CN102492616B

CN102492616B - 一种菌物孢子萌发载膜及其制作方法

Info

Publication number: CN102492616B
Application number: CN 201110358164
Authority: CN
Inventors: 许文耀; 江茂生
Original assignee: Fujian Agriculture and Forestry University
Current assignee: Fujian Agriculture and Forestry University
Priority date: 2011-11-14
Filing date: 2011-11-14
Publication date: 2013-05-15
Anticipated expiration: 2031-11-14
Also published as: CN102492616A

Abstract

本发明提供了一种菌物孢子萌发载膜及其制作方法，所述载膜的组成物为琼脂、水溶性无机盐、吐温-20、水。将各组成物热溶冷却后摊成均匀薄层，在室温下凝固即，本发明制作的载膜较薄，不易破碎，孢子悬浮液能方便在其上铺展成较薄液层，故透光性好不影响菌物孢子萌发状态的观察，适宜作为各种菌物孢子配制成悬浮液后进行萌发试验的悬浮液载物，且制作简单、使用方便。本发明制作的载膜可满足孢子萌发需氧要求高的菌物，孢子萌发整齐，透光性好、不影响菌物孢子萌发状态的观察；且具有制作方法简单、使用方便、制作过程和制成品对操作者和试验环境安全、易保存等优点。

Description

一种菌物孢子萌发载膜及其制作方法

技术领域

本发明涉及一种菌物孢子萌发载膜及其制备方法。用于食品、粮食、环境微生物检测、商品检验检疫、药物、农药和农业等的菌物孢子萌发试验。

背景技术

菌物（fungi），原统称真菌，是一类与人类社会关系密切的真核微生物，既可用来制造药物、食物、工业原料等，又可引起人、动物、植物的传染病。菌物孢子萌发试验是研究菌物的一项常用技术。菌物的种类鉴定，菌种选育、遗传和变异的研究，生存、繁殖和种群扩散能力，抗逆性，与其他生物之间的相互关系，有害菌物防除技术的研究等，都必须进行孢子萌发试验。孢子萌发试验时，一般是用水将孢子配成悬浮液，将孢子悬浮液滴注在透光性好、便于进行显微镜下观察、成分稳定的载物上，再置于试验设计的条件下进行。常用于孢子萌发试验的悬浮液载物有：凹玻片、置于皮氏培养皿中或滴注在载玻片上的水琼脂凝胶平板、滴注在载玻片上的火棉胶载膜。

琼脂（agar），是一种由红藻提出的海藻多糖，广泛用作微生物培养的凝固剂，无臭，味淡，不溶于40 ℃以下冷水和无机、有机溶剂中，可溶解于85 ℃以上热水，显中性反应，放冷至室温则形成凝胶。在显微镜下观察，琼脂水凝胶为无色的不规则多角形黏液质片。相较于常用的载玻片，以琼脂水凝胶作为基质的载膜，能使孢子水悬浮液在面上完全铺展，兼有一定的保湿功能。单纯采用琼脂水凝胶为载膜，若成批制作，载膜干燥后易破碎，使用不便；若使用前在面积较小的载玻片上直接制作，费料、费时、费工；载膜干、湿状态下厚度相差5~10倍（视琼脂含量不同而有差别），使用湿膜因琼脂水凝胶在玻片上表面张力较大不易制作成达到观察需要的薄度，太厚则影响透光性；使用干膜则因琼脂水凝胶摊成薄层至干燥时间长（需要24小时或以上，时间长短因制作处温度、湿度不同而异），必须使琼脂水凝胶在载玻片上放置较长时间，管理麻烦，不慎易引起膜破裂或飘进杂物。

发明内容

为了解决上述问题，本发明提供了一种菌物孢子萌发载膜及其制作方法。本发明制作的载膜较薄，不易破碎，孢子悬浮液能方便在其上铺展成较薄液层，故透光性好不影响菌物孢子萌发状态的观察，适宜作为各种菌物孢子配制成悬浮液后进行萌发试验的悬浮液载物，且制作简单、使用方便。

本发明的技术方案如下所述：

本发明的一种菌物孢子萌发载膜，其组成物为琼脂、水溶性无机盐、吐温-20、水。

上述组成物的比例按质量百分数计为：琼脂0.8%~2.0%、水溶性无机盐1.0%~4.0%、吐温-20 0.05%~1.0%,余量为水。

组成物中的水溶性无机盐为钠盐、钾盐、铵盐中的一种或多种混合。

所述的菌物孢子萌发载膜的制作方法为，先使组成物中的琼脂、水溶性无机盐和吐温-20完全溶解在85 ℃以上热水中，待混合液降至50-60℃，将其倾注在表面光滑的耐热平板上，摊成均匀薄层，在室温下待其凝固后，用刀片切割成方形膜片，自然阴干、保存。

本发明的菌物孢子萌发载膜使用时，先在洁净的载玻片或相当器皿上滴上一滴水，稍微摊开，取出一张载膜摊在水滴上方。用吸水纸将载膜四周多余的水吸干。将菌物孢子悬浮液滴在载膜上方，并摊成均匀液层，进行孢子萌发试验。需要观察孢子萌发试验结果时，取出载玻片，将载玻片底部的水滴或雾层抹去后，置于显微镜下便可观察。

本发明采用的水溶性无机盐（water-soluble inorganic salts），主要是可溶于水的钠盐、钾盐、铵盐。琼脂水凝胶中加入适量的水溶性无机盐，可调节凝胶的酸碱平衡、改善膜制品的柔韧性。

采用的吐温-20（Tween-20），化学名称聚氧乙烯山梨糖醇单月桂酸（polyoxyethylene (20)sorbitan monolaurate），非离子型表面活性剂，可与水、乙醇、甲醇和乙酸乙酯等混溶，具有良好的助润湿作用。琼脂水凝胶中加入适量的吐温-20，制作过程中使琼脂液易于扩散成薄层，且可改善膜制品的柔韧性。

本发明人通过一系列的试验证明，以琼脂、水溶性无机盐和吐温-20为组成物制成的薄膜，较薄（干膜厚度0.2-0.4mm），不易破碎，干膜成品破碎率低于2%、使用过程破碎率低于5%；用作菌物孢子悬浮液萌发的载膜，孢子悬浮液能方便在其上铺展成较薄液层，可满足孢子萌发需氧要求高的菌物，孢子萌发整齐，透光性好、不影响菌物孢子萌发状态的观察；且具有制作方法简单、使用方便、制作过程和制成品对操作者和试验环境安全、易保存（室温保存于密封容器中的干载膜存放期能超过24个月）等优点。

附图说明

图1为番石榴炭疽病菌分生孢子萌发的芽管所产生的附着孢形态。

具体实施方式

载膜组成物琼脂、水溶性无机盐和吐温-20的优选比以质量百分数计为：琼脂1.0%~1.8% 、水溶性无机盐1.2%~3.1%、吐温-20 0.1%~0.8%，余量为水。琼脂、水溶性无机盐和吐温-20的更优选比以质量百分计为：琼脂1.2%、水溶性无机盐1.6%、吐温-20 0.2%，余量为水。

本发明的菌物孢子萌发载膜制作步骤为，将琼脂粉或琼脂条在去离子水中加热至完全溶化，溶化后的琼脂液用多层纱布或相当的过滤介质过滤除去不溶物后，依次加入无机盐水溶液、加入吐温-20，搅拌均匀；用热水定容，搅拌均匀；趁热将定量的混合液均匀地摊在玻璃板或表面光滑的耐热平板上，摊成均匀薄层，在室温下待其凝固后，用刀片切割成大小适宜的膜片。自然阴干后，收放在适宜的密封容器中保存。切割后的琼脂膜边角料，可回收加热至完全溶化后，可再次用作制膜材料。

在下面的实施例中，对本发明的菌物孢子萌发载膜进一步的说明，但其绝不对本发明的范围构成限制。另外，以下实施例中所用的份均或比例均为质量比。

实施例1

称取磷酸二氢钾7.0 g（准确至0.01g）、磷酸氢二钾9.0 g（准确至0.01 g）置于500 mL烧杯中，加入去离子水约200 mL搅拌至完全溶解；取去离子水约800 mL于可加热容器中加热，称取琼脂12 g（准确至0.1 g），倒入热水中，并继续加热至琼脂完全溶化；溶化后的琼脂液用4层纱布过滤除去不溶物；滤过液加入上述配制的无机盐水溶液，加入2.0 g（准确至0.1g）吐温-20搅拌均匀，用85℃热水定容至1000 mL后，搅拌均匀；将琼脂液（10 mL ~12 mL，组合物液温约60℃）缓缓倾注在已预热至约60 ℃（60℃恒温水浴约5 min）的洁净玻璃板上，将其摊开、流平成厚度约1.0 mm、面积100 cm²的均匀薄层；在室温下待其凝固后，用刀片切割成边长为1.8 cm的方形膜片。自然阴干（24 h）后，将载膜收放在适宜的密封容器中，室温保存。使用时，直接取出使用。干膜成品破碎率低于1%、使用过程破碎率低于4 %。

实施例2

琼脂 10 g

一水磷酸二氢钠（NaH₂PO₄·H₂O）17g

二水磷酸氢二钠（NaH₂PO₄·2H₂O）14g

吐温-20 1.5 g

去离子水定容至1000mL。

制作方法同实施例1。干膜成品破碎率低于2%、使用过程破碎率低于4%。

实施例3

琼脂 18 g

磷酸二氢钾 .3.5 g

磷酸氢二钾 4.5g

一水磷酸二氢钠（NaH₂PO₄·H₂O） 8.5g

二水磷酸氢二钠（NaH₂PO₄·2H₂O） 7g

吐温-20 4 g

去离子水定容至1000mL。

制作方法同实施例1。干膜成品破碎率低于1%、使用过程破碎率低于5%。

实施例4：杧果炭疽病菌孢子萌发试验

先在洁净的载玻片或相当器皿上加一滴水，稍微摊开，取实施例1的一张载膜摊在水滴上方，用吸水纸将载膜四周多余的水吸干。将添加0.5%杧果汁的杧果炭疽病菌孢子悬浮液调配成每毫升含杧果炭疽病菌分生孢子4×10⁴个，取0.2 mL 杧果炭疽病菌孢子悬浮液滴在载膜上方，并摊成均匀液层，将载玻片倒置于底部装有无菌水、带架的有机玻璃培养盒中，于28℃±1℃生化培养箱中培养4 h ~6 h，取出载玻片，将载玻片底部的水滴或雾层抹去后，置于100倍显微镜下观察孢子萌发情况。孢子萌发率达93.5%（5个重复平均数）。

实施例5：辣椒疫病菌游动孢子萌发试验

先在洁净的载玻片或相当器皿上加一滴水，稍微摊开，取实施例2的一张载膜摊在水滴上方，用吸水纸将载膜四周多余的水吸干。将辣椒疫霉病菌孢子囊悬浮液调配成每毫升含辣椒疫霉病菌分生孢子4×10⁴个，于4℃冰箱中预处理15min后取出，取一滴辣椒疫霉病菌孢子悬浮液滴在载膜上方，并摊成均匀液层，将载玻片倒置于底部装有无菌水、带架的有机玻璃培养盒中，于25℃±1℃生化培养箱中培养6 h，取出载玻片，将载玻片底部的水滴或雾层抹去后，置于100倍显微镜下观察游动孢子萌发情况。游动孢子萌发率达91.4%（5个重复平均数）。

实施例6：番石榴炭疽病菌分生孢子萌发的芽管所产生的附着孢形态观察。

先在洁净的载玻片或相当器皿上加一滴水，稍微摊开，取实施例3的一张载膜摊在水滴上方，用吸水纸将载膜四周多余的水吸干。将将添加0.8%番石榴新鲜果汁的番石榴炭疽病菌孢子浮液调配成每毫升含番石榴炭疽病菌分生孢子4.7×10⁵个，取0.2 mL孢子悬浮液滴在载膜上方，并摊成均匀液层，将载玻片倒置于底部装有无菌水、带架的有机玻璃培养盒中，于25℃±1℃生化培养箱中培养10 h，取出载玻片，将载玻片底部的水滴或雾层抹去后，加入0.2 mL新蒸的蒸馏水，用接种环轻搅2~3圈，置于100倍显微镜下观察附着孢的萌发情况。分生孢子萌发的芽管附着孢产生率达90.3%（5个重复平均数），附着孢呈椭圆形、梨形或球形，深褐色（如图1所示）。

Claims

1.一种菌物孢子萌发载膜，其组成物为琼脂、水溶性无机盐、吐温-20、水，组成物的比例按质量百分数计为：琼脂0.8%~2.0%、水溶性无机盐1.0%~4.0%、吐温-20 0.05%~1.0%,余量为水，组成物中的水溶性无机盐为钠盐、钾盐、铵盐中的一种或多种混合；所述的菌物孢子萌发载膜的制作方法，先使组成物中的琼脂、水溶性无机盐和吐温-20完全溶解在85 ℃以上热水中，待混合液降至50-60℃，将其倾注在表面光滑的耐热平板上，摊成均匀薄层，在室温下待其凝固后，用刀片切割成方形膜片，自然阴干、保存。