CN102639718B - 用于扩增靶核酸的方法 - Google Patents

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Abstract

本发明提供了用于扩增核酸样品中的至少一种靶核酸的方法，其包括：(a)使核酸样品片段化，以产生至少一种的靶片段，靶片段包含靶核酸并包含两个探针互补部分，其中两个探针互补部分的至少一个位于靶片段的末端；(b)使片段化的核酸样品与至少一种探针接触，探针提供有固定化部件并任选地通过部件的方式固定在固相上，探针包含与靶片段的探针互补部分在序列上互补的两个靶片段互补部分，其中探针的部分可以是相邻的，或可被居间非靶片段互补部分分开；(c)使片段化的核酸样品成为单链的，其中该步骤在步骤(b)之前或与步骤(b)同时或在步骤(b)之后发生；(d)允许靶片段的探针互补部分与探针的靶片段互补部分杂交；(e)如果在步骤(b)中提供的探针未被固定化，通过固定部件的方式使探针-靶片段杂交体在固相上固定；(f)将未固定的核酸片段与固相分开；(g)使固相与连接酶连接以直接或间接连接靶片段的5’和3’端，由此环化靶片段，其中如果靶片段的探针互补部分之一没有位于靶片段的末端，通过瓣状内切核酸酶或外切核酸酶的作用形成除了探针互补部分所位于的末端之外的另一可连接末端；和(h)扩增所述环化的靶片段。还提供了在本发明的方法中使用的试剂盒。

Description

用于扩增靶核酸的方法
本发明涉及用于扩增在核酸样品中存在的靶核酸的改进方法。在此类方法中，将样品片段化并且将含有靶核酸的片段(“靶片段”)与提供的探针杂交，所述探针含有与靶片段互补的序列，排列为在杂交时使得靶片段采用环形构象。探针被固定在固相上，便于在探针-靶片段杂交中的靶片段的连接-介导的环化之前进行去除非靶核酸的分离步骤。接着扩增环化的靶片段，并且可通过例如核酸测序、微阵列、qPCR等等对扩增产物进行随后的分析。本发明特别涉及这样的改进，其中杂交步骤和连接步骤被分开，并在分立的步骤中、在分开的溶液中进行，允许例如，在连接之前分离并去除未杂交的片段和核酸。本发明的方法特别适合核酸的多重靶向扩增。
通常期望能选择性多重扩增许多感兴趣的基因组区，例如为了分析在生理或病理状况中的牵涉的候选区域。特别地，伴随着下一代平行测序技术的出现，为了克服基因组分析中由于聚合酶链式反应(PCR)对于高多重扩增的不适宜性导致的瓶颈，需要允许即时制备感兴趣大的基因组区样品的方法。充分开发下一代测序器的测序通量的成本有效的靶向重测序需要能特异性平行扩增大量的靶基因组序列的方法。
从WO 99/49079中可知，一种用于从核酸样品中扩增靶核酸的不依赖于PCR的方法是使样品片段化以生成含有靶核酸的片段并且通过将片段与下述的线性寡核苷酸探针杂交使片段环化，所述探针被设计以含有分别与片段的5′和3′末端序列互补的相邻序列。探针可被固定化。通过相邻杂交的末端的连接，片段随后被环化，并且接着通过滚环扩增(RCA)被扩增。但是，WO 99/49079中没有公开此类方法的多重实施方式。
WO 01/38580公开了固定化的“锚定引物”，其可使靶核酸环化用于随后例如通过RCA的扩增。
在WO 2005/111236中公开用于从核酸样品中多重扩增靶核酸的溶液相(非固定化探针)方法。在该方法中，具有在双链部分侧翼的单链末端的部分双链探针通过它们的单链末端以靶特异性方式与从核酸样品的片段化产生的靶片段的两个末端都杂交。连接步骤导致探针-靶片段杂交体环化。探针的双链区(其一个链形成环化的探针-靶片段杂交体的部分)含有引物对基元，所述引物对基元对于在多重检验中使用的许多不同的靶-特异性探针是相同的。因此，多种靶片段的PCR扩增可同时实现，同时避免由于使用多种不同的引物对而可能导致的扩增假象(artefacts)。
现已令人吃惊地发现，通过在靶片段与探针的杂交和随后的连接(环化)之间进行分离步骤，在分别使用如在WO 99/49079或WO2005/111236中描述的单链或部分双链探针的方法的情况下，可实现出乎意料的良好结果。在分离步骤中，探针-靶片段杂交体被从样品中特别是从未杂交的片段或其他核酸中分离。此种效果是不可预见的。通常不会预见到通过在连接步骤之前(即在杂交后并且在连接前)分离探针靶片段杂交体与通过在连接步骤后分离相比将使得所述方法获得的结果差异显著。的确，如果预见在此类方法的步骤顺序中分离步骤的位置将具有重要作用，考虑到靶片段与通过连接而被稳定的探针的结合，在连接步骤之后分离将是有利的。特别地，如果探针被固定，这将导致被稳定的靶片段的固定，因而提高其与未非特异性固定的核酸的分离。事实上，已令人吃惊地发现，相反是正确的；当杂交步骤和连接步骤被分离步骤分开(即在连接之前分离)时获得的结果显著好于无分离步骤或分离步骤在连接步骤之后时获得的结果。
不希望受理论束缚，我们相信，若未由连接之前的分离步骤去除，非靶“背景(background)”核酸片段分子间或分子内连接为容易扩增的线性多连体分子或环形分子。经历连接后分离步骤留下来的任何此类分子引起扩增步骤期间高水平的背景扩增。可以认为，通过在连接前将靶(探针杂交的)片段与非靶片段分离，分离步骤后在固相上剩余的任何非靶片段由于它们的低浓度和/或由于它们与固相附接导致的空间位阻而具有低的连接概率。此类片段较低的连接成容易扩增种类的水平导致背景扩增的水平显著降低。
因而，本发明提供用于扩增核酸样品中的至少一种靶核酸的方法，其包括：
(a)使核酸样品片段化，以产生至少一种靶片段，所述靶片段包含所述靶核酸并包含两个探针互补部分，其中所述两个探针互补部分的至少一个位于靶片段的末端；
(b)使所述片段化的核酸样品与至少一种探针接触，所述探针具有固定化部件并任选地通过所述部件被固定在固相上，并且所述探针包含与靶片段的探针互补部分在序列上互补的两个靶片段互补部分，其中探针的所述部分可以是紧邻的，或被中间非靶片段互补部分分开；
(c)使片段化的核酸样品成为单链的，其中所述步骤可在步骤(b)之前、与步骤(b)同时或在步骤(b)之后发生；
(d)使靶片段的探针互补部分与探针的靶片段互补部分杂交；
(e)如果在步骤(b)中提供的探针未被固定化，通过所述固定化部件使探针靶片段杂交体固定在固相上；
(f)将未固定化的核酸片段与固相分离；
(g)使固相与连接酶接触，以直接或间接连接靶片段的5′和3′可连接末端，由此环化靶片段，其中如果靶片段的所述探针互补部分之一没有位于靶片段的末端，则通过瓣状(flap)内切核酸酶或外切核酸酶的作用生成除探针互补部分所位于的末端之外的可连接末端；和
(h)扩增所述环化的靶片段。
如上所述的本发明的方法可被用来扩增单种(即单一种类的，其通常以许多拷贝存在)靶核酸(“单一方式”(simplex format))或其中使用多种探针的多种(即多个种类的)靶核酸(“多重方式”(multiplexformat))。但是，如果片段化的核酸样品含有在序列上充分类似的片段从而可能与一种探针杂交，则在方法中可以使用单种探针扩增超过一种靶核酸，并因此可以在该方法中使用相同探针来扩增。根据上文清楚的是，“单种”探针意味着单种类的探针并且不是暗示对使用的探针分子的实际数目的任何限制。
本文使用术语“多种”表示两种或更多种(或至少两种)，更具体地3种或更多种(至少3种)，或4、5、6、8、10、15、20、30、50、70、100、500、1000、2000、5000或10,000或更多种。例如，10、100、1000或10000种不同的探针可同时被用来分别扩增10、100、1000或10000种不同的靶核酸。当以多重方式进行时，可使用一个或多个探针文库，所述探针文库被特异性设计来扩增通过用特定的限制性酶或限制性酶的组合消化产生的特定核酸样品(例如人基因组DNA)的片段或其一个或多个亚组。因而，可设计对期望的(多种)靶序列而言是特异性的探针文库。
在优选的实施方式中，多种靶核酸被扩增。还优选使用一个或多个探针文库扩增具体的核酸样品的片段的一个或多个亚组，例如被认为与具体的病理生理状况相关的片段的亚组。
本文中，术语“扩增”被广义地使用，以包括增加给定核酸序列的分子数目的任何手段(例如拷贝或复制核酸序列)，并且包括指数扩增机制，例如熟知的PCR和其已知的变形形式和多重链置换(MDA)，以及非指数机制，例如RCA(也有RCA的指数变形形式)。类似RCA并且和PCR不同，MDA是不需要温度循环的等温反应(如根据本发明的方法的情况，当使用环形模板时，MDA与“超支化RCA”同义；Lizardi P.M.等，Nat Genet.，19(3)，225-32，1998)。特别地，扩增方法可包括从引物的延伸(即核苷酸链延伸)(即基于引物的扩增)并且如上文所述的，这可以是线性扩增或指数扩增。
此类扩增方法可利用序列特异性引物，即被设计成与靶片段中的特定的已知序列杂交的引物，或可使用“随机”引物例如六聚体，如在本领域中已知的，其在统计学上容易在合理长度的任何靶片段中发现与其杂交的互补序列。随机引物的使用在本发明的方法中是特别有用的。
在本发明的方法的一种实施方式中，可能优选的是进行选择性扩增步骤，通过该步骤，意味着仅特异性(种类的)环化的靶片段，即一种或多种(种类)的环化的靶片段被扩增。或者，环化的靶片段可被选择性扩增，使得不是所有的通过所述方法产生的环化的靶片段被扩增。此类选择性的或靶向的扩增可通过本领域中已知的任何手段实现，例如通过控制扩增试剂和/或条件使得仅仅含有特定靶序列的环化的靶片段被扩增。因此，通过例如RCA、PCR等等，扩增可被限制于一种(种类)的环化靶片段或包含一个或多个共有序列的环化的(多种种类)靶片段的组。类似地，每个具有不同的扩增靶序列的若干组(多种种类)环化的靶片段可被选择性扩增。在一种实施方式中，单种引物(或在PCR的情况下，引物对)可被用来扩增超过一种(种类的)的环化的靶片段，例如每种(种类)的环化的靶片段含有共有序列或类似序列，所述序列使引物能与所述序列杂交并起动扩增。
本文中使用的“靶核酸”表示期望被扩增的在样品中的核酸区域。这通常是可在样品中存在的较长核酸分子的一部分(或一部份或一段)。因而，其可以是在核酸样品中存在的较长核酸中的区域或序列段(stretch)。靶核酸可以是任何长度，但是为了通过本发明的方法扩增，所述靶核酸必须包含通过使核酸样品片段化的步骤产生的片段(“靶片段”)或被含在通过使核酸样品片段化的步骤产生的片段(“靶片段”)内。靶核酸的序列可以是未知的，但是为了有助于设计必须能与靶片段的两个探针互补部分杂交的探针，对应的靶片段的至少一些是已知的序列。
上文的提到的“核酸样品”可以是含有来自任何来源或具有任何起源的任意量核酸的任何样品，期望从所述样品扩增包括在其中的已知(或怀疑)的靶核酸。更特别地，样品可以是含有核酸的任何样品。在样品中含有的核酸可以是DNA和/或RNA。样品可以是复合物，例如整个基因组DNA或其部分。在这一方面，其可以是例如核酸分离过程或细胞裂解过程的直接产物，或者其可以通过一些方式被进一步分级或纯化，例如其可含有已通过一些方式被部分或完全分离、或通过任何方式处理的核酸。样品可以来自任何真核或原核或病毒来源，例如其可以是微生物(例如细菌或真菌)、植物或动物(例如脊椎动物、哺乳动物或灵长动物)起源的。在一个具体的方面中，样品可以是人起源的，例如人基因组DNA。
因而，靶核酸优选地是基因组DNA。其可代表总基因组DNA或其可以是总基因组DNA的亚级分。
在方法的第一个步骤(a)中，已知(或怀疑)含有靶核酸的核酸样品被片段化，以生产片段，(如果样品中存在靶核酸并且适当地选择了片段化方法的话)其中会存在至少一种(即至少一个种类)含有靶核酸的片段。术语“片段化”在本文中广义地使用，以包括可以将样品中的核酸片段化或切割(即分成或“切”成更小片或片段)的任何手段。因而，片段化可以酶促进行(例如使用限制性或其他内切核酸酶或核酸酶如DNase)，和/或物理地进行(例如通过喷雾法或超声处理或任何基于剪切的方法)。此类物理方法导致不可预测的、非序列特异性的片段化，就像某些(非限制性)核酸内切酶一样。因此，随机片段化和预定(或位点特异性)片段化均包括在内，但是优选后者。因此，使用在已知或确定的位点切割的酶的片段化是优选的，也就是说，以序列特异性或结构特异性方式切割的酶，或换句话说，切割产生具有已知(确定)或预定序列末端的酶，例如限制性内切酶和瓣状内切核酸酶。然而，在步骤(a)中提及的“片段化”还包括可能由于样品年龄、储存样品的条件和对样品的任何处理(例如固定化，例如在福尔马林固定、石蜡包埋的样品中)固有地导致的核酸样品的片段化和这些因素促成的降解。可以使用任何合适的限制性内切核酸酶种类，包括II型和IIs型酶。或者，可以使用瓣状内切核酸酶(FEN)来实现切割(片段化)，其中所添加的核酸或寡核苷酸由于仅部分是双链的，所以仅部分可与核酸样品中的序列杂交，导致与杂交区域相邻的核酸样品的突出的非杂交区域。该二级结构是所谓的结构特异“瓣状内切核酸酶底物”，所述酶在杂交和非杂交区域的结合处切割核酸样品(Lyamichev V et al，Science.，260(5109)，778-83，1993)。不存在接近核酸样品内靶DNA的(已知)限制性酶识别序列时，瓣状内切核酸酶的使用可以是有利的，因为其允许切割(片段化)被靶向至已知序列的任何区域。藉此提供了定位切割位点的灵活性。使用瓣状内切核酸酶时，先行进行物理片段化步骤可能是有利的。
在优选的实施方式中，片段化通过一种或多种限制性内切核酸酶来实现。
片段化手段可以组合使用，例如一起使用两种或更多种的内切核酸酶，更特别地两种或更多种的限制性内切核酸酶，或一起使用酶促手段和物理手段。另外，核酸样品可以在多份单独的小份试样中被差异化地片段化，所述小份试样随后被合并在一起进行本发明的方法的剩余步骤。在某些情况下，可以使用单种限制性核酸内切酶适当并充分片段化，而在其他情况下，使用额外的限制性核酸内切酶可以是优选的。
因此，片段化可如下实现：将核酸样品分成多个小份试样，并用不同的手段或不同的手段组合将各个小份试样片段化，此类手段例如为限制性酶。样品的任何数目(例如2或更多个、或3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15或20或更多个等等)的小份试样可被差异化处理。代表性的范围可包括5到20、5到18或5到15，但可使用任何上文记录的整数之间的任何范围。小份试样然后进行方法的剩余步骤并可在方法期间的任何点处合并，例如在步骤(b)之前、在步骤(c)之前、在步骤(d)之前、在步骤(e)之前、在步骤(f)之前、在步骤(g)之前或在步骤(h)之前，以给出在上文方法中涉及的(单一)核酸样品。在上文步骤(a)中提及“包含所述靶核酸的至少一种靶片段”(即至少一种此类靶片段)因此反映了下述事实，如果通过多于一种手段(的组合)将多份单独的小份试样中的样品片段化，将会产生多于一种的含有靶核酸的靶片段。
因此，在具体的实施方式中，通过使核酸样品的多份小份试样分别经受一种或多种限制性内切核酸酶的不同的组合，并在上文的步骤(b)之前合并片段化的核酸样品的所述小份试样，实现片段化。
可能的话，可以使用下述内切核酸酶通过片段化来开发样品核酸中已知的杂合多态性(heterozygous polymorphisms)，所述内切核酸酶识别在至少一种情况下被此类多态性失活的序列。通过设计被靶向至在存在和不存在多态性内切核酸酶识别位点处的切割时所产生的片段的探针，所述单体型特异性片段可独立地被扩增。
除了包含靶核酸，靶片段包含两个“探针互补部分”。这些部分可独立地与期望被扩增的靶核酸序列分开，或与其部分或完全重叠。探针互补部分由与对应的探针的靶片段互补部分的序列互补的核苷酸序列组成，探针的靶片段互补部分的序列在上文步骤(b)中称为“与靶片段的探针互补部分在序列上互补的靶片段互补部分”。本文中使用的“互补的”表示具有功能互补性，即足以介导与探针的上文所述部分的有效的杂交的互补性水平，其包括100％互补性和小于100％互补性的程度。探针互补部分和探针的对应部分之间100％互补性是优选的。有效的杂交是这样的杂交，其中探针和靶片段之间的“结合”是充分的，例如是稳定的或足够强的，以允许探针-靶片段杂交体与样品分离。特别地，其可以是这样的杂交，所述杂交能使探针互补部分的直接或间接连接模板化，包括在特殊的实施方式中的在前的瓣状核苷酸内切或核苷酸外切消化。直接连接表示靶片段的探针互补部分(其构成或形成“可连接的末端”)彼此连接。间接连接表示靶片段的探针互补部分(换句话说为“可连接末端”)彼此不是直接连接的，而是通过一个或多个居间的(寡)核苷酸的居间(intermediacy)连接。因而，在后者的情况下，靶片段的探针互补部分以这样的方式与探针杂交：它们在探针上不是紧密相邻的，而是在它们之间有一个或多个核苷酸的缺口。此类缺口可被与探针的该非靶互补部分互补的一个或多个“缺口”寡核苷酸“填充”。这在下文中进一步描述。或者，缺口可通过使位于靶片段的3′末端的探针互补部分延伸而被填充。在间接的实施方式中，通过探针的居间的非靶片段互补部分，使连接模板化。
靶片段的探针互补部分可以是相同或不同长度，并且每个可以是任何长度，只要它们根据上文给出的含义与探针的对应部分“互补”。因而，探针互补部分可以是5个核苷酸长或高于5个核苷酸的任何长度，例如6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、30、40或50或这些之间的任何整数或等于或多于这些的核苷酸。20个核苷酸是优选地。“互补”在针对探针互补部分使用时，将所述部分作为一个整体而非个别核苷酸(使得，如上文讨论的，探针互补部分并不必须由100％互补的核苷酸组成)，这些探针互补部分长度应被认为表示：如果探针互补部分不与探针的对应部分100％互补，则所述部分的距离最远的靶片段互补核苷酸描绘该长度的核苷酸的序列段。如下文所讨论的，在多重实施方式中达到在所有探针上靶片段杂交的近似一致的Tm可影响或控制各个探针的每个靶片段互补探针部分的精密长度并因而也影响或控制各个靶片段的对应探针互补部分的长度。
两个探针互补部分的至少之一必须位于靶片段的5′或3′末端。在上文步骤(a)中使用的“位于末端”表示至少一个靶片段末端的一定数目的末端残基构成探针互补部分，即在探针互补部分和片段末端之间没有不与探针的相应靶片段互补部分互补的核苷酸(即不是探针互补部分的一部分)，所述靶片段互补部分在序列上与所述探针互补部分互补。虽然如上所讨论的，在探针互补部分和探针的对应部分之间的互补性可以不是100％，但是位于靶片段末端的探针互补部分的末端核苷酸应当与探针中对应的核苷酸互补。优选地，探针互补部分和探针的对应部分之间的互补性为100％。如果探针互补部分之一没有位于靶片段的末端，即在片段内部，该探针互补部分与另一探针互补部分的直接或间接连接首先需要使用瓣状内切核酸酶或外切核酸酶以产生与探针杂交的可连接末端，即源自内部探针互补部分的可连接末端。这在下面进一步讨论。
在优选的实施方式中，两个探针互补部分都位于靶片段的末端。
一旦核酸样品已经被片段化，片段化样品与至少一种探针接触。如上所讨论的，除了其中单种探针可能够扩增两个或多个靶片段(其序列上足够相似以便可能与相同的探针杂交并使用相同的探针扩增)的情况，使用的探针的数目(种类)将对应于期望扩增的靶片段的数目(种类)。探针具有(例如附接或缀合，或含有)固定化部件，即用于将探针附着至固相的手段，并且可能已经或还没有通过这种手段附着至固相(“固定化的”)。因此，固定化部件用于选择性将探针-靶片段杂交体(在其在上述步骤(d)中形成之前或之后)附着至固相或支持物(包括例如颗粒，诸如珠粒)。可起到固定化部件作用的元件的许多例子是本领域已知的，并包括例如，亲和力结合配偶体，例如生物素或半抗原，其能够与在固相或支持物上提供的其结合配偶体(即同源(cognate)结合配偶体，例如抗生蛋白链菌素或抗生物素蛋白，或抗体)结合。因而这种固定化部件可以是能够与它的结合配偶体或“受体”结合的任何“配体”，其中结合配偶体或“受体”可被提供在固相上。或者，它可以是任何官能团(例如化学基团)，其能够参与与在固相上存在的对应或活性基团的反应，从而在相应各基团之间形成键(可以是共价键或非共价键)，将固定化部件(并因此将探针)结合至固相。探针和固相之间的相反作用可通过点击化学(clickchemistry)介导(Kolb H.C，等，Angew Chem Int Ed Engl.，40(11)，2004-2021，2001)。
优选使用在5’或3’末端携带生物素的探针，其可与在固相上的抗生物素蛋白或抗生蛋白链菌素部件相互作用。探针可在合成期间或随后使用TdT和生物素化的核苷酸被生物素化(Igloi，G.L.，Schiefermayr，E.，BioTechniques，15，486-497，1993)。使用胺基固化探针也是优选的。
固相可以是目前广泛用于或推荐用于固定化、分离等等的任何已知的支持物或基质。这些可采用下列形式：颗粒(例如珠粒，其可以是磁性的或非磁性的)、片、凝胶、滤器、膜、纤维、毛细管或微量滴定带、管、盘或孔等。支持物可由玻璃、硅石、乳胶或聚合材料制成。合适的材料是提供用于结合分析物的高表面积的材料。这种支持物可具有不规则的表面并可以是例如多孔的或颗粒状的，例如为颗粒、纤维、网、烧结物或筛。因为更大的结合能力，颗粒状的材料例如珠粒，尤其聚合珠粒是有用的。便利地，根据本发明使用的颗粒状固体支持物包含球形珠粒。珠粒的尺寸不是至关重要的，但是它们可例如具有至少1μm和优选地至少2μm的直径等级，并且具有优选地不大于10μm，例如不大于6μm的最大直径。在尺寸上基本上均一(例如具有小于5％的直径标准差的尺寸)的那些单分散粒子具有下述优势：它们提供非常均一的反应再现性。代表性的单分散聚合物颗粒可通过US-A-4336173中描述的技术产生。但是，为了帮助操作和分离，磁性珠粒是有利的。在本文使用时，术语“磁性的”表示支持物置于磁场中时能够被给予磁矩，从而能够在所述场的作用下移动。换句话说，包含磁性颗粒的支持物可容易地通过磁性聚集去除，这提供了一种在分析物结合步骤之后分离颗粒的快速、简单和高效的方式。特别有利的固相包括非常小的颗粒，所述颗粒可高效地接触高比例的可固定化的探针。此类颗粒还可进一步用于如下：延缓与颗粒附接的靶片段移动通过凝胶，允许与游离的、未与颗粒附接的(非靶)片段分离。或者，还优选的是使用经下述基团修饰的色谱基质，所述基团可与探针上的基团共价或非共价地反应。
在具体的实施方式中，固相携带一个或多个抗生蛋白链菌素部件。在相同或另一种实施方式中，固相是磁性珠粒。
除了携带或含有固定化部件，探针包含两个“靶片段互补部分”，其在序列上与靶片段的探针互补部分互补，在本文中也被称作“探针的对应部分”。探针的这些部分的长度可以是相同的或不同的并且可以是如上所定义的足够介导与靶片段的探针互补部分的有效杂交的任何长度。因此，它们可以是5个核苷酸长或大于5个核苷酸的任何长度，例如6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、30、40或50或这些之间的任何整数或等于或多于这些的核苷酸。20个核苷酸是优选地。就探针互补部分而言，因为“互补的”是指将探针的这些部分作为整体而非个别的核苷酸，这些长度应当认为表示，如果该部分不是与靶片段的对应探针互补部分100％互补，所述部分的距离最远的与靶片段互补(即探针互补部分-互补)的核苷酸描绘该长度的核苷酸的序列段。在其中使用多于一种探针的多重实施方式中，可选择各自探针的每个靶片段互补部分的精确长度，使得所有的探针共有用于与对应的靶片段杂交的基本上一致的融解温度(Tm)。
探针的序列上与靶片段的探针互补部分互补的两个部分可以在探针中彼此紧邻，或可以通过其序列不与靶片段互补的居间“载体”部分分开。在某些实施方式中，与探针杂交的靶片段的末端之间的缺口(所述缺口对应于探针的载体部分)，通过与载体部分的互补寡核苷酸(本文称为“缺口寡核苷酸”)的杂交来填充。在这种实施方式中，载体部分可以是足够允许与“缺口寡核苷酸”有效杂交的任何长度，其中在该情况下有效杂交的意思是能够使靶片段的探针互补部分的间接连接(即靶片段的可连接末端与缺口寡核苷酸的各自末端的连接，所述缺口寡核苷酸与探针的居间部分杂交)模板化的杂交。载体部分可以是任何序列，前提是该序列不引起与靶片段的杂交。与载体部分互补的缺口寡核苷酸可含有一个或多个用于扩增靶片段的引物结合序列，其中所述靶片段当在步骤(g)(在使用包含这种居间部分的探针的实施方式中)中环化时并入缺口寡核苷酸(在环化靶片段的情况中称为“载体序列”)。另外或或者，缺口寡核苷酸可含有一个或多个“条形码(barcode)”序列，其是任意核苷酸序列，在其中多重样品(例如，患者样品)根据本发明的方法被平行处理的多重实施方式中可在诊断上用于鉴定环化的靶片段的样品来源。例如，根据该方法使用条形码不同的探针和对应的缺口寡核苷酸，可独立地环化并连接不同的片段化样品，然后在扩增和下游分析之前合并。
可见，在相关的实施方式中可使用多于一种的缺口寡核苷酸，所述缺口寡核苷酸与探针的非靶互补部分以这种方式杂交：它们和探针的可连接末端在连接步骤期间在序列上连接在一起。在其他实施方式中，对应于探针的载体部分的靶片段的末端之间的缺口可通过靶片段的可连接3′末端聚合酶-介导的延伸填充。合适的聚合酶是本领域熟知的。一旦所述3′末端已经延伸至可连接的5′末端，所述末端可在连接反应中连接。
因此，居间的载体部分可以是，例如1个核苷酸长或大于1个核苷酸的长度，例如1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、30、40、50、100、150或之间的任何整数或等于或多于这些的核苷酸。
多重实施方式中的探针或多种探针可从组合合成或微阵列合成中产生(Zhou X.等，Nucleic Acids Res.，32(18)，5409-5417，2004)；Gnirke A.等，Nat Biotechnol.，27(2)，182-189，2009)。这种策略可用于产生小量的高复合的探针文库。
在靶片段可与探针杂交之前，片段化的核酸样品必须变成单链的。这可通过本领域已知的任何方式实现，比如变性，例如通过热或pH，或通过使用化学品。热变性是优选的。如在上面步骤(c)中所指示的，片段化的样品可在杂交步骤(d)之前的任何点，即在使片段化的样品与探针接触之前、期间或之后制成单链的。优选地，片段化的样品在上面步骤(b)之后制成单链的。
一旦片段化的、单链化的核酸样品与探针接触，靶片段将通过它的探针互补部分与探针杂交。当靶片段的两个探针互补部分与探针的对应部分杂交时，分开两个探针互补部分的序列将远离探针成环，使得杂交的靶片段采用基本上环形的构象。“远离成环的”序列优选地是不在探针互补部分中的大部分或所有的靶片段序列。只有在其中探针互补部分之一没有在靶片段末端的实施方式中，杂交的靶片段将含有不是远离成环、环形构象一部分的非探针互补部分序列(这种序列将形成不与探针杂交的突出末端)。用于实现核酸杂交的适合条件是本领域熟知的。
在优选的实施方式中，靶片段的探针互补部分被允许在甲酰胺存在的情况下与探针的互补部分杂交。在这种实施方式中，杂交在含有甲酰胺的溶液中发生，产生改善的结果。在特别优选的实施方式中，杂交溶液含有下列组分：1％和50％之间的甲酰胺；10mM和2M之间的单价阳离子；和EDTA。例如，可以使用20％甲酰胺；1M NaCl；和5mM EDTA。将会理解的是，为了获得合适的杂交严格性，这些组分应当在各自规定的范围内以适当的比例组合，针对杂交温度所述比例被适当地选择，杂交温度反过来受靶片段的探针互补部分和探针的对应部分的长度影响。例如，假设探针互补部分和对应的靶片段互补部分约20个核苷酸，对于上面指定的杂交溶液的合适温度可以是46℃。杂交溶液可与探针同时被添加至反应混合物。
当片段化的样品和探针已经在本领域已知的允许杂交的充足条件下孵育充足的时间时，如果探针在上面步骤(b)中没有被提供为固定在固相上，则将探针-靶片段-杂交体通过探针的固定部件固定至固相。如本领域已知的，通过将含有探针-靶片段-杂交体的杂交混合物与能够与探针的固定化部件相互作用的固相接触可简单地实现这种固定化。
探针-靶片段杂交体的固定化有利地促进杂交体与反应混合物中的其他组分例如非靶片段“背景”核酸的分离。这种分离可通过本领域已知的允许反应的液体组分从一种或多种固相组分中去除的任何方式来实现。例如，如果磁性的珠粒用作固相，反应混合物的液体组分可通过微移液管被选择性地抽吸，同时通过施加至容器侧的磁力将珠粒保留在反应器中。假设使用合适的“颗粒”固相，备选方案将是使用凝胶来尺寸选择性地从反应混合物的“小的”液相组分纯化“大的”固相颗粒。如果固相是容器或孔，分离可通过从容器或孔中去除反应介质来简单地实现。
如上面所讨论，在环化的靶片段连接之前，通过探针或探针-靶片段杂交体的预先固定化促进的分离步骤显著地且预想不到地改善了通过本发明的方法获得的结果。推测这可能是由于在连接步骤之前背景核酸的去除，所述背景核酸否则会连接成为可高度扩增的种类，导致高水平的背景扩增并从而明显降低该方法结果的质量。
在本发明方法的背景下，分离步骤提供了其他优势：用于制备样品，用于使用下一代测序技术来测序，例如靶向再测序。这种测序技术对反应器中存在的所有核酸分子测序。因此，即使不倾向于问题扩增的背景核酸可能污染测序分析。通过去除固定化的探针-靶片段杂交体之外的所有核酸的分离步骤减小或避免了该问题。
此外，如下面更详细地讨论的，有助于分离步骤的可固定化探针和固相的使用使得从扩增步骤去除探针变得可能。因此，在某些实施方式中，环化的靶片段与探针脱离，且由于能够从扩增步骤去除探针，这导致了有利的结果，并因而避免探针的潜在干扰。这可允许使用更高的探针浓度。
在一种实施方式中，通过使用对固相的一次或多次洗涤加强分离。从固相中洗涤去除非固定化试剂在本领域中是常规的。在优选的实施方式中，在存在甲酰胺的情况下进行洗涤。在特别优选的实施方式中，洗涤溶液含有下列组分的任何组合：1％和50％之间的甲酰胺；10mM和2M之间的单价阳离子；和EDTA。洗涤溶液和洗涤条件(例如温度)可以与上述的杂交溶液和条件相同。如上面提及的，温度和溶液组分可一起优化。
有利地，本发明的方法允许在杂交和洗涤步骤期间使用高严格性条件，使得探针-靶片段杂交体可稳健地从背景核酸分离，所述背景核酸否则会非特异性扩增，导致不期望的扩增背景核酸水平。该方法利用分子内堆积作用，其通过增加杂交体的熔点、准许使用高严格性条件去除非特异性杂交的核酸，稳定紧邻杂交的核酸的杂交。因此，已知的是，相对于通过缺口分开的杂交的寡核苷酸，相邻杂交的两个寡核苷酸(即通过切口(nick)而不是缺口分开)使彼此的杂交稳定。这是“堆积作用”。还已知的是，相对于两个未连接的寡核苷酸，单寡核苷酸的两个区域(否则与所述未连接的寡核苷酸相当)会与互补的核酸以更大的稳定性杂交，因为连接的区域的紧密接近意味着，如果一个区域从互补核酸释放出，由于另一区域的保持的杂交，其仍会保持紧密接近。彼此相关的两个区域的局部浓度将从而降低离解速率，因为如果一个区域未杂交，它将被限制自由扩散，并且再杂交的概率相对高。这是“分子内作用”。根据本发明的方法在靶片段与探针杂交的情况下，两个作用都发生并彼此加强(分子内堆积作用)。
一旦固定化的探针-靶片段杂交体已从反应混合物中分离并任选地被洗涤一次或多次，将固相与连接酶接触。适合用于连接靶片段的可连接末端的连接酶是本领域已知的，其包括，例如，Tth DNA连接酶、Taq DNA连接酶、Thermococcus sp.(株9°N)DNA连接酶(9°NTM DNA连接酶，NewEngland Biolabs)、AmpligaseTM(Epicentre Biotechnologies)和T4DNA连接酶。连接酶直接或间接连接靶片段的可连接5’和3’端，导致靶片段的环化。在上面步骤(g)中，“直接或间接”意味着靶片段的末端可彼此连接，或连接至缺口寡核苷酸的末端(例如每个末端)，或靶片段的可连接5′末端被连接至可连接的3′端，所述3′端被延伸，以填充对应于探针的载体部分的缺口，如上面所讨论。
提到“可连接的”5’和3’端应当被理解为表示容易进行连接(即与探针杂交)的靶片段的末端。在其中两个探针互补部分之一在靶片段内部的一些实施方式中，所述可连接的末端之一将不对应于通过片段化靶核酸序列产生的靶片段末端的任何一个。在其中探针互补部分之一不在靶片段的末端(即在内部)的实施方式中，缺乏探针互补部分的片段末端(即相对于内部探针互补部分的末端“终端”)将“突出”。突出的末端可以是靶片段的5′端或3′端。通过该突出的末端和相反的含探针互补部分的末端(与探针相邻于突出末端从内部探针互补部分与探针杂交的位点突出之处杂交)形成的结构是瓣状内切核酸酶的底物。如上所述，通过切割突出末端以留下与探针杂交的可连接末端，瓣状内切核酸酶“拆解(resolve)”该二级结构。作为使用瓣状内切核酸酶的备选方案，3′或5′外切核酸酶(如果适用)可用于降解突出末端以产生这种可连接的末端。合适的外切核酸酶在本领域是已知的并包括例如外切核酸酶I、外切核酸酶T和RecJf。因此，在一种实施方式中，连接步骤之前使用瓣状内切核酸酶，或外切核酸酶。
在优选的实施方式中，可连接探针末端的连接在不存在甲酰胺的情况下进行。因此，在这种实施方式中，并且其中靶片段与探针的杂交在存在甲酰胺的情况下发生，杂交和连接步骤之间的分离步骤和任选的洗涤步骤用于从后一步骤中去除甲酰胺。通过使用固相促进的杂交和连接步骤的分开除了通过防止非靶片段的连接而显著降低背景扩增之外，还有助于在杂交步骤(和任选的洗涤步骤)中选择性地使用甲酰胺，这改善杂交的严格性并从而进一步降低了与探针的非特异性杂交和随后的背景核酸的连接的可能性。
靶片段的可连接5’和3’端的(直接或间接)连接使得靶片段被环化。提及“环化的靶片段”应当被理解为包括，已经通过间接连接被环化的靶片段，即靶片段的每个末端已经被连接至与探针中的居间载体部分(如上面所讨论)互补的缺口寡核苷酸的末端，使得所得环形分子含有靶片段和缺口寡核苷酸序列。
环化的靶片段接着被扩增。扩增可通过用于扩增核酸的本领域已知的任何方式且可以是选择性的或随机的。如上面所讨论，扩增可具体地通过引物介导的扩增和更具体地通过PCR、RCA或MDA发生。可能期望使用这些扩增技术的不止一种技术。对于这些技术的每一个，可以使用随机引物，例如六聚体，或序列特异性引物(即被设计与靶片段中的预先确定的已知的序列杂交)。如本领域所熟知的，PCR需要反向的两条引物并由于该原因，优选地使用采用序列特异性引物的PCR。还已知的是，RCA是等温扩增方法，其通常使用单一(序列特异性)引物以实现环形模板的连续扩增，产生包含模板补体的多个拷贝的线性多连体扩增产物。在本发明的方法中，引物可以是添加的寡核苷酸或可以是探针。根据本发明的方法也可以使用各种RCA，比如超支化RCA，其使用与多连体扩增产物互补的第二引物并通过链置换机制以实现模板的几何扩增。
在优选的实施方式中，环化的靶片段使用随机引物，优选随机的六聚体通过MDA扩增。相对于使用单一、序列特异性引物的常规RCA，这种MDA导致指数扩增。随机引物的使用允许从环形模板上的多个位点起动，以及从由此产生的扩增产物起动，这通过使用具有链置换活性的聚合酶来促进。合适的聚合酶是本领域已知的，并且就RCA和MDA而言特别优选phi29聚合酶。对于PCR，合适的酶是熟知的并包括Taq聚合酶。PCR可尤其用在本发明的方法中的如下实施方式中：其中探针的与靶片段的探针互补部分互补的部分被居间部分分开，导致与其互补的缺口寡核苷酸(载体序列)被并入环化的靶片段，如上面所讨论。在这种实施方式中，载体序列可含有序列特异性PCR引物的结合位点，以促进靶片段的PCR扩增。结合位点和相应的引物可被布置和设计，使得引物相对于载体序列是面向外侧的，导致跨靶片段序列的扩增。如上所讨论的，载体序列可另外或可选地含有条形码序列。以允许随后的样品鉴定的环化的靶片段的条形码也可通过如下来实现：将含有序列特异性PCR引物的结合位点的载体序列而非条形码序列与对于这种结合位点具有特异性的PCR引物一起使用，该PCR引物装有包含条形码序列的5’尾端。条形码序列被并入扩增产物并在随后的步骤比如核苷酸测序中可“读”。这避免需要为每个将被鉴定的样品提供不同条形码的探针和相应的缺口寡核苷酸。根据该方法，使用相同的探针和相应的缺口寡核苷酸，不同的片段化的样品可因此独立地被环化并连接，使用条形码的PCR引物来扩增，然后扩增产物被合并用于下游分析。
在另一种实施方式中，载体序列可含有用于序列特异性引物MDA的序列特异性引物的结合位点。在这种情况下，将提供对载体序列中的结合位点特异性的一种引物并提供第二引物，所述第二引物与从第一引物产生的扩增产物中的序列(其对应载体序列的一部分)互补(即与靶片段互补)。
在本发明方法的具体实施方式中，通过随机引物MDA的初始扩增步骤之后是起始于载体序列的PCR扩增步骤。在进一步的实施方式中，使用随机引物或对环化的靶片段的载体序列中的引物结合位点特异性的引物的MDA扩增步骤之后是PCR扩增步骤，其中对在对应于载体序列的MDA产物中的引物结合位点特异性的PCR引物包含在5′尾端的条形码序列。
在某些实施方式中，特别是使用高浓度探针的情况下，在扩增步骤之前，将环化的靶片段从固定化探针脱离是有利的。这是为了防止可在存在高浓度的游离3’探针末端的情况下发生的通过聚合酶比如phi29的扩增抑制；这种聚合酶具有3′外切核苷酸酶活性，导致与游离3′末端缔合，可能牺牲环化的靶片段的扩增。高的探针浓度也可潜在地损害基于PCR扩增的实施，因为探针是与具有在载体序列中的结合位点的PCR引物互补的序列。这可抑制PCR引物与环化的靶片段的退火。这可通过如下来避免：将环化的靶片段从固定化探针去除并从固相分离前者。这种分离步骤在本领域是常规手段并与上面所讨论的初期分离步骤类似。可通过用于使杂交的核酸去杂交的本领域已知的任何方式使环化的靶片段与固定化探针脱离。优选地，环化的靶片段从探针变性。这可通过本领域已知的任何方式，诸如通过热或pH或通过使用化学品实现。热变性是优选的。或者，探针可使用外切核酸酶去除，或如果探针部分由尿苷残基构成，通过使用尿嘧啶-N-转葡糖基酶(UNG)去除。除了允许使用高浓度的探针之外，扩增之前从环化的靶片段分离探针的步骤具有其他优势：依赖探针的非特异性扩增被消除。
含有靶核酸的扩增的靶片段可用于任何期望的目的，并且许多可能的用途将对于技术人员读者而言是显而易见的。如上所述，通过本发明方法的靶核酸的扩增(尤其当使用多种探针以多重方式进行多种靶片段的扩增时)在样品制备中特别有用，所述样品制备用于使用下一代测序技术对感兴趣的多个大的基因组区域进行平行测序，例如靶向再测序。这种技术包括大规模平行测序平台，比如SOLiD(Applied Biosystems，Inc.)、IlluminaGenome Analyzer(lllumina，Inc.)和Genome Sequencer(454 Life Sciences)。
本发明提供用于本发明方法的试剂盒。这种试剂盒将至少包含一个探针文库，所述探针文库由对通过用具体的限制性酶或限制酶的组合消化核酸样品(例如，人基因组DNA)所产生的所有片段或片段的一个亚组特异性的探针组成。试剂盒可含有多于一个探针文库，即多个文库，其分别包括对通过不同的限制性酶或其组合所产生的片段特异性的探针和/或分别包含对通过消化核酸样品产生的片段的不同亚组特异性的探针。如上所讨论的，探针携带或含有固定化部件。在优选的实施方式中，所述部件是生物素(即探针是生物素化的)。
试剂盒可进一步包括下列组分中的一种或多种。第一，一种或多种限制酶。如果试剂盒包含多于一种限制性酶，这些酶可单独提供或组合，或二者(即可提供组合和单种酶)。优选地，提供的酶或酶的组合与包含在试剂盒中的探针文库或多个文库一致，使得当所述样品用在试剂盒中提供的限制性酶或酶的组合消化时，所提供的探针文库被设计来扩增所产生的具体核酸样品的片段。
第二，连接酶可提供在试剂盒中，任选地与合适的缓冲液一起提供在试剂盒中。本发明的方法中使用的合适连接酶是已知的。例如，试剂盒可含有Tth DNA连接酶、Taq DNA连接酶、Thermococcus sp.(株9°N)DNA连接酶(9°NTM DNA连接酶，New England Biolabs)、AmpligaseTM(Epicentre Biotechnologies)或T4DNA连接酶。Tth DNA连接酶是优选的。
第三，试剂盒可包含扩增试剂，比如聚合酶、缓冲液和/或引物。聚合酶可以是已知适合用于PCR的聚合酶(例如Taq聚合酶)，或已知适合用于环形模板的扩增的聚合酶(例如phi29聚合酶)。提供的引物可以是序列特异性引物，任选地成对，或可以是随机引物比如随机六聚体。引物可含有包含条形码序列的5′尾端。
第四，固相可提供在试剂盒中。可能的固相为如上面所讨论的固相。固相将可与探针上的固定化部件缀合。优选地，固相将携带抗生蛋白链菌素部件。特别地，固相是抗生蛋白链菌素化的微珠，比如有磁性的微粒。
第五，试剂盒可包含缺口寡核苷酸，所述缺口寡核苷酸与探针的与靶片段的探针互补部分互补的部分之间的居间部分(如果存在)互补。缺口寡核苷酸可含有引物结合序列和/或条形码序列。或者或另外地，试剂盒可包含聚合酶，所述聚合酶能在靶片段与探针(如果所述探针具有这种居间部分)杂交时延伸靶片段的可连接3′末端。
试剂盒中可以包括的其他可能的组分(可彼此任意组合或与上述组分组合)是：瓣状内切核酸酶；有助于核酸样品的瓣状内切核苷酸切割的寡核苷酸；5′或3′外切核酸酶；甲酰胺；和UNG。
除了上面的组分，试剂盒可进一步包括用于实施本发明方法的说明。这些说明可以各种形式存在于试剂盒中，其中的一种或多种可存在于试剂盒中。这些说明可存在的一种形式是试剂盒包装中、包装插入物中等的合适的介质或基底上的印刷信息(例如印刷有信息的一片纸或数片纸)。另一种手段可以是记录了所述信息的计算机可读介质，例如，磁盘、CD等。可存在的另一种方式是通过因特网使用以访问远程站点上信息的网站地址。任何便利的手段可存在于试剂盒中。
因此，在本发明的其他实施方式中，提供了用于扩增核酸样品中的多种靶核酸的试剂盒，其包含探针的一个或多个文库，其中所述文库分别包含对通过用具体的限制性酶或其组合消化核酸样品产生的所有片段或片段的一个亚组特异性的探针和/或分别包含对通过消化核酸样品产生的片段的不同亚组特异性的探针组成，并且其中所述探针携带或含有固定化部件，所述试剂盒还包含下列组分的一个或多个：
(i)一种或多种限制酶，其中所述酶被单独和/或组合提供，并且其中所述酶和/或其组合与用于产生所述核酸样品的片段的酶和/或其组合一致，所述探针的一个或多个文库对所述核酸样品的片段是特异性的；
(ii)连接酶；
(iii)聚合酶和/或扩增引物，所述引物任选地具有包含条形码序列的5’尾端；
(iv)固相；
(v)任选地包含引物结合序列和/或条形码序列的缺口寡核苷酸；
(vi)瓣状内切核酸酶；
(vii)5’或3’外切核酸酶；
(viii)有助于核酸样品的瓣状内切核苷酸切割的寡核苷酸；
(ix)甲酰胺；和
(x)UNG。
参考下列非限制性实施例并参考下列附图进一步描述本发明，其中：
图1示出了来自中靶(on-target)区域和脱靶(off-target)区域的八个不同PCR反应中检测到的分子的平均数目。在富集之后实际上没有脱靶区域片段留在样品中。
实施例
限制性消化
每个样品被分为由100ng DNA构成的八个不同反应。所有的反应含有在10μl总体积中的1个单位的每种限制性酶、相应的反应缓冲液和85ng BSA。八个反应是Sfcl和Hpy1881，在NEB缓冲液4中；Ddel和Alul，在NEB缓冲液2中；Msel和Bsu361，在NEB缓冲液3中；Msll和Bfal，在NEB缓冲液4中；HpyCH4lll和Bsp1286，在NEB缓冲液4中；Sfcl和Nlalll，在NEB缓冲液4中；Msel和HpyCH4lll，在NEB缓冲液4中；HpyCH4V和EcoO1091，在NEB缓冲液4中。反应在37℃下孵育60min并在合并之前在80℃下失活20min。
探针杂交
80μl的合并的反应物与在160μl的总体积中的1.6μl的1nM(单独浓度)的生物素化的探针、28μl的4×Bind & Wash缓冲液(1M NaCl、5mM Tris-HCI(pH 8.0)和5mM EDTA构成1×B&W缓冲液)和37μl的100％甲酰胺。溶液在95℃下孵育10min、75℃下孵育30min、68℃下孵育30min、55℃下孵育30min和46℃下孵育10小时。
固相捕获
通过将10μl M-280抗生蛋白链霉素涂覆的磁性珠粒、6.7×108珠粒/ml(Life Technologies)；10μl的4×B&W缓冲液和20μl的H2O添加至反应并在室温下孵育10min，来捕获生物素化的探针。孵育之后，使用磁体清除上清液。为去除非特异性结合的DNA，将珠粒用包含20％甲酰胺的200μl 1×B&W缓冲液在46℃下旋转洗涤30min。
靶向片段的环化
接着，将珠粒在包含12.5U Ampligase(Epicentre)、1×反应缓冲液(10×反应缓冲液包含200mM Tris-HCl(pH 8.3)、250mM KCl、100mM MgCl2、5mM NAD和0.1％TritonX-100；Epicentre)和0.02μg/μlBSA的50μl连接混合物中在55℃下孵育15min。
扩增
为富集环化的分子，使用Templiphi(GE Healthcare)扩增样品。在扩增之前，用5μl Templiphi样品缓冲液(GE Healthcare)在95℃将连接的环变性10min，脱离固定在珠粒上的探针，然后收集上清液。接着将收集的体积与包含4.5μl反应缓冲液和0.5μl酶混合物的5μl体积合并并在30℃下孵育4小时，随后在65℃下通过热失活10分钟。
富集确认-靶区域的qPCR定量
为确认靶向区域的扩增并评估富集效率，扩增中靶(富集的)序列的八个定量PCR(qPCR)反应与扩增脱靶(未富集的)区域的八个qPCR反应一起运行。对于16个PCR反应的每一个，在30μl PCR混合物中扩增10μl的1∶200稀释的Templiphi扩增产物，所述PCR混合物包含2mMMgCl2、1×PlatinumTaq缓冲液(20mM Tris-HCl(pH 8.4)，50mMKCl)、0.2mM的每一种dNTP、1×Sybr green和167nM的每一种引物的。使用下述方案循环反应：使用MX 3000仪器(Stratagene)，95℃5min，40×(95℃15s，56℃30s，72℃15s)。使用附带的软件确定循环阈值。假设40的循环阈值对应1个分子并且一个PCR循环使扩增子的数目加倍，估计分子数目。包含已知数目的基因组的gDNA样品被用来建立定量的参考点。

Claims (30)

1.用于扩增核酸样品中的至少一种靶核酸的方法，其包含：
(a)使所述核酸样品片段化，以产生至少一种靶片段，所述靶片段包含所述靶核酸并包含两个探针互补部分，其中所述两个探针互补部分的至少一个位于所述靶片段的末端；
(b)使所述片段化的核酸样品与至少一种探针接触，所述探针具有固定化部件并任选地通过所述部件固定在固相上，并且所述探针包含与所述靶片段的所述探针互补部分在序列上互补的两个靶片段互补部分，其中所述探针的所述部分可以是紧邻的，或可被居间非靶片段互补部分分开；
(c)使所述片段化的核酸样品成为单链的，其中所述步骤可在步骤(b)之前、与步骤(b)同时或在步骤(b)之后发生；
(d)允许所述靶片段的所述探针互补部分与所述探针的所述靶片段互补部分杂交；
(e)如果在步骤(b)中提供的所述探针未被固定化，通过所述固定化部件使所述探针-靶片段杂交体固定在固相上；
(f)将未固定的核酸片段与所述固相分离；
(g)使所述固相与连接酶接触，以直接或间接连接所述靶片段的可连接的5'和3'端，由此环化所述靶片段，其中如果所述靶片段的所述探针互补部分之一没有位于所述靶片段的末端，通过瓣状内切核酸酶或外切核酸酶的作用生成除探针互补部分所位于的末端之外的另一所述可连接末端；和
(h)扩增所述环化的靶片段。
2.根据权利要求1的方法，用于扩增核酸样品中的多种靶核酸，其中在步骤(b)中将所述片段化的核酸样品与多种探针接触。
3.根据权利要求1或权利要求2所述的方法，其中所述核酸样品包含DNA。
4.根据权利要求3所述的方法，其中所述核酸样品包含基因组DNA或其部分。
5.根据权利要求1或权利要求2所述的方法，其中步骤(a)中所述片段化通过一种或多种限制性核酸内切酶的方式。
6.根据权利要求5所述的方法，其中步骤(a)中所述片段化通过如下进行：将所述核酸样品的多份小份试样分别经受一种或多种限制性核酸内切酶的各不同的组合，并在步骤(b)之前合并片段化的核酸样品的所述小份试样。
7.根据权利要求1或权利要求2所述的方法，其中两个探针互补部分都位于所述靶片段的末端。
8.根据权利要求1或权利要求2所述的方法，其中所述固定化部件是生物素部件。
9.根据权利要求1或权利要求2所述的方法，其中所述固相携带一个或多个抗生蛋白链菌素部件。
10.根据权利要求1或权利要求2所述的方法，其中所述固相包括磁性珠粒。
11.根据权利要求1或权利要求2所述的方法，其中探针-靶片段杂交体在步骤(e)中固定在固相上。
12.根据权利要求1所述的方法，其中在步骤(b)中所述至少一种探针的与所述靶片段的探针互补部分互补的所述靶片段互补部分由居间非靶片段互补部分分开，并且所述方法还包括使所述片段化的核酸样品接触与所述居间部分互补的缺口寡核苷酸。
13.根据权利要求12所述的方法，其中所述缺口寡核苷酸含有一种或多种扩增引物结合序列。
14.根据权利要求12或权利要求13所述的方法，其中所述缺口寡核苷酸含有一种或多种条形码序列，所述方法还包含在步骤(g)之后将所述环化的靶片段与从其他样品产生的环化的靶片段合并，并使所述合并的环化的靶片段经受步骤(h)。
15.根据权利要求1或权利要求2所述的方法，其中在步骤(c)中通过热变性的方式使得所述片段化的核酸样品成为单链的。
16.根据权利要求1或权利要求2所述的方法，其中在步骤(d)中使得所述靶片段的探针互补部分在甲酰胺存在的情况下与所述探针的靶片段互补部分杂交。
17.根据权利要求1或权利要求2所述的方法，还包括在步骤(f)和(g)之间的一个或多个洗涤所述固相的步骤。
18.根据权利要求17所述的方法，其中所述洗涤步骤在存在甲酰胺的情况下进行。
19.根据权利要求1或权利要求2所述的方法，其中在步骤(g)中所述靶片段的所述可连接的5'或3'末端的直接或间接连接在不存在甲酰胺的情况下进行。
20.根据权利要求1或权利要求2所述的方法，还包括在步骤(g)和(h)之间的将所述环化的靶片段从所述固定化的探针脱离并分离的步骤。
21.根据权利要求20所述的方法，其中所述脱离通过变性的方式进行。
22.根据权利要求1或权利要求2所述的方法，其中所述环化的靶片段通过PCR、RCA或MDA扩增。
23.根据权利要求12所述的方法，其中所述环化的靶片段通过PCR或MDA扩增，并且所述PCR或MDA起始于如下的引物，所述引物具有在所述缺口寡核苷酸中的，并且在MDA的情况下，任选地在所述环化的靶片段扩增产物的对应部分中的，结合位点。
24.根据权利要求23所述的方法，其中所述PCR引物具有包含一种或多种条形码序列的5'尾端，所述方法还包括在步骤(h)之后将所述扩增的环化的靶片段与从其他样品产生的扩增的环化的靶标片段合并。
25.根据权利要求12所述的方法，其中所述环化的靶片段通过MDA扩增，其中所述MDA起始于随机引物或起始于具有所述缺口寡核苷酸中的结合位点的引物，所述方法还包括随后的PCR扩增步骤，其中所述PCR起始于下述引物：具有在对应所述缺口寡核苷酸的所述MDA产物序列中的结合位点并且具有包含一种或多种条形码序列的5'尾端。
26.根据权利要求22所述的方法，其中所述RCA起始于所述至少一种探针的所述3’末端。
27.根据权利要求22所述的方法，其中所述MDA起始于随机引物。
28.根据权利要求27所述的方法，其中所述随机引物是六聚体。
29.根据权利要求22所述的方法，其中所述RCA或MDA使用phi29聚合酶实现。
30.根据权利要求1所述的方法，其中所述方法用于扩增核酸样品中的多种靶核酸并且所述方法包括：
(a)使所述核酸样品的多份小份试样分别经受一种或多种限制性核酸内切酶的各不同组合，以产生包含所述靶核酸的多种靶片段，并合并片段化的核酸样品的所述小份试样；
(b)使所述片段化的核酸样品与具有固定化部件的多种探针接触，其中所述接触在含有1％和50％之间的甲酰胺的杂交溶液中进行，其中所述探针包含在序列上与所述靶片段的探针互补部分互补的两个靶片段互补部分，并且其中探针的所述部分可以是紧邻的或由居间非靶片段互补部分分开；
(c)使所述片段化的核酸样品成为单链的，其中所述步骤可在步骤(b)之前、与步骤(b)同时或在步骤(b)之后发生；
(d)使得所述靶片段的探针互补部分与所述探针的靶片段互补部分杂交；
(e)添加固相以通过所述固定化部件固定探针-靶片段杂交体；
(f)将未固定的核酸片段与所述固相分离；
(g)在甲酰胺存在的情况下洗涤所述固相；
(h)使所述固相与含有连接酶的连接溶液接触，以使得所述靶片段的可连接的5'和3'端直接或间接连接，由此环化所述靶片段，其中如果所述靶片段的所述探针互补部分之一没有位于所述靶片段的末端，通过瓣状内切核酸酶或外切核酸酶的作用生成除探针互补部分所位于的末端之外的另一所述可连接末端；
(i)将所述环化的靶片段与所述固定化的探针脱离并将所述环化的靶片段与所述固相分离；和
(j)扩增所述环化的靶片段。
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