CN102492670A - 磷脂酰乙醇胺基超氧化物歧化酶组合物及其制备方法 - Google Patents

Abstract

本发明涉及如式(I)所示的磷脂酰乙醇胺基超氧化物歧化酶组合物及其制备方法，超氧化物歧化酶(SOD)的一个以上的氨基被磷脂酰乙醇胺残基取代，式中n为取代基个数，n为1～4的整数，n的平均值为1.5～2.4，式中的R为C₁₁，C₁₃，C₁₅，C₁₇的烷基。如式(I)所示的组合物由25～40摩尔％的n＝1的磷脂酰乙醇胺基超氧化物歧化酶，35～50摩尔％的n＝2的磷脂酰乙醇胺基超氧化物歧化酶，10～20摩尔％的n＝3的磷脂酰乙醇胺基超氧化物歧化酶，5～15摩尔％的n＝4的磷脂酰乙醇胺基超氧化物歧化酶组成。经过磷脂酰乙醇胺修饰后的SOD显示出稳定性增加、活性提高等优点。

Description

磷脂酰乙醇胺基超氧化物歧化酶组合物及其制备方法

发明领域：

本发明涉及磷脂酰乙醇胺基超氧化物歧化酶组合物及其制备方法。

背景技术：

超氧化物歧化酶Orgotein(Superoxide Dismutase，SOD)，别名肝蛋白、奥谷蛋白，简称：SOD，是1938年Marn等人首次从牛红血球中分离得到的。SOD是生物体内重要的抗氧化酶，广泛分布于各种生物体内，如动物，植物，微生物等。SOD具有特殊的生理活性，是生物体内清除自由基的首要物质。SOD在生物体内的水平高低意味着衰老与死亡的直观指标；现已证实，由氧自由基引发的疾病多达60多种。它可对抗与阻断因氧自由基对细胞造成的损害，并及时修复受损细胞，复原自由基造成的对细胞伤害。由于现代生活压力，环境污染，各种辐射和超量运动都会造成氧自由基大量形成；因此，生物抗氧化机制中SOD的地位越来越重要。

SOD具有非均化分解作为富于反应性的游离活性氧的超氧化物阴离子自由基的活性。期待可以将SOD用于抗风湿药物、自身免疫性疾病治疗剂、心肌梗塞治疗剂和脏器移植，以及用于除去脑梗塞后的抗血栓剂使用时在生物体内产生的自由基，还可期待将其用于各种炎症等(参照日本专利第3070980号公报)。

SOD体内半衰期短(6-10min)、稳定性差、难以进入细胞内、与细胞膜亲和力小、具有抗原性，直接药用存在疗效差和有一定的副作用等缺点，有必要进行结构修饰和改造。对SOD的分子修饰包括化学修饰和酶切修饰。目前国内外大多采用一些不具有免疫原性的水溶性高分子化合物对SOD的非活性部位的氨基酸残基进行修饰。修饰剂主要有聚乙二醇(PEG)、右旋糖酐、聚蔗糖、药用淀粉、粘多糖等。经过不同手段修饰后的SOD保留了天然酶活性，而且显示出体内半衰期延长、稳定性增加、抗原性降低、毒副作用降低等优点(Shimizu T，Iwanaga M，Yasunaga A.Protective role of glutathione synthesis on radiation-induceDNA damage in rabbit brain[J].Cell-Mol-Neurobiol，1998，18(3)：299-310)。

磷脂是膜的主要组成成分，对膜的结构完整、膜的离子传输和分子识别等功能的正常发挥以及依赖于磷脂的蛋白质系统的活性等都起着决定作用。人体所有细胞中都含有磷脂，它是维持生命活动的基础物质。磷脂对活化细胞，维持新陈代谢，基础代谢及荷尔蒙的均衡分泌，增强人体的免疫力和再生力，都能发挥重大的作用。概括的讲磷脂的基本功用是：增强脑力，安定神经，平衡内分泌，提高免疫力和再生力，解毒利尿，清洁血液，健美肌肤，保持年轻，延缓衰老。

磷脂酰乙醇胺(PE，phosphatidyl ethanolamine)，又名脑磷脂，是磷脂的一种，由甘油、脂肪酸、磷酸和乙醇胺组成的一种磷脂。存在于脑、神经、大豆等中。新鲜制品是无色固体，空气中易变为红棕色。有吸湿性。不溶于水和丙酮，微溶于乙醇，溶于氯仿和乙醚。由于其含有极性部分和非极性部分，极适宜在体内降解，无毒性，无免疫原性。作为载体有降低药物毒性、提高疗效、减少副作用和药物剂量的作用。也可用作抗氧剂。

本发明使用磷脂酰乙醇胺对SOD进行结构修饰，以提高SOD的稳定性和活性，增强SOD的细胞亲和力，降低抗原性和毒副作用，为SOD的临床应用提供支持。

发明内容：

本发明的磷脂酰乙醇胺基超氧化物歧化酶(PE-SOD)组合物的结构如下式(I)所示，

特征在于超氧化物歧化酶(以下称为SOD)的一个以上的氨基被磷脂酰乙醇胺残基取代，式中的R为C₁₁，C₁₃，C₁₅，C₁₇的烷基。

此外，本发明还涉及PE-SOD组合物的制备方法，式(1)的化合物可以按照以下反应式概括的方法进行：

以下，按照反应式说明本发明的制备方法。

(1)乙二醇在二氯甲烷中与对硝基苯基氯甲酸酯以及吡啶反应，生成化合物(II)，乙二醇∶对硝基苯基氯甲酸酯∶吡啶的摩尔比为1∶2～4∶4～8，反应温度为0～30℃，反应时间3～5小时。

(2)惰性气体保护条件下，化合物(III)与化合物(II)以氯仿为溶剂在三乙胺的作用下生成化合物(IV)，化合物(III)∶三乙胺∶化合物(II)的摩尔比为1∶20～30∶8～12，反应温度为20～40℃，反应时间12～24h。

(3)将SOD溶于适当的溶剂获得SOD溶液，搅拌的同时向该溶液中添加磷脂酰乙醇胺衍生物(IV)，生成组合物(I)(PE-SOD)。

此时，通过调节添加速度、搅拌速度、反应温度、反应时间等各种反应条件，能够以更高的收率获得本发明的PE-SOD组合物。

在SOD溶液中添加磷脂酰乙醇胺衍生物溶液的速度只要是磷脂酰乙醇胺衍生物可在短时间内分散于反应体系内的搅拌速度即可，通常较好为50～500rpm，特好为100～300rpm。

由于温度越高每一分子的SOD中的磷脂酰乙醇胺衍生物的导入数越多，所以反应温度的上限优选30℃。反应温度的下限只要是反应液不会冻结即可。反应温度优选0～30℃。反应时间优选0.5～72小时，更优选2～24小时。

为了以更好的收率和更佳的品质制备本发明的PE-SOD组合物，对于包含于SOD溶液中的来自人的SOD的浓度、磷脂酰乙醇胺衍生物溶液的添加方法等，最好设定更严密的条件。

具体来讲，最好以100～2000倍量的溶剂稀释来自人的SOD，调制SOD溶液后，在该溶液加入20～100倍量的有机溶剂稀释磷脂酰乙醇胺衍生物而得到的磷脂酰乙醇胺衍生物溶液。

作为溶解SOD的溶剂，可列举水或水和有机溶剂的混合溶剂，优选水和有机溶剂的混合溶剂。通过使用该混合溶剂，在添加磷脂酰乙醇胺衍生物溶液时可使反应体系均一化，防止沉淀物的产生。此外，最好使硼酸等溶于这些溶剂中而使其具备缓冲能力。

作为水，优选精制水、离子交换水、蒸馏水或注射用水(以下它们总称为“水”)。作为有机溶剂，可列举异丙醇、N，N-二甲基甲酰胺、N-甲基吡咯烷酮、N，N-二甲基乙酰胺、环丁砜、二甲亚砜、丙酮、1，4-二噁烷及甲醇等，优选异丙醇。

作为溶解磷脂酰乙醇胺衍生物有机溶剂，可选用溶解SOD的溶剂中的有机溶剂，优选异丙醇。

(4)精制方法，将步骤(3)所得磷脂酰乙醇胺化超氧化物歧化酶组合物吸附于离子交换树脂后，用溶液A洗脱除去未反应的SOD，再用溶液B洗脱磷脂酰乙醇胺基超氧化物歧化酶组合物，浓缩洗脱液既得所需组合物(I)。

精制工序可通过填充有离子交换树脂的柱中加入前述未精制PE-SOD使其吸附后，用含缓冲液的溶剂使作为目标的PE-SOD组合物溶解析出的方法实施，前述缓冲液含无机盐。

作为离子交换树脂，可以任意使用阴离子交换树脂或阳离子交换树脂。

作为洗脱溶液所含的缓冲液，只要是无机盐的具有缓冲能力的溶液即可，无特别限定。但是，采用磷酸系缓冲液时，由于PE-SOD不易溶解，所以在使用前要充分确认其溶解性。从保持精制时的PE-SOD的稳定性考虑，缓冲液的pH优选6～9。

作为无机盐，可列举氯化钠、硫酸铵等。它们可单独使用，也可作为任意比例的混合物使用。

此外，为了提高PE-SOD的溶解性，用于洗脱的溶液最好含有有机溶剂。

有机溶剂，可列举异丙醇、N，N-二甲基甲酰胺、N-甲基吡咯烷酮、N，N-二甲基乙酰胺、环丁砜、二甲亚砜、丙酮、1，4-二噁烷及甲醇等。其中，从PE-SOD的溶解性良好，精制效率高的角度考虑，优选甲醇。

该溶剂中所含的有机溶剂量以不会使PE-SOD不溶解，又不会妨碍PE-SOD对离子交换树脂的吸附为佳。相对于溶液的总容量，有机溶剂的比例优选10～80体积％，更优选20～70体积％，最优选40～60体积％。

通过改变所含缓冲液的无机盐的浓度，可使目标PE-SOD组合物被洗脱下来。

具体来讲，可通过下述步骤实施，即，将未精制PE-SOD填入柱后，使未吸附的物质被洗脱除去。然后，采用下述溶液A洗脱除去未反应的SOD，再用下述溶液B使本发明的PE-SOD组合物析出。

溶液A由无机盐浓度为5～100mmol，pH6～9的缓冲液和有机溶剂组成，缓冲液为20～90体积％，有机溶剂为10～80体积％；溶液B由无机盐浓度为150～400mmol，pH6～9的缓冲液和有机溶剂组成，缓冲液为20～90体积％，有机溶剂为10～80体积％。

利用前述制备方法获得的含有PE-SOD组合物的部分可以通过超滤以除去该部分所含的无机盐及有机溶剂等。通过超滤，可获得含PE-SOD组合物及PE-SOD组合物的水性溶液。还可以对该水性溶液进行浓缩，由此精制PE-SOD组合物。由于PE-SOD组合物的制剂化通常情况下采用水性溶液实施，所以最好以水性溶液的形式获得。该水性溶液中的PE-SOD组合物的浓度优选0.1～300mg/mL，更优选1～50mg/mL。

具体实施方式

本发明所用的SOD可以是从牛血或猪血中提取纯化而得，也可以是采用基因表达而得到的重组人SOD。以下结合实施例更详细地说明本发明，但是本发明并不受这些记载的任何限定。

实施例1

乙二醇二对硝基苯氧羰基酯(化合物(II)的合成)

取8g乙二醇用500ml二氯甲烷溶解，于0℃下滴加对硝基苯基氯甲酸酯100g，吡啶79g(乙二醇∶对硝基苯基氯甲酸酯∶吡啶，摩尔比1∶4∶8)。反应升至室温，在氮气保护下反应3小时。加入200ml水，分液，有机相用稀盐酸洗涤至pH2，水洗至中性，有机相加入无水硫酸钠干燥。过滤，滤液浓缩得到固体。乙酸乙酯-石油醚重结晶得到42g白色固体，收率82％。

实施例2

二硬脂酰磷脂酰乙醇胺基甲酰基乙二醇基羰基对硝基苯氧基酯(化合物(IV)，R为C₁₇的烷基)的合成

将0.5g二硬脂酰磷脂酰乙醇胺溶于氯仿中，配成50mg/ml的溶液。向溶液中加入2.9ml三乙胺。将2.8g化合物(II)溶于15ml氯仿中，滴加至上述混合物中，氩气保护下，室温搅拌过夜。蒸干溶剂，残留物柱层析纯化，干燥得化合物(IV)0.46g，收率69％。

实施例3

二棕榈酰磷脂酰乙醇胺基甲酰基乙二醇基羰基对硝基苯氧基酯(化合物(IV)，R为C₁₅的烷基)的合成

将0.5g二棕榈酰磷脂酰乙醇胺溶于氯仿中，配成50mg/ml的溶液。向溶液中加入2.5ml三乙胺。将3g化合物(II)溶于20ml氯仿中，加入上述混合物中，在氩气保护下，室温搅拌过夜。蒸干溶剂，残留物柱层析纯化，干燥得产物0.44g，收率65％。

实施例4

二肉豆蔻酰磷脂酰乙醇胺基甲酰基乙二醇基羰基对硝基苯氧基酯(化合物(IV)，R为C₁₃的烷基)的合成

将0.5g二肉豆蔻酰磷脂酰乙醇胺溶于氯仿中，配成50mg/ml的溶液。向溶液中加入2.2ml三乙胺。将3.1g化合物(II)溶于25ml氯仿中，加入上述混合物中，氩气保护下，室温搅拌过夜。蒸干溶剂，残留物柱层析纯化，干燥得化合物(IV)0.47g，收率68％。

实施例5

二月桂酰磷脂酰乙醇胺基甲酰基乙二醇基羰基对硝基苯氧基酯(化合物(IV)，R为C₁₁的烷基)的合成

将0.5g二月桂酰磷脂酰乙醇胺溶于氯仿中，配成50mg/ml的溶液。向溶液中加入3.6ml三乙胺。将4g化合物(II)溶于30ml氯仿中，加入上述混合物中，氩气保护下，室温搅拌过夜。蒸干溶剂，残留物柱层析纯化，干燥得产物0.53g，收率74％。

实施例6PE-SOD组合物(化合物(I))的合成和精制通法

在2L烧瓶中加入900ml硼酸缓冲液(50mmol/L，pH8.5+0.2)，然后添加SOD的水溶液(100g，SOD浓度113.6mg/L)，以210rpm搅拌的同时，以33ml/分钟的速度滴加温度为8℃的异丙醇200ml，调制SOD溶液。

将化合物(IV，R分别为C₁₁H₂₃，C₁₃H₂₇，C₁₅H₃₁和C₁₇H₃₅)0.5g溶于异丙醇15ml，然后用疏水性滤器过滤不溶物。在滤液中添加异丙醇，使总容量达到800ml，制成磷脂酰乙醇胺衍生物溶液。溶液温度为8℃，接着，以66ml/分钟的速度在前述SOD溶液中滴加该磷脂酰乙醇胺溶液800ml，将于210rpm搅拌4小时而得的溶液为反应液。

使反应液全部承载于填入了用硼酸缓冲液(50mmol/L，pH8.5±0.2)和甲醇的1∶1(容量比)混合溶液预先进行了平衡化处理的离子交换树脂柱(cellulofinesf A500)，利用前述混合溶液洗脱除去未吸附物质，获得含有对硝基苯酚的部分。

然后用溶有NaCl的50mmol/L硼酸溶液(pH8.5±0.2，NaCl浓度＝25mmol/L)和甲醇的1∶1(体积比)洗脱溶液，洗脱除去未修饰的SOD。

最后，用溶有NaCl的50mmol/L硼酸溶液(pH8.5±0.2，NaCl浓度＝200mmol/L)和甲醇的1∶1(体积比)洗脱溶剂洗脱，将洗脱出的部分作为PE-SOD组合物部分。

通过对PE-SOD组合物部分进行超滤，除去盐类和甲醇，用注射用水置换，在超滤透过侧的电导率变得与注射用水的电导率相同时结束过滤操作，再将溶液中的PE-SOD浓度调整为约40mg/ml，获得PE-SOD组合物的水性溶液。

(R分别为C₁₁H₂₃，C₁₃H₂₇，C₁₅H₃₁和C₁₇H₃₅)

PE-SOD组合物各组分含量测定

用制备高效液相色谱(HPLC)分离出与PE-SOD(所用样品为按实施例6方法制得的水性溶液，R分别为C₁₁H₂₃、C₁₃H₂₇、C₁₅H₃₁和C₁₇H₃₅)组合物中的PE-SOD各峰对应的部分。流动相为0.1％三氟乙酸和20％乙腈的水溶液到0.075％三氟乙酸和90％乙腈的水溶液形成浓度梯度，以0.8ml/分钟的速度流动。检测器采用UV检测器，波长220nm，柱温为室温。

对所得各部分用基质辅助激光解吸电离飞行时间质谱(MALDITOF-MS)进行分析，测定PE-SOD的分子量，求出1分子SOD与磷脂酰乙醇胺(PE)的结合数n以及n的平均值。根据与各PE-SOD对应的峰面积计算PE-SOD中各组分所占摩尔百分比。经计算磷脂酰乙醇胺基超氧化物歧化酶组合物中含25～40摩尔％的n＝1的磷脂酰乙醇胺基超氧化物歧化酶，35～50摩尔％的n＝2的磷脂酰乙醇胺基超氧化物歧化酶，10～20摩尔％的n＝3的磷脂酰乙醇胺基超氧化物歧化酶，5～15摩尔％的n＝4的磷脂酰乙醇胺基超氧化物歧化酶，n为1～4的整数，n的平均值为1.5～2.4。部分数据总结如下：

PE-SOD活性测定

采用微量连苯三酚自氧化法(简称325nm法)

酶活性单位定义：在一定条件下，1mL的反应液中，每1min控制连苯三酚在325nm波长处的自氧化速率达50％时的酶量定义为一个活性单位。

测定系统：pH8.2、5mmol/L的Tris-HCl缓冲液2.99mL(其中含1mmol/L EDTA-2Na)，在25℃下预保温10min，最后加入50mmol/L的连苯三酚(配于10mmol/L HCl)约10μL，使反应液总体积在3mL，开始计时。自氧化速率变化在4min内有效，控制连苯三酚量使其在325nm波长处自氧化速率变化为0.070/min。测定人SOD活性时，加入40μL的人SOD溶液，缓冲液相应减至2.95mL，并控制人SOD浓度，使连苯三酚自氧化的A值变化降为0.035/min左右。自制PE-SOD(来自实施例6)活性测定方法同人SOD。

表1微量连苯三酚自氧化法加样表

操作步骤：

1.按上表加入缓冲液和样液，混匀，用空白作对照，要求自氧化速率控制在每分钟0.035(±0.002)。

2.pH计经严密校正，所用缓冲液的pH为8.2，误差不得大于±0.01。

3.水浴和测定温度尽量严格控制在25℃，偏差不得大于±0.5℃。

4.在同一台仪器上，在2.5min内每隔0.5min读书一个A值，共5点通过线性回归，r＞0.999的数值被录用，每个样品重复测定3次，RSD≤5％，取平均值代入公式进行计算。

测得数据按下列公式计算酶活性：

式中V_总∶V_定义体积＝3∶1

结果与讨论：

经计算人SOD活性值为5794u/mL，PE-SOD(R为C11的烷基)活性值为7815u/mL，PE-SOD(R为C17的烷基)活性值为8395u/mL。这表明，用磷脂酰乙醇胺修饰后的人SOD(PE-SOD)活性高于人SOD活性。

PE-SOD稳定性试验：

1.pH稳定性比较

将PE-SOD(实施例6，R为C₁₇H₃₅)与人SOD放在pH5.5和pH10的缓冲液中，然后保温4小时，测定酶的活力并计算相对活力。

表2 pH5.5缓冲液中测得的相对酶活力    ％

表3 pH10缓冲液中测得的相对酶活力     ％

2.热稳定性比较

将PE-SOD(实施例6，R为C₁₇H₃₅)和人SOD置于50℃水溶液中保温4小时，定时取样，测定酶活力，并计算相对活力。

表4 酶液50℃保温后测得的相对酶活力    ％

结果与讨论：

根据表1和表2数据我们可以看出，pH分别为5.5和10时，各取样时间点PE-SOD的相对酶活力均高于人SOD相对酶活力。

表3表明，50℃保温过程中，各取样时间点自制PE-SOD的相对酶活力明显大于人SOD的酶活力。

综合上述稳定性试验结果，经磷脂酰乙醇胺修饰后的人SOD(PE-SOD)稳定性相对于人SOD显著提高。

PE-SOD抗炎活性研究

试验动物：Wister大鼠，雌雄兼用，体重150～200g。

试验方法：大鼠32只，随机分为4组，给药前灌水5mL，在右后足关节相同部位作出标记，分别测定各鼠致炎前足跖体积。1、2组分别腹腔注射人SOD和PE-SOD(实施例6，R为C₁₇H₃₅)溶液200u/g，3组注射2.5％醋酸氢化泼尼松4μl/g作阳性对照，4组给予等体积生理盐水。给药后1h，分别于各鼠右后足足跖皮下注射1％琼脂溶液0.1ml致炎，并于致炎后不同时间测定足跖体积。按下式计算肿胀率：

表5 人SOD和PE-SOD(实施例6，R为C₁₇H₃₅)抗炎活性数据(n＝8)

*P＜0.01

结果表明，人SOD200u/g对琼脂引起的大鼠足跖肿胀无明显抑制作用，而同剂量的PE-SOD则有极为明显的抑制作用(P＜0.01)。

Claims (10)

1.一种磷脂酰乙醇胺基超氧化物歧化酶组合物，如下式(I)所示，

其特征在于，超氧化物歧化酶，简称SOD，一个以上的氨基被磷脂酰乙醇胺残基取代，式(I)中n为取代基个数，R为烷基。

2.如权利要求1所述的磷脂酰乙醇胺基超氧化物歧化酶组合物，其特征在于，n为1～4的整数，n的平均值为1.5～2.4，该组合物由25～40摩尔％的n＝1的磷脂酰乙醇胺基超氧化物歧化酶，35～50摩尔％的n＝2的磷脂酰乙醇胺基超氧化物歧化酶，10～20摩尔％的n＝3的磷脂酰乙醇胺基超氧化物歧化酶，5～15摩尔％的n＝4的磷脂酰乙醇胺基超氧化物歧化酶组成。

3.如权利要求1所述的磷脂酰乙醇胺基超氧化物歧化酶组合物，其特征在于，R选自C₁₁，C₁₃，C₁₅，C₁₇的烷基。

4.一种权利要求1～3任一所述的磷脂酰乙醇胺基超氧化物歧化酶组合物的制备方法，其特征在于，包括以下反应步骤：

(1)乙二醇在二氯甲烷中与对硝基苯基氯甲酸酯以及吡啶反应，生成化合物(II)，乙二醇∶对硝基苯基氯甲酸酯∶吡啶的摩尔比为1∶2～4∶4～8，反应温度为0～30℃，反应时间3～5小时；

(2)惰性气体保护条件下，化合物(III)与化合物(II)以氯仿为溶剂在三乙胺的作用下生成化合物(IV)，化合物(III)∶三乙胺∶化合物(II)的摩尔比为1∶20～30∶8～12，反应温度为20～40℃，反应时间12～24h；

(3)将SOD溶于适当的溶剂获得的SOD溶液，搅拌的同时向该溶液中添加磷脂酰乙醇胺衍生物(IV)，生成组合物(I)；

(4)精制方法，将步骤(3)所得磷脂酰乙醇胺化超氧化物歧化酶组合物吸附于离子交换树脂后，用溶液A洗脱除去未反应的SOD，再用溶液B洗脱磷脂酰乙醇胺基超氧化物歧化酶组合物，浓缩洗脱液既得精制组合物(I)；

5.如权利要求4所述的磷脂酰乙醇胺基超氧化物歧化酶组合物的制备方法，其特征在于，步骤(3)中所用溶剂选自水或水和有机溶剂的混合溶剂，优选水和有机溶剂的混合溶剂，作为水，选自精制水、离子交换水、蒸馏水或注射用水，有机溶剂，选自异丙醇、N，N-二甲基甲酰胺、N-甲基吡咯烷酮、N，N-二甲基乙酰胺、环丁砜、二甲亚砜、丙酮、1，4-二噁烷、甲醇，优选异丙醇。

6.如权利要求4所述的磷脂酰乙醇胺基超氧化物歧化酶组合物的制备方法，其特征在于，步骤(3)中磷脂酰乙醇胺衍生物(IV)与SOD的摩尔比为1∶0.05～0.4，优选1∶0.1～0.25。

7.如权利要求4所述的磷脂酰乙醇胺基超氧化物歧化酶组合物的制备方法，其特征在于，步骤(3)的反应温度为0～30℃，反应时间为0.5～72小时，优选2～24小时。

8.如权利要求4所述的磷脂酰乙醇胺基超氧化物歧化酶组合物的制备方法，其特征在于，步骤(3)的搅拌速度为50～500rpm，优选100～300rpm。

9.如权利要求4所述的磷脂酰乙醇胺基超氧化物歧化酶组合物的制备方法，其特征在于，步骤(4)所用溶液A由无机盐浓度为5～100mmol，pH6～9的缓冲液和有机溶剂组成，缓冲液为20～90体积％，有机溶剂为10～80体积％；溶液B由无机盐浓度为150～400mmol，pH6～9的缓冲液和有机溶剂组成，缓冲液为20～90体积％，有机溶剂为10～80体积％。

10.如权利要求9所述的磷脂酰乙醇胺基超氧化物歧化酶组合物的制备方法，其特征在于，溶液A、B所用有机溶剂选自异丙醇、N，N-二甲基甲酰胺、N-甲基吡咯烷酮、N，N-二甲基乙酰胺、环丁砜、二甲亚砜、丙酮、1，4-二噁烷、甲醇，优选甲醇。