CN102507913A - 一种精确定量湖泊生态系统氮循环的方法 - Google Patents

Abstract

精确定量湖泊生态系统氮循环的方法，1)应用同位素配对方法，定量研究湖泊生态系统沉积物-水界面的氮素迁移转换；2)水-气界面氮素的释放通过密闭室-气相色谱法测定N₂O产生量来确定。从而精确定量水-气界面的氮素释放量；3)采用杜马斯法测定水生植物的生物量及植物体内氮素含量，确定水生植物对氮素的吸收量：4)采用MPN法测定生态系统中微生物的生物量，测定微生物在氮素转换过程中的作用及其对氮素的转化量，5)应用稳定性同位素技术测量水生动物对氮素的吸收同化，精确定量氮素的循环；即测量水生动物食物网及营养级结构，确定氮素在食物网中的迁移转化；上述过程均在同一模拟生态系统中进行。

Description

一种精确定量湖泊生态系统氮循环的方法

技术领域

本发明属于生态工程修复技术领域，具体涉及一种精确定量湖泊生态系统氮循环的方法。

背景技术

随着我国经济的快速发展与城乡建设的加快，沿河湖地区氮、磷、有机物等污染物的排放逐年增加，湖泊及入湖河道水环境的污染问题日趋严重，湖泊富营养化加剧。2010年中国环境状况公报显示，26个国控重点湖泊(水库)中，营养状态为重度富营养的1个，占3.8％，中度富营养的2个，占7.7％，轻度富营养的11个，占42.3％，其他均为中营养，占46.2％。主要污染指标是总氮和总磷。说明全国湖泊水体富营养化整体较为严重，形势严峻，湖泊富营养化的治理刻不容缓。

目前，湖泊科学家认为氮素是富营养化的关键影响因子之一，对氮素在湖泊中的生物地球化学循环过程进行全面完整的了解，有助于为湖泊系统生态修复提供理论基础，从而有效控制治理湖泊富营养化。研究表明，氮素经固氮作用输入湖泊生态系统后，在沉积物-水界面进行交换，并通过湖泊中的动物、植物、微生物等生物的同化吸收或选择性捕食，在食物链营养级中自下而上进行传递；最后氮素主要经以下三种途径输出湖泊系统：水生植物、浮游动物、底栖动物等将氮素吸收同化，经收割、捕捞后输出湖泊系统；氮素经反硝化以N₂、N₂O等气体形式离开湖泊系统；氮素经过沉积作用沉入底泥中固定下来。

随着人类活动的影响，氮循环越来越不平衡，由此引发的水体富营养化等环境问题迫使学者们对氮素在生态系统中输入、迁移、转化、循环和输出的规律进行大量的研究。例如，徐徽，张路等(湖泊科学，2009，太湖梅梁湾水土界面反硝化和厌氧氨氧化)利用15N同位素配对技术研究了湖泊底泥中硝化-反硝化脱氮过程；杨竹攸，李正魁等(湖泊科学，2009，固定化氮循环细菌修复城市湖泊水体脱氮效果及N₂O排放)利用静态箱法研究了湖泊水-气界面氮迁移特征；张晓姣，李正魁等(湖泊科学，2009，固定化土著氮循环细菌在城市湖泊水体净化中的应用)利用MPN法研究了氮循环细菌；申请号CN201010533685.8，一种大型底栖生物和沉水植物联合调控富营养化方法；申请号CN200910053309.6，在富营养化水域底泥层上构筑底栖微生物层的方法；申请号CN200680056888.4，利用各种植物、微生物的水质净化机能，综合改善富营养化污染水域的水质净化系统；申请号CN201010168350.0公开了富营养化海水网箱养殖区的综合生物修复方法。上述学者虽然对湖泊系统中氮素的迁移转化进行了大量的研究，但或只限于自然底泥生态系统，或只明确了水生植物吸收、鱼类觅食等单一过程中氮素的转化过程，均未全面包含水-沉积物界面、水-气界面、水生植物、微生物及鱼类等全方位氮循环。因此，当综合考虑整个湖泊生态系统时，各脱氮途径间的氮素输出、转化和定量关系难以确定，从而阻碍了湖泊生态系统生态修复的研究。

虽然国内外学者已对湖泊水体富营养化生态修复模拟进行了一定的研究，并研发了一系列技术，但是迄今为止，能够将原位湖泊沉积物、上覆水、沉水植物、氮循环菌等因素整合到一个系统内进行研究的实验技术方法较少。采用实验室人工模拟湖泊生态系统及野外实验，进行包括水-沉积物界面、水-气界面、沉水植物、脱氮微生物及鱼类等各方面，精确定量测量整个湖泊生态系统氮循环的方法还未见报道。因此，研究此类方法对富营养化湖泊水体治理具有积极意义。

针对愈加严重的湖泊富营养化问题及现有方法难以精确模拟不同湖泊生态修复手段中氮素的循环过程。本发明提供一种精确定量测量不同湖泊生态修复手段中氮素循环的方法，可以精确定量测量湖泊生态氮循环，从而可以促进原位湖泊生态修复机理的研究。采用该方法可以测量不同湖泊生态系统氮含量，研究氮素在水-沉积物界面的交换、水-气界面的释放及在水生植物、水生动物等构成的食物链中的迁移转化，从而精确定量氮素的循环过程，便于探讨生态修复机理。

发明内容

本发明目的是：提出一种精确定量湖泊生态系统氮循环的方法，为了精确测量湖泊生态系统中的氮循环，在湖泊生态系统中，尤其是采用不同方法分别定量沉积物-水界面氮素迁移转化、水-气界面氮释放、水生植物、微生物、碎屑、鱼类等生物对氮素的同化吸收。通过将各种方法整合在一个系统中，精确定量测量氮素在整个湖泊生态系统中的循环。

本发明技术方案是：精确定量湖泊生态系统氮循环的方法，1)应用同位素配对方法，通过测定水中溶解性同位素气体N₂含量，测量湖泊生态系统中耦合硝化-反硝化、非耦合硝化-反硝化及厌氧氨氧化过程，从而定量获得湖泊生态系统沉积物-水界面的氮素迁移转换指标；

2)水-气界面氮素的释放通过密闭室-气相色谱法测定N₂O产生量来确定。从而精确定量水-气界面的氮素释放量；

3)采用杜马斯法测定水生植物的生物量及植物体内氮素含量，确定水生植物对氮素的吸收量：将植物样品在900℃～1200℃高温下燃烧，燃烧过程中产生混合气体，其中的干扰成分被适当的吸收剂所吸收，混合气体中的氮氧化物被还原成分子氮，检测氮含量，从而明确水生植物对氮素的同化吸收量；

4)同时，采用MPN法测定生态系统中微生物的生物量，测定微生物在氮素转换过程中的作用及其对氮素的转化量，即利用待测微生物的特殊生理功能的选择性，来摆脱其他微生物类群的干扰，并通过该生理功能的表现来判断该类群微生物的存在和丰度，确定氮循环菌的生物量，从而明确微生物对氮的同化吸收；

5)应用稳定性同位素技术(δ¹³C和δ¹⁵N)测量水生动物对氮素的吸收同化，精确定量氮素的循环；即测量水生动物食物网及营养级结构，确定氮素在食物网中的迁移转化；

同位素配对技术是将¹⁵N指示剂加入到沉积物上覆水中，¹⁵N与上覆水中原有的¹⁴N混合并进入表层沉积物中，经过微生物的硝化、反硝化作用，生成²⁸N₂、²⁹N₂、³⁰N₂。通过膜接口质谱仪测定同位素反硝化产物测定反硝化速率。同位素配对技术可以明确耦合和非耦合硝化-反硝化过程的比例和速率，同时也能明确厌氧氨氧化脱氮速率，从而精确定量沉积物-水界面氮素的迁移转化过程。

由于空气中氮气本底值很高，直接测定空气中的氮气会造成很大误差，因此本发明中水-气界面氮素的释放通过密闭室-气相色谱法测定N₂O产生量来确定。从而精确定量水-气界面的氮素释放量。

考虑到生态系统的完整性，需对水生植物及水生动物等对氮素的同化吸收进行研究，本发明采用杜马斯法测定水生植物的生物量及植物体内氮素含量，确定水生植物对氮素的吸收量。将植物样品在900℃～1200℃高温下燃烧，燃烧过程中产生混合气体，其中的干扰成分被适当的吸收剂所吸收，混合气体中的氮氧化物被还原成分子氮，检测氮含量，从而明确水生植物对氮素的同化吸收量。同时，采用MPN法测定生态系统中微生物的生物量，测定微生物在氮素转换过程中的作用及其对氮素的转化量，即利用待测微生物的特殊生理功能的选择性，来摆脱其他微生物类群的干扰，并通过该生理功能的表现来判断该类群微生物的存在和丰度，确定氮循环菌的生物量，从而明确微生物对氮的同化吸收。此外，应用稳定性同位素技术(δ¹³C和δ¹⁵N)构建湖泊生态系统的食物网结构和营养级关系，研究鱼类等水生动物对氮素的吸收同化，精确定量氮素的循环。

本发明中上述过程均在同一模拟生态系统中进行。通过上述方法的整合，在同一装置中精确模拟湖泊生态系统中氮素在沉积物，水体、空气及水生动植物之间的迁移转化。

通过上述方法的整合，在同一装置中精确模拟湖泊生态系统中氮素在沉积物，水体、空气及水生动植物之间的迁移转化。

综合考虑所有氮素转化途径时，氮素变化理想方程式如下：

$\frac{\mathrm{dN}}{\mathrm{dt}}=\frac{{\mathrm{dN}}_{\mathrm{SW}}}{\mathrm{dt}}+\frac{{\mathrm{dN}}_{\mathrm{WG}}}{\mathrm{dt}}+\frac{d{N}_{\mathrm{WP}}}{\mathrm{dt}}+\frac{{\mathrm{dN}}_{\mathrm{WM}}}{\mathrm{dt}}+\frac{{\mathrm{dN}}_{\mathrm{WO}}}{\mathrm{dt}}$

dN表示水体中氮的变化量；dN_SW表示泥水界面氮的变化量；dN_WG表示水气界面氮的释放通量，dN_WP表示水生植物对氮素的吸收过程。dN_WM表示水体中微生物硝化-反硝化造成的氮量变化，dN_Wo表示水生动物对氮的同化量。理想状态下，假设氮的变化率为100％。

本发明有益效果：本发明提供了一种精确测定湖泊生态系统氮循环的方法，综合了氮素在沉积物、水生植物、微生物、底栖动物、空气等迁移转化的循环过程。本发明提供的方法可在一个生态系统中，测定氮素循环过程，并可对氮素在整个生态系统中的迁移转化定量化。本方法涉及沉积物-水界面、水-气界面、水生植物、底栖物等对氮素循环的影响，能完整的模拟湖泊氮素循环过程，为生态修复、降低营养盐浓度提供新的途径。

本发明方法提供了湖泊生态系统不同界面及水体的氮素研究方法，既可考察单一界面，单一因素中氮素的迁移转化，也可综合考察氮素在整个湖泊系统中的循环过程。同时也可适用于考察不同生态修复手段对氮素循环的影响。

附图说明

图1实施例1总反硝化速率图

图2实施例1非耦合硝化反硝化速率图

图3实施例1耦合硝化反硝化速率图

图4实施例1氧化亚氮排放通量图

图5实施例2总反硝化速率图

图6实施例2非耦合硝化反硝化速率图

图7实施例2耦合硝化反硝化速率图

图8实施例2氧化亚氮排放通量图

图9实施例3总反硝化速率图

图10实施例3非耦合硝化反硝化速率图

图11实施例3耦合硝化反硝化速率图

图12实施例3氧化亚氮排放通量图

图13、图14、图15、图16分别为实施例4总氮浓度、氨氮浓度、硝氮浓度、亚硝氮浓度随时间变化趋势图

图17、图18分别为实施例4pH、D0随时间变化趋势图

图19实施例4氧化亚氮排放通量图

图20实施例4总反硝化速率图

图21实施例5总反硝化速率图

图22实施例5非耦合硝化反硝化速率图

图23实施例5耦合硝化反硝化速率图

图24实施例5氧化亚氮排放通量图

图25实施例6氧化亚氮排放通量图

图26实施例6总反硝化速率图

图27、图28、图29分别为实施例6总氮浓度、硝氮浓度、氨氮浓度随时间变化趋势图

图30实施例6反硝化细菌数量上随时间变化图

具体实施方式

下面通过具体实施例，对本发明的方法进一步说明；下述实施例是说明性的，不是限定性的。

1.同位素配对技术测定反硝化量，将适量¹⁵N标记的指示剂添加到上覆水中，经一段时间的密闭培养，采集水样，运用同位素质谱仪测定水样中的溶解性同位素N₂，确定反硝化通量，从而定量沉积物-水界面的氮素迁移转化量。

2.静态箱-气相色谱法测定氮素释放量，在湖泊系统上部设置气体收集室，密闭培养，通过真空瓶收集气体，经气相色谱测定N₂O的含量定量水-气界面的氮素释放量。

3.杜马斯法测定水生植物体内氮素含量。采集植物样品，运用蛋白质分析仪测定植物体内氮素含量，定量水生植物对氮素的同化吸收。

4.MPN法测定微生物生物量。分别配制氮循环细菌的选择培养基，接种水样进行培养，根据不同的指示剂反应各种氮循环菌(氨化细菌、亚硝化细菌、硝化细菌、反硝化细菌)，查MPN表确定细菌的数量，确定氮循环菌的生物量，检测对应于不同MPN条件下，水体中被转化的氮含量。

5.稳定性同位素技术(δ¹³C和δ¹⁵N)研究鱼类等生物的食物网及营养级结构，确定氮素在食物网中的迁移转化。

实施例1

实验室小试，室内模拟太湖梅梁湾氮素在沉积物-水界面、水-气界面、水生植物、脱氮微生物等之间的循环过程。梅梁湾位于太湖北部，是太湖中水质最差的湖区，2005年～2008年水质总体为劣V类，属于富营养化较严重的藻型湖区。原位采集梅梁湾柱状底泥、上覆水及伊乐藻。

具体实验步骤如下：

(1)将取自原位的湖泊底泥，从试验柱底部按原貌装填入柱底部，底泥厚度为20cm，调整至合适高度外侧包裹铝箔纸使底泥侧面呈遮光状态；添加原位采集的上覆水进行培养。

(2)选取一定生物量长势茁壮的伊乐藻，每株沉水植物长度约10cm，均匀种植在底泥上。培养一段时间，待水生植物生长茁壮进行模拟氮循环过程实验；

(3)将甲基丙烯酸β-羟乙酯、马来酰胺酸和去离子水按一定比例混合均匀，经⁶⁰Co-γ射线低温辐射后形成多孔载体，用制备的载体富集四种氮循环菌(氨氧化细菌、亚硝化细菌、硝化细菌、反硝化细菌)，使氮循环菌固定化。将富集四种氮循环菌的固定化载体以细孔网袋包裹的形式投放至水体中，向水体和沉积物中释放氮循环菌；

(4)向实验柱中添加同位素指示剂15NO₃ ^-，密闭培养9h后采集水样，用膜接口质谱仪测定同位素氮气28N₂、29N₂、30N₂，经计算得出沉积物-水界面反硝化通量；

(5)在实验柱水面上部设置，气体收集室，密闭培养，用双峰针和真空瓶收集气体，用气相色谱测定N₂O浓度，得出N₂O的释放通量；

(6)采集试验柱内伊乐藻样品，将植物样品粉碎，用快速定氮仪测定伊乐藻样品中的总氮含量；

(7)分别配置氮循环菌(亚硝化细菌、硝化细菌、反硝化细菌)的培养基，灭菌处理，采集水样接种至各培养基上，在28℃恒温培养14天，检查培养情况，对照MPN表，确定细菌数量。

试验柱设置如下：

1试验柱(沉积物)步骤：如上述(1)(4)(5)(6)(7)

2试验柱(沉积物+脱氮微生物)步骤：如上述(1)(3)(4)(5)(6)(7)

3试验柱(沉积物+伊乐藻)步骤：如上述(1)(2)(4)(5)(6)(7)

4试验柱(沉积物+脱氮微生物+伊乐藻)步骤：如上述(1)(2)(3)(4)(5)

(6)(7)

各试验柱沉积物-水界面总反硝化速率结果如图1所示，非耦合硝化反硝化速率如图2所示，耦合硝化反硝化速率如图3所示，水-气界面氧化亚氮释放通量如图4所示，沉水植物伊乐藻体内含氮量为2.56％。水体中氮循环细菌数量如表1所示。

表1氮循环细菌数量

由上述结果经氮素变化理想方程式计算得水体中氮素变化量，水生植物吸收转化17％，沉积物-水界面迁移转化20％，水-气界面释放23％，微生物转化40％。结果表明，通过上述方法，能够定量湖泊生态系统沉积物-水界面、水-气界面、水生植物、微生物等的氮素迁移转换。

实施例2

在太湖贡湖湾进行氮循环研究，贡湖位于太湖东北部，曾是太湖水质较好的区域之一，近年来，随着流域内经济的快速发展和人为活动的影响，入湖氮、磷营养负荷居高不下，水污染加剧，水质不断恶化。原位采集贡湖柱状底泥、上覆水及金鱼藻，室内模拟太湖贡湖湾氮素在沉积物-水界面、水-气界面、水生植物、脱氮微生物等之间的循环过程。

具体实验步骤如下：

(1)将取自原位的湖泊底泥，从试验柱底部按原貌装填入柱底部，底泥厚度为20cm，调整至合适高度外侧包裹铝箔纸使底泥侧面呈遮光状态；添加原位采集的上覆水进行培养。

(2)选取一定生物量长势茁壮的金鱼藻，每株沉水植物长度约10cm，均匀种植在底泥上。培养一段时间，待水生植物生长茁壮进行模拟氮循环过程实验；

(3)将甲基丙烯酸β-羟乙酯、马来酰胺酸和去离子水按一定比例混合均匀，经⁶⁰Co-γ射线低温辐射后形成多孔载体，用制备的载体富集四种氮循环菌(氨氧化细菌、亚硝化细菌、硝化细菌、反硝化细菌)，使氮循环菌固定化。将富集四种氮循环菌的固定化载体以细孔网袋包裹的形式投放至水体中，向水体和沉积物中释放氮循环菌；

(4)向实验柱中添加同位素指示剂¹⁵NO₃ ^-，密闭培养9h后采集水样，用膜接口质谱仪测定同位素氮气²⁸N₂、²⁹N₂、³⁰N₂，经计算得出沉积物-水界面反硝化通量；

(5)在实验柱水面上部设置，气体收集室，密闭培养，用双峰针和真空瓶收集气体，用气相色谱测定N₂O浓度，得出N₂O的释放通量；

(6)采集试验柱内金鱼藻样品，将植物样品粉碎，用快速定氮仪测定金鱼藻样品中的总氮含量；

(7)配置反硝化细菌的培养基，灭菌处理，采集水样接种至各培养基上，在25℃恒温培养14天，检查培养情况，对照MPN表，确定反硝化菌数量。

试验柱设置如下：

A试验柱(沉积物)步骤：(1)(4)(5)(6)(7)

B试验柱(沉积物+脱氮微生物+金鱼藻)步骤：(1)(2)(3)(4)(5)(6)(7)

各试验柱沉积物-水界面总反硝化速率结果如图5所示，非耦合硝化反硝化速率如图6所示，耦合硝化反硝化速率如图7所示，水-气界面氧化亚氮释放通量如图8所示，沉水植物金鱼藻体内含氮量为2.82％。沉水植物组A反硝化细菌数量为2.9×10²，植物+微生物组B反硝化细菌数量为5.1×10⁵。由上述结果经氮素变化理想方程式计算得水体中氮素变化量，水生植物吸收转化18％，沉积物-水界面迁移转化22％，水-气界面释放23％，微生物转化37％，结果表明，通过上述方法，能够定量湖泊生态系统沉积物-水界面、水-气界面、水生植物、微生物等的氮素迁移转换。

实施例3

以太湖金墅湾入湖河道进行氮循环研究，该河水流缓慢，周边有农村生活污水排放、农田尾水以及企业排污，水体浊度较大。原位采集河道柱状底泥、上覆水及轮叶黑藻，室内模拟该河流氮素在沉积物-水界面、水-气界面、水生植物、脱氮微生物等之间的循环过程。

具体实验步骤如下：

(1)将取自原位的河道底泥，从试验柱底部按原貌装填入柱底部，底泥厚度为20cm，调整至合适高度外侧包裹铝箔纸使底泥侧面呈遮光状态；添加原位采集的上覆水进行培养。

(2)选取一定生物量长势茁壮的轮叶黑藻，每株沉水植物长度约10cm，均匀种植在底泥上。培养一段时间，待水生植物生长茁壮进行模拟氮循环过程实验；

(3)将甲基丙烯酸β-羟乙酯、马来酰胺酸和去离子水按一定比例混合均匀，经⁶⁰Co-γ射线低温辐射后形成多孔载体，用制备的载体富集四种氮循环菌(氨氧化细菌、亚硝化细菌、硝化细菌、反硝化细菌)，使氮循环菌固定化。将富集四种氮循环菌的固定化载体以细孔网袋包裹的形式投放至水体中，向水体和沉积物中释放氮循环菌；

(4)向实验柱中添加同位素指示剂¹⁵NO₃ ^-，密闭培养12h后采集水样，用膜接口质谱仪测定同位素氮气²⁸N₂、²⁹N₂、³⁰N₂，经计算得出沉积物-水界面反硝化通量；

(5)在实验柱水面上部设置，气体收集室，密闭培养，用双峰针和真空瓶收集气体，用气相色谱测定N₂O浓度，得出N₂O的释放通量；

(6)采集试验柱内轮叶黑藻样品，将植物样品粉碎，用快速定氮仪测定轮叶黑藻样品中的总氮含量；

(7)配置反硝化细菌的培养基，灭菌处理，采集水样接种至各培养基上，在25℃恒温培养14天，检查培养情况，对照MPN表，确定反硝化菌数量。

试验柱设置如下：

A试验柱(沉积物)步骤：(1)(4)(5)(6)(7)

B试验柱(沉积物+脱氮微生物+轮叶黑藻)步骤：(1)(2)(3)(4)(5)(6)(7)

各试验柱沉积物-水界面总反硝化速率结果如图9所示，非耦合硝化反硝化速率如图10所示，耦合硝化反硝化速率如图11所示，水-气界面氧化亚氮释放通量如图12所示，沉水植物轮叶黑藻体内含氮量为3.09％。沉水植物组A反硝化细菌数量为3.5×10²，植物+微生物组B反硝化细菌数量为5.7×10⁵。由上述结果经氮素变化理想方程式计算得水体中氮素变化量，水生植物吸收转化15％，沉积物-水界面迁移转化27％，水-气界面释放24％，微生物吸收同化34％，结果表明，通过上述方法，能够定量湖泊生态系统沉积物-水界面、水-气界面、水生植物、微生物等的氮素迁移转换。

实施例4

室外实验(围隔试验)，在太湖梅梁湾水域进行原位围隔试验。试验分为四组：A组为空白对照，B组添加固定化脱氮微生物，C组种植伊乐藻，D组为伊乐藻+固定脱氮微生物。具体实验如下：

(1)试验中，首先用篷布、油布、泡沫板、扁带等制作围隔，在水源地选择合适位置，搭建试验围隔，围隔尺寸为1m×1m。

(2)在围隔内种植沉水植物伊乐藻，同时用网兜包覆附载有氮循环菌的固定化载体，并将其投加入围隔中。在围隔内放养几尾生长状况良好的鲫鱼。

(3)围隔区域内各因素进行观察分析，定期检测水体中的pH、DO、TN、NH₄ ⁺、NO₃ ^-、NO₂ ^-等水质参数。

(4)向围隔中添加同位素指示剂¹⁵NO₃ ^-，将围隔密闭24h后，采集水样，用膜接口质谱仪测定同位素氮气²⁸N₂、²⁹N₂、³⁰N₂，经计算得出沉积物-水界面反硝化速率。

(5)在围隔内设置静态箱，将橡胶浮筒裹在箱体底部，使箱体漂浮在水面。箱体顶部设采气口和温度计插口，使用双峰针和真空瓶从采气口采集气体，然后使用气相色谱测定氧化亚氮浓度。

(6)采集围隔内水生植物伊乐藻，将植物样品粉碎，用快速定氮仪测定伊乐藻样品中的总氮含量；

(7)捕捞放养的鱼，取其肌肉样品，经预处理后，用同位素比例质谱仪测定样品的¹⁵N百分含量。

(8)配置反硝化细菌的培养基，灭菌处理，采集水样接种至培养基上，在25℃恒温培养14天。检查培养结果，对照MPN表读数，确定反硝化细菌的数量。

水体中TN、NH₄ ⁺、NO₃ ^-、NO₂ ^-、pH、、DO、等水质指标的实验结果如图13、图14、图15、图16、图17、图18所示；水-气界面氧化亚氮释放通量结果如图19所示。沉积物-水总反硝化速率结果如图20所示，沉水植物伊乐藻体内含氮量为2.22％；水生动物鱼的平均氮稳定同位素比值为7.57‰，其可能摄食饵料的δ¹⁵N变化范围为4.01‰～8.12‰。空白组A反硝化细菌数量5.4×10²～2.7×10³，伊乐藻+固定化微生物组D反硝化细菌数量为3.9×10⁵～9.1×10⁵。由上述结果经氮素变化理想方程式计算得水体中氮素变化量，水生植物吸收转化16％，沉积物-水界面迁移转化22％，水-气界面释放20％，鱼类吸收同化7％，微生物转化35％。结果表明，通过上述方法，能够定量湖泊生态系统沉积物-水界面、水-气界面、水生植物、微生物鱼类等的氮素迁移转换。

实施例5

室外实验(围隔试验)，在太湖贡湖水域进行原位围隔试验，此水域的特点是风浪大、湖流快等。试验分为四组：A组为空白对照，B组添加固定化脱氮微生物，C组种植伊乐藻，D组为伊乐藻+固定脱氮微生物。具体实验如下：

(1)试验中，首先用篷布、油布、泡沫板、扁带等制作围隔，在贡湖水域选择合适位置，搭建试验围隔。围隔尺寸为1m×1m。

(2)在围隔内种植沉水植物伊乐藻，同时用网兜包覆附载有氮循环菌的固定化载体，并将其投加入围隔中。在围隔内放养几尾生长状况良好的鲫鱼。

(3)围隔区域内各因素进行观察分析，定期检测水体中的pH、DO、TN、NH₄ ⁺、NO₃ ^-、NO₂ ^-等水质参数。

(4)向围隔中添加同位素指示剂¹⁵NO₃ ^-，将围隔密闭24h后，采集水样，用膜接口质谱仪测定同位素氮气²⁸N₂、²⁹N₂、³⁰N₂，经计算得出沉积物-水界面反硝化速率。

(5)在围隔内设置静态箱，将橡胶浮筒裹在箱体底部，使箱体漂浮在水面。箱体顶部设采气口和温度计插口，使用双峰针和真空瓶从采气口采集气体，然后使用气相色谱测定氧化亚氮浓度。

(6)采集围隔内水生植物伊乐藻，将植物样品粉碎，用快速定氮仪测定伊乐藻样品中的总氮含量；

(7)捕捞放养的鱼，取其肌肉样品，经预处理后，用同位素比例质谱仪测定样品的15N百分含量。

(8)配置反硝化细菌的培养基，灭菌处理，采集水样接种至培养基上，在25℃恒温培养14天。检查培养结果，对照MPN表读数，确定反硝化细菌的数量。

氧化亚氮排放通量结果如图21所示。沉积物-水总反硝化速率结果如图22所示，非耦合硝化反硝化速率结果如图23，耦合硝化反硝化速率结果如图24。沉水植物伊乐藻体内含氮量为2.34％；水生动物鱼的平均氮稳定同位素比值为7.09‰，其可能摄食饵料的δ¹⁵N变化范围为3.89‰～7.95‰。空白组A反硝化细菌数量6.4×10²～9.7×10²，伊乐藻+固定化微生物组D反硝化细菌数量为3.7×10⁵～8.5×10⁵。由上述结果经氮素变化理想方程式计算得水体中氮素变化量，水生植物吸收转化19％，沉积物-水界面迁移转化24％，水-气界面释放19％，鱼类吸收同化5％，微生物转化33％。结果表明，通过上述方法，能够定量湖泊生态系统沉积物-水界面、水-气界面、水生植物、微生物鱼类等的氮素迁移转换。

实施例6

以太湖武进港红旗河入湖河道进行氮循环原位实验研究。具体实验步骤如下：

(1)首先用篷布、油布、泡沫板、扁带等制作围隔，在红旗河水域选择合适位置，搭建试验围隔。围隔尺寸为1m×0.5m。

(2)在围隔内种植沉水植物伊乐藻，同时用网兜包覆附载有氮循环菌的固定化载体，并将其投加入围隔中。在围隔内放养几尾生长状况良好的鲫鱼。

(3)向围隔中添加同位素指示剂¹⁵NO₃ ^-，将围隔密闭24h后，采集水样，用膜接口质谱仪测定同位素氮气²⁸N₂、²⁹N₂、³⁰N₂，经计算得出沉积物-水界面反硝化速率。

(4)在围隔内设置静态箱，将橡胶浮筒裹在箱体底部，使箱体漂浮在水面。箱体顶部设采气口和温度计插口，使用双峰针和真空瓶从采气口采集气体，然后使用气相色谱测定氧化亚氮浓度。

(5)采集围隔内水生植物伊乐藻，将植物样品粉碎，用快速定氮仪测定伊乐藻样品中的总氮含量；

(6)捕捞放养的鱼，取其肌肉样品，经预处理后，用同位素比质谱仪测定样品的15N百分含量。

(7)围隔区域内各因素进行观察分析，定期检测水体中的pH、DO、TN、NH₄ ⁺、NO₃ ^-、NO₂ ^-等水质参数。

(8)配置反硝化细菌的培养基，灭菌处理，采集水样接种至培养基上，在25℃恒温培养14天。检查培养结果，对照MPN表读数，确定反硝化细菌的数量。

氧化亚氮排放通量实验结果如图25。沉积物-水界面总反硝化速率结果如图26所示。水生动物鱼的平均氮稳定同位素比值为6.98‰，其可能摄食饵料的δ¹⁵N变化范围为3.45‰～7.59‰。水质参数TN、NO₃ ^-、NH₄ ⁺实验结果如图27、图28、图29所示。MPN法测定围隔内外水体中反硝化细菌数量的结果如图30所示。由上述结果经氮素变化理想方程式计算得水体中氮素变化量，水生植物吸收转化17％，沉积物-水界面迁移转化24％，水-气界面释放16％，鱼类吸收同化8％，微生物吸收同化35％。结果表明，通过上述方法，能够定量湖泊生态系统沉积物-水界面、水-气界面、水生植物、微生物、鱼类等的氮素迁移转换。

Claims (4)

1.精确定量湖泊生态系统氮循环的方法，其特征是步骤如下：

1)应用同位素配对方法，通过测定水中溶解性同位素气体N₂含量，测量湖泊生态系统中耦合硝化-反硝化、非耦合硝化-反硝化及厌氧氨氧化过程，从而定量获得湖泊生态系统沉积物-水界面的氮素迁移转换指标；

2)水-气界面氮素的释放通过密闭室-气相色谱法测定N₂0产生量来确定。从而精确定量水-气界面的氮素释放量；

3)采用杜马斯法测定水生植物的生物量及植物体内氮素含量，确定水生植物对氮素的吸收量：将植物样品在900℃～1200℃高温下燃烧，燃烧过程中产生混合气体，其中的干扰成分被适当的吸收剂所吸收，混合气体中的氮氧化物被还原成分子氮，检测氮含量，从而明确水生植物对氮素的同化吸收量；

4)同时，采用MPN法测定生态系统中微生物的生物量，测定微生物在氮素转换过程中的作用及其对氮素的转化量，即利用待测微生物的特殊生理功能的选择性，来摆脱其他微生物类群的干扰，并通过该生理功能的表现来判断该类群微生物的存在和丰度，确定氮循环菌的生物量，从而明确微生物对氮的同化吸收；

5)应用稳定性同位素技术(δ¹³C和δ¹⁵N)测量水生动物对氮素的吸收同化，精确定量氮素的循环；即测量水生动物食物网及营养级结构，确定氮素在食物网中的迁移转化；

上述过程均在同一模拟生态系统中进行，即在同一装置中精确模拟湖泊生态系统中氮素在沉积物，水体、空气及水生动植物之间的迁移转化；

综合考虑所有氮素转化途径时，氮素变化方程式如下：

$\frac{\mathrm{dN}}{\mathrm{dt}}=\frac{{\mathrm{dN}}_{\mathrm{SW}}}{\mathrm{dt}}+\frac{{\mathrm{dN}}_{\mathrm{WG}}}{\mathrm{dt}}+\frac{d{N}_{\mathrm{WP}}}{\mathrm{dt}}+\frac{{\mathrm{dN}}_{\mathrm{WM}}}{\mathrm{dt}}+\frac{{\mathrm{dN}}_{\mathrm{WO}}}{\mathrm{dt}}$

dN表示水体中氮的变化量；dN_SW表示泥水界面氮的变化量；dN_WG表示水气界面氮的释放通量，dN_WP表示水生植物对氮素的吸收过程；dN_WM表示水体中微生物硝化-反硝化造成的氮量变化，dN_WO表示水生动物对氮的同化量。

2.根据权利要求1所述的精确定量湖泊生态系统氮循环的方法，其特征是步骤1)中所述同位素配对技术测定测量湖泊生态系统中耦合硝化-反硝化，将适量¹⁵N标记的指示剂添加到上覆水中，经一段时间的密闭培养，采集水样，运用同位素质谱仪测定水样中的溶解性同位素N₂，确定反硝化通量，从而定量沉积物-水界面的氮素迁移转化量。

3.根据权利要求1所述的精确定量湖泊生态系统氮循环的方法，其特征是步骤2)静态箱-气相色谱法测定氮素释放量，在湖泊系统上部设置气体收集室，密闭培养，通过真空瓶收集气体，经气相色谱测定N₂O的含量定量水-气界面的氮素释放量。

4.根据权利要求1所述的精确定量湖泊生态系统氮循环的方法，其特征是步骤4)MPN法测定微生物生物量：分别配制氮循环细菌的选择培养基，接种水样进行培养，根据不同的指示剂反应各种氮循环菌(氨化细菌、亚硝化细菌、硝化细菌、反硝化细菌)，查MPN表确定细菌的数量，确定氮循环菌的生物量，检测对应于不同MPN条件下，水体中被转化的氮含量。

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