CN102481377B - 糖基化相关的材料和方法 - Google Patents

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Abstract

本发明描述了糖基化技术，且更具体地说，生产糖基化结构的技术，所述结构耐受酶促降解，因而调节其一个或多个生物特性或整合了它们的治疗性部分的生物特性，且特别是使活化的含氟糖底物(例如，3-氟唾液酸化合物)与糖接受体反应以产生糖接受体与一种或多种唾液酸化合物的共价缀合物的技术。

Description

糖基化相关的材料和方法
技术领域
本发明涉及糖基化相关的材料和方法，其更具体地说涉及糖基化结构的生产，所述结构耐受酶促降解，因而调节其一个或多个生物特性或整合它们的治疗部分的生物特性。更具体地说，本发明涉及使活化的含氟糖底物(例如，3-氟唾液酸化合物)与糖接受体(sugar acceptor)反应以产生糖接受体与一种或多种所述唾液酸化合物的共价缀合物。
背景技术
多数天然多肽含有糖部分，所述部分在一级多肽链的一些氨基酸残基处共价连接至所述多肽。在本领域中，这些多肽一般称为糖肽或糖蛋白。还已知，当多肽存在于生物系统(例如，细胞或个体)时，任何给定多肽上的糖基化模式的性质可影响其特性，所述特性包括蛋白酶抗性、细胞内运输、分泌、组织靶向、生物半衰期和抗原性。
多肽的糖基化是翻译后修饰的天然形式，其改变多肽的结构和功能。在自然界中，通过酶促的过程引入糖基化，导致不同类型糖基化多肽的位点特异性修饰。在N-连接的糖基化中，聚糖被连接至天冬酰胺侧链的酰胺氮，而在O-连接的糖基化中，聚糖连接至丝氨酸和苏氨酸侧链的羟基氧。其他形式的糖基化包括糖胺聚糖(其连接至丝氨酸的羟基氧)、糖脂(其中聚糖连接至神经酰胺)、透明质烷(其不连接至蛋白或脂质)和GPI锚(其通过聚糖连接将蛋白连接至脂质)。
本领域中的普遍问题是糖基化通常加至真核细胞中的多肽，但很少加至经常用于治疗性多肽重组表达的原核宿主中所表达的多肽。原核宿主中产生的多肽中糖基化的缺乏可导致所述多肽被识别为外源物，或者意味着其具有其他不同于其天然形式的特性。还有一个问题是，在试图在没有天然糖基化的位置将糖基化改造进入多肽来调节肽特征时，发现其非常困难。
因此，例如在多肽的表达可引起多肽的天然糖基化形式改变(例如，在细菌宿主中表达)或需要修饰多肽的糖基化形式以改进所述多肽的一个或多个特征(尤其是当所述多肽是治疗性蛋白时)的情况下，本领域中一直在尝试引入或修饰多肽的糖基化形式。例如，参见US专利No：7226903中描述的干扰素β的修饰。
连接至多肽的聚糖分子具有一系列直链和支链结构和不同长度的聚糖链，并且多肽上存在的特定聚糖分子影响所述多肽的特征。很多类型的聚糖分子包括末端唾液酸。这些在生理pH下带负电荷的9个碳原子的糖被认为参与配体-受体相互作用，所述相互作用可极大地影响特定的细胞-细胞、病原体-细胞或药物-细胞的通讯。包含末端唾液酸残基的聚糖链的一个特别的特征是其增加以所述唾液酸糖基化的治疗性多肽的半衰期。通过这样的观察而得知：包含无末端唾液酸残基的聚糖被肝从循环中迅速地除去，因而降低治疗性多肽的半衰期。
氟取代的糖已被用作不可加工的底物用于结晶酶，例如CstII(Chiu等，Nat.Struct.Mol.Biol.(2004)11，163-170)。在这种情况下，在含氟糖的糖苷连接处，含氟的糖已知对酶促加工有抗性。
2，3-二氟唾液酸衍生物已被合成，并且用作来自寄生虫克氏锥虫(Trypanosoma cruzi)(Watts等，J.Am.Chem.Soc.(2003)125，7532-7533)和让氏锥虫(Trypanosoma rangeli)(Watts等，Can.J.Chem.(2004)82，1581-1588)之唾液酸酶的灭活剂。该前期工作导致发现这些唾液酸酶通过共价的唾液酸基酶中间体的参与而运作，并且确立例如该衍生物的化合物作为锥虫唾液酸酶的时间依赖性的共价灭活剂而发挥作用。
随后，还已知在C-5具有羟基(而非天然的N-乙酰基基团)的2，3-二氟神经氨酸衍生物也作为让氏锥虫(T. rangeli)唾液酸酶的共价灭活剂而发挥作用，但显示出对原抑制剂(Watts等，J.Biol.Chem.(2006)281，4149-4155)非常不同的动力学行为(k非活性和k反应性)。
总之，多肽糖苷的修饰(尤其是对其生物特性的修饰)仍然是本领域中具有挑战性的问题和尚未被以满意的方式解决的问题。
发明概述
广义上，本发明的基础是这样的认识：氟唾液酸化合物(例如，3-氟唾液酸化合物)可被用于与糖接受体形成缀合物，其调节所述缀合物或整合有所述缀合物的治疗性部分(therapeutic moiety)的一个或多个生物特性。因此，使用这些方法所产生的修饰的糖基化结构可被引入治疗性部分(例如，多肽)或者是其一部分。因此，一方面，本发明涉及用于使活化的3-氟唾液酸化合物与糖接受体基团反应的方法，其中所述3-氟唾液酸化合物并不像本领域中常规使用的那样连接至CMP基团。该方法可酶促进行(例如使用唾液酸转移酶(sialyl transferase)、转唾液酸酶(trans-sialidase)或使用来自糖化学领域的合成技术)。
唾液酸转移酶被用于转移唾液酸衍生物至接受体糖，使用天然或修饰的天然底物(即，CMP-唾液酸或其衍生物)作为所述酶的供体。反转唾液酸转移酶(inverting sialyl transferase)PmST1已被证明将3-氟-CMP唾液酸转移至半乳糖基接受体，然而，该反应使用二酶一锅法(two-enzymeone-pot method)原位产生天然供体糖的3-氟类似物(Harshal等，J.Am.Chem.Soc.(2007)129，10630-10631)。然而，使用唾液酸转移酶，从未将非天然的活化3-氟唾液酸转移至糖接受体，且在此之前，尚未提出将3-氟唾液酸的特性整合进入多肽的糖基化结构。
因此，在第一个方面，本发明提供包括在糖接受体和3-氟唾液酸化合物之间形成共价缀合物的方法，所述方法包括将糖接受体与3-氟唾液酸化合物相接触，该接触步骤在适于使3-氟唾液酸化合物与糖接受体反应并与其共价键合的条件下发生，其中所述3-氟唾液酸化合物不包含胞苷一磷酸(CMP，cytidine monophosphate)基团。
在一个实施方案中，该方法包括将糖接受体、3-氟唾液酸化合物和能够将3-氟唾液酸化合物转移至所述糖接受体的酶相接触，该接触步骤在适宜使3-氟唾液酸化合物转移至糖接受体并取其共价键合的条件下发生。该酶可包括唾液酸转移酶或转唾液酸酶。作为替代或补充，3-氟唾液酸化合物与糖接受体的共价键合还通过合成化学反应来进行。
一般来说，与3-氟唾液酸化合物之共价缀合物的形成调节糖接受体或包含所述糖接受体的治疗性部分的生物特性，例如酶水解(例如，通过外-唾液酸酶(exo-sialidase)或神经氨酸苷酶)抗性、生物稳定性或药代动力学特性。
优选地，该方法作为体外无细胞方法而进行。在转移反应为酶促反应的情况下，其可发生时伴有在3-氟唾液酸化合物和接受体糖基团之间异头连接处的倒转(inversion)。与现有技术中基于CMP的方法不同，本发明的方法可使用一种酶进行。本发明还帮助克服了现有技术中存在的问题，即已知的CMP3-氟唾液酸化合物的少量已知例子被证明对唾液酸转移酶非常稳定，因而在合成氟唾液酸缀合物中并不实用。
在一些实施方案中，该方法可包括修饰已存在于多肽上的糖基化结构(例如，表达产生的或之前合成产生的糖基化结构)的步骤。在一个典型的情况下，其可包括从初始存在于多肽上的糖基化结构中除去一个或多个末端糖基基团以形成接受体基团和/或用一个或多个3-氟唾液酸基团替代糖基化结构的末端糖基基团的额外步骤。为了方便起见，酶促地进行除去所述末端糖基基团的步骤，例如通过使用唾液酸酶来进行。或者，现有的糖基化结构可被进一步切割或改变(例如不仅除去末端糖基基团)以提供根据本发明可使用的糖接受体。
此外，在一些实施方案中，本发明的方法可包含将多个3-氟唾液酸基团转移至多肽的接受体基团。这样做是为了提供额外保护，以使核心糖基化结构免受降解。举例来说，通过重复连接连续的3-氟唾液酸基团或将3-氟唾液酸基团寡聚物共价连接至接受体的方法，两个、三个或更多个3-氟唾液酸基团可共价连接至接受体基团。在一些实施方案中，3-氟唾液酸基团可缀合至多肽上存在的糖基化结构的末端糖基残基。
优选地，本申请中公开的方法使用通式(I)所示的3-氟唾液酸化合物：
或者两个或多个式(I)分子的寡聚物；
及其异构体、盐、溶剂化物或化学保护形式：
其中：
Y1选自-O-、-S-或-NR-，其中R独立地选自H、C1-7烷基、C3-10杂环基或C5-20芳基；
R1是良好的离去基团，前提是其不是胞苷一磷酸(CMP)基团；
X1是-CO2R，其中R的定义见上文；
R2选自H、卤素或OH；
R3和R4各自独立地选自H、-OR、-NR2或-Z1(CH2)mZ2，其中R的定义见上文，Z1选自-O-、-NR-、-CR2-和-S-，m是从0至5，并且Z2选自-OR、-NR2或-CN；前提是R3和R4不能同时是H；
R5是H；
R6选自C1-7烷基；C1-7羟基烷基，C1-7氨基烷基或C1-7硫代烷基；
R7是下式的基团：
其中Y2选自N、O、S和CH；Z3选自H、羟基、卤素、C1-7烷基、C1-7氨基烷基、C1-7羟基烷基或C1-7硫代烷基；R9和R10独立地选自H、羟基、C1-7羟基烷基、C1-7烷基、C5-20芳基、C(O)Z4，其中Z4选自C1-7烷基或C5-20芳基，前提是如果Y2是O或S，则R10不存在；
或者其中R4不是羟基，R7可另外是C1-7羟基烷基；
R8是H。
另一个方面，本发明提供包含糖基化结构之治疗性部分的缀合物，其中所述糖基化结构共价键合至一个或多个3-氟唾液酸基团，其中3-氟唾液酸基团形成糖基化结构的末端糖基基团。一般来说，所述治疗部分会是多肽，并且所述糖基化结构在糖基化位点连接至多肽和/或连接至氨基酸残基中的一个，任选地通过接头基团连接。接头基团的使用将在下文中进一步地讨论。
在另一个方面，本发明提供糖基化结构，其中所述糖基化结构包含一个或多个3-氟唾液酸基团，并且其中所述3-氟唾液酸基团共价键合所述糖基化结构的一个或多个末端糖基基团。如下文中描述的那样，所述糖基化结构一般包含至少一个3-氟唾液酸基团和另外两个糖单元，所述糖单元可为3-氟唾液酸基团或不同类型的糖单元。
另一个方面，本发明提供包含一个或多个末端3-氟唾液酸基团的糖基化结构，其中所述结构表示为下式：
或者两个或多个式(I)分子的寡聚物；
和其异构体、盐、溶剂化物或化学保护的形式：
其中：
Y1选自-O-、-S-或-NR-，其中R独立地选自H、C1-7烷基、C3-10杂环基或C5-20芳基；
X1是-CO2R，其中R的定义见上文；
X2表示该糖基化结构的其余部分，并且其包含至少两个糖单元；
R2选自H、卤素或OH；
R3和R4各自独立地选自H、-OR、-NR2或-Z1(CH2)mZ2，其中R的定义见上文，Z1选自-O-、-NR-、-CR2-和-S-，m是从0至5，并且Z2选自-OR、-NR2或-CN；前提是R3和R4不能都是H；
R5是H；
R6选自C1-7烷基；C1-7羟基烷基，C1-7氨基烷基或C1-7硫代烷基；
R7是下式的基团：
其中Y2选自N、O、S和CH；Z3选自H、羟基、卤素、C1-7烷基、C1-7氨基烷基、C1-7羟基烷基或C1-7硫代烷基；R9和R10独立地选自H、羟基、C1-7羟基烷基、C1-7烷基、C5-20芳基、C(O)Z4，其中Z4选自C1-7烷基或C5-20芳基，前提是如果Y2是O或S，则R10不存在；
或其中R4不是羟基，R7可另外是C1-7羟基烷基；
R8是氢。
在该式中，X2基团表示两个或多个糖单元，形成糖基化结构或其一部分。所述单元可为另外一个或多个3-氟唾液酸基团(例如，如果该结构中包含多个这样的基团)，或可为任何天然或修饰的糖基团。如下文中更详细记载的那样，所述糖基化结构可基于天然或合成的聚糖，并具有单触角(monoantennary)结构、双触角(biantennary)结构、三触角(triantennary)结构或复合糖基化(complex glycosylation)结构。
另一个方面，本发明提供如本文中所公开的缀合物、用于医学处理的方法中。
另一个方面，本发明提供用于本发明公开的处理方法的缀合物，其中所述处理为治疗或诊断。
另一个方面，本发明提供本文中公开的缀合物在制备药物中的用途，所述药物用于治疗(treatment)应答于施用该多肽的病症。
另一个方面，本发明提供药物组合物，所述药物组合物包含本文中公开的缀合物和药学上可接受的载体。
现在通过举例而非限制的方式描述本发明的实施方案。
发明详述
氟唾液酸化合物
如上文中所提及的那样，本发明利用氟唾液酸化合物(且更尤其是3-氟唾液酸化合物)来产生具有有用的生物特性(例如增加对酶降解的抗性)的缀合物。根据本发明使用的优选化合物表示为式I和/或具有实施例中公开的化合物的取代基的各种组合和排列。一般来说，所述化合物不同于现有技术中公开的化合物，因为其在3-位包含氟取代基，以提高其对酶降解的耐受，并且在化合物的2-位存在不是CMP的良好的离去基团，在式I的情况中，所述离去基团为轴向的2-位R1取代基。根据本发明适合使用的3-氟唾液酸糖苷可如Sun等，Eur.J.Org.Chem(2000)，2643-2653中示例的那样化学生成。
术语“离去基团”是公知的和本领域中常用的，并且其是指在化学反应中，可从分子中排除的原子或官能团。本文中使用的术语“离去基团”是指在亲核取代反应中不稳定的基团。特定官能团的不稳定性/离去基团能力取决于其缀合物酸的pKa——一般来说，其越低，所述离去基团就越好。优选地，所述离去基团能够支持和稳定负电荷，即所述基团能够作为阴离子而离去。很多这样的离去基团是本领域中已知的，其包括但不限于卤素(F-、Cl-、Br-、I-)、氢氧化物(HO-)、烷氧化物(RO-，其中R为下文中定义的醚取代基)、羧酸酯/盐(RC(O)O-，其中R为下文中定义的酰氧基取代基；例如AcO-)、叠氮化物(N3 -)、硫氰酸酯/盐(SCN-)、硝基(NO2 -)、胺(NH2 -)。根据有机化学中通常的做法，本领域中的技术人员将能够选择适宜的良好的离去基团。
优选良好离去基团的例子包括甲磺酸酯/盐、4-甲苯磺酸酯/盐、三氟甲基磺酸酯/盐、三氟甲基甲苯磺酸酯/盐、咪唑磺酸酯/盐或卤素(即，F、Cl、Br、I)。
可存在于本文中公开的化合物中的其他取代基包括以下各项。
C1-7烷基：本文中使用的术语“C1-7烷基”是指通过从具有1至7个碳原子的C1-7烃类化合物中除去氢原子而获得的一价基团，其可为脂肪的或脂环的，或其组合，并且其可为饱和的、部分不饱和的或完全不饱和的。
饱和直链C1-7烷基基团的例子包括但不限于甲基、乙基、正丙基、正丁基和正戊基(戊基(amyl))。饱和支链C1-7烷基基团的例子包括但不限于异丙基、异丁基、仲丁基、叔丁基和新戊基。
饱和脂环C1-7烷基基团(也称为“C3-7环烷基”基团)的例子包括但不限于例如环丙基、环丁基、环戊基和环己基基团，以及取代的基团(例如，包含所述基团的基团)，例如，甲基环丙基、二甲基环丙基、甲基环丁基、二甲基环丁基、甲基环戊基、二甲基环戊基、甲基环己基、二甲基环己基、环丙基甲基和环己基甲基。
具有一个或多个碳-碳双键的不饱和C1-7烷基基团(也称为“C2-7烯基”基团)的例子包括单不限于乙烯基(乙烯基(vinyl)，-CH＝CH2)、2-丙烯基(烯丙基，-CH-CH＝CH2)、异丙基(-C(CH3)＝CH2)、丁烯基、戊烯基和己烯基。
具有一个或多个碳-碳三键的不饱和C1-7烷基基团的(也称为“C2-7炔基”基团)例子包括单不限于乙炔基(ethynyl，ethinyl)和2-丙炔基(炔丙基)。
具有一个或多个碳-碳双键的不饱和脂环(碳环)C1-7烷基基团(也称为“C3-7环烯基”基团)的例子包括但不限于例如环丙烯基、环丁烯基、环戊烯基和环己烯基的未取代的基团，以及取代的基团(例如，包含所述基团的基团)，例如环丙烯甲基和环己烯甲基。
C3-10杂环基：本文中使用的术语“C3-10杂环基”是指通过从C3-10杂环化合物的环原子中除去氢原子而获得的一价部分，所述化合物具有一个环或者两个或更多个环(例如，螺环的、稠合的、桥连的)，并且具有3至10个环原子，其中1至10个原子为环杂原子，并且其中所述环的至少一个是杂环。优选地，每个环具有3至7个环原子，其中1至4个环杂原子。环杂原子可优选地选自O、N、S和P。“C3-10”表示环原子，无论是碳原子或杂原子。类似地，术语“C3-10杂环基”将被理解为是指3至10个环原子的等同部分，等。
C5-20芳基：本文中使用的术语“C5-20芳基“是指通过从C5-20芳环化合物的芳环原子中除去氢原子而获得的一价部分，所述化合物具有一个环或者两个或多个环(例如，稠合的)，并且具有5至20个环原子，并且其中所述环的至少一个是芳环。优选地，每个环具有5至7个环原子。所述环原子可全部为碳原子，如在“碳芳基基团(carboaryl group)”中那样，在该情况下，所述基团可方便地被称为“C5-20碳芳基”基团。
上述烷基、杂环基和芳基基团(无论是单独或是其他取代基的部分)可本身任选地用一个或多个基团取代，所述基团选自其本身和下文中所列出和定义的其他取代基。
卤基：-F、-Cl、-Br和-I。
羟基：-OH。
醚：-OR，其中R是醚取代基，例如C1-7烷基基团(也称为C1-7烷氧基基团，下文中讨论)、C3-20杂环基基团(也称为C3-20杂环基氧基基团)或者C5-20芳基基团(也称为C5-20芳基氧基基团)，优选C1-7烷基基团。
C1-7烷氧基：其中R是C1-7烷基基团。C1-7烷氧基基团的例子包括但不限于-OCH3(甲氧基)、-OCH2CH3(乙氧基)和-OC(CH3)3(叔丁氧基)。
氧基(酮基、酮)：＝O。具有氧基(＝O)作为取代基的环化合物和/或基团的例子包括但不限于碳环，例如环戊酮和环己酮；杂环，例如吡喃酮、吡咯烷酮、吡唑酮、吡唑啉酮、哌啶酮、哌啶二酮、哌嗪二酮、咪唑烷酮；环酸酐，包括但不限于马来酸酐和琥珀酸酐；环碳酸酯，例如碳酸丙烯酯；酰亚胺，包括但不限于琥珀酰亚胺和马来酰亚胺；内酯(环状酯，环中的-O-C(＝O)-)，包括但不限于β-丙内酯、γ-丁内酯、δ-戊内酯和ε-己内酯；以及内酰胺(环状酰胺，环中的-NH-C(＝O)-)，包括但不限于β-丙内酰胺、γ-丁内酰胺(2-吡咯烷酮)、δ-戊内酰胺和ε-己内酰胺。
亚氨基(亚胺)：＝NR，其中R是亚氨取代基，例如氢、C1-7烷基基团、C3-20杂环基基团或C5-20芳基基团，优选氢或C1-7烷基基团。
酯基的例子包括但不限于＝NH、＝NMe、＝NEt和＝NPh。
甲酰基(甲醛(carbaldehyde、carboxaldehyde))：-C(＝O)H。
酰基(酮)：-C(＝O)R，其中R是酰基取代基，例如C1-7烷基基团(也称为C1-7烷酰基(alkylacyl或alkanoyl))、C3-20杂环基(也称为C3-20杂环酰基)或C5-20芳基基团(也称为C5-20芳基酰基)，优选C1-7烷基基团。酰基基团的例子包括但不限于-C(＝O)CH3(乙酰基)、-C(＝O)CH2CH3(丙酰基)、-C(＝O)C(CH3)3(丁酰基)和-C(＝O)Ph(苯甲酰基、酰苯)。
羧基(羧酸)：-COOH。
酯(羧酸酯(carboxylate)、羧酸酯(carboxylic acid ester)、氧羰基)：-C(＝O)OR，其中R是酯取代基，例如C1-7烷基基团、C3-20杂环基基团或C5-20芳基基团，优选C1-7烷基。酯基的例子包括但不限于-C(＝O)OCH3、-C(＝O)OCH2CH3、-C(＝O)OC(CH3)3和-C(＝O)Oph。
酰氧基(反向酯(reverse ester))：-OC(＝O)R，其中R是酰氧基取代基，例如C1-7烷基基团、C3-20杂环基基团或C5-20芳基基团，优选C1-7烷基基团。酰氧基基团的例子包括但不限于-OC(＝O)CH3(乙酰氧基)、-OC(＝O)CH2CH3、-OC(＝O)C(CH3)3、-OC(＝O)Ph和-OC(＝O)CH2Ph。
酰胺基(氨基甲酰基(carbamoyl、carbamyl)、氨基羰基、羧酰胺)：-C(＝O)NR1R2，其中R1和R2独立地是如氨基基团中所定义的氨基取代基。酰胺基基团的例子包括但不限于-C(＝O)NH2、-C(＝O)NHCH3、-C(＝O)N(CH3)2、-C(＝O)NHCH2CH3和-C(＝O)N(CH2CH3)2，以及酰胺基基团，其中的R1和R2与其连接的氮原子一起形成杂环结构，例如，哌啶羰基、吗啉羰基、硫代吗啉羰基和哌嗪羰基中的杂环结构。
酰基氨基(acylamido、acylamino)：-NR1(C＝O)R2，其中R1是酰胺取代基，例如，氢、C1-7烷基基团、C3-20杂环基基团或C5-20芳基基团，优选是氢或C1-7烷基基团，且R2是酰基取代基，例如C1-7烷基基团、C3-20杂环基基团或C5-20芳基基团，优选是氢或C1-7烷基基团。酰基氨基基团的例子包括单不限于-NHC(＝O)CH3、-NHC(＝O)CH2CH3和-NHC(＝O)Ph。R1和R2可一起形成例如琥珀酰亚胺基、马来酰亚胺基和苯邻二甲酰亚胺基中的环状结构。
酰基脲基：-N(R1)C(O)NR2C(O)R3，其中R1和R2独立地是脲基取代基，例如，氢、C1-7烷基基团、C3-20杂环基基团或C5-20芳基基团，优选氢或C1-7烷基基团。R3是按照酰基基团定义的酰基基团。酰基脲基基团的例子包括但不限于-NHCONHC(O)H、-NHCONMeC(O)H、-NHCONEtC(O)H、-NHCONMeC(O)Me、-NHCONEtC(O)Et、-NMeCONHC(O)Et、-NMeCONHC(O)Me、-NMeCONHC(O)Et、-NMeCONMeC(O)Me、-NMeCONEtC(O)Et和-NMeCONHC(O)Ph。
氨基甲酸酯：-NR1-C(O)-OR2，其中R1是按照氨基定义的氨基取代基，且R2是按照酯基团定义的酯基团。氨基甲酸酯基团的例子包括但不限于-NH-C(O)-O-Me、-NMe-C(O)-O-Me、-NH-C(O)-O-Et、-NMe-C(O)-O-叔丁基和-NH-C(O)-O-Ph。
硫代酰胺基(硫代氨基甲酰基)：-C(＝S)NR1R2，其中R1和R2独立地是按照氨基基团定义的氨基取代基。酰胺基的例子包括但不限于-C(＝S)NH2、-C(＝S)NHCH3、-C(＝S)N(CH3)2和-C(＝S)NHCH2CH3。
四唑基：具有4个氮原子和1个碳原子的五元芳环，
氨基：-NR1R2，其中R1和R2独立地是氨基取代基，例如，氢、C1-7烷基基团(也称为C1-7烷基氨基或二-C1-7烷基氨基)、C3-20杂环基基团或C5-20芳基基团，优选H或C1-7烷基基团，或在“环”氨基基团的情况下，R1和R2与它们所连接的氮原子一起形成具有4至8个环原子的杂环。氨基基团的例子包括但不限于-NH2、-NHCH3、-NHC(CH3)2、-N(CH3)2、-N(CH2CH3)2和-NHPh。环氨基基团的例子包括但不限于氮杂环丙基(aziridino)、氮杂环丁基(azetidino)、吡咯烷基、哌啶基、哌嗪基、吗啉基和硫代吗啉基。
亚氨基：＝NR，其中R是亚胺基取代基，例如氢、C1-7烷基基团、C3-20杂环基基团或C5-20芳基基团，优选H或C1-7烷基基团。
脒：-C(＝NR)NR2，其中每个R是咪取代基，例如氢、C1-7烷基基团、C3-20杂环基基团或C5-20芳基基团，优选H或C1-7烷基基团。咪基团的例子是-C(＝NH)NH2。
咔唑基(肼基羰基)：-C(O)-NN-R1，其中R1是按照氨基基团定义的氨基取代基。连氮基基团的例子包括但不限于-C(O)-NN-H、-C(O)-NN-Me、-C(O)-NN-Et、-C(O)-NN-Ph和-C(O)-NN-CH2-Ph。
硝基：-NO2。
亚硝基：-NO。
叠氮基：-N3。
氰基(腈(nitrile、carbonitrile))：-CN。
异氰基：-NC。
氰氧基：-OCN。
异氰氧基：-NCO。
氰硫基(thiocyano、thiocyanato)：-SCN。
异氰硫基(isothiocyano、isothicyanato)：-NCS。
硫基：(巯基(sulfhydryl、thiol、mercapto))：-SH。
硫醚(thioether)(硫化物(sulfide))：-SR，其中R是硫醚取代基，例如，C1-7烷基基团(也称是C1-7烷基硫基)、C3-20杂环基基团或C5-20芳基基团，优选C1-7烷基基团。C1-7烷基硫基的例子包括但不限于-SCH3和-SCH2CH3。
二硫化物：-SS-R，其中R是二硫化物取代基，例如，C1-7烷基基团、C3-20杂环基基团或C5-20芳基基团，优选C1-7烷基基团(本文中也称为C1-7烷基二硫化物)。C1-7烷基二硫化物基团的例子包括但不限于-SSCH3和-SSCH2CH3。
砜(磺酰基)：-S(＝O)2R，其中R是砜取代基，例如，C1-7烷基基团、C3-20杂环基基团或C5-20芳基基团，优选C1-7烷基基团。砜基团的例子包括但不限于-S(＝O)2CH3(甲磺酰基(methanesulfonyl、mesyl))、-S(＝O)2CF3(三氟甲磺酰基)、-S(＝O)2CH2CH3、-S(＝O)2C4F9(九氟丁磺酰基(nonaflyl))、-S(＝O)2CH2CF3(三氟乙磺酰基)、-S(＝O)2Ph(苯磺酰基)、4-甲基苯磺酰基(甲苯磺酰基(tosyl))、4-溴苯磺酰基(对溴苯磺酰基(brosyl))和4-硝基苯基(对硝基苯磺酰基(nosyl))。
锍化物(sulfine)(亚磺酰基、亚砜)：-S(＝O)R，其中R是锍化物取代基，例如，C1-7烷基基团、C3-20杂环基基团或C5-20芳基基团，优选C1-7烷基基团。
锍化物基团的例子包括但不限于-S(＝O)CH3和-S(＝O)CH2CH3。
磺酰氧基：-OS(＝O)2R，其中R是磺酰氧基取代基，例如，C1-7烷基基团、C3-20杂环基基团或C5-20芳基基团，优选C1-7烷基基团。磺酰氧基的例子包括但不限于-OS(＝O)2CH3和-OS(＝O)2CH2CH3。
亚磺酰氧基：-OS(＝O)R，其中R是亚磺酰氧基取代基，例如，C1-7烷基基团、C3-20杂环基基团或C5-20芳基基团，优选C1-7烷基基团。亚磺酰氧基的例子包括但不限于-OS(＝O)CH3和-OS(＝O)CH2CH3。
磺胺基：-NR1S(＝O)2OH，其中R1是按照氨基基团定义的氨基取代基。磺胺基基团的例子包括但不限于-NHS(＝O)2OH和-N(CH3)S(＝O)2OH。
亚磺酰氨基：-NR1S(＝O)R，其中R1是按照氨基基团定义的氨基取代基，且R是亚磺酰氨基取代基，例如，C1-7烷基基团、C3-20杂环基基团或C5-20芳基基团，优选C1-7烷基基团。亚磺酰氨基的例如包括但不限于-NHS(＝O)CH3和-N(CH3)S(＝O)C6H5。
胺磺酰基：-S(＝O)NR1R2，其中R1和R2独立地是按照氨基基团定义的氨基取代基。胺磺酰基基团的例子包括但不限于-S(＝O)NH2、-S(＝O)NH(CH3)、-S(＝O)N(CH3)2、-S(＝O)NH(CH2CH3)、-S(＝O)N(CH2CH3)2和-S(＝O)NHPh。
磺酰胺基：-NR1S(＝O)2R，其中R1是按照氨基基团定义的氨基取代基，且R是磺酰胺基取代基，例如，C1-7烷基基团、C3-20杂环基基团或C5-20芳基基团，优选C1-7烷基基团。磺酰胺基基团的例子包括但不限于-NHS(＝O)2CH3和-N(CH3)S(＝O)2C6H5。
亚磷酰胺：-OP(OR1)-NR2 2，其中R1和R2是亚磷酰胺取代基，例如，-H、(任选地取代的)C1-7烷基基团、C3-20杂环基基团或C5-20芳基基团，优选-H、C1-7烷基基团或C5-20芳基基团。亚磷酰胺基团的例子包括但不限于-OP(OCH2CH3)-N(CH3)2、-OP(OCH2CH3)-N(i-Pr)2和-OP(OCH2CH2CN)-N(i-Pr)2。
磷酰胺：-OP(＝O)(OR1)-NR2 2，其中R1和R2是磷酰胺取代基，例如，-H、(任选地取代的)C1-7烷基基团、C3-20杂环基基团或C5-20芳基基团，优选-H、C1-7烷基基团或C5-20芳基基团。亚磷酰胺基团的例子包括但不限于-OP(＝O)(OCH2CH3)-N(CH3)2、-OP(＝O)(OCH2CH3)-N(i-Pr)2和-OP(＝O)(OCH2CH2CN)-N(i-Pr)2。
在很多情况下，取代基本身可被取代。例如，C1-7烷氧基基团可有例如C1-7烷基(也称为C1-7烷基-C1-7烷氧基基团)(例如环己基甲氧基)、C3-20杂环基基团(也称为C5-20芳基-C1-7烷氧基基团)(例如，邻苯二甲酰亚胺基乙氧基)或C5-20芳基基团(也称为C5-20芳基-C1-7烷氧基基团)(例如，苄氧基)的取代基。
C1-12亚烷基：本文中使用的术语“C1-12亚烃基”是指通过除去具有1至12个碳原子的脂肪直链烃化合物的两个氢原子而获得的双齿状基团，所述氢原子为从两个相同的碳原子中除去两个氢原子，或从两个不同的碳原子的每个中除去一个氢原子，所述烃化合物可为饱和的、部分不饱和的或完全不饱和的。因此，术语“亚烷基”包括下文中讨论的亚烯基、亚炔基等。
饱和的C1-12亚烷基的例子包括但不限于-(CH2)n-，其中n是1至12的整数，例如，-CH2-(亚甲基)、-CH2CH2-(亚乙基)、-CH2CH2CH2-(亚丙基)、-CH2CH2CH2CH2-(亚丁基)和-CH2CH2CH2CH2CH2-(亚戊基)。
部分不饱和C1-12亚烷基的例子包括但不限于-CH＝CH-(亚乙烯基)、-CH＝CH-CH2-、-CH2-CH＝CH2-、-CH＝CH-CH2-CH2-、-CH＝CH-CH2-CH2-CH2-、-CH＝CH-CH＝CH-和-CH＝CH-CH＝CH-CH2-。
亚烷基可任选地用一个或多个取代基，所述取代基包括单不限于上述列出的那些。C1-12亚烷基链可被一个或多个二价杂原子基团(例如，氧、氮(其可被C1-7烷基所取代)或硫所中断。
将特别的标记或定义(例如，R)应用至一个或多个化合物中超过一个取代基时，该取代基的每次发生都独立于其他取代基，并且可与任何具有该标记的其他取代基相同或不同。
包括其他形式：这些取代基的公知的离子、盐、溶剂化物和保护形式包括在上文中。例如，提到羧酸(-COOH)也包括其阴离子(羧酸根)形式(-COO-)、盐或溶剂化物，以及常规的保护形式。类似地，提及氨基基团，包括氨基基团的质子化形式(-N+HR1R2)、盐或溶剂化物(例如，氢氯化物盐)，以及氨基基团常规的保护形式。类似地，提及羟基基团，也包括其阴离子形式(-O-)、盐或溶剂化物，以及羟基基团的常规保护形式。
异构体、盐、溶剂化物、保护形式和前药：某些化合物可存在于一种或多种特定的几何异构体、光学异构体、对映体、非对映体、差向异构体、立体异构体、互变异构体、构象异构体或异头物形式，包括但不限于顺式(cis)-和反式(trans)-形式；E-和Z-形式；c-、t-和r-形式；endo-和exo-形式；R-、S-和内消旋形式；D-和L-形式；d-和l-形式；(+)和(-)形式；酮、烯醇和烯醇化物形式；syn-和anti-形式；向斜和背斜形式；α-和β-形式；轴向和平伏形式；船式、椅式、扭船式、信封式和半椅式形式；和其组合，在下文中共同称为“异构体”(或“异构体形式”)。
要注意的是，除了下文中讨论的互变异构形式之外，明确排除在本文中使用的术语“异构体”之外的是结构(structural、constitutional)异构体(即，原子之间的连接不同，而非仅原子在空间中的位置不同)。例如，提及甲氧基基团-OCH3，不能被解释为提及其结构异构体羟甲基基团，-CH2OH。类似地，提及邻氯苯基不能被解释为提及其结构异构体间氯苯基。然而，提及一类结构或通式包括属于该类或通式的结构异构体形式(例如，C1-7烷基包括正丙基和异丙基；丁基包括正、异、仲和叔丁基；甲氧基苯基包括邻、间和对甲氧基苯基)，并且，除了特别陈述或说明之外，本文中化合物的所有可能的构象和构型都意在包括于所述通式中。
上文中的排除不涉及互变异构形式，例如，酮、烯醇和烯醇化物形式，例如以下互变异构对中：酮/烯醇(下图所示)、亚胺/烯胺、酰胺/亚氨基醇、脒/脒、亚硝基/肟、硫酮/烯硫醇、N-亚硝基/羟基偶氮和硝基/酸硝基。
要注意的是，具有一个或多个同位素取代的化合物特别地包括在术语“异构体”中。例如，H可为任何同位素形式，包括1H、2H(D)和3H(T)；C可为任何同位素形式，包括12C、13C和14C；O可为任何同位素形式，包括16O和18O，等。
除非另外指定，否则提及具体的化合物包括全部所述同位素形式，包括(全部或部分)其外消旋和其他混合物。用于制备(例如，非对称合成)和分离(例如，分级结晶和色谱方法)所述异构体形式的方法或是本领域中已知的，或是已经通过适应本文中教导的方法而容易地获得，或以已知方式的已知的方法。
除非另外指定，提到具体的化合物也包括其离子、盐、溶剂化物和保护形式，例如下文中讨论的那些。
可方便或理想地制备、纯化和/或处理活性化合物对应的盐，例如，药学上可接受的盐。Berge，等，J.Pharm.Sci.，66，1-19(1977)中讨论了药学上可接受的盐的例子。
例如，如果所述化合物是阴离子，或具有可为阴离子的官能团(例如，-COOH可为-COO-)，那么可用适宜的阳离子形成盐。合适的无机阳离子的例子包括但不限于碱金属离子(例如，Na+和K+)、碱土金属阳离子(例如，Ca2+和Mg2+)，以及其他阳离子(例如，Al3+)。适宜的有机阳离子的例子包括但不限于铵离子(即，NH4 +)和取代的铵离子(例如，NH3R+、NH2R2 +、NHR3 +、NR4 +)。一些合适的取代铵离子的例子来自如下胺：乙胺、二乙胺、二环己胺、三乙胺、丁胺、乙二胺、乙醇胺、二乙醇胺、哌嗪、苄胺、苯基苄胺、胆碱、葡甲胺和缓血酸胺，以及氨基酸，例如赖氨酸和精氨酸。普通季铵离子的例子是N(CH3)4 +。
如果该化合物是阳离子，或具有可为阳离子的官能团(例如，-NH2可为-NH3 +)，那么可与合适的阴离子形成盐。合适的无机阴离子的例子包括但不限于来自如下无机酸：盐酸、氢溴酸、氢碘酸、硫酸、亚硫酸、硝酸、亚硝酸、磷酸和亚磷酸。合适的有机阴离子的例子包括但不限于来自如下有机酸：乙酸、丙酸、琥珀酸、乙醇酸、硬脂酸、棕榈酸、乳酸、苹果酸、扑酸、酒石酸、柠檬酸、葡萄糖酸、抗坏血酸、马来酸、羟基马来酸、苯乙酸、谷氨酸、天冬氨酸、苯甲酸、肉桂酸、丙酮酸、水杨酸、磺胺酸、2-乙酰氧基苯甲酸、富马酸、苯磺酸、甲苯磺酸、甲磺酸、乙磺酸、乙烷二磺酸、草酸、泛酸、羟基乙磺酸、戊酸、乳糖酸和葡萄糖酸。合适的多聚阴离子的例子包括但不限于来自以下聚合物酸：单宁酸、羧甲基纤维素。
可方便或理想地制备、纯化和/或处理活性化合物对应的溶剂化物。本文中，以其常规意义使用术语“溶剂化物”，其是指溶质(例如，活性化合物、活性化合物的盐)和溶剂的复合物。如果所述溶剂是水，则所述溶剂化物可被方便地称为水合物，例如一水合物、二水合物、三水合物等。
可以以化学保护形式方便或理想地制备、纯化和/或处理活性化合物。本文中使用的术语“化学保护形式”是指这样的化合物，其中保护一种或多种反应性官能团以免其发生不期望的化学反应，即其为受保护的或保护基团的形式(也称为被掩蔽或掩蔽基团或者被封闭或封闭基团)。通过保护反应性官能团，可进行涉及其他未保护的反应性官能团的反应，而不影响所保护的基团；所述保护基团可被除去，通常在随后的步骤中除去，而不显著影响该分子的其余部分。参见例如′Protective Groups in OrganicSynthesis′(T.Green and P. Wuts，Wiley，1999)。
例如，羟基基团可作为醚(-OR)或酯(-OC(＝O)R)而被保护，例如，作为叔丁基醚；苄基醚、二苯甲基(benzhydryl)(二苯基甲基(diphenylmethyl))醚、三苯甲基(trityl)(三苯基甲基(triphenylmethyl))醚；三甲基硅基醚或叔丁基二甲基硅醚；或乙酰酯(-OC(＝O)CH3，-OAc)而保护。
例如，醛或酮基团可分别作为缩醛或缩酮而保护，通过与例如伯醇的反应，其中的羰基基团(＞C＝O)被转化为二醚(＞C(OR)2)。在酸存在下，通过使用大量过量的水透析，很容易产生醛或酮基团。
例如，氨基基团可作为例如酰胺或聚氨酯而被保护，例如作为甲基酰胺(-NHCO-CH3)；苄氧基酰胺(-NHCO-OCH2C6H5，-NH-Cbz)；作为叔丁基氧基酰胺(-NHCO-OC(CH3)3，-NH-Boc)；2-联苯-2-丙氧基酰胺(-NHCO-OC(CH3)2C6H4C6H5，-NH-Bpoc)、作为9-芴基甲氧基酰胺(-NH-Fmoc)、作为6-硝基藜芦基氧基酰胺(-NH-Nvoc)、作为2-三甲基甲硅烷基乙氧基酰胺(-NH-Teoc)、作为2，2，2-三氯乙氧基酰胺(-NH-Troc)、作为烯丙氧基酰胺(-NH-Alloc)、作为2(-苯磺酰基)乙氧基酰胺(-NH-Psec)或在适宜的情况下，作为N-氧化物(＞NO$)而被保护。
例如，羧酸基团可作为酯而被保护，例如作为如下酯而保护：C1-7烷基酯(例如，甲基酯；叔丁基酯)；C1-7卤代烷基酯(例如，C1-7三卤代烷基酯)；三C1-7甲硅烷基硅基-C1-7烷基酯；或C5-20芳基-C1-7烷基酯(例如，苄基酯；硝基苄基酯)；或作为酰胺(例如，作为甲基酰胺)而被保护。
可方便或理想地以前药的形式制备、纯化和/或处理活性化合物。本文中使用的术语“前药”是指这样的化合物，当被代谢(例如，体内)时，产生所需的活性化合物。一般来说，所述前药是无活性的，或比活性化合物的活性低，但可提供有利的处理、施用或代谢特性。
例如，一些前药是活性化合物的酯(例如，生理上可接受的代谢不稳定的酯)。在代谢过程中，酯基团(-C(＝O)OR)被切割以产生活性药物。可通过酯化来形成这样的酯，例如母化合物中的任何羧酸基团(-C(＝O)OH)与母化合物中酌情预先保护的任何其他反应基团的酯化来形成这样的酯，并且，如果需要的话，随后脱保护。这样的代谢不稳定的酯的例子包括这样的酯，其中R为C1-7烷基(例如，-Me、-Et)；C1-7氨基烷基(例如，氨基乙基；2-(N，N-二乙胺基)乙基；2-(4-吗啉基)乙基)；和酰氧基-C1-7烷基(例如，酰氧基甲基；酰氧基乙基；例如特戊酰氧基甲基；乙酰氧基甲基；1-乙酰氧基乙基；1-(1-甲氧基-1-甲基)乙基-羧基氧基乙基；1-(苄基氧基)乙基；异丙基氧基-羰基氧基甲基；1-异丙基氧基-羰基氧基乙基；环己基-羰基氧基甲基；1-环己基-羰基氧基乙基；环己基氧基-羰基氧基甲基；1-环己基氧基-羰基氧基乙基；(4-四氢吡喃基氧基)羰基氧基甲基；l-(4-四氢吡喃基氧基)羰基氧基乙基；(4-四氢吡喃基)羰基氧基甲基；和1-(4-四氢吡喃基)羰基氧基乙基)。
此外，一些前药被酶活化，以产生活性化合物，或是经过进一步的化学反应产生活性化合物的化合物。例如，所述前药可为糖衍生物或其他糖苷缀合物，或可为氨基酸酯衍生物。
糖基化转移酶的生产
为了优化活化的氟唾液酸化合物的转移，鉴定和/或优化用于根据本文中公开的方法的糖基转移酶的特性可以是理想的。本文中的例子表明，可使用来自草地夜蛾(S.frugiperda)的α-2，3-(O)-唾液酸转移酶来形成糖接受体和本发明氟唾液酸化合物之间的缀合物。然而，可开发候选酶，以提高该反应的效率，例如，改善该酶的一个或多个特性，例如提高结合常数(Km)和催化转换数(kcat)和/或底物特异性。糖基转移酶的开发可涉及例如定向进化(directed evolution)技术的使用，所述技术在Aharoni等，Nature Methods，2003，3，609-614中说明。
糖基化
使用本发明在指定的位点控制糖基化的能力，代表了用于改造糖基化结构的有用工具。其可通过制造糖基化结构的糖接受体部分，并随后使其与活化的氟唾液酸化合物反应而完成。所述糖基化结构一般为糖，并可包含单触角结构、双触角结构、三触角结构或复合糖基化结构。在此公开的化学可采用天然或合成的单糖、寡糖或多糖，并且其可被用于修饰N连接或O连接的糖基化结构。
本发明的方法可包括一个或多个其他步骤，所述步骤作为糖基化结构之合成的一部分或将其引入治疗部分(例如，治疗性多肽)的一部分而进行。可在包含糖基化结构的治疗性部分上或在糖基化结构连接至治疗性部分之前进行这些步骤。这些步骤包括从糖基化结构中除去末端糖基基团以形成糖接受体基团，例如，在使用唾液酸酶的酶反应中的步骤。在一些糖基化基团未连接至治疗性部分的实施方案中，当进行缀合物反应时，该方法可包括将所述缀合物连接至所述治疗性部分的额外步骤。该方法还可包括将糖基化结构引入进入多肽中位点的最初步骤。
作为替代地或补充，本发明的方法还可用于将多个3-氟唾液酸化合物转移至糖接受体。这可通过转移包含多个3-氟唾液酸化合物的寡聚物或通过重复该缀合反应而完成。
作为替代地或补充，所述糖基化结构还可包含接头基团和/或其他基团(例如一个或多个聚(亚烷基二醇)分子)。在一个优选的实施例中，所述多肽表示为以下示意式：
多肽-AA-L1-Gly
其中：
AA为所述多肽的末端或内部氨基酸残基；
L1是共价连接至所述氨基酸AA的任选的接头基团；
Gly表示糖接受体基团，其任选地是糖基化结构的一部分。
在很多情况下，所述治疗性部分会是多肽，尽管本发明一般适用于其中包含糖基化或需要引入糖基化的任何类型的治疗部分。多肽包括治疗性蛋白和抗体及其片段，以例如控制其免疫原性和药理特性(例如，半衰期)。目前，重组蛋白治疗剂的制造是昂贵和缓慢的，因其通常使用哺乳动物细胞系来生产，以确保所述蛋白是糖基化的。在细菌细胞系中生产之后，本文中公开的方法可用于向多肽中添加糖基化，细菌细胞系中表达一般更加高效，因而帮助提高蛋白生产的速度和/或经济性，同时保持其糖基化。或者，对于使表达产物糖基化的细胞系中表达的多肽，可使用本发明来修饰或添加糖基化。
在一些优选的实施方案中，所使用的糖可包含天然支链寡糖的化学修饰衍生物，所述寡糖通常展示在N或O连接的糖蛋白或其降解产物上。可在本发明中使用的糖基团是本领域中公知的，并且包括见于真核蛋白中的N和O连接的糖基基团和人造糖基团的，例如，参见WO2003/025133和WO2004/083807中公开的糖基团以及生产和鉴定它们的方法。
在序列子(sequon)中，发现N连接的多肽连接至精氨酸的R基团的氮(N)上。所述序列子是Asn-X-Ser或Asn-X-Thr序列，其中X是除脯氨酸之外的任何氨基酸，并可由N-乙酰基半乳糖胺、半乳糖、神经氨酸、N-乙酰葡糖胺、果糖、甘露糖、岩藻糖和其他单糖构成。
在真核细胞中，N连接的聚糖来自细胞质和内质网中组装的核心14糖单元。首先，两个N-乙酰基葡糖胺残基连接至多萜醇磷酸(dolicholphosphate)，其为内质网膜外侧上的脂质。随后，5个甘露糖残基被添加至该结构。这时，部分完成的核心聚糖糖被迅速翻转跨越所述内质网膜，以使其现在位于网状腔内。随后，在内质网内部通过添加另外4个甘露糖残基而继续组装。最后，3个葡萄糖残基被添加至该结构中。在所述网状腔中，完全组装之后，通过糖基转移酶寡糖基转移酶将所述聚糖全部转移至新生的肽链。因此，N连接多糖的所述核心结构由14个残基构成(3个葡萄糖、9个甘露糖和2个N-乙酰葡糖胺)。
在真核细胞中，O连接的聚糖糖是在高尔基体中一次一个糖地组装在肽链的丝氨酸或苏氨酸残基上而组装的。与N连接的多糖不同，尚没有已知的共有序列。然而，在相对于丝氨酸或苏氨酸的-1或+3安放脯氨酸残基是对O连接糖基化有利的。
在O连接的聚糖的合成中，第一个连接的单糖是N-乙酰基-半乳糖胺。此后，多种不同的途径是可能的。核心1结构是通过添加半乳糖产生的。核心2结构是通过添加N-乙酰-葡糖胺至核心1结构的N-乙酰基-半乳糖胺而产生的。核心3结构是通过添加单个N-乙酰基-葡糖胺至初始的N-乙酰基-半乳糖胺而产生的。核心4结构是通过添加第二个N-乙酰基-葡糖胺至核心3结构而产生的。虽然不常见，但其他核心结构也是可能的。O连接的聚糖中常见的结构主题是添加聚乳糖胺单位至各种核心结构上。这些是通过重复添加半乳糖和N-乙酰基-葡糖胺单元而形成的。O连接的聚糖上的聚乳糖胺链通常是通过添加唾液酸残基(类似于神经氨酸)而加帽的(capped)。如果还添加了岩藻糖残基，在倒数第二个残基旁边，则形成唾液酸-lewis-X(sialyl-Lewis-X，SLex)结构。
糖基化结构的例子包括以下O连接和N连接的结构：
其中X是本文中讨论的接头，而Y是氢或蛋白质或多肽。
其中X是聚糖基团或本文中讨论的接头，而Y是氢或蛋白质或多肽。多肽
本发明的方法一般适用于一系列基于能够修饰糖基化的反应，特别是添加唾液酸基团至治疗性部分(例如，多肽)的应用。本文中使用的多肽包括其中单体是氨基酸并且通过酰胺键连接到一起的聚合物。形成多肽的氨基酸可包括非天然氨基酸(例如β-丙氨酸、苯基甘氨酸和高精氨酸)，或不是核酸编码的氨基酸，和/或本发明中还可使用被修饰包括反应基团、糖基化位点、聚合物、治疗性部分、生物分子等的氨基酸。本发明中使用的所有氨基酸可为D-或L形式。一般优选使用天然的L-异构体。本发明中可使用的多肽可为初始为糖基化的或未糖基化的多肽，并且这包括未被表达它们的系统完全糖基化的多肽。
所描述的方法适用于任何大小或类型的多肽，从单个氨基酸和肽至具有高达或超过100kDa分子量的多肽和蛋白。因此，为了方便，本文中的该方法一般通过提及“多肽”来描述，这应被认为包括氨基酸的较短序列(例如，从2、3、4、5或10个氨基酸长度至30、40或50个氨基酸长度)，其有时在本领域中称为肽。该术语还应被认为包括具有二级、三级或四级结构(一般被称为蛋白)的多肽和多结构域蛋白。
本文中公开的方法和试剂对于使治疗性多肽功能化尤其地有用，例如，修饰其药理学特性(例如，稳定性、生物半衰期或水溶性)或所述肽的免疫学特征。
可根据本发明而进行修饰的适宜的多肽类别的例子包括红细胞生成素(erythropoietin，EPO)、干扰素、白细胞介素、趋化因子、淋巴因子、细胞因子、胰岛素、单克隆抗体和片段、重组抗体和片段、凝血因子、集落刺激因子(CSF)、生长激素、纤溶酶原激活物、病毒来源的肽(virally-derived peptide)、生殖激素和治疗性酶。可使用的多肽的具体例子包括集落刺激因子(CSF)、粒细胞集落刺激因子(G-CSF)、粒细胞巨噬细胞集落刺激因子(GM-CSF)、因子VIIa、因子VIII、因子IX、人生长激素(hGH)、DNA酶、胰岛素、胰高血糖素、VEGF、VEGF受体、TNF、TNF受体、血小板衍生生长因子(PDGF)、组织纤溶酶原激活物(tPA)、红细胞生成素(EPO)、恩夫韦肽(enfurvirtide)、胰岛素样生长因子(IGF)、神经生长因子(NGF)、IL-1、IL-2、IL-6、IL-I0、IL-12、IL-18、IL-24、干扰素β-1a、干扰素β-1b、干扰素α-2a、干扰素α-2b、干扰素α或干扰素γ。
在本发明中，提及是抗体的多肽则包括无论天然的或者部分或全部合成生产的免疫球蛋白。该术语还涵盖任何包含抗原结合结构域的多肽或蛋白。包含抗原结合结构域的抗体片段包括Fab、scFv、Fv、dAb、Fd片段、双抗体(diabody)、三抗体(triabody)或纳米抗体。采用单克隆和其他抗体并使用重组DNA技术来生产保持原抗体特异性的其他抗体或嵌合分子是可能的。该技术可涉及将编码抗体的免疫球蛋白可变区或互补决定区(CDR)的DNA引入不同免疫球蛋白的恒定区或恒定区加框架区。参见例如EP0184187A、GB2，188，638A或EP0239400A。可以以很多方式修饰抗体，并且该术语应被解释为涵盖任何特异性结合成员或具有所需的特异性的抗体抗原结合结构域的物质。因此，该术语涵盖抗体片段和衍生物，包括包含免疫球蛋白结合结构域的任何天然或者完全或部分合成的多肽。因此，包含融合至另一多肽的免疫球蛋白结合结构域或等同物的嵌合分子也包括在内。EP0120694A和EP0125023A中描述了嵌合抗体的克隆和表达。
已证明完整抗体的片段可进行结合抗原的功能。结合片段的例子为(i)由VL、VH、CL和CH1结构域组成的Fab片段；(ii)由VH和CH1结构域组成的Fd片段；(iii)由单个抗体的VL和VH结构域组成的Fv片段；(iv)由VH结构域组成dAb片段(Ward，E.S.等，Nature341，544-546(1989))；(v)分离的CDR区；(vi)F(ab′)2片段，其为包含两个连接的Fab片段的二价片段；(vii)单链Fv分子(scFv)，其中通过肽接头连接VH结构域和VL结构域，所述肽接头允许所述两个结构域连接以形成抗原结合位点(Bird等，Science，242；423-426，1988；Huston et al，PNAS USA，85：5879-5883，1988)；(viii)双特异性单链Fv二聚体(PCT/US92/09965)和(ix)“双抗体”，通过基因融合而构建的多价或多特异性片段(WO94/13804；Holliger等，P.N.A.S.USA，90：6444-6448，1993)。可通过整合二硫键桥连接VH和VL结构域来稳定Fv、scFv或双链抗体分子(Reiter等，Nature Biotech，14：1239-1245，1996)。还可制造包含连接至CH3结构域之scFv的微抗体(minibody)(Hu等，Cancer Res.，56：3055-3061，1996)。
聚乙二醇化
作为采用本发明修饰多肽的糖基化的替代或补充，本文中公开的方法可被用作给定多肽聚乙二醇化之方法的一部分。聚乙二醇化是一种也可采用的设计治疗性蛋白的方法，以使其含有用于修饰其药理学特性的其他部分。一个优选的实例是将多肽缀合至聚(亚烷基二醇)分子，尤其是聚乙二醇(polyethylene glycol，PEG)分子，所述缀合可用于增强多肽治疗剂的半衰期或其他药理学特性。本发明提供以选择性的方式将目标蛋白聚乙二醇化的机会，所述选择性方式取决于所述蛋白中硫醇基基团存在的位置。聚(亚烷基二醇)分子在本领域中可互换地称为聚(环氧烷)分子，并且其为聚醚。聚(亚烷基二醇)分子可具有直链、支链、梳子状或星状结构，并且一般是高度水溶的。
根据本发明，所述糖基化结构可包含或被连接至一个或多个聚(亚烷基)二醇基团。这些基团可作为治疗性部分和糖基化结构之间的接头。
此外，基本的聚(亚烷基二醇)结构可提供一个或多个反应性官能团(例如羟基、胺、羧酸、卤代烷或硫醇基团)，以协助聚(亚烷基二醇)分子与其他种类(例如，多肽)的反应。优选的聚(亚烷基二醇)分子包括在一个或多个羟基位置用化学基团(例如具有1至4个碳原子之间的烷基基团)取代的那些分子。尽管技术人员能够联用其他聚(亚烷基二醇)分子(例如，聚丙二醇或聚乙-聚丙二醇共聚物)而使用本文中公开的技术，但根据本发明使用的最优选聚(亚烷基二醇)分子是聚乙二醇(“PEG”)分子。聚(亚烷基二醇)分子(包括PEG)通常具有约400Da至约80kDa之间的分子量，更优选在约1kDa至约60kDa之间，并且更优选在约5kDa至约50kDa之间，例如，10kDa、20kDa、30kDa或40kDa的分子量。可根据本发明使用的聚(亚烷基二醇)分子是本领域中公知的和可为公众获得的，例如获自商业化的可获得的来源(例如，SigmaAldrich)。
聚乙二醇化是用于修饰治疗性多肽(例如，肽、蛋白和抗体)之特性的已知策略。一般来说，将PEG分子连接至多肽被用于改变其构象、静电或疏水特性，并导致其生物学和药理学特性的改善，例如，增加药物的溶解性、降低剂量频率、调节(尤其是增加)循环半衰期、增加药物的稳定性和增加对蛋白水解降解的耐受。通过将多肽缀合至一个或多个PEG聚合物分子，聚乙二醇化通过增加治疗性多肽的分子量而发挥作用。本发明的方法具有通过硫醇基团的存在来确定引入PEG分子进入多肽之位置的优势。
接头及其用途
在本发明的一些实施方案中，多肽的糖基化可通过接头基团被连接至多肽的末端或内部氨基酸残基。在本发明的一个优选的方面中，该接头基团可包含具有乙烯取代基的含氮杂芳环，所述乙烯取代基用于与一个或多个硫醇基团反应，所述硫醇基团是天然存在的或被引入所述多肽的，例如，一个或多个半胱氨酸残基的硫醇基团。这些接头基团具有可额外地被连接至能够改变多肽特性的偶联伙伴(coupling partner)(例如，聚(亚烷基二醇)分子或聚糖基团)的位置。GB-A-0823309.0中描述了用于在期望引入糖基化时将偶联其至多肽中的氨基酸的这类接头和方法的例子，其通过引用明确地整体并入本文。
实施例
阐述以下实施例以为本领域的技术人员提供如何实施本发明的完整公开和说明，并且其并不意在限制本发明的范围。
实验
合成活化的3-氟唾液酸供体。
将半缩醛(173mg)溶于5ml的CH2Cl2中，并保持在N2气下。向溶液中添加吡啶(164.8μl，6当量(eq.))和甲磺酰氯(79.2μl，3当量)。在R.T.下，使该反应物被搅拌5小时。浓缩该反应物并用硅胶色谱纯化(10％EtOAc/石油醚→10％MeOH/EtOAc)以获得白色产物(152mg，76％产率)。1H NMR，400MHz(CDCl3)：5.66(br. s，1H)，5.47(dd，1H，J＝1.6和4.7Hz)，5.40-5.21(m，2H)，4.92(dd，1H，H-3，J＝2.3，48.9Hz)，4.66(dd，1H，J＝2.3和12.5Hz)，4.49-4.43(m，2H)，4.17(dd，1H，J＝6.7和12.5Hz)，3.91(s，3H)，3.18(s，3H)，2.15(s，3H)，2.10(s，3H)，2.07(s，3H)，2.02(s，3H)，1.90(s，3H)。19F NMR，400MHz(CDCl3)：-206.00(dd，J＝28.8和48.9Hz)。ESI-MS：预计的分子离子C21H30FN2O15S＝587.1320。实测M+Na+＝610.1235。
将完全保护的甲磺酰基唾液酸(72mg，0.123mmol)溶于THF(4ml)中。向其中添加1M NaOH(7.5当量，0.92ml)。超声该反应物30秒并保持在4℃下搅拌过夜。用amberlite IR120+中和该反应，过滤并在真空中缩小体积。冷冻干燥剩余的溶液以获得脱保护的甲磺酸酯/盐白色粉末(30mg)，其无需进一步纯化而使用。ESI-MS：预计的分子离子C12H20FNO11S＝405.0741。实测M-H+＝404.0683。
将甲磺酰基-唾液酸(3mg，7.4μmol)添加至溶液中，所述溶液含有1mM氯化镁、10mM pNP-乳糖、50mM柠檬酸钠缓冲液[pH＝6.0，具有5％(v/v)Triton-X和0.5％(w/v)牛血清白蛋白]、5mM半胱氨酸、5mM半胱氨酸和20μLα-2，3-(O)-唾液酸转移酶(大鼠重组的，草地夜蛾，0.8mg/ml)。在37℃下孵育该反应物18小时，随后进行质谱分析。预计的分子离子C29H41F1N2O21＝772.2186。实测M-H+＝771.2123。
将二氟唾液酸(3mg，9.1μmol)添加至溶液中，所述溶液含有10mMpNP-乳糖、30mM氯化钠、20mM Tris-HCl缓冲液[pH＝7.6]和40μL克氏锥虫(T.cruzi)转唾液酸酶(1.0mg/ml)。在37℃下孵育该反应物18小时，随后通过质谱分析以确证产生了3-氟唾液酸乳糖产物。预计的分子离子C29H41F1N2O21＝772.2186。实测M-H+＝771.2117。
尽管为了清楚和理解的目的，上述发明是以一些具体细节来描述的，但很清楚的是，对于本领域的技术人员来说，通过阅读本公开内容，可对其进行各种形式和细节的改变。例如，上文中描述的所有技术和设备可以以各种组合物使用。本申请中引用的所有的出版物、专利、专利申请和/或其他文献就所有目的而言均通过引用整体并入，与每个单独的出版物、专利、专利申请和/或其他文献各自表明就所有目的而言通过引用并入之程度相同。
参考文献：
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Claims (27)

1.一种对多肽进行糖基化的方法，其包括在糖接受体和3-氟唾液酸化合物之间形成共价缀合物，所述方法包括将所述糖接受体和3-氟唾液酸化合物相接触，所述接触步骤在适于使所述3-氟唾液酸化合物与所述糖接受体反应并共价键合的条件下进行，其中酶促地或者使用来自糖化学领域的合成技术进行所述3-氟唾液酸化合物与所述糖接受体的反应和共价键合，其中所述3-氟唾液酸化合物不包含胞苷一磷酸(CMP)基团，其中所述糖接受体存在于所述多肽上或用于连接至所述多肽，其中所述3-氟唾液酸化合物表示为以下通式(I)：
或者两个或更多个式(I)分子的寡聚物；
和其异构体、盐、溶剂化物或化学保护形式，
其中：
Y1选自-O-、-S-或-NR-，其中R独立地选自H、C1-7烷基、C3-10杂环基或C5-20芳基；
R1是能够支持和稳定负电荷的离去基团，前提是其不是胞苷一磷酸(CMP)基团；
X1是-CO2R，其中R的定义见上文；
R2选自H或卤素；
R3和R4各自独立地选自H、-OR、-NR2或-Z1(CH2)mZ2，其中R的定义见上文，Z1选自-O-、-NR-、-CR2-和-S-，m是从0至5，并且Z2选自-OR、-NR2或-CN；前提是R3和R4不能同时是H；
R5是H；
R6选自C1-7烷基；C1-7羟基烷基，C1-7氨基烷基或C1-7硫代烷基；
R7是下式的基团：
其中Y2选自N、O、S和CH；Z3选自H、羟基、卤素、C1-7烷基、C1-7氨基烷基、C1-7羟基烷基或C1-7硫代烷基；R9和R10独立地选自H、羟基、C1-7羟基烷基、C1-7烷基、C5-20芳基、C(O)Z4，其中Z4选自C1-7烷基或C5-20芳基，前提是如果Y2是O或S，则R10不存在；
或者其中R4不是羟基，R7可另外是C1-7羟基烷基；
R8是H。
2.权利要求1的方法，其中所述方法包括将所述糖接受体、所述3-氟唾液酸化合物和能够将所述3-氟唾液酸化合物转移至所述糖接受体的酶相接触，所述接触步骤在适合转移所述3-氟唾液酸化合物并使其共价键合至所述糖接受体的条件下进行，或者其中所述3-氟唾液酸化合物与所述糖接受体的共价键合是通过合成化学反应进行的。
3.权利要求1或2的方法，其中与3-氟唾液酸化合物的共价缀合物的形成调节糖接受体或包含所述糖接受体的治疗性部分的生物特性，任选地其中所述生物特性是对酶水解的抵抗、生物稳定性或药代动力学特性。
4.权利要求1或2的方法，其中所述方法是体外无细胞方法。
5.权利要求1的方法，其中R1是甲磺酸酯/盐、4-甲苯磺酸酯/盐、三氟甲基磺酸酯/盐、三氟甲基甲苯磺酸酯/盐、咪唑磺酸酯/盐或卤素。
6.权利要求1或2的方法，其中所述反应是酶促的，伴有在3-氟唾液酸化合物和糖接受体之间异头连接处的倒转。
7.权利要求1或2的方法，其中所述糖接受体是糖基化结构的一部分。
8.权利要求7的方法，其中：
(a)所述糖基化结构包含单触角结构、双触角结构、三触角结构或复合糖基化结构；和/或
(b)所述糖基化结构包含天然的或合成的单糖、寡糖或多糖；和/或
(c)所述糖基化结构包含N连接的或O连接的糖基团。
9.权利要求7的方法，其中所述方法还包括从糖基化结构中除去末端糖基基团以形成糖接受体基团，任选地其中所述末端糖基基团的除去是通过使用唾液酸酶酶促进行的。
10.权利要求1或2的方法，其中所述方法包括将多个3-氟唾液酸化合物转移至糖接受体，任选地其中所述多个3-氟唾液酸化合物是作为寡聚体或通过重复所述缀合反应而转移的。
11.权利要求1或2的方法，其包括将所述缀合物连接至多肽。
12.权利要求1或2的方法，其中所述方法包括将多个3-氟唾液酸基团转移至多肽上存在的糖基化结构的一个或多个末端糖基残基。
13.权利要求1或2的方法，其中用于转移所述3-氟唾液酸基团的酶是唾液酸转移酶或转唾液酸酶，并且任选地其中所述酶是经基因改造而提高转移反应速率和/或提高供体3-氟唾液酸分子之结合的唾液酸转移酶或转唾液酸酶。
14.权利要求7的方法，其包括将糖基化结构引入多肽中位点的初始步骤。
15.权利要求1或2的方法，其中所述糖基化结构包含聚(亚烷基二醇)分子。
16.权利要求1或2的方法，其中所述多肽表示为下式：
多肽-AA-L1-Gly
其中：
AA是所述多肽的末端或内部氨基酸残基；
L1是共价连接至所述氨基酸AA的任选的接头基团；
Gly表示糖接受体基团，其任选地是糖基化结构的一部分。
17.权利要求1或2的方法，其中：
(a)所述将3-氟唾液酸化合物与所述糖接受体和所述多肽缀合的反应改变所述多肽的稳定性、生物半衰期、清除特性、水溶性和/或免疫学特征；和/或
(b)所述方法是为了提高多肽的糖基化结构对唾液酸酶水解的抗性；和/或
(c)所述多肽是红细胞生成素、干扰素、白细胞介素、趋化因子、淋巴因子、胰岛素、单克隆抗体或其片段、重组抗体或其片段、凝血因子、集落刺激因子、生长激素、纤溶酶原激活物、病毒来源的肽、生殖激素或治疗性酶。
18.权利要求1或2的方法，其中：
(a)所述将3-氟唾液酸化合物与所述糖接受体和所述多肽缀合的反应改变所述多肽的稳定性、生物半衰期、清除特性、水溶性和/或免疫学特征；和/或
(b)所述方法是为了提高多肽的糖基化结构对唾液酸酶水解的抗性；和/或
(c)所述多肽是细胞因子。
19.一种可通过前述权利要求中任一项的方法获得的缀合物。
20.一种包含糖基化结构之治疗性多肽的缀合物，其中所述糖基化结构共价键合至一个或多个3-氟唾液酸基团，其中所述3-氟唾液酸基团形成所述糖基化结构的末端糖基基团，
其中酶促地或者使用来自糖化学领域的合成技术进行3-氟唾液酸化合物与所述糖基化结构的共价键合使得所述糖基化结构共价键合至所述3-氟唾液酸基团，其中所述3-氟唾液酸化合物不包含胞苷一磷酸(CMP)基团，其中所述3-氟唾液酸化合物表示为以下通式(I)：
或者两个或更多个式(I)分子的寡聚物；
和其异构体、盐、溶剂化物或化学保护形式，
其中：
Y1选自-O-、-S-或-NR-，其中R独立地选自H、C1-7烷基、C3-10杂环基或C5-20芳基；
R1是能够支持和稳定负电荷的离去基团，前提是其不是胞苷一磷酸(CMP)基团；
X1是-CO2R，其中R的定义见上文；
R2选自H或卤素；
R3和R4各自独立地选自H、-OR、-NR2或-Z1(CH2)mZ2，其中R的定义见上文，Z1选自-O-、-NR-、-CR2-和-S-，m是从0至5，并且Z2选自-OR、-NR2或-CN；前提是R3和R4不能同时是H；
R5是H；
R6选自C1-7烷基；C1-7羟基烷基，C1-7氨基烷基或C1-7硫代烷基；
R7是下式的基团：
其中Y2选自N、O、S和CH；Z3选自H、羟基、卤素、C1-7烷基、C1-7氨基烷基、C1-7羟基烷基或C1-7硫代烷基；R9和R10独立地选自H、羟基、C1-7羟基烷基、C1-7烷基、C5-20芳基、C(O)Z4，其中Z4选自C1-7烷基或C5-20芳基，前提是如果Y2是O或S，则R10不存在；
或者其中R4不是羟基，R7可另外是C1-7羟基烷基；
R8是H。
21.权利要求20的缀合物，其中所述糖基化结构在糖基化位点处和/或通过所述多肽的氨基酸残基连接至所述多肽，任选地通过接头基团连接至所述多肽。
22.一种糖基化结构，其中所述糖基化结构包含一个或多个3-氟唾液酸基团并且其中所述3-氟唾液酸基团共价键合至所述糖基化结构的一个或多个末端糖基基团，任选地其包含至少一个3-氟唾液酸基团和另外两个糖单元，
其中酶促地或者使用来自糖化学领域的合成技术进行3-氟唾液酸化合物与所述糖基化结构的共价键合使得所述3-氟唾液酸基团共价键合至所述糖基化结构的所述末端糖基基团，其中所述3-氟唾液酸化合物不包含胞苷一磷酸(CMP)基团，其中所述3-氟唾液酸化合物表示为以下通式(I)：
或者两个或更多个式(I)分子的寡聚物；
和其异构体、盐、溶剂化物或化学保护形式，
其中：
Y1选自-O-、-S-或-NR-，其中R独立地选自H、C1-7烷基、C3-10杂环基或C5-20芳基；
R1是能够支持和稳定负电荷的离去基团，前提是其不是胞苷一磷酸(CMP)基团；
X1是-CO2R，其中R的定义见上文；
R2选自H或卤素；
R3和R4各自独立地选自H、-OR、-NR2或-Z1(CH2)mZ2，其中R的定义见上文，Z1选自-O-、-NR-、-CR2-和-S-，m是从0至5，并且Z2选自-OR、-NR2或-CN；前提是R3和R4不能同时是H；
R5是H；
R6选自C1-7烷基；C1-7羟基烷基，C1-7氨基烷基或C1-7硫代烷基；
R7是下式的基团：
其中Y2选自N、O、S和CH；Z3选自H、羟基、卤素、C1-7烷基、C1-7氨基烷基、C1-7羟基烷基或C1-7硫代烷基；R9和R10独立地选自H、羟基、C1-7羟基烷基、C1-7烷基、C5-20芳基、C(O)Z4，其中Z4选自C1-7烷基或C5-20芳基，前提是如果Y2是O或S，则R10不存在；
或者其中R4不是羟基，R7可另外是C1-7羟基烷基；
R8是H。
23.一种包含一个或多个末端3-氟唾液酸基团的糖基化结构，其中所述结构表示为下式：
或者两个或更多个式(I)分子的寡聚物；
和其异构体、盐、溶剂化物或化学保护形式，
其中：
Y1选自-O-、-S-或-NR-，其中R独立地选自H、C1-7烷基、C3-10杂环基或C5-20芳基；
X1是-CO2R，其中R的定义见上文；
X2表示所述糖基化结构的其余部分，并且其包含至少两个糖单元；
R2选自H或卤素；
R3和R4各自独立地选自H、-OR、-NR2或-Z1(CH2)mZ2，其中R的定义见上文，Z1选自-O-、-NR-、-CR2-和-S-，m是从0至5，并且Z2选自-OR、-NR2或-CN；前提是R3和R4不能都是H；
R5是H；
R6选自C1-7烷基；C1-7羟基烷基，C1-7氨基烷基或C1-7硫代烷基；
R7是下式的基团：
其中Y2选自N、O、S和CH；Z3选自H、羟基、卤素、C1-7烷基、C1-7氨基烷基、C1-7羟基烷基或C1-7硫代烷基；R9和R10独立地选自H、羟基、C1-7羟基烷基、C1-7烷基、C5-20芳基、C(O)Z4，其中Z4选自C1-7烷基或C5-20芳基，前提是如果Y2是O或S，则R10不存在；
或其中R4不是羟基，R7可另外是C1-7羟基烷基；
R8是氢。
24.权利要求23的糖基化结构，其中
(a)所述糖基化结构包含单触角结构、双触角结构、三触角结构或复合糖基化结构；和/或
(b)所述糖基化结构包含天然的或合成的单糖、寡糖或多糖和/或
(c)所述糖基化结构包含N连接的或O连接的糖基团。
25.权利要求23或24的糖基化结构和治疗性多肽的缀合物，其中的所述糖基化结构共价键合至一个或多个3-氟唾液酸基团，其中所述3-氟唾液酸基团形成所述糖基化结构的末端糖基基团。
26.根据权利要求19至21或25中任一项的缀合物，其用于治疗方法中。
27.一种药物组合物，其包含根据权利要求19至21或25中任一项的缀合物和药学上可接受的载体。
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