CN102586467A - Pig3基因或蛋白表达量检测试剂在制备诊断唐氏综合症的试剂盒中的应用 - Google Patents

Abstract

本发明利用基因芯片检测方法，对确诊为唐氏综合症的母体以及作为对照的健康母体羊水细胞样品中的基因表达水平进行整体研究，以鉴定DS的生物分子标记物。经筛选，发现多种基因在DS发病时出现显著的差异化表达，通过基因表达验证，确证PIG3基因的表达在DS患者和健康母体羊水细胞样品中的确存在显著的差异。通过临床病例进一步证实，PIG3基因的高表达与唐氏综合症的发病存在密切的正相关性。由此，可利用PIG3基因或蛋白表达量检测试剂制备用于检测唐氏综合症试剂盒，通过上述试剂盒，可以简单、快捷的实现唐氏综合症的特异性检测，从而为唐氏综合症的确诊提供有力的辅助指标。

Description

PIG3基因或蛋白表达量检测试剂在制备诊断唐氏综合症的试剂盒中的应用

技术领域

本发明属于医学分子生物学领域，涉及PIG3基因或蛋白表达量检测试剂在制备诊断唐氏综合症的试剂盒中的应用。

背景技术

唐氏综合症(Down' s syndrome，DS)是人类最常见的一种染色体病，由于在配子(生殖细胞)形成期或合子期(约在受精后24小时内)细胞内多了一条21号染色体所致。患者有严重的智力障碍，生活难以自理，且多合并多系统的疾病，给家庭与社会带来了沉重的负担。因此自上世纪60年代起，人们即致力于唐氏综合症的产前筛查。

产前检查可以作入侵性诊断，入侵性诊断通常有以下几种:

1.羊水细胞制备染色体

羊膜穿刺抽出羊水细胞，培养9-12天后，进行染色体核型分析。常规羊膜腔穿刺术通常在孕16-20周进行，此期间羊水量已达200-400m1，胎儿漂浮羊膜腔内，穿刺危险小，且羊水中有活力的细胞比例最高，易成功。羊水细胞诊断染色异常疾病的可靠性超过99%，但是侵入性检查对胎儿可造成一定的损害，如导致医源性流产。据统计进行羊膜腔穿刺检查流产率约为0.3%(0.1%-0.4%)，再加上羊水细胞需培养2至3周，确诊后孕妇只能行引产术、承受很大痛苦。

2.绒毛细胞制备染色体

1983年，Simon用直接法成功地进行了绒毛组织的染色体核型分析，并用于1例DS的产前诊断。绒毛组织检查提供了1个孕早期产前诊断方法。孕9-11周时，在超声监测下从胎盘边缘取少量绒毛组织进行培养，并作染色体核型分析。绒毛活检比妊娠中期羊膜穿刺更易引起流产，据统计进行绒毛取样检查流产率约为0.6%。同时，还应注意避免母体细胞及其他细胞污染。

3.胎儿血细胞培养制备染色体

该方法经腹穿刺胎儿脐血，培养48-72小时后制片，此法能校正羊水细胞。绒毛细胞培养出现的假嵌合体，结果准确可靠。此法自然流产发生率0.5%-1.5%，反复的脐带穿刺，可导致穿刺点出血，造成胎儿急性贫血，严重者可致胎儿及新生儿死亡。

以上方法都是通过把一支细针头穿过孕妇的肚皮，进入子宫，然后抽取妊娠的细胞进行检验。由于需要把仪器放进母亲体内，所以这两种检查称为入侵性检查。以上三种入侵检测方法会引起0.3%-1.5%的流产机会。但是，由于这两种检查抽取的胎盘绒毛组织和胎水的细胞成分和胎儿的一样，检验细胞样本的染色体便可准确验出胎儿是否患上唐氏综合症，准确度达到99%。

经典的细胞遗传学方法是诊断唐氏综合症的金标准，但此方法有实验周期长、费力、羊水细胞培养成功与否多种因素的影响等缺点，这说明仅靠常规的细胞遗传学方法进行唐氏综合症产前筛查是不够的。

由于入侵性的绒毛抽吸和羊膜穿刺术等筛查手段可能导致流产，所以较安全的方法是进行非入侵性筛查试验，以评估胎儿患上唐氏综合症的几率，筛查结果显示怀有唐氏综合症胎儿几率较高的孕妇才需要接受入侵性的诊断，经过筛查，只有约5%的孕妇需要作入侵性诊断，但非入侵性筛查准确度不及上述入侵性的诊断高。

非入侵性筛查试验有三种方法:超声唐氏综合症产前筛查法、孕妇血清筛查和将二者结合起来进行产前筛查。

1.超声唐氏综合症产前筛查法

超声进行唐氏综合症产前筛查是一种非侵入性的检查方法，既能有效降低出生缺陷，又可以极大地减少由于侵入性检查所造成地正常胎儿地流产。

超声唐氏综合症产前筛查方法是通过超声测量10-13周孕胎儿的头臀长(Crown Rump Length，CRL)，确定“超声孕周”后，再测量胎儿的颈部半透明层厚度((Nichol Translucency，  NT)， NT大于等于2.5mm为筛查阳性病例((NT阈值((Cut-of)值为2.5)。对筛查阳性的病例建议羊水穿刺，再经细胞遗传学证实，进而研究各地区或民族的胎儿NT与CRL以及孕周的关系。目前该筛查方法主要运用于妊娠10-13周产前筛查，即妊娠早期唐氏综合症风险筛查中。

2.孕妇血清筛查

孕妇血清筛查是通过抽取母亲的血液样本，检验其中一项或几项指标的含量，和相同怀孕天数正常孕妇血清中的同种标记物含量相比较，通过计算机软件计算胎儿患唐氏综合症的风险值。

目前，测定孕妇血清标志物含量方法有以下几种:

2.1磁性分离酶联免疫测定法

该方法为夹心法酶链免疫分析系统与分离技术相结合的一种测定方法，并使用两种高亲合力单克隆抗体，标本、标准液、质控液中的血清筛查标志物和与该标志物单克隆抗体起作用。酶联单克隆抗体和荧光素标单克隆抗体分别与筛查标志物分子不同的部位结合，形成“三明治”机构。加入过量与磁性微粒偶联的抗荧光素抗体后，它快速、特异地与荧光素标单克隆抗体形成复合物，不需离心，在磁场中沉淀，倒去上清液，清洗后加入基质液孵育。加入终止液结束酶/基质反应。用光度计测量所形成的颜色的强度。酶反应所生成的颜色强度，在测定工作范围内与患者标本中的标志物的浓度成正比。这样，患者标本、质控液中的标志物浓度可用内插法直接从标准曲线求得。

2.2胶体金免疫层析法的唐氏综合症产前筛查定量测试系统

胶体金免疫层析法(gold immunochromatographic assay简称GICA)是上世纪90年代初发展起来的快速免疫分析技术，它应用抗原、抗体特异性规律及胶体金显色原理工作。用金免疫层析法之称得测试试条称为金免疫层析条，简称金标试条。

当待测血清滴入试条时，试液通过吸水前卫的毛细作用，将胶体金一起带到抗体的测试线上，若试液中的抗原与抗体相对应，则产生特异性结合，胶体金呈红色或紫红色，称为阳性；反之不显色，称阴性。配合金标试条读数仪，定量测量孕妇血清样本指标含量，结合相应的筛查软件，利用计算机分析唐氏综合症的风险值。该方法还可以用于尿液中相关指标的含量测定。

2.3放射免疫法

该方法的特异性和灵敏度作为定量测定的可靠方法已为大家公认，然而用于检测的试剂的稳定性和有效期短的问题，而且这种方法对设备的要求特殊，使它在一般试验室开展受到了限制。

3.超声筛查和孕妇血清筛查相结合

据资料统计，颈皮厚度试验能够监测出大约69%唐氏综合症胎儿；怀孕15-20周进行的孕妇血清筛查能够检测出约70%的患病胎儿；综合颈皮厚度和对怀孕15至20周的孕妇血清筛查能够监测出大约86%的患病胎儿。

4.无创性产前基因诊断唐氏综合症

近年来发现孕妇外周血中存在少量胎儿细胞，国外己从孕妇静脉外周血中分离到少量胎儿细胞，对孕妇及胎儿均未造成任何不良影响，并成功地对一些主要的遗传性疾病，如各型地中海贫血、Duchenne's肌营养不良症、囊性纤维化症、苯丙酮尿症、血友病等进行产前基因检测，因属于一种无创性产前检查而日益受到重视和深入研究。国内少数单位也开始尝试此种方法，但均因胎儿细胞在孕妇外周血中的含量极少，估计胎儿有核红细胞数量仅为母血细胞的1/10⁵-1/10⁹，而明显阻碍了产前基因诊断的开展。为此，可以通过优化孕妇外周血胎儿细胞的分离方法，简化胎儿细胞的鉴定步骤，以提高胎儿细胞的富集率，并尝试对21三体综合征进行无创性产前基因诊断。目前该方法的检出精度，还没有资料有统计，正在研究和探索中。

血清学筛查中最关键的是标记物的确定。目前唐氏综合症筛查常用以下标记物。

AFP是胎儿血清中最早产生的球蛋白。在妊娠早期，它产生于卵黄囊；妊娠后期，大量产生于胎儿肝脏，后进入胎儿血浆，在排尿过程中进入羊水，进而通过胎盘屏障转移进入母亲的血液循环。在妊娠前六个月，母体AFP水平持续升高，30周左右达到一个平台。在孕妇怀有唐氏综合征胎儿时，母体血清AFP水平比正常妊娠低23%左右。

hCG是由胎盘细胞合成的，由α-和β-两个亚单位构成，主要以完整的hCG和单独的β-链两种形式存在。大约1%的β-亚基以游离形式存在。文献报道，应用游离β-hCG较hCG可以显著提高DS产前筛查的检出率。hCG在妊娠前8周迅速增高，然后在18-20周时下降到稳定水平。当胎儿为DS时，母体血清β- hCG主要表现为升高异常(一般>2. 5MOM )。

uE3是经胎儿肾上腺和肝脏，最后由胎盘合成的一种甾体类激素，它以游离形式直接由胎盘分泌进入母体循环，在母体肝脏内很快地以硫酸盐和葡萄糖苷酸雌三醇的形式代谢，其在母体血清中的水平随着孕周的增长而增加。1988年Canick等人最先报道受DS影响的孕妇血清uE3明显降低，提出在孕中期测定uE3水平是一项有效的指标。患有唐氏综合征的母体血清uE3的水平比正常妊娠水平平均低29%。

妊娠相关血浆蛋白A (pregnancy-associated plasma protein A，PAPP-A)是由胎盘滋养层合成的蛋白，并释放到母血中。PAPP-A的功能目前还不清楚。早孕期母血中PAPP-A水平快速升高，但是在DS综合症和18染色体三体患者母血中明显降低(约0. 44 MOM )。

抑制素是一个异二聚体的糖蛋白。β-亚单位与一个βA-亚单位组成抑制素-A，与βB-亚单位组成抑制素-B。血液中以无生物活性的游离亚单位存在。妊娠时母体血清中的大量抑制素被认为来源于胎盘的合体滋养层。抑制素-A在孕10-12周时增加并达到高峰，在妊娠中期下降成一个平台，但到妊娠晚期时再一次升高，足月时达最高水平。抑制素-A和hCG一样在胎儿唐氏综合征时升高。

Isozaki等人1997年发现尿促性腺激素β核心片断可能成为DS妊娠的另一种标记物；这种多肤被发现在母体尿中的水平很高，但在DS妊娠时水平更高。Laigaard等人2003年研究发现解整合素样金属蛋白酶-12 (A disintegrin and metalloprotease，DSAM-12)也是一种有潜力的早孕期筛查因子。

早孕期筛查有利于早期诊断，如果需要可以较早终止妊娠。1998年Wald等人研究发现，用β-hCG，PAPP-A组合，在早孕期(10-14周)DS的阳性检出率可达62%。若在此基础上增加胎儿颈部半透明度的检测，结果阳性检出率增加到80%。DSAM-12、人胎盘催乳素(hPL)均为近期报道的在早孕期有用的唐氏综合征筛查指标。但是尚需要更多的研究来证实这两种标志物的作用。

中孕期筛查国际上常用的方法是检测母亲血中的β-HCG和AFP(二联筛查)，Jou等人曾在亚洲人群中，采用中孕期二联筛查结合孕龄及母亲的其他因素，应用计算机综合分析发生DS的危险机率，筛查出62.5%的DS患儿。将AFP、HCG和uE三项指标合起来进行三联筛查，检出率可达到60%-70%(假阳性率为5%)。近年，抑制素-A加盟唐氏综合征产前筛查后(四联筛查)使检出率提高到70-80%左右，而假阳性率不增加。

Wald等人进一步探讨将早孕期和中孕期标志物综合在一起得到一个单一的风险估计值的可能性。在早孕期测量NT及检测母体血清的PAPP-A，在中孕期进行四联检验，将所有标志物综合进行风险评估，检出率可达到93%(假阳性率为5%)。

DS的发生是一个复杂的病理生理过程，是细胞内多个基因结构和功能异常改变的结果，受许多基因和信号通路调控，单纯从某单一因素进行分析无法了解整个疾病发生、发展的过程，必须在基因水平进行整体的、网络化的研究，才能全面了解发病的机制。而传统的研究方法(例如，Northern-blot和RT-PCR)一次只能研究一个或几个基因的改变，揭示的只是病理生理中的过程一个或几个方面，不能满足需要。而通过各种高通量的现代生物学技术，例如蛋白质组、基因芯片等，筛选可用于DS早期诊断的蛋白质或基因标志物，可大大有利于DS 的早期干预，控制DS的进展。

由于21世纪人类基因组计划和随后的蛋白质组计划相继启动，基因序列数据及蛋白质序列数据正以前所未有的速度迅速增长，传统方法己很难适应对如此庞大数据的研究，因此生物芯片技术应运而生。真正实现基因分析的大规模、平行、小型和自动化。目前研究最成功的且形成一定商业市场的是狭义的生物芯片，也称为DNA芯片、DNA阵列、微阵列等(DNA chip，DNA Microarray，Gene chip等)。基因芯片是用硅、玻璃、聚丙烯等材料作承载基片，在大小1cm²左右的芯片上将成千上万个不同的基因片段经光刻、化学合成点样等技术微加工而成。按其性能和用途分为毛细管型和基因探针型两类。

医学研究常用后者，它的构件用光蚀刻法、压电印刷法、预先合成寡核苷酸或肽核酸后，再通过机械接触组成方阵。应用的基本原理是分子杂交。用荧光染料标记样本DNA或cDNA，与微阵列杂交。经激光共聚隽荧光显微镜检出杂交信号，通过计算机处理、分析，即可获得所需信息。用红、绿荧光分别标记实验样本和对照样本的cDNA，混合后与微阵列杂交，可显示实验样本和对照样本基因的表达强度(显示为红、绿或黄色)，由此则在同一微阵列上同时检测两样本的基因差异表达。

应用基因芯片可以一次性获得大量的数据并进行平行分析，极大地加快了实验进程。同时在一个阵列上进行多样本比较，由于排除了一系列复杂因素导致的各项比较实验的内在差异，使一次性多样本比较性分析的精确性大大提高，与计算机相连的图像分析系统使研究结果更客观、准确。

它的应用范围很广，可以进行基因表达谱分析、基因功能分析、基因制图和基因测序、检测基因突变及多态性等。医学常用它研究肿瘤的发生机理、分型和诊断、传染病诊断、药物筛选和指导合理用药、环境保扩，和监测等。

p53可诱导基因3(p53-inducible gene 3，PIG3)是PIG 家族的成员之一，与多种氧化还原酶同源，并参与细胞氧化应激或辐射引起的细胞凋亡。通常，PIG3受肿瘤抑制蛋白p53调控，其表达与细胞中活性氧(reactive oxygen species，ROS)的产生相关。到目前为止，尚无文献报道其与唐氏综合症的发病相关。

发明内容

本发明利用基因芯片检测方法，对确诊为唐氏综合症的母体以及作为对照的健康母体羊水细胞样品中的基因表达水平进行整体研究，寻找该疾病的发病机制，并通过高通量的方法鉴定DS的生物分子标记物。经筛选，发现多种基因在DS发病时出现显著的差异化表达，通过基因表达验证，确证PIG3基因的表达在DS患者和健康母体羊水细胞样品中的确存在显著的差异。通过临床病例进一步证实，PIG3基因的高表达与唐氏综合症的发病存在密切的正相关性。

基于PIG3与DS的这种相关性，本发明首次证实，该基因及其蛋白可以作为DS的分子标记物，对其表达量进行检测可以用于检测DS。PIG3蛋白与DS的相关性为DS的诊断和/或治疗提供了一条全新的途径。

本发明的一个目的在于提供一种检测唐氏综合症的试剂盒。

本发明的另一个目的在于提供一种PIG3基因或蛋白表达量检测试剂在制备用于检测唐氏综合症试剂盒中的应用。

通过上述试剂盒，可以简单、快捷的实现唐氏综合症的特异性检测，从而为唐氏综合症的确诊提供有力的辅助指标。

附图说明

图1为DS患者和健康母体羊水细胞样品的基因表达谱。其中，红色代表与健康母体样品相比，表达量上调的基因，绿色代表与健康母体样品相比，表达量下调的基因。而颜色的深浅与表达量差异正相关。

图2为4个DS患者和1个健康母体羊水细胞正常样品中PIG3基因表达量的Real-time PCR检测结果。所有结果均以β-actin作为内参进行校正，并以健康母体PIG3基因表达量为相对参照。

具体实施方式

下面结合具体实施例进一步对本发明加以说明。下列实施例中未注明具体条件的试验方法，按照常规条件操作或按照制造厂商建议的条件。

实施例1、差异表达基因的基因芯片筛选

1.细胞培养：

收集接受常规羊水诊断的孕妇羊水细胞，其中10例确诊为DS，10例为正常个体。所述羊水细胞与2300rpm离心10min后，0.5ml的沉淀羊水细胞样品添加2ml CHANG培养基(IRVINE SCIENTIFIC)，于培养皿中，5% CO₂，37℃继续培养。

2.细胞总RNA提取及浓度测定

取对照组、处理组细胞，弃去培养液，以0.25%胰蛋白酶消化细胞，终止消化后用滴管反复吹打细胞，1000rpm离心5分钟，弃上清进行RNA提取。采用Qiagen公司easy微量抽提试剂盒抽提其总RNA，并用Beckman DU530测定其浓度，-80℃保存。(参照easy操作说明书)

3. RNA质量检测

使用Agilent公司的2100生物分析仪进行微流路芯片高压凝胶电泳检测总RNA的质量，参照RNA 6000Nano芯片操作程序。

4. RNA标本的线性荧光扩增标记

取对照组总RNA、处理组总RNA样品，采用Agilent公司生产的低样品量RNA线性扩增试剂盒进行双色荧光标记，实验步骤按说明书进行，大致如下：

4.1逆转录合成cDNA

1)在两个1.5 ml的去RNA酶微量离心管中分别加入对照组与处理组总RNA各0.5μg，两管分别加入5μl T7启动子引物，加无核酸酶水至总的反应体积为11.5μl；

2) 65℃水浴10 min，冰上放置5 min；

3)然后在两管样品中分别加入8.5μl cDNA Master Mix，逆转录合成cDNA；

4) 40℃水浴2h；

5) 65℃孵育15 min灭活MMLV逆转录酶；

6)冰上孵育5min。

4.2荧光标记cRNA的合成

Cy5-CTP标记处理组cDNA样品，Cy3-CTP标记对照cDNA样品，避光条件下，在合成好的cDNA样品中分别加入2.4μl Cy3-CTP (10mmol/L)和2.4ul Cy5-CTP (10mmol/L)；各加入57.6μl的转录Master混合液合成cRNA，并在合成的过程中掺入荧光物质，40℃避光水浴2 h。

4.3荧光标记cRNA的纯化

采用Qiagen公司的RNeasy微型纯化柱来纯化标记的cRNA样品，具体操作步骤按照说明书进行。

5 Agilent Human 1B基因芯片杂交 

采用Agilent公司生产的原位合成试剂盒、60 mer Human 1B寡核苷酸基因芯片试剂盒及进行样品的准备及杂交，采用Agilent 2565BA基因芯片扫描仪进行杂交结果的扫描，Feature extraction软件数据分析，具体操作步骤如下：

5.1 2xcRNA样品溶液的准备

取第一组Cy3及Cy5标记的线性扩增cRNA各0.75μg混合，同样第二组Cy3及Cy5标记的线性扩增cRNA各0.75μg混合，分别加入到1.5m1去RNA酶的微量离心管中。在第一组管和第二组管中分别加入50μl的l0x对照质控样品(control target )，用去核酸酶水调整终体积至215μl，混匀。-80℃避光保存。

5.2 2x杂交溶液的准备

在以上两组准备好的2xcRNA样品溶液中分别加入9.0μl的25x片段化缓冲液(fragmentation buffer)，轻轻混匀。60℃水浴中避光孵育30 min。各加入225μl的2x杂交缓冲溶液，轻轻混匀。短暂离心沉淀标本。

5.3芯片杂交

1)在SL基因芯片杂交炉中安装上转子，将转速调整到4转/分，并预热到60℃待用。

2)准备好需要用的Agilent芯片杂交盒套装部件。

3)从盒中拿出Agilent盖玻片套装，用镊子小心的揭去覆盖在盖玻片上的透明塑料膜，戴清洁无尘手套，持边缘，小心地将盖玻片从包装盒中拿出，然后立刻放入杂交盒中，以免表面受污染。

4)将盖玻片具有Agilent的标记字样的一面向上，轻轻放入杂交盒的底座上，并保证贴标签一端位于杂交盒底座的矩形端。

5)加样，自上述第2)部分准备好的440ul 12x杂交溶液中吸取400 ul杂交液，将枪头从盖玻片表面的一端缓慢移行到另一端，在此过程中，枪头不接触盖玻片表面，一边移动一边将样品慢慢滴在玻片上。

6)芯片放入，戴清洁无尘手套，持边缘，小心地将芯片从玻片盒中拿出，Agilent的标记字样向下，条形码标签向上，与盖玻片方向一致 (即贴标签一端位于杂交盒底座的矩形端)放入杂交盒中，正好盖在盖玻片表面的橡胶垫上，从两端对齐芯片和盖玻片，这样杂交液    就在芯片与盖玻片之间形成了一个夹层，构成一个杂交的“三文治”结构。

7)组装杂交盒，将杂交盒的顶盖放在芯片的上方，对齐芯片边缘，并留下一条狭缝而防止上夹后芯片碎裂，从圆型端放置芯片夹于杂交盒的中央，拧紧顶盖上的螺丝。

8)样品湿片，垂直按顺时针方向轻轻旋转杂交盒，使样品液均匀的覆盖在玻片的表面。

9)检查气泡，在旋转杂交盒的过程中，芯片与盖玻片夹层中除液体外，仍会存在一些气泡，这些气泡应该随杂交盒的旋转而自由移动，发现有小气泡不移动，则轻打杂交盒的一角，重新垂直旋转，使气泡重新移动，形成大的气泡。     

10)在放入芯片后3 min内，将组装好的杂交盒循杂交炉转子上的卡槽放入杂交炉，在该杂交盒对应的位置放好平衡的杂交盒后，保持60℃ 4转/分转速杂交17 h。

6杂交后洗脱

6.1 在孵育结束前，准备好三个Wheaton公司的洗片缸，

1)其中第一个洗片缸中加入漂洗液1约200 ml，放置在室温下。

2)在第二个洗片缸中放入玻片架，并在缸内放入磁力搅拌棒，倒入漂洗液1直到淹过玻片架，然后将其放置在磁力搅拌器上。

3)将第三个洗片缸缸置于冰浴中，加入保存在4℃的漂洗液2直到淹过玻片架，并溶液尽可能的保持低温。

(1)从烤箱中拿出杂交盒，平放在桌面上，松开翼形螺钉，拆卸杂交盒，移开顶盖。

(2)戴手套，持芯片的边缘小心的从杂交盒拿出整个片(盖片和芯片)，快速将其(数字面朝向操作者)放入染缸1中，使漂洗液淹没整个玻片。

(3)用镊子分开两片玻片，并使盖玻片沉在洗片缸底部。

(4)迅速将芯片移至染缸2中的片架上，在此过程中尽量减少与空气的接触。

(5)调整磁力搅拌器中等速度，室温下洗片10 min

(6)将片架放入冰浴下的染缸3(其中为漂洗液2)中，磁力搅拌器中等速度，洗片5 min

(7)用镊子轻轻从洗液2中取出玻片，印有Agilent字符面向上，迅速用Millipore公司的滤过性氮气枪吹干阵列表面的水渍。

(8)将芯片置于干燥遮光的盒子内室温下保存，可供进一步扫描检测。

7芯片扫描

将芯片Agilent字符面向内，放入Agilent芯片夹中，并将其置入Agilent2565BA基因芯片扫描仪中，采用Agilent scanner软件由仪器自动平衡红绿荧光的激发光能量及增益值进行扫描，获得双色叠加的杂交结果图，保存该结果。

8扫描结果初步分析

(1)在Agilent FeatureExtraction软件中打开前面保存的图象，调整红绿颜色范围，获取最佳图象结果。

(2)点击窗口菜单栏的“Grid”按钮，在弹出的对话框中选择“Agilent Design File”选项，然后从芯片配套的数据光盘中导入HumanlB阵列的设计文件，将阵列图片上的每个点与数据库中相应的编号、Genbank索取号、基因名称、功能描述以及相关信息建立关联。

(3)点击“Auto Fit"按钮，将预先设定好的格子固定到阵列上，然后依次调整格子的四个角以及每一行的中心，使每个格子方框的十字中心对准阵列上的每一个点的中心。

(4)点击，"Save Grid"按钮保存此格子，然后点击“Grid on/off'，开关，关闭格子设置，此时即可进行数据的提取。

(5)点击FeatureExtraction选项，此时弹出数据提取对话框，设定好数据保存的途径后，调整好各项参数:

9表达差异的基因按照功能进行分类:

1)以EXCEL打开数据文件，删除芯片扫描实验等与结果无关的信息。

2)对Probe Name进行排序，删除162个阴性对照基因和918个内参照基因。

3)对LogRatio P Value进行排序，删除P Value≥0.05或0.01的数据。

10基因芯片杂交结果分析

通过以LogRatio P Value值≦0.01的标准筛选表达差异基因得到1938个基因，再根据rprocessedsignal/gprocessedsigna1≦0.5标准得到209个表达下调基因，根据rprocessedsignal/gprocessedsignal≥ 2得到541个表达上调基因。使用ABI公司的PANTHZER数据库(http://www.pantherdb.org)对差异表达的基因进行分析，按生物功能进行分类得到147类。结合PANTHER数据库按生物功能和细胞通路对表达差异基因的分类以及对差异基因功能描述的分析，得出与DS密切相关的基因（部分节选）：

基因名称	索取号	基因名称	索取号
				PCNA	M15796	AKT2	M77198
CASP2	U13021	DAXX	AF015956
				COL3A1	X14420	GSTP1	X08058
PDPK1	AC005591	BAD	NM_004322
				ACTB	BC002409	GABRG3	S82769
PFKL	NM_001002021	PIG3	AF010309
				TRAF6	U78798	UBC	M26880
COL6A1	X99135	BDNF	X60201
				ADAM17	U86755	BID	NM_001196
RBP2	S66431	BNIP1	U15172
				JNK1	L26318	GADD45	M60974
CRAF1	U21092	HPRT	V00530
				HIAP1	U45878	NCAM21	U75330
ADCY8	NM_001115	OSF-2	NM_006475

PIG3为其中表达量变化最为显著的基因，其在DS患者羊水细胞中的表达量比健康母体羊水细胞中上调约80倍。以其作为候选的分子标记物，进行后续验证。其他表达量变化显著的基因的验证在另外的试验中讨论，在此不再赘述。

实施例2、PIG3基因差异表达的Realtime PCR验证

为了验证PIG3基因的差异表达，取已被确诊为DS的患者羊水细胞标本4例，并取经证实为正常个体羊水细胞标本1例作为对照，经常规RNA样品处理后，进行Real-time PCR检测。实验步骤大体如下：

1总RNA的提取

1.1用Trizol试剂按其说明提取细胞的总RNA，操作步骤如下：

1)细胞常规培养达指数生长期时，在超净台中弃去培养液，PBS漂洗后加入适量Trizol，  Trizol加入量基于细胞数量(1m1/10⁷个细胞)；

2)用滴管吹打均匀，室温放置10 min，使核蛋白复合物完全分离；

3)将混合物转移到DEPC处理过的1.5 ml离心管中(若不马上进行提取，可放入-70℃冰箱中冻存)；

4)按lml Trizol加入0.2 ml氯仿的比例加入氯仿，震荡30s或用手剧烈摇动15s，室温放置2-3 min，然后4℃，12000 g，离心15 min；

5)将上清（约600μl）转移到另一新的1.5 ml离心管中(离心后溶液分层，分成底层酚-氯仿、中间层和上层水相，RNA仅存在水相中)；

6)按1 ml Trizol加入0.5 ml异丙醇的比例加入异丙醇，混匀，室温放置10 min。然后4 ℃，12000 g，离心10 min；

7)小心弃去上清，加入1 ml 75%乙醇；

8) 4℃，7500 g，离心5 min ；

9)小心弃去75%乙醇，超净台吹干10 min；

10) RNA溶于15-20μl DEPC水，55-60℃水浴5-10 min，使RNA完全溶解。

1.2 RNA浓度分析和纯度鉴定

从所提取RNA中各吸取1μl，稀释至100μl后，利用紫外分光光度计分别测定其在260 nm和280 nm波长处的吸光度(OD260和OD280)，两者比值在1.8-2.0之间时，说明提取的RNA纯度较好，符合下一步实验要求。

1.3完整性鉴定

利用甲醛变性琼脂糖凝胶电泳进行鉴定；电泳后，将凝胶浸于EB溶液中染色30分钟后，紫外灯下观察，28S的亮度是18S的2倍，提示RNA完整无降解。

2逆转录合成cDNA链

以2μg总RNA为模板反转录cDNA，逆转录体系是20μl，具体操作步骤如下:

以随机6核苷酸为引物，合成cDNA第一链。反应体系：总RNA 2μg；随机6核苷酸(500μg/μl) 1.0μl；dNTP(l0mmol/l) 1.0μl；DEPC水12μl；加热至65℃，5 min，迅速置冰上，稍离心后加DTT(0.1 mmol)2.0μl；5XRT buffer 4.0μl；Rasin 1μl；轻柔混匀，37℃ 2 min；加MMLV逆转录酶1.0μl (100U/μl)，37℃ 50 min，70℃ 15 min，反应完成后产物于-20℃保存。

3 Real-time PCR检测基因表达变化

以上述逆转录产物作为模板，构建如下反应体系：SYBR Green Mix (2X) 5.0μl，DEPC水2.6μl，上游引物0.2μl，下游引物0.2μl，模板2.0μl，共10μl体系。

引物序列如下：

PIG3上游引物：5'-CGCAGATCTATGTTAGCCGTGCACTTTGAC-3'

PIG3下游引物：5'-CCTAGAGTCACTGGGGCAGTTCCAGGAC-3'

β-actin上游引物：5'-TACGCCTCTGGCCGTACCAC-3'

β-actin下游引物：5'-GCCAGGTCCAGACGCAGGAT-3'

选择56℃作为荧光实时定量PCR的退火温度。

4 PIG3基因的表达变化数据分析

采用标准曲线对样品基因表达进行相对定量。数据采集应用Option Monitor2软件。标准曲线绘制及线性拟合应用Origin 5.0软件。样品基因表达相对定量应用EXCEL软件。结果取3次实验的平均值。以PIG3基因相对拷贝数与内参β-actin相对拷贝数之比表示PIG3基因mRNA的表达量。结果表明，和健康母体羊水细胞相比，PIG3基因在几例DS患者羊水细胞中均显著高表达，这与芯片结果吻合，进一步验证了芯片鉴定结果的准确性。

实施例3、PIG3基因或蛋白表达量检测试剂在制备用于DS检测的试剂盒中的应用

由于PIG3基因在DS患者与正常母体中存在显著的差异表达，提示其与DS的发生发展有着密切的相关性，因此以PIG3基因或蛋白作为DS的分子标记物，对其在受测对象生物样本中的表达量进行检测，可以用于检测DS。相应的，能够特异性检测PIG3基因或蛋白表达量的试剂，例如抗PIG3蛋白的抗体（包括各种抗PIG3蛋白的单克隆抗体和多克隆抗体），或者PIG3基因的特异性PCR扩增引物，由于能够用于检测PIG3基因或蛋白的表达量，因而可以用于检测DS，或者用于制备检测DS的制剂或试剂盒等。

检测方法包括，但不限于，针对蛋白的免疫印迹、免疫荧光、酶联免疫检测、免疫层析检测等方法，以及针对基因的Northern，Real-time PCR等方法。所述生物样本可以是血清、羊水等。试剂盒中的其他试剂及其组合方法均为本领域的常规之选，例如，抗体可进行必要的修饰，例如偶联标记物，所述标记物可以是荧光物质、酶、放射性同位素等。本领域的技术人员可基于PIG3基因或蛋白在DS中存在差异表达这一重要信息，对上述内容进行适当修改，以实现相应的执行情况。但是，所有基于本发明的修改或改造新方法，属于保留的权利。

以临床经确诊为DS的患者（39例）和健康母体（74例）的血清样本为检测对象，利用抗PIG3蛋白的单克隆抗体，通过常规的双抗体夹心法进行对血清中的PIG3蛋白进行ELISA检测，结果显示，DS检出率高达97.4%（38/39），且无一例假阳性，表明该方法具有良好的敏感性和特异性。

 

	份数	阳性份数	阴性份数	敏感性	特异性
						DS患者血清	39	38	1	97.40%
健康母体血清	74	0	74		100%

Claims (9)

1.一种检测唐氏综合症的试剂盒，其特征在于，包括能检测PIG3基因或蛋白表达量的试剂，用于测量来自受测对象生物样本中的PIG3基因或蛋白表达量。

2.如权利要求1所述的试剂盒，其中，所述试剂为PIG3蛋白抗体。

3.如权利要求2所述的试剂盒，其中，所述PIG3蛋白抗体为单克隆或多克隆抗体。

4.如权利要求3所述的试剂盒，其中，所述PIG3蛋白抗体偶联有标记物。

5.如权利要求4所述的试剂盒，其中，所述标记物选自由荧光物质、酶、放射性同位素组成的组。

6.PIG3基因或蛋白表达量检测试剂在制备诊断唐氏综合症的试剂盒中的应用，其特征在于，所述试剂盒用于测量来自受测对象生物样本中的PIG3基因或蛋白表达量，通过与正常个体生物样本中的PIG3基因或蛋白表达量进行比较，以确定所述受测对象是否患有唐氏综合症。

7.如权利要求6所述的试剂盒，其中，所述试剂为PIG3蛋白抗体。

8.如权利要求7所述的试剂盒，其中，所述PIG3蛋白抗体为单克隆或多克隆抗体

如权利要求8所述的试剂盒，其中，所述PIG3蛋白抗体偶联有标记物。

9.如权利要求9所述的试剂盒，其中，所述标记物选自由荧光物质、酶、放射性同位素组成的组。

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