CN102550606B - 昆虫病原线虫的剂型化方法 - Google Patents

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Abstract

本发明涉及一种能够将昆虫病原线虫长期保管及便于使用的剂型化方法。本发明提供一种昆虫病原线虫的剂型化方法，该方法对其它非目标昆虫安全，而对害虫则可以自行找到化学杀虫剂无法到达的土壤深处的幼虫，从而在不引起环境污染和生态副作用的条件下，能够有效杀灭害虫；在不影响昆虫病原线虫的病原性的情况下，在线虫无法生存的温度下也能提高存活率，从而能够长期保存；其具有水溶性、能够完全溶解而方便农民使用。

Description

昆虫病原线虫的剂型化方法
技术领域
本发明涉及一种能够将昆虫病原线虫长期保管并方便使用的剂型化方法。
背景技术
昆虫病原线虫属于胞管肾纲(Sececerneetea)的小杆圆虫目，寄生于昆虫并诱发病原性，因此通常称为昆虫寄生性线虫。昆虫病原线虫的形状像圆筒形的线，属于非环节形，具有简单的内脏和棒槌状形态。另外，感染态线虫的大小根据其种类有些差异，但约为100μm-2000μm。昆虫病原线虫栖息地为大海、淡水、温泉、山等，分布在地球上的大部分位置。线虫显示与昆虫的便乘、兼性寄生、专性寄生等关系具有对宿主产生致死、不孕的诱发、加害行动迟缓、羽化迟缓、产卵力下降、变态失败的诱发、组织破坏等直接或间接的影响，迄今为止已知的寄生于昆虫的线虫分约为40多个科，其中斯氏属(Steinernema ssp.)和异小杆线虫属(Heterorhabditis spp.)与在其体内共生的细菌一同作用来使昆虫死亡。昆虫病原线虫的肠内有共生细菌，因此用作害虫防治用天敌而喷洒时，能够侵入到害虫的幼虫，使害虫发生败血症而在24-48小时内使其死亡，从而显示出高杀虫率。
线虫根据其种类侵入害虫体内的方式也不同，其中，斯氏属潜伏在害虫的通行路径，通过害虫移动时的接触侵入到害虫体内。
所述昆虫病原线虫侵入害虫的路径根据线虫的种类和害虫的种类有所不同，但是基本上通过宿主开放的体腔，即口、肛门、气门(呼吸孔)侵入，侵入后进入到宿主血管体腔内释放无色杆菌属(Xenorhabdus spp.)。上述所释放的共生细菌分泌抑制宿主昆虫免疫作用的毒素和抗生物质，能够在24-48小时内使昆虫因白血病而死亡，具有快速的杀虫机制。
另外，所述共生细菌还分泌防止其它微生物生长的2次代谢产物，使宿主体内组织适于昆虫病源线虫的生长，从而使线虫在昆虫体内的生长。
这种昆虫病原线虫具有广泛的宿主范围、出色的宿主探索能力及致死率、通过批量生产的经济性等诸多优点，因此广泛用作害虫的天敌产品。
此外，昆虫病原线虫在人工培养之后利用各种材料的载体制成制剂而商品化，但是这种传统的剂型在线虫产品自身的存活率和保存等方面存在问题，无法在20℃以上进行保存。
为了克服所述问题，研究了多种方法。
首先，韩国授权专利公告第10-0542152号(昆虫病原线虫的液态保存及活力增进用组成物)公开了一种将甲基立枯磷(Tolclofos-methyl)、白炭墨或滑石添加到保存液中，从而在不影响昆虫病原线虫的病原性的情况下，能够延长保存期间的组成物。
还有，韩国授权专利公告第10-0515009号(长期保存及有效利用的粉末状昆虫病原线虫的剂型)中公开了将昆虫病原线虫与去水山梨糖醇单油酸酯，聚氧乙烯十二烷基单醚(polyoxyethylenedodecylmonoether)，硅酸钠混合，再与木屑、甘油、黄原胶(keltrol F)、海藻糖中的一种以上的物质混合并制成制剂，从而在室温能够保持稳定，具有良好的生存能力并可以长期保存的剂型化方法。
还有，在韩国授权专利公告第10-0408482号(剂型化昆虫病原线虫的生产方法及其长期保存方法)中公开了将昆虫病原线虫与燕麦、面粉、高岭土或泥炭藓混合，在4℃-25℃下干燥成水分含量为35％-60％的剂型，从而在室温也能够大量增殖，在维持良好的杀虫力的同时能够长期保存稳定性的方法。
但是，所述的发明由于使用多种化学成分，因此不适合节约费用，且使用的多种赋形剂是为了将昆虫病原线虫的水分进行适当调节从而有利于保存，而不是使线虫的代谢中止，因此很难长期保存，而且如果霉等污染源通过吸收水分侵入时，会影响昆虫病原线虫的存活率，还有所使用的赋形剂在农民们进行喷洒时可能会堵塞喷洒机的喷嘴。
发明内容
本发明的目的在于提供一种能够长期保存的昆虫病原线虫的剂型化方法。
本发明的另一目的在于提供一种方便农民使用的昆虫病原线虫的剂型化方法。
为了实现所述目的，本发明提供一种昆虫病原线虫的剂型化方法，该方法包括：第一步骤，准备pH 9-10的胶质氧化硅溶液；
第二步骤，在所述胶质氧化硅溶液中接种昆虫病原线虫，在5℃-15℃下放置5小时以上，从而制备线虫混悬液；
第三步骤，在所述线虫混悬液中添加醇类溶剂，该醇类溶剂的添加量为相对于总体积占0.5％-2％，从而制备胶质氧化硅凝胶线虫组成物。
在一实施例中，第一步骤的胶质氧化硅溶液中二氧化硅的粒径可以为2nm-150nm。
在另一实施例中，第一步骤的胶质氧化硅溶液中Na浓度可以小于10ppm。
在又一实施例中，第一步骤的胶质氧化硅溶液中K浓度可以小于0.5ppm。
在再一实施例中，第一步骤的胶质氧化硅溶液中二氧化硅浓度可以为10％-40％。
在另一实施例中，第三步骤所制备胶质氧化硅凝胶线虫组成物可以在10℃-25℃保存。
作为本发明优选的第二实施例提供通过所述第一实施例的方法来制备的昆虫病原线虫制剂。
本发明能够提供对其它非目标昆虫安全，而对害虫则可以自行找到化学杀虫剂无法到达的土壤深处的幼虫，从而在不引起环境污染和生态副作用的条件下，能够有效杀灭害虫；在不影响昆虫病原线虫的病原性的情况下，在线虫无法生存的温度下也能提高存活率，从而能够长期保存的昆虫病原线虫的剂型化方法。
另外，本发明能够提供一种具有水溶性、能够完全溶解而方便农民使用的昆虫病原线虫的剂型化方法。
附图说明
图1为根据本发明一优选实施例的胶质氧化硅凝胶线虫组成物的照片；以及
图2为根据本发明一优选实施例的用胶质氧化硅凝胶制成制剂的昆虫病原线虫的光学显微镜(20×)下的照片。
具体实施方式
作为本发明的优选第一实施例，本发明提供一种昆虫病原线虫的剂型化方法，该方法包括：第一步骤，准备pH 9-10的胶质氧化硅溶液；第二步骤，在所述胶质氧化硅溶液中接种昆虫病原线虫，在5℃-15℃下放置5小时以上，从而制备线虫混悬液；第三步骤，在所述线虫混悬液中添加醇类溶剂，该醇类溶剂的添加量为相对于总体积占0.5％-2％，从而制备胶质氧化硅凝胶线虫组成物。
以下根据各步骤进行详细说明。
第一步骤：准备胶质氧化硅溶液
胶质氧化硅是一种化学稳定的无机材料，其比表面积和表面物性优良，因此在工业中用在各种不同的用途。
使胶质氧化硅溶液的pH为9-10。另外，还使Na浓度小于10ppm、K浓度小于0.5ppm。线虫主要对酸度敏感，因此优选溶液的pH为9-10的碱性环境。优选，碱度调节为Na浓度小于10ppm、K浓度小于0.5ppm，从而在长期保存时防止由于渗透压现象导致线虫的水分排出。
另外，在胶质氧化硅溶液中二氧化硅是保存并提供线虫所需的氧的重要要素，优选其浓度为10％以上，其浓度过高时为防止线虫体内水分损失，而优选为40％以下。特别是，使用昆虫病原线虫处理小卷蛾斯氏线虫(Steinernema carpocapsae)和异小杆嗜菌线虫(Heterohabdits bacteriophora)时，优选使用二氧化硅浓度为40％的胶质氧化硅溶液。
另外，二氧化硅的粒径优选在2nm至150nm的范围调整。
第二步骤：制造线虫混悬液
在所述第一步骤中准备的胶质氧化硅溶液中接种昆虫病原线虫後，在5℃-15℃下放置5小时以上，通过此过程减少线虫的代谢，由此抑制线虫的活动而诱导休眠，从而制备线虫混悬液。
此时，昆虫病原线虫可以使用小卷蛾斯氏线虫(Steinernema carpocapsae)和异小杆嗜菌线虫(Heterohabdits bacteriophora)等。
第三步骤：制备胶质氧化硅凝胶线虫组成物
在所述第二步骤中制备的线虫混悬液中添加醇类溶剂，所述醇类溶剂的添加量为占总体积的0.5％-2％，从而制备胶质氧化硅凝胶线虫组成物。
将制备的所述胶质氧化硅凝胶组成物装入保存容器中，在10℃-25℃进行保存。如上所述，将线虫制成胶质氧化硅凝胶组成物进行保存，通常在约4℃保存的保存温度可以提高至在10℃以上的温度中保存；另外，为防止线虫的存活率、病原性及感染性降低等，优选在25℃以下的温度保存。
以下，对本发明的实施例进行详细说明。但，应当理解的是下述的实施例仅用于说明本发明，并不限定本发明的范围。
制备例1：胶质氧化硅溶液
将三种韩国工业规格的硅酸钠用纯水稀释，制备浓度为4％的二氧化硅溶液。在制备的溶液中加入硫酸溶液150g，将溶液的pH维持于10.0后，将溶液通过阳离子交换树脂，从而得到pH为3的溶液。所述溶液中胶质氧化硅的平均粒径通过Sears法测定为2.8nm-150nm，具有不同粒径。所述胶质氧化硅不是单圆球形，而是显示出以球状相互连接的非定型状态。
在所述溶液中加入硅酸钠以将pH调节为10.5，以3℃/分钟的温度上升率将温度提高到90±5℃后，维持所述温度并加热100分钟。在所述溶液中添加NH4OH及2-氨基-2-甲基-1-丙醇作为pH调节剂，将pH调节为9.5至10.0的稳定状态而使用。此时，获得的溶液的Na浓度为10ppm，K浓度为0.5ppm，二氧化硅浓度为40％。
制备例2：昆虫病原线虫
将土壤试料接种到大蜡螟和甜菜夜蛾5龄虫，分离出小卷蛾斯氏线虫(Steinemema carpocapsae)和异小杆嗜菌线虫(Heterohabdits bacteriophora)。所述感染的大蜡螟和甜菜夜蛾利用贝尔曼漏斗分离技术(baermann funnel technique)收集后，通过试验用筛(HAN KUK JUNG MIL：筛孔大小38μm，线的粗度30μm)回收昆虫病原线虫。
将回收的线虫各100只分别与1次蒸馏水1mL混合，放入组织培养板在25℃下培养。
实施例
制备例1中制备的胶质氧化硅溶液中分别接种了制备例2中培养的小卷蛾斯氏线虫(Steinernema carpocapsae)和异小杆嗜菌线虫(Heterohabdits bacteriophora)2×105/mL。含有线虫的胶质氧化硅溶液在10℃下放置5小时以上，通过所述过程后以50rpm搅拌。
搅拌时添加相当于总体积的1％的乙醇，从而制备了胶质氧化硅凝胶线虫组成物。
比较例
分别接种制备例2中培养的小卷蛾斯氏线虫(Steinemema carpocapsae)和异小杆嗜菌线虫(Heterohabdits bacteriophora)2×105/mL，而制备线虫混悬液。
实验例1：根据胶质氧化硅凝胶线虫组成物的保管温度的生存期间
将所述实施例及比较例中准备的线虫组成物根据线虫的种类各分为5个组，并在250mL(75cm2)组织培养板中分别加入50g，在10℃、15℃、20℃、25℃及30℃下保存12周，然后利用光学显微镜(20×)对线虫进行观察。
结果如下表1所示。
表1.
如所述表1所示，可以确认使用胶质氧化硅凝胶线虫组成物制备成制剂的昆虫病原线虫与比较例中没有制备成制剂的线虫混悬液相比，皆可在相当长的时间内存活并保存。
实验例2：胶质氧化硅凝胶线虫组成物的昆虫病原线虫活性及病原性调查
进行所述胶质氧化硅凝胶线虫组成物的昆虫病原线虫的感染态幼虫的活性及病原性的调查。
准备的线虫在25±2℃下保存6周后，利用光学显微镜(×20)观察其活动状态。
在90×15mm有盖培养皿(Petri dish)中垫上滤纸后，分别接种了5000只经保存的昆虫病原线虫，并放入10只大蜡螟，分别比较根据时间变化的病原性变化。其结果在下表2中示出。
表2.
如所述表2所示，可以确认本发明的胶质氧化硅凝胶线虫组成物的昆虫病原线虫保留很高的病原性。

Claims (5)

1.一种昆虫病原线虫的剂型化方法，其特征在于，该方法包括：
第一步骤，准备pH 9-10的胶质氧化硅溶液，且使该溶液中的Na浓度小于10ppm，K浓度小于0.5ppm；
第二步骤，在所述胶质氧化硅溶液中接种昆虫病原线虫，在5℃-15℃下放置5时以上，从而制备线虫混悬液；以及
第三步骤，在所述线虫混悬液中添加醇类溶剂，该醇类溶剂的添加量为相对于总体积占0.5％-2％，从而制备胶质氧化硅凝胶线虫组成物。
2.根据权利要求1所述的昆虫病原线虫的剂型化方法，其特征在于，所述第一步骤的胶质氧化硅溶液中二氧化硅的粒径为2nm-150nm。
3.根据权利要求1所述的昆虫病原线虫的剂型化方法，其特征在于，所述第一步骤的胶质氧化硅溶液中二氧化硅浓度为10％-40％。
4.根据权利要求1所述的昆虫病原线虫的剂型化方法，其特征在于，所述第三步骤中制备的胶质氧化硅凝胶线虫组成物在10℃-25℃保存。
5.一种昆虫病原线虫的制剂，利用根据权利要求1-4中任意一项所述的方法来制备。
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