CN102605032A - 一种利用类波氏真眼点藻生产β-胡萝卜素的方法 - Google Patents

Abstract

本发明公开一种利用类波氏真眼点藻(Eustigmatoscf.polyphem)生产β-胡萝卜素的方法，生产β-胡萝卜素的流程为：藻种逐级扩大培养，待藻液光密度OD₇₅₀达到2.5时，进行户外规模化培养，规模化养殖选用尿素或硝酸盐为氮源，氮元素浓度为2-6mM，控制培养光强为100-600μE/m²s，培养周期8-12天，藻体收获后可进行β-胡萝卜素的提取。与现有技术相比，本发明提供的利用类波氏真眼点藻生产β-胡萝卜素的方法，可以实现β-胡萝卜素的高效生产。

Description

一种利用类波氏真眼点藻生产β-胡萝卜素的方法

技术领域

本发明涉及微藻领域，确切地说是指一种利用类波氏真眼点藻生产β-胡萝卜素的方法。

背景技术

β-胡萝卜素是由碳、氢两种元素组成的萜类化合物，它是类胡萝卜素的一种，广泛存在于植物细胞中，参与光能的捕获和传递，同时保护植物细胞免受强光辐射损伤，动物细胞不能合成β-胡萝卜素，只能从外界环境摄入。β-胡萝卜素是一种极具营养和药用价值的生物活性物质，其生理功能主要有：1)维生素A合成的前体物质；2)光保护作用；3)预防肿瘤发生和抗癌功效；4)对白内障及心血管疾病有一定的防治作用。

人们最初是由天然物中提取获得β-胡萝卜素，所使用的原料主要是胡萝卜，这一生产方式收率低且提取工艺复杂，制约了β-胡萝卜素的应用。于是人们将注意力转向有机合成法生产β-胡萝卜素，如利用β-紫罗兰酮合成β-胡萝卜素，但有机合成β-胡萝卜素工艺更加复杂，而且合成色素的毒性问题，限制了其在食品、药品、化妆品等范围内的应用。近些年，科研工作者再次将研究方向转向由天然物中提取β-胡萝卜素：1)研究发现一些真菌及酵母菌可以合成β-胡萝卜素，如改良的三胞布拉霉菌(Blakeslea tripora)，它的最高β-胡萝卜素产量可达3.0-3.5g/L，许多嗜盐海洋细菌也含有较高含量的β-胡萝卜素；2)采用植物细胞培养法生产β-胡萝卜素，但植物细胞培养条件苛刻、反应器要求高，与工业化生产尚有一定差距；3)培养单细胞藻类生产β-胡萝卜素，如Dunaliella.bardwill和Dunaliella.Salinade的β-胡萝卜素含量可占细胞干重的13％，并且微藻具有细胞结构简单、光合效率高、生长速率快、可进行户外养殖等优势，因而受到科学家和企业家的广泛关注。

目前，培养微藻生产β-胡萝卜素的研究主要集中在杜氏藻(Dunaliela)，杜氏藻属于绿藻门、绿藻纲、团藻目、杜氏藻科、杜氏藻属，其细胞微小，通常情况下，藻体细胞长约7-22μm、宽约3-14μm，杜氏藻细胞的形态多样，有卵圆形、球形、梨形、长颈形等，杜氏藻是目前已知的最耐盐的生物之一。目前已经实现产业化生产的杜氏藻有两个种：Dunaliela.salina(盐藻)、Dunaliela.bardawill(巴氏藻)，它们的β-胡萝卜素含量均超过干重的10％。国际上已经实现利用杜氏藻生产β-胡萝卜素的公司有：澳大利亚的贝它亭公司(Betatene Ltd.)和西部生物工程公司(Western Biotechnology Ltd.)、美国的微生物资源公司(Microbio Resources Inc.)、以色列的库尔食品公司(Koor Foods Ltd.)以及日本的天然β技术公司(Natural Beta-BiotechologyLtd.)等。

国内已公开β-胡萝卜素相关发明专利较多，主要包括：β-胡萝卜素新商品的开发、β-胡萝卜素的提取方法、β-胡萝卜素的化学合成方法、富含β-胡萝卜素的生物材料的保护等。专利中提到的富含β-胡萝卜素的天然物主要有三类：1)高等植物，如一种从绿茶中制备高纯度β-胡萝卜素的方法(200710164487.7)，一种从胡萝卜中提取天然β-胡萝卜素的方法(200610094872.4)，一种从沙棘果皮中提取β-胡萝卜素的方法(200910263590.6)，从枸杞皮渣中提取β-胡萝卜素、玉米黄素的方法(201010573774.5)等；2)厌氧微生物，一种粗壮脉纹胞菌发酵生产β-胡萝卜素的方法(200910115555.X)，从三孢布拉霉菌发酵液中制备β-胡萝卜素的方法(200910135676.0)，一种生产β-胡萝卜素的粘性红圆酵母、β-胡萝卜素及其生产方法(200610008485.4)，一种好食脉菌固态发酵生产β-胡萝卜素的方法(200710071831.8)等；3)目前专利中仅有杜氏盐藻一个微藻种类，可用于β-胡萝卜素的生产，一种从杜氏盐藻中提取类胡萝卜素和食用甘油的方法(200710120704.2)，从杜氏盐藻中提取类胡萝卜素和液化制生物燃油的方法(200910238784.0)，基于杜氏盐藻代谢途径的β-胡萝卜素工程菌及构建方法(201110008946.9)，养殖盐藻生产β-胡萝卜素模式的建立(93106062.1)，盐藻的收集与β-胡萝卜素的提取方法(92107782.3)等。

培养杜氏盐藻进行β-胡萝卜素的商业化生产始于上世纪八十年代中期，至今已有20多年的历史，其在藻种的选育、培养条件的优化、提取工艺的改进和产品的创新等方面已经取得了巨大的突破，但杜氏盐藻自身的生物学缺陷始终无法克服，影响生产效率。培养杜氏盐藻生产β-胡萝卜素，虽然已经成功实现了商业化生产，但仍然存在下列诸多缺点：

1、杜氏盐藻个体微小，其培养介质的盐度高，藻体比重与培养液比重接近，增加了藻体采收难度。离心分离是杜氏盐藻常用的分离方法，但其成本较高，另外，盐藻培养液的盐度较高，容易腐蚀离心机，特别注意的是，盐藻无细胞壁，离心分离易产生藻细胞破裂，降低产物的提取率；

2、β-胡萝卜素的单位面积产率最高仅为400mg/m²d(日本的天然β技术公司)，难以满足市场的需要；

3、杜氏盐藻作为一种高附加值的生物材料，目前对它的利用仅限于β-胡萝卜素的提取，杜氏盐藻虽然可以合成占总脂肪酸2.0％的EPA，但在实际生产中，难以进行有效提取，造成资源浪费。

发明内容

针对上述缺陷，本发明解决的技术问题在于提供一种利用类波氏真眼点藻生产β-胡萝卜素的方法，可以实现β-胡萝卜素的高效生产。

为了解决以上的技术问题，本发明提供的利用类波氏真眼点藻生产β-胡萝卜素的方法，其中：

类波氏真眼点藻的培养环境条件：适宜生长温度为15-30℃，光照强度为30-600μE/m²s，pH为6-8；

类波氏真眼点藻的营养条件：a).NaNO₃ 300-1500mg/L或Urea 150-750mg/L；b).K₂HPO₄·3H₂O 20-100mg/L；c).MgSO₄·7H₂O 50-80mg/L；d).CaCl₂·2H₂O30-50mg/L；e).NaCO₃10-30mg/L；f).FeCl₃·6H₂O 2-6mg/L；g).Citricacid 4-8mg/L；h).EDTANa₂ 2-5mg/L；i).H₃BO₃ 2-4mg/L；j).MnCl₂·4H₂O1-2mg/L；k).ZnSO₄·7H₂O 0.1-0.3mg/L；l).Na₂MoO₄·2H₂O 0.2-0.4mg/L；m).Co(NO₃)₂·6H₂O 0.02-0.05mg/L；n).CuSO₄·5H₂O 0.06-0.09mg/L；

生产β-胡萝卜素的流程为：藻种逐级扩大培养，待藻液光密度OD₇₅₀达到2.5时，进行户外规模化培养。规模化养殖选用尿素或硝酸盐为氮源，氮元素浓度为2-6mM，控制培养光强为100-600μE/m²s，培养周期8-12天，藻体收获后可进行β-胡萝卜素的提取。

与现有技术相比，本发明提供的利用类波氏真眼点藻生产β-胡萝卜素的方法具有以下优点：

1)类波氏真眼点藻细胞体积较大(细胞直径最大可达35μm)，易于采收；

2)类波氏真眼点藻在正常培养条件下的生物量可达8.0g/L以上，远超过杜氏盐藻的生物量，并且类波氏真眼点藻的β-胡萝卜素可占细胞干重的8％，与其他生物相比，也具有明显的优势；

3)类波氏真眼点藻细胞还含有超过干重5％的EPA，企业可同时进行β-胡萝卜素和EPA的生产，提高藻体的利用效率；

4)通过氮浓度调控的方式，可以实现β-胡萝卜素的一步法生产，降低了生产工艺的复杂性。

附图说明

图1类波氏真眼点藻随着培养液中营养的不断消耗，细胞中大量积累油体和类胡萝卜素：A.对数前期的细胞；B.对数中期细胞；C.对数末期细胞(油体明显形成)；D.平台期细胞(细胞中较大的富含类胡萝卜素的油体)；

图2为不同硝酸钠浓度条件下，类波氏真眼点培养物颜色的变化，其中A.培养初期，B.平台期；

图3为类波氏真眼点藻对数生长阶段细胞的色素组成；

图4为类波氏真眼点藻平台期细胞的色素组成。

具体实施方式

为了本领域的技术人员能够更好地理解本发明所提供的技术方案，下面结合具体实施例进行阐述。

本发明专利提供了一种富含β-胡萝卜素的微藻及其培养方法，该微藻拉丁名称为类波氏真眼点藻(Eustigmatos cf.polyphem)，已于2011年9月13日在“中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心”保藏成功；地址：中国科学院微生物研究所菌种保藏中心；菌种保藏号：CGMCCNo.5247。

类波氏真眼点藻属于真眼点藻纲(Eustigmatophyceae)、真眼点藻目(Eustigmatales)、真眼点藻科(Eustigmataceae)、真眼点藻属(Eustigmatos)，细胞为球形或近球形，大小通常在10-11μm，培养过程中一些细胞会达到20-35μm，细胞中具有一个相对较大的、近球形的液泡，其中含有能振动的颗粒物和一个直径在3-5μm的色素体，它的颜色从灰黄、褐色到红褐色变化，随着培养时间的延长会变大变暗；细胞中有一周生深裂状叶绿体；通常形成2个D形或4个四方体的似亲孢子，或形成8到16个球形细胞。

类波氏真眼点藻在培养过程中，细胞的颜色会发生明显变化，如图1A-1D所示，培养初期(图1A)，类波氏真眼点藻细胞的颜色为绿色，细胞内存在明显的周生深裂状叶绿体，但随着培养时间的延续(图1B和1C)，藻细胞的叶绿体逐渐片段化，细胞内出现黄色的油体，并逐渐增大，平台期(图1D)，油体体积达到最大，大量β-胡萝卜素溶解在油体中，使油体显现黄色。

为了提高类波氏真眼点藻β-胡萝卜素的产量，本发明专利从氮源形式、氮浓度和光强出发，对类波氏真眼点藻高产β-胡萝卜素的条件进行了优化。图2A和2B为类波氏真眼点藻液在不同硝酸钠浓度条件下，藻液颜色的变化(图2A培养初期，图2B平台期)，其中1号培养管为高浓度硝酸钠处理组，2号培养管为中浓度硝酸钠处理组，3号培养管为低浓度硝酸钠处理组，由图可知，在培养过程中，类波氏真眼点藻培养物的颜色由绿色变为黄色，但不同硝酸钠处理组藻液的颜色变化有明显差异，低浓度硝酸钠处理组藻液颜色明显黄于其他两个处理组，说明低浓度硝酸钠有利于β-胡萝卜素的积累。

图3和图4分别为类波氏真眼点藻在对数生长阶段和平台期，藻细胞的色素组成，由图看出，在培养初期，藻细胞的色素主要以堇菜黄素、无隔藻黄素、β-胡萝卜素、玉米黄素和叶绿素a为主，此时β-胡萝卜素含量不高。平台期，藻细胞β-胡萝卜素含量明显增加，β-胡萝卜素含量最高可占到细胞干重的6％。

本发明提供的利用类波氏真眼点藻生产β-胡萝卜素的方法，其中：

类波氏真眼点藻的培养环境条件：适宜生长温度为15-30℃，光照强度为30-600μE/m²s，pH为6-8；

类波氏真眼点藻的营养条件：a).NaNO₃ 300-1500mg/L或Urea 150-750mg/L；b).K₂HPO₄·3H₂O 20-100mg/L；c).MgSO₄·7H₂O 50-80mg/L；d).CaCl₂·2H₂O30-50mg/L；e).NaCO₃10-30mg/L；f).FeCl₃·6H₂O 2-6mg/L；g).Citricacid 4-8mg/L；h).EDTANa₂ 2-5mg/L；i).H₃BO₃ 2-4mg/L；j).MnCl₂·4H₂O1-2mg/L；k).ZnSO₄·7H₂O 0.1-0.3mg/L；l).Na₂MoO₄·2H₂O 0.2-0.4mg/L；m).Co(NO₃)₂·6H₂O 0.02-0.05mg/L；n).CuSO₄·5H₂O 0.06-0.09mg/L；

生产β-胡萝卜素的流程为：藻种逐级扩大培养，待藻液光密度OD₇₅₀达到2.5时，进行户外规模化培养。规模化养殖选用尿素或硝酸盐为氮源，氮元素浓度为2-6mM，控制培养光强为100-600μE/m²s，培养周期8-12天，藻体收获后可进行β-胡萝卜素的提取。

通过对类波氏真眼点藻培养条件的优化，本发明选择合适的氮源，通过调节培养基初始氮浓度至适宜范围，无需增设胁迫培养装置，即可以实现β-胡萝卜素的高效生产。通过研究，本发明提出β-胡萝卜素高产的氮源为尿素和硝酸盐，氮元素浓度为2-6mM，控制光照强度为100-600μE/m²s。

与现有技术相比，本发明提供的利用类波氏真眼点藻生产β-胡萝卜素的方法具有以下优点：

1)类波氏真眼点藻细胞体积较大(细胞直径最大可达35μm)，易于采收；

2)类波氏真眼点藻在正常培养条件下的生物量可达8.0g/L以上，远超过杜氏盐藻的生物量，并且类波氏真眼点藻的β-胡萝卜素可占细胞干重的8％，与其他生物相比，也具有明显的优势；

3)类波氏真眼点藻细胞还含有超过干重5％的EPA，企业可同时进行β-胡萝卜素和EPA的生产，提高藻体的利用效率；

4)通过氮浓度调控的方式，可以实现β-胡萝卜素的一步法生产，降低了生产工艺的复杂性。

对所公开的实施例的上述说明，使本领域专业技术人员能够实现或使用本发明。对这些实施例的多种修改对本领域的专业技术人员来说将是显而易见的，本文中所定义的一般原理可以在不脱离本发明的精神或范围的情况下，在其它实施例中实现。因此，本发明将不会被限制于本文所示的这些实施例，而是要符合与本文所公开的原理和新颖特点相一致的最宽的范围。

Claims (1)

1.一种利用类波氏真眼点藻(Eustigmatoscf.polyphem)生产β-胡萝卜素的方法，其特征在于，其中：

类波氏真眼点藻的培养环境条件：适宜生长温度为15-30℃，光照强度为30-600μE/m²s，pH为6-8；

类波氏真眼点藻的营养条件：a).NaNO₃ 300-1500mg/L或Urea 150-750mg/L；b).K₂HPO₄·3H₂O 20-100mg/L；c).MgSO₄·7H₂O 50-80mg/L；d).CaCl₂·2H₂O30-50mg/L；e).NaCO₃10-30mg/L；f).FeCl₃·6H₂O 2-6mg/L；g).Citricacid 4-8mg/L；h).EDTANa₂ 2-5mg/L；i).H₃BO₃ 2-4mg/L；j).MnCl₂·4H₂O1-2mg/L；k).ZnSO₄·7H₂O 0.1-0.3mg/L；l).Na₂MoO₄·2H₂O 0.2-0.4mg/L；m).Co(NO₃)₂·6H₂O 0.02-0.05mg/L；n).CuSO₄·5H₂O 0.06-0.09mg/L；

生产β-胡萝卜素的流程为：藻种逐级扩大培养，待藻液光密度OD₇₅₀达到2.5时，进行户外规模化培养，规模化养殖选用尿素或硝酸盐为氮源，氮元素浓度为2-6mM，控制培养光强为100-600μE/m²s，培养周期8-12天，藻体收获后可进行β-胡萝卜素的提取。

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