CN102517283B

CN102517283B - 一种特异性降低人IQGAP1基因表达的shRNA及其应用

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Publication number: CN102517283B
Application number: CN 201110388883
Authority: CN
Inventors: 王晓霞; 陈显久; 牛勃; 解军; 路娜; 程牛亮
Original assignee: Shanxi Medical University
Current assignee: Shanxi Medical University
Priority date: 2011-11-30
Filing date: 2011-11-30
Publication date: 2013-07-03
Anticipated expiration: 2031-11-30
Also published as: CN102517283A

Abstract

本发明涉及分子遗传学及生物医药领域，具体为一种特异性降低人IQGAP1基因表达的shRNA及其应用，本发明提供了一种特异性降低人IQGAP1基因表达的发夹型干扰RNA，如SEQIDNO.1所示，针对的靶序列为人IQGAP1mRNA的第1901～1921位，如SEQIDNO.2所示，该shRNA在体内或体外可剪切形成含如SEQIDNO.4和SEQIDNO.5所示的siRNA；本发明还提供了编码该shRNA的DNA寡核苷酸链，如SEQIDNO.3所示，以及包含如SEQIDNO.3所示的DNA寡核苷酸链的质粒。而且本发明还证明了利用含IQGAP1-shRNA干扰载体的药物瞬时转染人食管癌EC9706细胞后，细胞中IQGAP1基因的mRNA转录水平明显降低，蛋白表达水平明显降低，使食管癌细胞的侵袭能力显著降低，克服了体外化学合成的siRNA作用时间短暂的缺点，为新型抗肿瘤药物的开发提供了新途径。

Description

一种特异性降低人IQGAP1基因表达的shRNA及其应用

技术领域

本发明涉及分子遗传学及生物医药技术领域，具体为一种特异性降低人IQGAP1基因表达的shRNA及其应用。

背景技术

RNA干扰技术（RNAi）是指双链RNA特异性地诱发与其同源序列mRNA分子被降解，导致相应基因表达抑制的现象。人工化学合成或细胞内转录生成的小的双链RNA（small interfering RNA，siRNA）进入细胞后，能和与之互补的靶基因mRNA结合，从而介导特异性的切割酶将mRNA降解，达到降低目的基因表达的目的。

目前，体外化学合成的siRNA虽然可以引起靶基因表达降低，但其作用相对短暂。为了对基因进行长效抑制，许多哺乳动物质粒表达载体已被作为研究工具，在细胞内指导合成siRNA。这些载体包含依赖RNA polymerase-Ⅲ U6或H1启动子，有一个明确的转录起始点和一个由连续5个胸腺嘧啶组成的转录终止信号（T5）。其中，一对特定的寡核苷酸来源于目标基因mRNA 的一段长度为19～21个碱基的独特序列。当将正向和反向的DNA寡核苷酸退火，并克隆至载体的两个限制性内切酶位点之间时，正向DNA 寡核苷酸将正确定位于U6启动子的下游。重组载体的转录产物即发夹型RNA（small hairpin RNA，shRNA）可以自身折叠配对形成茎长为19～21个碱基的茎环（Stem-loop）结构，这种茎环结构的前体在细胞内很快被切割形成有功能的siRNA。这种载体表达的shRNA经剪切形成的siRNA具有表达量稳定、持续时间长的特点，从而可引起目标基因表达的长效抑制。

IQGAPs（IQ motif containing GTPase activating proteins）是近年来新发现的一个蛋白家族，在哺乳动物中有3个同源物，即IQGAP1、IQGAP2和IQGAP3。IQGAP1于1994年最早被发现 [Weissbach L, Settleman J, Kalady MF, Snijders AJ, Murthy AE, Yan YX, Bernards A. Identification of a human rasGAP-related protein containing calmodulin-binding motifs. J Biol Chem. 1994; 12;269(32):20517-21.]，它是Rho家族GTP酶成员Rac1和cdc42 的一个重要效应因子，能与细胞骨架和黏附成分广泛作用，通过调节分裂原激活蛋白激酶途径，影响细胞增殖和分化，在细胞黏附和迁移的信号网络中发挥关键作用[Brown MD, Sacks DB. IQGAP1 in cellular signaling: bridging the GAP. Trends Cell Biol. 2006; 16(5):242-9.]。近年来研究发现，IQGAP1在许多肿瘤中如肺癌[Nakamura H, Fujita K, Nakagawa H, Kishi F, Takeuchi A, Aute I, Kato H. Expression pattern of the scaffold protein IQGAP1 in lung cancer. Oncol Rep. 2005; 13(3):427-31.]、结肠癌[Nabeshima K, Shimao Y, Inoue T, Koono M. Immunohistochemical analysis of IQGAP1 expression in human colorectal carcinomas: its overexpression in carcinomas and association with invasion fronts. Cancer Lett. 2002; 176(1):101-9.]、乳腺癌[Jadeski L, Mataraza JM, Jeong HW, Li Z, Sacks DB. IQGAP1 stimulates proliferation and enhances tumorigenesis of human breast epithelial cells. J Biol Chem. 2008; 283(2):1008-17.]、卵巢癌[Dong P, Nabeshima K, Nishimura N, Kawakami T, Hachisuga T, Kawarabayashi T, Iwasaki H. Overexpression and diffuse expression pattern of IQGAP1 at invasion fronts are independent prognostic parameters in ovarian carcinomas. Cancer Lett. 2006; 243(1):120-7.]呈现过表达，其过表达水平与肿瘤细胞的侵袭和转移之间存在着密切的相关性。发明人前期研究表明，IQGAP1在食管癌中也存在过表达。

众所周知，我国食管癌的发病率目前居世界第一位，尤其以太行山周边的河北、河南及山西的部分地区为高发区。虽然手术切除以及术后放化疗使病人生存率得到了较大提高，但总体预后仍不乐观，导致病人死亡的主要原因是肿瘤的复发和转移。因此，研制治疗食管癌的新型药物具有重要的经济价值和社会效益，而采用RNA干扰技术将成为治疗食管癌的有效途径。但到目前为止，还没有关于将IQGAP1基因作为治疗食管癌靶基因的报道。

发明内容

本发明的目的在于提供一种特异性降低人IQGAP1基因表达的shRNA及其应用。

本发明是采用如下技术方案实现的：一种特异性降低人IQGAP1基因表达的shRNA，其碱基序列如SEQ ID NO.1所示，即

5’-GUUAUGGUUGGAUGAAAUUCACUCGAGUGAAUUUCAUCCAACCAUAAC-3’。

该shRNA可应用于治疗食管癌的药物中。

本发明提供了一种可以特异性降低人IQGAP1基因表达的发夹型干扰RNA（IQGAP1-shRNA），如SEQ ID NO.1所示，针对的靶序列为人IQGAP1 mRNA的第1901～1921位，如SEQ ID NO.2所示，该shRNA在体内或体外可剪切形成含如SEQ ID NO.4和SEQ ID NO.5所示的siRNA；本发明还提供了编码该shRNA的DNA寡核苷酸链，如SEQ ID NO.3所示，以及包含如SEQ ID NO.3所示的DNA寡核苷酸链的质粒，利用该质粒可以直接在体内或者体外生成IQGAP1-shRNA。而且本发明还证明了利用含IQGAP1-shRNA干扰载体的药物瞬时转染人食管癌EC9706细胞后，细胞中IQGAP1 基因的mRNA转录水平明显降低，蛋白表达水平明显降低，使食管癌细胞的侵袭能力显著降低。

总之，本发明利用RNA干扰技术，成功获得针对人IQGAP1基因的shRNA；以此序列为基础的真核表达载体在细胞中能稳定持续的抑制IQGAP1 mRNA和蛋白表达水平，克服了体外化学合成的siRNA作用时间短暂的缺点；以此序列为基础的真核表达载体在细胞中能有效抑制食管癌细胞的侵袭，因此，为新型抗肿瘤药物的开发提供了新途径。

附图说明

图1为免疫组化方法检测IQGAP1在食管癌旁组织中的表达；

图2为免疫组化方法检测IQGAP1在食管癌组织中的表达；

图3为本发明RNA干扰载体的特征图；

图4为转染后普通显微镜下观察EC9706细胞图（×100）；

图5为转染后荧光镜下观察EC9706细胞中绿色荧光蛋白表达图（×100）；

图6为转染后EC9706细胞中IQGAP1 mRNA表达的RT-PCR结果图；

图7为转染后EC9706细胞中IQGAP1蛋白表达的Western blot结果图；

图8为转染后对照组Transwell侵袭实验结果图（×100）；

图9为转染后实验组Transwell侵袭实验结果图（×100）；

图10为转染后Transwell侵袭实验结果统计图。

具体实施方式

以下实施例仅用于说明本发明而不用于限制本发明的范围，下列实施例中未注明具体条件的实验方法，通常按照常规条件或者按照生产厂商所建议的条件。

实施例1：

IQGAP1在食管癌及癌旁组织中的表达

组织芯片购自上海芯超生物科技有限公司。整个组织芯片共包括75例患者的食管鳞癌及配对的癌旁正常组织，共150点。

免疫组织化学染色步骤：

1) 组织标本石腊包埋切片，常规脱腊：70℃烤片2h，二甲苯处理2次，每次10min。2) 水化：100%，85%，70%乙醇各3min。3) PBS缓冲液洗2次，每次3min。4) 3% H₂O₂溶液室温处理10min以去除内源性过氧化物酶。5) 双蒸水洗3次，每次3min。6) 浸在0.01 M枸橼酸盐缓冲液（pH6.0）中92~98℃水浴中处理25min修复抗原，自然冷却到室温。7) PBS缓冲液洗2次，每次3min。8) 封闭液37℃ 30min。9) 稀释的一抗，37℃作用1～2h或4°C过夜。10) PBS洗3次，每次3min。11) 加生物素标记的二抗IgG，37℃孵育30min。12) PBS冲洗3次，每次3min。13) 加HRP（辣根酶过氧化物酶）标记的链霉卵白素37℃作用30min。14) PBS冲洗，3次，每次3min。15) 配DAB：1ml水中依次滴加A、B、C液各一滴。滴加DAB（二甲基联苯胺）溶液显色，自来水冲洗。16) 苏木素复染，立刻水冲。17) 梯度乙醇脱水。18) 树脂封片：将一滴树脂滴在石蜡片上，盖上盖玻片。

免疫组织化学评分：

IQGAP1各种组织中的胞浆染色评分标准如文献所述。阳性细胞数按以下标准评分：（a）0，组织中的上皮细胞或肿瘤细胞阳性染色数＜5%；（b）1，组织中的上皮细胞或肿瘤细胞阳性染色数为26-50%；（c）3，组织中上皮细胞或肿瘤细胞阳性染色细胞数为 51-75% ；(d) 4，组织中的上皮细胞或肿瘤细胞阳性染色细胞数＞75%。染色强度的分级按以下标准：（a）0，染色阴性；（b）1+，弱阳性；（c）2+，中等程度阳性；（d）≥3+，强阳性。对每一个组织点来说，以不同拷贝的阳性细胞数评分与染色程度的乘积之平均值为最终评分，最终评分范围为0~12分。我们将最终评分≥8～≤12定义为强表达，≥4～<8 为中等表达，≥0～<4为弱表达。

结果显示，在正常食管鳞状上皮细胞中，IQGAP1蛋白低水平表达于膜或不表达（图1），而在食管鳞癌细胞中，IQGAP1蛋白主要表达于胞浆，且阳性细胞数量及染色强度均明显增高（图2）。经统计学分析，差异具有显著性。

实施例2：

可降低人IQGAP1基因表达的shRNA的设计

根据NCBI数据库中人IQGAP1基因（GeneBank编号NM003870）的mRNA碱基序列，借助siDirect公司在Internet上提供的siRNA工具软件（siDirect version 2.0）选择靶点序列，靶点序列为人IQGAP1 mRNA的第1901～1921位，如SEQ ID NO.2所示，即5’-GUUAUGGUUGGAUGAAAUUCA-3’，

根据靶点序列设计的相应shRNA序列为：

SEQ ID NO.1：5’-GUUAUGGUUGGAUGAAAUUCACUCGAGUGAAUUUCAUCCAACCAUAAC-3’

编码shRNA的DNA序列为：

SEQ ID NO.3：5’-GTTATGGTTGGATGAAATTCACTCGAGTGAATTTCATCCAACCATAAC-3’

该shRNA序列在体内或体外可剪切形成含如SEQ ID NO.4和SEQ ID NO.5所示的siRNA正义链和反义链：

SEQ ID NO.4：正义链为5’-GUUAUGGUUGGAUGAAAUUCA-3’，

SEQ ID NO.5：反义链为5’-UGAAUUUCAUCCAACCAUAAC-3’。

实施例3：

可降低人IQGAP1基因表达的shRNA干扰载体的构建

根据以上序列，由上海吉凯有限公司通过化学合成法合成SEQ ID NO：3所示的DNA，并在两端加上BamHⅠ和Hind Ⅲ的酶切位点。将DNA寡核苷酸溶解在灭菌、无核酸酶的水中，终浓度为3mg/mL。退火反应是将各1mL的正向和反向DNA 寡核苷酸与48ml的退火缓冲液（10mM Tris, pH 7.5-8.0, 50mM NaCl, 1mM EDTA）混合，在90℃温育4min，70℃温育10min，慢慢冷却退火的寡核苷酸至10℃。将退火产物与空的GV102质粒（上海吉凯有限公司提供）进行双酶切，采用DNA纯化试剂盒纯化酶切产物，各取2μL用T4 DNA连接酶连接。将重组的GV102载体转化含有氨苄青霉素的琼脂糖平板，挑取阳性克隆，通过测序来确定重组质粒中是否插入正确的序列。

质粒特征如图3所示，其中shDNA代表编码本发明序列shRNA（SEQ ID NO.1）的DNA序列（SEQ ID NO.3）。测序证实插入序列完全正确。

实施例4：

含人IQGAP1-shRNA干扰载体药物的制备

将8μg 质粒稀释于500μL无培养基中，轻轻混匀。取Lipofectamine 2 000 （脂质体介导法）8μL稀释于500μL无血清培养基，混匀，室温孵育5min。将稀释的脂质体与稀释的质粒DNA混合，室温孵育20min。

实施例5：

利用含人IQGAP1-shRNA干扰载体的药物瞬时转染人食管癌EC9706细胞

取生长状态良好的细胞，于转染前一天将细胞接种于培养皿中，转染时细胞密度达到70%左右。将实施例3所制备的药物加入培养皿内，加无血清培养基至2mL，轻轻混匀。6h后补加含20%的RPMI 1640培养基2mL，24h后，弃去原培养基，换含10%的RPMI 1640培养基。48h后收集细胞进行鉴定。

实施例6：

转染后显微镜下观察EC9706细胞中绿色荧光蛋白的表达

载体上带有GFP 基因，表达绿色荧光蛋白，利于观察含重组载体的药物的转染效率。结果显示，随着转染时间的延长，绿色荧光逐渐增多增强。同一视野白光（图4）和荧光镜下（图5）对比观察细胞中绿色荧光蛋白的表达，经计算得出在48h时，含人IQGAP1-shRNA干扰载体的药物的转染效率约为65-70%。

实施例7：

转染后半定量RT-PCR法检测对IQGAP1 mRNA表达的干扰作用

转染48h 后，用Trizol 试剂抽提细胞总RNA，取RNA 7.5μg，random hexamers (500μg/mL) 2μL，10mM dNTP mix 1μl，加DEPC水至10μL，混匀后65℃作用5min；置于冰上3-5min，加入10×RT buffer 2μl，25 mmol/L MgCl₂ 4μl，0.1mol/L DTT 2μl，混匀后25℃作用2min；在每管中加SuperscriptII^TM 逆转录酶1μl，混匀，依次25℃作用10min，42℃ 作用90min，70℃作用15min，逆转录成cDNA。再以cDNA 为模板，PCR 扩增IQGAP1基因，上游引物为：5’-ACCGTGGACCCAAAGAAC-3’；下游引物为：5’-CTTCCCGTAGAACTTTTTGTTG-3’。以看家基因GAPDH 为内参照，上游引物为：5’-GCTGAGAACGGGAAGCTTGT-3’；下游： 5’-GCCAGGGGTGCTAAGCAGTT-3’。引物由大连宝生物公司合成。PCR反应体系如下：

组分	体积（μL）
		10×PCR Buffer	2.5
MgCl₂	1
		dNTP (5 mmol/L)	2
Taq DNA聚合酶	0.25
		cDNA模板	1
目的基因上/下游引物(10 mmol/L)	2
		GAPDH引物	1
去离子水	15.25
		总体积	25

反应条件为：94℃ 30 s，58℃ 30 s，72℃ 30 s，共30 个循环。结果显示，与阴性质粒转染组比较，含人IQGAP1-shRNA干扰载体的药物处理细胞中IQGAP1 基因的mRNA 转录水平明显降低（见图6）。

实施例8：

转染后Western blot法检测对IQGAP1蛋白表达的干扰作用

转染48h后收集细胞，取50μg细胞总蛋白，经10% SDS-PAGE 后，转移至硝酸纤维素膜，以鼠抗IQGAP1 单抗（1:5000 稀释）为一抗，HRP 标记的羊抗鼠IgG 为二抗，经孵育洗膜后ECL 显影，检测细胞内IQGAP1蛋白的表达水平，以β-actin 为内参照。结果显示，与阴性质粒转染组比较，含人IQGAP1-shRNA干扰载体的药物处理细胞中IQGAP1蛋白的表达水平明显降低（见图7）。

实施例9：

转染后Transwell侵袭实验检测对细胞侵袭能力的影响

稀释Matrigel至250μg/mL，将8μm孔聚碳酯膜双面经细胞外基质Matrigel包被各30min，取出风干备用。将30μL RPMI 1640培养基加在Boyden小室下室，Matrigel包被好的8μm孔聚碳酯膜铺于下室上面，再加一层橡胶垫，并安装好Boyden小室上槽。取生长状态良好的细胞消化，将50μL 2×10⁴个细胞种植于每个Boyden小室下室，于37℃ 5%CO₂培养箱中培养。24h后小心取下膜，刮去上层未发生迁移的细胞。以75%的甲醇固定膜上的细胞15min。以0.5%结晶紫（甲醇配制）染色20min后，蒸馏水清洗。在显微镜下计数聚碳酯膜下表面的细胞数，进行统计学分析，同时拍照。结果显示，含人IQGAP1-shRNA干扰载体的药物处理细胞穿过膜的细胞数为346±66.53（图9），对照组穿过膜的细胞数为890±90.05（图8）。结果表明，与对照细胞相比，含人IQGAP1-shRNA干扰载体的药物处理细胞的体外侵袭能力明显减弱，经统计学分析，差异具有显著性（见图10）。

序列表

<110> 山西医科大学

<120>一种特异性降低人IQGAP1基因表达的shRNA及其应用

<160>5

<170> PaUentIn Version 3.5

<210> 1

<211> 48

<212> RNA

<213> 人工序列

<223> 根据IQGAP1基因siRNA设计的shRNA序列

<400> 1

　 guuaugguug gaugaaauuc acucgaguga auuucaucca accauaac

<210> 2

<211> 21<212> RNA

<213> 人（Homo sapiens）

<223> IQGAP1靶基因序列

<400> 2

　guuaugguug gaugaaauuc a

<210> 3

<211> 48

<212> DNA

<213> 人工序列

<223> 编码IQGAP1基因shRNA的DNA序列

<400> 3

　gttatggttg gatgaaattc actcgagtga atttcatcca accataac

<210> 4

<211> 21

<212> RNA

<213> 人（Homo sapiens）

<223> shRNA剪切产物siRNA正义链

<400> 4

　guuaugguug gaugaaauuc a

<210> 5

<211> 21

<212> RNA

<213> 人（Homo sapiens）

<223> shRNA剪切产物siRNA反义链

<400> 5

ugaauuucau ccaaccauaa c

Claims

1.一种特异性降低人IQGAP1基因表达的shRNA，其特征在于，其碱基序列如SEQ ID NO.1所示，即

5’-GUUAUGGUUGGAUGAAAUUCACUCGAGUGAAUUUCAUCCAACCAUAAC-3’。

2.一种如权利要求1所述的特异性降低人IQGAP1基因表达的shRNA在制备治疗食管癌药物中的应用。