CN102579273A - 芸香苷作为酪氨酸酶抑制剂的应用 - Google Patents
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Abstract
本发明涉及到芸香苷作为酪氨酸酶抑制剂的应用。芸香苷作为酪氨酸酶抑制剂的作用机理为：芸香苷与酪氨酸酶的结合引起了竞争性抑制，但未引起三级结构的明显变化，芸香苷结合残基位于活性中心的凹陷区域，这些残基影响芸香苷在初始阶段的对接，一个位于活性中心与3个组氨酸结合的铜离子在平衡状态直接与芸香苷螯合。芸香苷作为酪氨酸酶抑制剂的进一步研究可开发用于皮肤黑色素生成紊乱的新型美白剂，抑制效果好，并且细胞毒性非常微小。
Description
技术领域
本发明涉及到芸香苷的用途，尤其涉及作为酪氨酸酶抑制剂的应用。
背景技术
酪氨酸酶(EC 1.14.18.1，Tyrosinase)是一种含铜的金属酶，广泛分布于微生物、动植物及人体中。酪氨酸酶是皮肤色素合成中具有多重催化功能的重要的酶，该酶兼有加氧酶和氧化酶的双重功能，在黑色素合成过程中起关键作用，是黑色素合成过程的限速酶。酪氨酸酶属于第三类铜蛋白家族(1.Yoon J，Fujii S，Solomon EI.Proc Natl Acad SciU S A.2009 Apr 21；106(16)：6585-6590；2.Li Y，Wang Y，Jiang H，Deng J.Proc Natl AcadSci U S A.2009 Oct 6；106(40)：17002-17006.)，在活性部位2个铜离子分别与3个组氨酸相连，并且这2个铜离子与不同的催化反应直接相关，如单酚羟基化为二酚(甲酚酶活性)和二酚氧化为二醌(邻苯二酚氧化酶活性)(3.Decker，H. and Tuczek，F. TrendsBiochem.Sci.2000；25：392-397.)。酪氨酸酶的活性与黑色素合成量密切相关，在人体内的活性增高会导致雀斑、黄褐斑等黑色素过度沉积疾病的发生(4.Olivares C，Solano F.Pigment Cell Melanoma Res.2009 Dec；22(6)：750-760；5.Jimbow K，Park JS，Kato F，Hirosaki K，Toyofuku K，Hua C，Yamashita T.Pigment Cell Res.2000Aug；13(4)：222-229.)。食物(果蔬、虾蟹等)中的酪氨酸酶会引起食物加工及贮藏过程中的褐变，导致食物变质(6.Kim YJ，Uyama H.Cell Mol Life Sci.2005Aug；62(15)：1707-1723；7.Rescigno A，Sollai F，Pisu B，Rinaldi A，Sanjust E.J Enzyme Inhib Med Chem.2002Aug；17(4)：207-218.)。酪氨酸酶在昆虫体内也普遍存在，在昆虫创伤愈合(8.KanostMR，Jiang H，Yu XQ.Immunol Rev.2004Apr；198：97-105；9.Lai SC，Chen CC，Hou RF.J MedEntomol.2002Mar；39(2)：266-274.)和表皮形成(10.Guerrero，A.and Rosell，G. Curr.Med.Chem.2005；12：461-469.)中起重要作用。
由于酪氨酸酶在医药、化妆品和农业上的潜在应用前景，其活性调控研究成为研究的焦点。迄今为止，已研制出多种类型的酪氨酸酶抑制剂，可作为开发美白剂及生物杀虫剂的候选。
目前，已有不少来源于化学合成和天然产物的酪氨酸酶抑制剂作为药品、化妆品、食品添加剂及生物杀虫剂。已普遍应用的酪氨酸酶抑制剂有氢醌、曲酸及其衍生物、壬二酸、熊果苷、黄酮类化合物、维生素C及其衍生物、绿茶提取物、甘草提取物等。但现有的酪氨酸酶抑制剂在抑制效果、稳定性或安全性等多方面存在着不同程度的缺陷，因此继续寻找抑制效果好、安全性高、性质稳定的酪氨酸酶抑制剂仍然具有十分重要的意义。
芸香苷，也称3-芸香糖苷-槲皮素，是一种来源于蔬菜和水果的天然物质(11.Z.Xie，Y. Zhao，P.Chen，P.Jing，J.Yue，and L.L.Yu.J Agric Food Chem.2011；59：3042-3049；12.R.Slimestad and M.Verheul.J Agric Food Chem.2011；59：3180-3185；13.S.Tong，J.Yan，G.Chen，and J.Lou.J Chromatogr Sci.2009；47：341-344；14.J.Kalinova，J.Triska，and N.Vrchotova.J Agric Food Chem.2006；54：5330-5335.)。在结构上，芸香苷包括一个黄酮槲皮素和通过糖苷键连接的二糖芸香糖。芸香苷被用于许多复合维生素的生产，并可作为中草药的有效成分(15.I.Erlund，T.Kosonen，G.Alfthan，J.
K.Perttunen，J.Kenraali，J.Parantainen，and A.Aro.Eur J Clin Pharmacol.2000；56：545-553；16.W.Dimpfel.Phytomedicine.2009；16：287-294.)。芸香苷作为生物药物的应用主要是由于其具有抗氧化作用，可用于治疗糖尿病(17.H. D.Je，C.Y. Shin，S.Y. Park，S.H. Yim，C.Kum，I.H.Huh，J.H.Kim，and U.D.Sohn.Arch Pharm Res.2002；25：184-190；18.A.A.Fernandes，E.L.Novelli，K.Okoshi，M.P. Okoshi，B.P. Di Muzio，J.F
and A.Fernandes Junior.Biomed Pharmacother.2010；64：214-219.)，还具有抗炎症(19.K.Nones，Y.E. Dommels，S.Martell，C.Butts，W. C.McNabb，Z.A.Park，S.Zhu，D.Hedderley，M.P. Barnett，and N.C.Roy.Br J Nutr.2009；101：169-181.)，抗肿瘤(20.E.Bourogaa，J.Bertrand，M.Despeaux，R.Jarraya，N.Fabre，L. Payrastre，C.Demur，J.J.Fournié，M.Damak，A.E.Feki，and C.LeukRes.2011；35：1093-1101；21.J.P. Lin，J.S.Yang，J.J.Lin，K.C.Lai，H.F Lu，C.Y. Ma，R，Sai-Chuen Wu，K.C.Wu，F. S.Chueh，W. Gibson Wood，and J.G. Chung.Environ ToxicolJan.2011；20.doi：10.1002/tox.20662.[Epub ahead of print])和抗血管生成的作用(22.H.Luo，B.H.Jiang，S.M.King，and Y. C.Chen.Nutr Cancer.2008；60：800-809.)。
发明内容
本发明的目的在于提供芸香苷的新用途，即作为酪氨酸酶抑制剂的新应用。
本发明所用的芸香苷，其英文名称为Rutin hydrate，分子式为C27H30O16·3H2O，分子量：610.52，为淡黄色或草黄色粉末，溶于二甲基亚砜和吡啶、甲酰和碱液中，常温密封避光贮存，其化学结构式如下所示：
芸香苷为商品化物质，可以从Sigma等试剂公司直接购买到。
酪氨酸酶的英文名称为Tyrosinase，分子量为128×103道尔顿，为冻干粉末，购于Sigma公司。以L-3，4-二羟基苯丙氨酸(L-DOPA)作为底物，采用Lineweaver-Burk双倒数作图法测得购买的酪氨酸酶的米氏常数Km＝0.71±0.04mM，最大反应速度Vmax＝0.17±0.005mM-1min-1。
为了更好的理解本发明的实质，下面详细说明芸香苷作为酪氨酸酶抑制剂使用的机理。
1.酪氨酸酶活性测定方法
可通过测定酪氨酸酶的邻苯二酚氧化酶活性来计算酪氨酸酶的活性。酪氨酸酶可催化底物L-DOPA形成多巴醌，而多巴醌在475nm波长处有最大吸收峰。因此通过测定酶催化反应体系的A475随时间的增长直线，该直线的斜率即为酪氨酸酶的活力，即以L-DOPA为底物通过分光光度法在波长475nm处测定多巴醌的产生速度来计算酪氨酸酶活力的大小。具体测定方法为：1mLL-DOPA底物体系中加入15μL酪氨酸酶溶液，迅速混匀，通过岛津公司UV-1800紫外可见分光光度计检测475nm处每分钟吸光值变化来指示反应速度v值，从而表征酶活性的大小。所有动力学反应和检测的缓冲液均采用50mM Tris-HCl，pH8.8。
2.芸香苷对酪氨酸酶抑制作用的测定
配制50mM(毫摩尔/升)芸香苷，用缓冲液逐级稀释成不同浓度。将不同浓度的芸香苷30μL与等体积的酪氨酸酶液混合，25℃保温3hr后测定酶活力。测定时酪氨酸酶终浓度为2.0μg/mL，底物L-DOPA浓度为2mM，底物中含相应浓度抑制剂芸香苷。芸香苷浓度与酪氨酸酶活力的关系如图1所示。由图1可知酪氨酸酶活力被芸香苷以浓度依赖的方式显著地抑制，酪氨酸酶活力下降一半时芸香苷的浓度(IC50)为6.8±0.3mM(n＝3)；当芸香苷浓度高于12mM时，酪氨酸酶被完全抑制。
酪氨酸酶抑制剂是通过抑制酪氨酸酶活性从而抑制黑色素生成。在芸香苷存在下进行酪氨酸酶的活性测定，测得的多巴醌v值在475nm波长处每分钟吸光值的变化即v值显著减小，说明酪氨酸酶被芸香苷抑制，这种抑制作用可导致黑色素生成的抑制从而起到美白等作用。由图1可知，当芸香苷浓度高于12mM时酪氨酸酶活性被完全抑制，该浓度可作为酪氨酸酶抑制剂使用时的最低浓度。
3.芸香苷对酪氨酸酶的抑制为可逆的抑制作用
为了判断芸香苷介导的抑制作用是否为可逆反应，我们在反应体系中，加入不同浓度的芸香苷，当底物L-DOPA浓度不变时，改变酪氨酸酶的加入量，测定酪氨酸酶催化底物氧化的活力随酶量的关系。结果如图2所示：v值代表在475nm波长处每分钟吸光值的变化，[E]代表酪氨酸酶的浓度，图2中1-5号芸香苷的浓度分别为0，2.5，5，7.5和10mM，体系中L-DOPA的终浓度为2mM。图中直线均经过坐标轴原点，直线的斜率随着加入芸香苷浓度的增大而下降，证实芸香苷对酪氨酸酶的抑制作用是一个可逆过程。
4.芸香苷和Cu2+的紫外/可见光扫描
由于芸香苷为多羟基的化合物，可预期其具有较强的铜离子螯合能力。通过紫外扫描光谱发现芸香苷溶液中加入铜离子引起明显的红移现象，即峰值处波长变大，如图3所示。这说明芸香苷可螯合铜离子，证实芸香苷可在酪氨酸酶的活性位点直接螯合铜离子。图3所示曲线中芸香苷的测试浓度为0.05mM，Cu2+的测试浓度为0.2mM。
5.芸香苷对酪氨酸酶的竞争性抑制分析
为了评估芸香苷对酪氨酸酶抑制的类型，用Lineweaver-Burk双倒数法作图。竞争性抑制动力学分析的Lineweaver-Burk方程如公式1和公式2所示：
式中：v为反应速度，Km为酪氨酸酶的米氏常数，Vmax为最大反应速度，Ki为抑制剂的抑制常数，
为表面米氏常数，[S]为底物L-DOPA浓度，[I]为抑制剂芸香苷的浓度。Ki、Km和Vmax可从上面方程计算得到。二次作图时通过
值对[I]作图。
结果如图4和图5所示：图4中芸香苷的浓度分别为0(●)，1.25(▲)，2.5(■)和5mM(□)，酪氨酸酶终浓度为2.0μg/mL；图5是根据公式2的二次作图曲线。由图4可以看出，Km和表面Vmax值没有变化，直线的交点在Y轴上，说明芸香苷引起的抑制是典型的竞争性抑制。由图5可以看出，Km对芸香苷浓度的二次作图结果为直线拟合，说明芸香苷对酪氨酸酶具有一个抑制位点或一类抑制位点。运用公式2，从图5得到的直线的Y轴截距/斜率，我们计算出Ki值为1.10±0.25mM(n＝3)。该结果直接说明芸香苷由于具有铜离子螯合的作用可在酪氨酸酶的活性位点(含铜离子)与底物L-DOPA竞争，说明芸香苷对酪氨酸酶的抑制机理为螯合活性中心的Cu2+，从而与底物L-DOPA竞争，抑制酶与底物的结合，进行竞争性抑制。
6.内源荧光测定
酪氨酸酶的活性取决于酶的构象，内源荧光的测定是为了检测酪氨酸酶在芸香苷作用下构象变化情况。采用激发波长为280nm检测300-400nm内源荧光强度的变化。该测定方法是基于蛋白质分子中色氨酸基团的荧光激发现象，蛋白质结构的变化会使荧光发射峰的峰值发生改变。
具体测定方法为：酪氨酸酶与不同浓度的芸香苷混合后保温3小时后测定，测定时酪氨酸酶的终浓度为66μg/mL。荧光发射光谱由日立公司F-4500荧光分光光度计用1cm光径比色皿检测。结果见图6和图7。图6为内源荧光最大荧光强度变化，图7为内源荧光最大荧光强度处波长变化。结果表明芸香苷对酪氨酸酶的内源荧光具有淬灭作用，随着芸香苷浓度的升高荧光强度逐渐降低，在0.4mM以下，芸香苷就能完全淬灭内源荧光。但是最大荧光强度处波长没有发生变化，说明芸香苷与酪氨酸酶的结合不引起酪氨酸酶三级结构的明显变化。
7.芸香苷与酪氨酸酶结合常数和结合位点数量的检测
当小分子等价结合到大分子上时，自由分子和结合分子的平衡方程如公式3所示：
公式3中，F0为天然状态下酪氨酸酶的最大荧光强度，F为加入芸香苷的最大荧光强度。[Q]是芸香苷的浓度，K为结合常数，n为结合位点数。根据公式3以F0/(F0-F)对[Q]-1作图得到的截距和斜率，即可计算n和K的值。
F0/(F0-F)对[Q]-1作图表现为直线关系，如图8所示。根据公式3我们能够计算出结合常数K＝15.27±0.13mM-1，结合位点数为n＝1.18±0.01。因此，在没有底物时，芸香苷显示出与酪氨酸酶较强的结合力，并具有一个结合位点。
8.ANS结合的外源荧光测定
ANS作为荧光染色剂能够和疏水性氨基酸结合，因此可用于检测酶在抑制剂作用下内部的疏水性基团是否暴露出来，从另一个角度来判断酶构象的变化情况。用缓冲液配制不同浓度的芸香苷溶液，各取150μL分别与等体积的酪氨酸酶液混合。25℃保温3hr后，加入ANS至终浓度为40μM并于暗处孵育30min以标记酶的疏水性表面，置于比色皿中测定芸香苷作用下酪氨酸酶的ANS结合的荧光强度变化情况。如图9所示，ANS结合的荧光测定时激发波长为390nm，检测波长范围在400至520nm。图9中，曲线1为酪氨酸酶的天然状态，曲线2-4分别为酪氨酸酶分别与0.078、0.15和0.31mM的芸香苷作用，酶终浓度为66μg/mL。由图9可见，天然状态下酪氨酸酶表现为较低水平的疏水性，主要是由活性部位的疏水性引起的。在0.078-0.31mM的芸香苷浓度下，ANS结合的荧光并没有以浓度依赖的形式出现显著变化，说明在一定的浓度范围芸香苷和酪氨酸酶的结合没有引起酶疏水性的显著变化，对酶结构的影响不明显。
9.酪氨酸酶和芸香苷的计算机对接
采用双孢蘑菇酪氨酸酶的晶体结构(PDB ID：2Y9X)作为酪氨酸酶的结构。在所有用于蛋白质-配体对接的计算机模拟工具中，AutoDock4由于其自动对接性能应用最为广泛。该程序利用一套预设的目标蛋白3D网格完成配体的连接。芸香苷的原始结构来自PubChem数据库(化合物Compound ID：5280805，http://www.pubchem.org)。对接步骤之前需进行：1)2D结构转换为3D结构，2)估算电荷，3)添加氢原子，4)凹陷区域定位。以上步骤中我们使用OMEGA 2.0 OpenEye软件包。
由于蘑菇酪氨酸酶的晶体结构已经获得，我们用MODELLER软件建立了酪氨酸酶的3D结构以进行同源测定。关于对接程序，我们使用一套目标蛋白的3D网格，运用系统的搜索技术。在酪氨酸酶的3D结构中，芸香苷和酪氨酸酶结合的对接非常成功，用AutoDock4(图10)得到的结合能分值为-9.1kcal/mol。我们搜索和发现了酪氨酸酶内部与芸香苷结合相关的一些氨基酸残基，包括HIS56、TYR73、LYS74、ALA75、HIS80、GLY81、PHE85、HIS89、TYR179、HIS234、ASP238、GLU246、HIS249、ASP250、HIS253、ASP266、HIS267、PRO268、PHE269、HIS281、ARG306和ASP307。由图10可知，芸香苷与酪氨酸酶在凹陷区域结合。图中A区域为AutoDock4软件预测的残基，B区域为CHARMM软件预测的残基。C、D两个球体为铜离子。
通过计算机对接模拟可以鉴定酪氨酸酶上芸香苷的结合位点并对结合区域进行了定位，也进一步证明了芸香苷是通过竞争性抑制方式作用于酪氨酸酶的。
10.酪氨酸酶和芸香苷的分子动力学模拟
为了证实我们的对接结果并观察模拟时的结构变化，我们用CHARMM软件进行了10ns产物分子动力学模拟，采用具有简单开关函数(GBSW)的通用的天然模型来理解其溶解作用。模拟过程中，每1ps保存一次结构以进行轨道分析。我们根据作用时间测量了相互作用的结构细节，来确保对接研究的相互作用在动力学模拟研究中能保持一致。
我们参考AutoDock4的结构证实α碳的标准差(RMSD)，结果表明酪氨酸酶结构被重新排列然后趋于稳定，图11所示为参考AutoDock4结构的α碳的RMSD时间表。根据最终的结构，我们选出了与芸香苷相互作用的候选氨基酸残基。我们通过模拟测量了所有这些候选残基的距离。图12为芸香苷的四个芳香环的相互作用时间表，测量在侧链的两个几何中心和芸香苷的芳香环的距离。芸香苷的四个主要芳香环具有四个可能的相互作用区域。由于芸香苷本身在模拟时是具有柔韧性的环，很难测量它们与酪氨酸酶的相互作用。因此我们把芸香苷分成四个环分别进行模拟。模拟程序进行7.5ns后相互作用逐渐稳定下来。通过分子动力学模拟推测的氨基酸残基包括：ALA75、HIS267、PRO268、PHE269和ASP307与环1结合，HIS56、HIS80、PHE85、PRO268和ASP307与环2结合，ARG306和ASP307与环3结合，GLU246、HIS249、ASP250与环4结合。环2作为凹陷区域的核心位点进入并稳定下来。环3表现出相对较弱的稳定性，具有较少数量的可结合残基和较大的距离波动，原因是其定位在活性位点形成的凹陷区域的表面。在我们的方法中，通过对接模拟和分子动力学模拟所发现的可能参与结合的氨基酸残基是相一致的。其四个主要芳香环(环1-4)的结构如下所示。
分子动力学计算机模拟的结果(图13和图14)与图8中通过内源荧光测定计算结合位点数所得结果一致：发现在两个铜离子中，只有一个铜离子在活性中心与芸香苷具有强烈的相互作用。图13为两个铜离子和芸香苷四个主要芳香环距离的时间表，铜离子A(绿色)，铜离子B(红色)，图14为活性中心的全貌图。
11.HaCaT细胞培养和MTS分析芸香苷对细胞的毒性
HaCaT人皮肤角质细胞系是一种能无限次传代的常用角质细胞，该细胞在含有10％胎牛血清和1％抗生素-抗霉剂(Gibco，Rockville，MD)的DMEM细胞培养基中培养。用Sigma-Aldrich公司购买的MTS细胞增殖与毒性检测试剂盒分析芸香苷对HaCaT细胞的细胞毒性，操作过程根据供应商的说明进行。图15所示：通过用添加不同浓度芸香苷的培养液培养HaCaT细胞进行MTS测定，检测芸香苷对皮肤细胞的毒性。1-5号分别代表0，50，100，500，1000μM芸香苷。结果表明芸香苷对HaCaT角质细胞没有毒性影响。该结果预示着芸香苷作为酪氨酸酶的抑制剂能作为一种有效的美白剂，应用于缓解色素合成失调(如色素沉着过度)。
在结构特征方面，芸香苷包括一个黄酮槲皮素和通过糖苷键连接的二糖芸香糖。在本发明中，我们证实具有羟基和苯环的芸香苷能抑制酪氨酸酶，而且芸香苷对皮肤角质化细胞毒性非常微小。芸香苷的抑制机制为铜离子螯合剂作用，能以竞争性抑制的方式在酶的活性位点凹陷区域与底物L-DOPA竞争。这种竞争性抑制暗示了芸香苷的结合位点与L-DOPA的结合位点极为贴近并重叠，因而可使芸香苷结合并与底物竞争。
运用计算机模拟，我们发现芸香苷能够与铜离子紧密结合，这种结合与在铜离子周围靠近活性位点的几个氨基酸残基的作用有关。我们认为这些氨基酸残基参与芸香苷结合的初始阶段，引导其与铜离子的螯合。计算机结构模拟通过鉴定凹陷区域的结合残基提供了芸香苷竞争性抑制的有用证据。
内源荧光的结果说明酪氨酸酶的活性中心和芸香苷之间只有一个可能的结合位点，支持了计算机模拟的结论，即活性中心分别与3个组氨酸基团结合的两个铜离子只有一个被芸香苷螯合。相连的残基在初始阶段引导芸香苷，然后芸香苷逐渐螯合铜离子并伴随酶活性的抑制。因此，在没有底物L-DOPA时内源荧光的测定结果显示为一个结合位点。
综上所述，本发明研究的结果总结如下：1)芸香苷与酪氨酸酶的结合引起了竞争性抑制。2)芸香苷与酪氨酸酶的结合未引起三级结构的明显变化。3)芸香苷结合残基位于活性中心的凹陷区域，这些残基影响芸香苷在初始阶段的对接。4)一个位于活性中心与3个组氨酸结合的铜离子在平衡状态直接与芸香苷螯合。5)芸香苷作为酪氨酸酶抑制剂的进一步研究可开发用于皮肤黑色素生成紊乱的新型美白剂，抑制效果好、细胞毒性非常微小。
附图说明
图1是芸香苷对酪氨酸酶的抑制影响图；
图2是v和[E]的关系图；
图3是芸香苷和Cu2+的紫外/可见光扫描图；
图4是Lineweaver-Burk双倒数图；
图5是根据图4求得的表面Km值对芸香苷浓度作图；
图6是不同浓度芸香苷作用下酪氨酸酶的内源荧光强度变化图；
图7是酪氨酸酶内源荧光最大荧光强度处波长随芸香苷浓度变化图；
图8是F0/(F0-F)对[Q]-1作图；
图9是不同浓度芸香苷作用下ANS结合的酪氨酸酶荧光变化图；
图10是酪氨酸酶与芸香苷的计算机对接图；
图11是参考AutoDock4结构的α碳的RMSD时间表；
图12环1至环4是芸香苷的四个芳香环的相互作用时间表；
图13环1至环4是两个铜离子与芸香苷四个芳香环距离的时间表；
图14是在活性中心的铜离子和芸香苷的结合模拟图；
图15是人HaCaT角质化细胞的芸香苷毒性试验图。
具体实施方式
实施例1
芸香苷对酪氨酸酶抑制作用的测定
配制50mM芸香苷，用三羟甲基氨基甲烷(Tris)促溶并调节pH至8.8，用缓冲液(50mM Tris-HCl，pH8.8)逐级稀释成40mM、30mM、25mM、22.5mM、20mM、17.5mM、15mM、12.5mM、10mM、7.5mM、5mM、2.5mM、1.25mM、0.625mM、0.3125mM、0.15625mM共16个浓度。酪氨酸酶用50mM Tris-HCl缓冲液溶解至pH8.8、浓度为0.275mg/mL。分别取上述不同浓度的抑制剂30μL与等体积的酪氨酸酶液混合。设置不含芸香苷的30μL缓冲液与等体积的酪氨酸酶混合作为空白对照。以上体系25℃保温3hr后测定酶活力。
用上述缓冲液配制4mM L-DOPA溶液，取600μL分别与上述等体积的芸香苷溶液和缓冲液(空白对照)混合，作为测定酪氨酸酶活性的底物体系。
酪氨酸酶活力测定方法：先将1mL预热至25℃的含不同浓度芸香苷的L-DOPA底物置于比色皿中，加入15μL对应芸香苷浓度的酪氨酸酶溶液，迅速混合，采用岛津公司UV-1800紫外可见分光光度计测定A475，25℃连续检测1min。计算酶活力ΔOD/min(每分钟吸光度的变化值)。测定时酪氨酸酶终浓度为2.0μg/mL，底物L-DOPA浓度为2mM，底物中含相应浓度芸香苷。以体系中芸香苷浓度为横坐标，以相对酶活力即含相应浓度芸香苷的酪氨酸酶液的酶活力/空白对照的酶活力×100％为纵坐标，作图，所得结果如图1所示。由图1可知酪氨酸酶活力被芸香苷以浓度依赖的方式显著地抑制，酶活力下降一半时的抑制剂浓度(IC50)为6.8±0.3mM(n＝3)。芸香苷浓度高于12mM时，酪氨酸酶被完全抑制。
Claims (1)
1.芸香苷作为酪氨酸酶抑制剂的应用。
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| CN (1) | CN102579273A (zh) |
Cited By (1)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| WO2020126653A1 (fr) * | 2018-12-20 | 2020-06-25 | L V M H Recherche | Extrait de bois de rosier |
-
2012
- 2012-01-19 CN CN2012100179582A patent/CN102579273A/zh active Pending
Non-Patent Citations (2)
| Title |
|---|
| 王芳: "桑叶中酪氨酸酶抑制成分的研究", 《中国博士学位论文全文数据库 基础科学辑》 * |
| 黄蕾等: "三维荧光光谱结合二阶校正算法快速测定化妆品中芦丁含量", 《分析化学（增刊）》 * |
Cited By (2)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| WO2020126653A1 (fr) * | 2018-12-20 | 2020-06-25 | L V M H Recherche | Extrait de bois de rosier |
| CN113316448A (zh) * | 2018-12-20 | 2021-08-27 | Lvmh研究公司 | 蔷薇木材提取物 |
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