用L₉(3⁴)正交设计法对桑黄合成漆酶发酵培养基进行了优化，筛选出了桑黄合成漆酶发酵培养基的重量配方为：玉米粉0.5～1.5%、麸皮0.3～1.5%、葡萄糖0.5～2.0%、蛋白胨0.3～0.9%、酵母膏0.1～1.0%、KH₂PO₄0.05～0.15%、MgSO₄0.01～0.06%、添加Cu²⁺浓度30～60μmol/L、维生素B₁1mg/100mL，漆酶产量可达12600U/L。

实施例1：

步骤一：配置发酵培养基，培养基的重量配方为：玉米粉0.5%、麸皮0.3%、葡萄糖0.5%、蛋白胨0.3%、酵母膏0.1%、KH₂PO₄0.05%、MgSO₄0.01%、添加Cu²⁺浓度30μmol/L、维生素B₁1mg/100mL；

步骤二：取生长在斜面上的桑黄菌丝体黄豆大小接入配制好的发酵培养基中，采用300mL三角瓶装发酵培养基，装液量为100mL，旋转频率150r/min，28℃培养60h，过滤得桑黄发酵液；

步骤三：取步骤二得到的桑黄菌发酵液100mL, 经4000r/min、4℃离心15min，弃去菌丝体，取得的上清液即为粗酶液；取4ml缓冲液和1ml粗酶液，混匀，30℃恒温水浴反应30min，得到目的酶。

其中，缓冲液是指，每1L缓冲液中包含有1.0mmol的愈创木酚和50mmol的琥珀酸，其中琥珀酸的pH为4.5。

实施例2：

步骤一：配置发酵培养基，培养基的重量配方为：玉米粉1%、麸皮0.9%、葡萄糖1.2%、蛋白胨0.6%、酵母膏0.5%、KH₂PO₄0.1%、MgSO₄0.03%、添加Cu²⁺浓度45μmol/L、维生素B₁1mg/100mL；

步骤二：取生长在斜面上的桑黄菌丝体黄豆大小接入配制好的发酵培养基中，采用300mL三角瓶装发酵培养基，装液量为100mL，旋转频率150r/min，28℃培养60h，过滤得桑黄发酵液；

步骤三：取步骤二得到的桑黄菌发酵液100mL, 经4000r/min、4℃离心15min，弃去菌丝体，取得的上清液即为粗酶液；取4ml缓冲液和1ml粗酶液，混匀，30℃恒温水浴反应30min，得到目的酶。

其中缓冲液是指，每1L缓冲液中包含有1.0mmol的愈创木酚和50mmol的琥珀酸，其中琥珀酸的pH为4.5。

实施例3：

步骤一：配置发酵培养基，培养基的重量配方为：玉米粉1.5%、麸皮1.5%、葡萄糖2.0%、蛋白胨0.9%、酵母膏1.0%、KH₂PO₄0.15%、MgSO₄0.06%、添加Cu²⁺浓度60μmol/L、维生素B₁1mg/100mL；

步骤二：取生长在斜面上的桑黄菌丝体黄豆大小接入配制好的发酵培养基中，采用300mL三角瓶装发酵培养基，装液量为100mL，旋转频率150r/min，28℃培养60h，过滤得桑黄发酵液；

步骤三：取步骤二得到的桑黄菌发酵液100mL, 经4000r/min、4℃离心15min，弃去菌丝体，取得的上清液即为粗酶液；取4ml缓冲液和1ml粗酶液，混匀，30℃恒温水浴反应30min，得到目的酶。

其中缓冲液是指，每1L缓冲液中包含有1.0mmol的愈创木酚和50mmol的琥珀酸，其中琥珀酸的pH为4.5。

对照实验：

选取相同桑黄菌株于普通综合PDA添加Cu²⁺浓度60μmol/L培养基，与以上不同实施培养基进行产漆酶对照实验：

步骤一：配置发酵培养基，培养基的重量配方为：将土豆20%（煮汁）、葡萄糖2.0%、蛋白胨1.5%、KH₂PO₄0.1%、MgSO₄0.05%、添加Cu²⁺浓度60μmol/L，维生素B₁ 1mg/100mL加水溶解混合，定容至1000mL，灭菌；

步骤二：以步骤一培养基为对照，对其碳源和氮源进行试验。

碳氮源的种类和浓度不仅是菌体生长的必要因素，对产漆酶也有很大的影响。本试验主要以等同质量的不同碳氮源代替对照试验的碳氮源进行试验，确定该发明所特有的优点。

试验培养基：将对照培养基中的葡萄糖分别以蔗糖、乳糖、麦芽糖、可溶性淀粉、玉米粉取代，进行试验；将对照培养基中的蛋白胨分别以酵母膏、麸皮、（NH₄）₂SO₄、黄豆粉、尿素代替进行试验。

碳源试验：将桑黄菌株在6种不同碳源培养基中培养，每次试验重复5次，结果取平均值。

氮源试验：将桑黄菌株在6种不同氮源培养基中培养，每次试验重复5次，结果取平均值。

优化培养基：试验以玉米粉（A）葡萄糖（B）为复合碳源，以麸皮（C）、蛋白胨和酵母膏（D）为复合氮源，采取四因素三水平正交试验的方法对桑黄菌产酶液体培养基进行优化。 取一级桑黄菌菌种黄豆大小分别接种于9种不同的正交试验培养基中，在温度29℃，摇床转速150 r/min条件下培养60h，每次试验重复5次，结果取平均值。试验因素及其各水平见表1。

不同碳源对产酶量的影响试验：

在碳源对照培养基中分别加入各种碳源2%，进行碳源的筛选试验，试验重复5次，取每次产酶量平均值。结果见表2。

不同氮源对产酶量的影响试验：

在氮源对照培养基中分别加入各种氮源0.5%，进行氮源的筛选试验，试验重复5次，取每次产酶量平均值。结果见表3。

正交试验优化桑黄发酵产漆酶的培养基结果与直观分析见表4：

从表4可以看出9个处理中，处理2的产酶量最大12000U/L。由此得出较优的桑黄发酵生产漆酶培养基组分为玉米粉、麸皮、葡萄糖、蛋白胨、酵母膏、KH₂PO₄、MgSO₄、Cu²⁺，维生素B₁。

步骤三：同实施例1。

不同培养基对漆酶产量的影响作用的对比如下表5

Claims (1)

1.利用桑黄发酵生产漆酶的方法，其特征在于：

由以下步骤实现：

步骤一：配置发酵培养基，培养基的重量配方为：玉米粉0.5～1.5%、麸皮0.3～1.5%、葡萄糖0.5～2.0%、蛋白胨0.3～0.9%、酵母膏0.1～1.0%、KH₂PO₄0.05～0.15%、MgSO₄0.01～0.06%、添加Cu²⁺浓度30～60μmol/L、维生素B₁1mg/100mL；

步骤二：取生长在斜面上的桑黄菌丝体黄豆大小接入配制好的发酵培养基中，采用300mL三角瓶装发酵培养基，装液量为100mL，旋转频率150r/min，28℃培养60h，过滤得桑黄发酵液；

步骤三：取步骤二得到的桑黄发酵液100mL, 经4000r/min、4℃离心15min，弃去菌丝体，取得的上清液即为粗酶液；取4ml缓冲液和1ml粗酶液，混匀，30℃恒温水浴反应30min，得到目的酶；

步骤三中的缓冲液是指，每1L缓冲液中包含有1.0mmol的愈创木酚和50mmol的琥珀酸，其中琥珀酸的pH为4.5。