CN102469770B - 通过选择表观遗传学修饰种群改进作物产量 - Google Patents

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Abstract

在此提供了用于选择具有改进的产量的表观遗传学上固定的作物的植物和种群的方法。

Description

通过选择表观遗传学修饰种群改进作物产量
发明领域
本发明涉及农业领域。更具体地，提供了选择植物(包括作物植物)种群的方法，这些种群显示出高能量使用效率或高能量使用效率与耐旱性的组合，并且只在它们的表观遗传学状态上有所不同，允许此类所选择的并且表观遗传学上不同的种群的产量较之未经选择的种群增加。还提供了显示出高能量使用效率的表观遗传学上不同的植物和植物种群，所述植物和植物种群可以通过它们更低的细胞呼吸速率和细胞的更高的能量含量、通过它们增加的抗坏血酸盐含量和/或增加的线粒体呼吸链中的复合体I含量的组合来进行鉴别。另外提供了显示出高能量使用效率与耐旱性组合的表观遗传学上不同的植物和植物种群。可以固定表观遗传学修饰并且传递给后代。也已经发现可以将表观遗传学能量使用效率组分添加到在杂种优势上并且可以导致更高产量的杂种。
背景
以足够的数量和质量生产农产品并且特别是生产食品和饲料，是愈发具有挑战性的任务。一方面，由于世界人口的增长以及大部分世界人口的平均生活标准的提高，对农产品的需求持续增长。另一方面，适合或可用于农业的区域持续缩小，部分因为气候条件变化，这可以导致以前适合于农业的区域退化。对增加农作物产量潜能，或者当在欠佳的或不利的非生物条件下种植农作物时至少保持这种产量潜能存在持续需求。
到目前为止，为增加内在产量潜能所作的努力主要集中在开发作物内的遗传变异性。通过传统育种技术，将现存的或经诱导的变体等位基因改组到新组合中。最近，已经通过分子技术扩大变异性库，所述分子技术允许遗传物质跨物种、以及甚至跨界、跨障碍交换。
然而，对于表观遗传学控制机制在决定数量性状(例如产量)方面可能起的作用投入了远远更少的关注。确实，甚至在遗传上相同的个体的种群内，所有数量性状(例如动物的大小和重量或作物的产量、特别是种子产量)显示出具有正常分布的变异性。观察到的表型变异性的基础是遗传组分、环境因素以及表观遗传学组分。已经有文件说明，在植物中，在对胁迫的短期和长期适应中，表观遗传学控制组分的重要性(Molinier等人，2006，Transgeneration memory of stress in plants.Nature442，1046-1049)。此外，已经证明，改变的表观遗传学状态可以被传递给未暴露于或不再暴露于产生诱导作用的触发物的连续世代(也在Jablonka和Raz，2009Transgenerationalepigenetic inheritance：prevalence，mechanisms，and implications for the study ofheredity and evolution.The Quarterly Review of Biology84，No.2，131-176中进行了综述)。
然而没有直接这样的证据，即轮回选择允许驱动数量性状的表观遗传学组分朝向正态分布曲线的末端。换言之，现有技术未谈及影响或从种群(特别是从遗传上均匀的种群)中选择具有高于或低于平均值的数量性状的那些个体并且在(亚)种群中固定所选择的表观遗传学组分的能力。
Enfield和同事(Enfield，F.D.，Comstock，R.E.&Braskerud，O.Selection forpupa weight in Tribolium castaneum.I.Parameters in base populations.Genetics54，523-533(1966)；Kaufman，P.K.& Enfield，F.D.，Comstock，R.E.Stabilizingselection for pupa weight in Tribolium castaneum.Genetics87，324-341(1977))描述了实验，其中从通过具有2400μg的平均蛹重量的两种近交的粉甲虫之间的杂交获得的种群开始，通过连续近交120代，他们能够选择具有5800μg的平均蛹重量的种群。对于经过如此多代的近亲交配以后仍保持如此多的遗传变异性，Enfield等人表示出惊讶。然而在选择过程的某些阶段，不是不可能选择表观遗传学变异性而不是选择遗传变异性。这进一步由从近交系开始的多个相同实验支持，所述近交系对于影响蛹重量的基因是纯合的(Enfield，F.D.& Braskerud，O.Mutational variance for pupa weight in Tribolium castaneum.Theor.Appl.Genet.77，416-420(1989))。
已经采用不同的参数来建立与植物产量潜能的关联。在产量潜能和较低的细胞呼吸速率之间已经发现正相关。
Wilson描述了在黑麦草(Lolium perenne)中对成熟叶子的暗呼吸速率的选择的反应，以及它对于幼苗生长和模拟草地的影响(Wilson Ann.Bot.49，303-312(1982))。
Wilson和Jones描述了对成熟叶子的暗呼吸速率的选择对于黑麦草cv.S23的作物产量的影响(Wilson和Jones Ann.Bot.49，313-320(1982))。
Kraus等人报告了取决于植株密度(Kraus等人，New Phytol.123，39-44(1993))，黑麦草cv.S23的“慢”呼吸种群优于“快”呼吸种群的产量优势并且报告了对就成熟叶子呼吸速率的差异所选择的黑麦草的两个种群的产量的处理的影响(Kraus等人.Physiol.Plant.89，341-346(1993))。
Nunes-Nesi等人描述了，在转基因番茄植物中，由于降低了线粒体苹果酸脱氢酶活性而导致的增强的光合性能和生长(Nunes-Nesi et al.Plant Physiol.137，611-622(2005))。Juczczuk等人报告了线粒体基因组重排对MSC16黄瓜(Cucumis sativus)突变体的呼吸活性、光合作用、光呼吸和能量状态的影响(Juczczuk等人，Physiol.Plant.131，527-541(2007))。
De Block和De Brouwer描述了用来定量油菜品系和杂种的活力的简单并且有力的体外测定法(Plant Physiol.Biochem.40，845-852(2002))。
WO02/066972提供了方法和手段，所述方法和手段用于确定具有良好的组合能力的亲本近交植物品系、用于确定能够产生具有高杂种优势的杂交品系的亲本近交植物品系的良好组合、以及另外用于确定不同植物品系的农艺学性能，其可以在受控和胁迫条件下，通过测定线粒体中的电子流在体外进行。
然而，没有现有技术文件描述对遗传上均匀的植物种群中的低细胞呼吸速率的轮回选择，所述轮回选择允许建立具有更高产量潜能和对不利生物条件的耐受性的植物的(亚)种群。在连续世代中，表观遗传学组分可以进一步遗传(并且表现为显性因子或共显性因子)。
发明概述
在本发明的一个实施方案中，选择具有高能量使用效率的植物(例如芸苔属油菜(Brassica oilseed rape)、番茄植物或稻植物，或它们的种子)的种群的方法包括以下步骤：
a.提供由遗传上均匀的多株个体植物组成的种群；
b.以允许进一步培养所述经取样的个体植物的方式从所述种群的个体植物中分离出组织样品或外植体；
c.任选地，在激活所述植物中新陈代谢的条件下，对所述组织样品或外植体进行培养；
d.通过分析所述植物的所述样品，测定所述个体植物的细胞呼吸速率；
e.选择多株植物，其中所述样品显示了比来自所述种群的样品的平均细胞呼吸更低的、优选地是显著地更低的细胞呼吸；
f.种植所选择的植物并且从每一所选择的植物中繁殖出克隆的后代植物品系；
g.测定克隆的后代植物的每一品系的能量使用效率；
h.选择克隆植物的品系，其中所述能量使用效率高于克隆的后代植物的所有品系的能量使用效率的平均值，优选地选择具有最高能量使用效率的克隆后代植物的品系；
i.从所述所选择的克隆后代植物的品系种植出个体植物的种群；并且
j.在所述随后的种群上将步骤b到步骤i重复至少一次。
可以如下测定能量使用效率：通过测定细胞呼吸并且测定在分离的样品中的NAD(P)H含量，并用NAD(P)H含量除以呼吸以确定能量使用效率。还可以通过测量植物的抗坏血酸盐或抗坏血酸含量、或者通过测量在所述样品中的呼吸链复合体I活性来确定能量使用效率。
提供的方法包括通过测定所述样品中的细胞呼吸和以下参数中的至少一个，鉴别具有高能量使用效率的植物：抗坏血酸盐含量；NAD(P)H含量；呼吸链复合体I活性；或光呼吸；并且选择与对照植物(即未接受对于低细胞呼吸的重复选择方案的原始种群的植物)相比具有更低的细胞呼吸和更高的抗坏血酸盐含量、或更高的呼吸链复合体I活性或更低光呼吸的那些植物。通常，细胞呼吸速率可以在对照植物的细胞呼吸速率的85％和95％之间，并且NAD(P)H含量可以在对照植物的NAD(P)H含量的95％至105％之间。通常呼吸链复合体I活性可以在对照植物的呼吸链复合体I活性的120％至140％之间，并且抗坏血酸盐含量可以在对照植物的抗坏血酸盐含量的150％至220％之间。光呼吸优选在对照植物的光呼吸的80％至92％之间。
本发明还提供了用于生产具有增加的产量潜能的植物或种子的种群的方法，所述方法包括根据在此展示的选择方法从遗传上均匀的个体植物的种群中选择具有高能量使用效率的那些植物或者植物或种子的亚种群。所选择的植物可以进一步与其他植物杂交以获得具有高能量使用效率和增加的产量潜能的后代。
在本发明的另一个实施方案中，提供了用于生产具有增强的活力和/或对不利的非生物条件耐受性增加的植物或种子的种群的方法，所述方法包括根据在此给出的选择方法从遗传上均匀的个体植物的种群中选择具有高能量使用效率的那些植物或者植物或种子的亚种群。所选择的植物可以进一步与其他植物杂交以获得具有高能量使用效率并且具有增加的活力和/或对不利的非生物条件的增加的耐受性的后代。
在本发明的另一个实施方案中，提供了用于增加收获产量的方法，所述方法包括以下步骤：通过对低细胞呼吸的重复选择，从遗传上均匀的种群生产具有高能量使用效率的植物或种子的亚种群；大田种植植物或种子；并且从那些植物或种子产生收获物。
在本发明的又一个实施方案中，提供了用于生产具有高产量或对不利的非生物条件的耐受性的杂种植物或杂种种子的方法，该方法包括以下步骤：
a.根据在此提到的选择方法，选择具有高能量使用效率的植物种群用于至少一株亲本近交植物，包括用于至少两株亲本近交植物；并且如果一株亲本植物是雄性不育植物并且保持所述雄性不育植物需要使用保持系，还可任选地用于该保持系；
b.将所述种群的植物与另一株近交植物进行杂交；
c.分离所述杂交的杂种种子；并且
d.任选地，从所述种子种植杂种植物。
在本发明的又一个实施方案中，提供了通过在此描述的方法之一所选择的植物、种子、或植物种群。
因此，本发明提供了具有高能量使用效率的植物，包括杂种植物(例如芸苔属油菜、番茄植物或稻植物、或它们的种子)，其特征在于植物具有低细胞呼吸，例如细胞呼吸速率在对照植物的细胞呼吸速率的85％和95％之间，以及以下特征中的至少一个、多个、或全部：
i.可以在对照植物的抗坏血酸盐含量的150％至220％之间的高的抗坏血酸盐含量；
ii.可以在对照植物的NAD(P)H含量的95％至105％之间的高的NAD(P)H含量；
iii.可以在对照植物的呼吸链复合体I活性的120％至140％之间的高的呼吸链复合体I活性；或
iv.可以在对照植物的光呼吸的80％至92％之间的低的光呼吸；
其中对照植物是未接受对于低细胞呼吸速率的重复选择方案的遗传上均匀的种群的植物。
附图简述
图1：用于分离卡诺拉油菜(canola)中细胞呼吸和能量使用效率不同的卡诺拉油菜亚种群的选择方案。从同基因双单倍体品系开始选择。让分别具有最低、最高呼吸的约五株经选择的个体植物自交，并且各自测试后代的呼吸和能量使用效率。对分别具有最高、最低能量使用效率的种群继续选择。
图2：六株经选择的卡诺拉油菜种群对比原始起始种群的呼吸。该值是对比起始品系“Simon”的平均数而标准化的％值。每一点代表从一株个体植物获得的数据。每一种群含有约200株植物。框中的条代表该种群的中位数。该条代表指示均值的标准差。
图3：六株经选择的卡诺拉油菜种群的能量使用效率。该值是对比起始品系“Simon”的平均数而标准化的％值。中等灰色条(左)代表获得的呼吸值；浅灰色条(中)代表获得的能量含量(NAD(P)H含量)值；深灰色条(右)代表能量使用效率(NAD(P)H含量除以呼吸)。
图4：经选择的卡诺拉油菜种群对高温的耐受性。在拍照前，对植物进行10天45摄氏度。左侧的植物是来自经选择的具有低能量使用效率的种群；右侧的植物是来自经选择的具有高能量使用效率的种群。
图5：在经选择的卡诺拉油菜种群中，能量使用效率和种子产量之间的关联。这些值是对比起始品系“Simon”的平均数而标准化的％值。浅灰色条代表标准化的能量使用效率而深灰色条代表种子产量。
图6：在经选择的卡诺拉油菜种群中，能量使用效率和抗坏血酸含量之间的关联。以mg/L表示抗坏血酸含量；**p＜0.01。
图7：在经选择的卡诺拉油菜种群中的光呼吸速率。该值是对比起始品系“Simon”的平均数而标准化的％值。
图8：来源于分别具有低、高能量使用效率的经选择的品系与未经选择的品系之间的杂交的后代植物的细胞呼吸速率。该值是对比起始品系“Simon”的平均数而标准化的％值。在每一条目的左侧的条(中等灰色)代表从具有高(右半边)或低(左半边)能量使用效率的自交品系获得的后代的值。在每一条目的中间的条(浅灰色)代表从具有高(右半边)或低(左半边)能量使用效率的品系与未经选择的Simon品系的杂交获得的后代的值，其中Simon品系是雄株。在每一条目的右侧的条(深灰色)代表从具有高(右半边)或低(左半边)能量使用效率的品系与未经选择的Simon品系的杂交获得的后代的值，其中Simon品系是雌株。
图9：用于高能量使用效率父本、母本和保持系亲本品系和杂种世代的轮回选择的选择方案。
图10：通过未经选择的父本和母本的杂交生成的商用杂种植物(左侧)与通过对于高能量使用效率进行选择的父本和母本的杂交生成的杂种植物(右侧)之间的比较。
图11：通过对于高能量使用效率(％)进行选择的父本和母本的杂交生成的杂种系的种子产量，所述种子产量对比通过未经选择的父本和母本的杂交产生的对照杂种植物而标准化。
图12：对于高能量使用效率和耐旱性进行选择的亚品系的生长。播种经选择的亚品系和对照品系的种子。一半植物接受正常灌溉方案。8天以后，在“干旱方案”下的植物不再给提供水，持续8天，直至萎蔫症状变得可见。弄湿土壤。约3天以后植物开始再次萎蔫。灌溉植物并且在1天以后测定植物的鲜重。图1代表在正常灌溉下，对照植物和耐旱的选择品系(LR-PEG_1574)的数据。图2代表在干旱方案下，对照植物和耐旱的选择品系(LR-PEG_1574)的数据。
图13是在受限的供水条件下生长的对照植物和耐旱植物的图片。下面的图代表对照植物和耐旱植物的鲜重的测量。
本发明的多种实施方案的详述
本发明基于发明者的以下出乎意料的观察：
a.在低呼吸，特别是低呼吸和高能量含量(即高能量使用效率)以及产量潜能之间，甚至在遗传上均匀的种群中的个体植物之间存在关联。
b.可以通过对于具有高能量使用效率的个体植物的轮回选择并且繁殖此类植物的后代导致植物亚种群来固定在遗传上均匀的种群中的控制高能量使用效率的表观遗传学成分，其中所述植物亚种群的能量使用效率高于原始起始种群中的能量使用效率，并且其中高能量使用效率表型被稳定地传递给连续世代。
c.当与未经选择的种群杂交时，表观遗传学决定的高能量使用效率表型可以被传递，并且表现为显性或共显性性状。
d.表观遗传学受控的高能量使用效率表型可以被选择用于亲本近交系(和/或保持系)中，并且在杂种后代中提供额外的产量潜能增加(超过杂种优势)。
e.高能量使用效率表型与高复合体I活性和抗坏血酸含量相关，因此它们可以被认为是高能量使用效率的指标。
f.高能量使用效率表型和光呼吸逆相关。
在本发明的第一实施方案中，提供了这样的方法，它允许从遗传上均匀的个体植物的最初种群中选择具有高能量使用效率(“EUE”)和由此而来的高产量(特别是种子产量潜能)的植物的(亚)种群。高能量使用效率是数量性状，其在遗传上均匀的植物的种群内存在变异性(沿正态分布曲线)。该方法包括以下步骤：
a.提供由遗传上均匀的多株个体植物组成的种群；
b.以允许进一步培养所述经取样的个体植物的方式从所述种群的个体植物中分离出组织样品或外植体；
c.任选地，在激活所述植物中新陈代谢的条件下，对所述组织样品或外植体进行培养；
d.通过分析所述植物的所述样品，测定所述个体植物的细胞呼吸速率；
e.选择多株植物，其中所述样品显示了比来自所述种群的样品的平均细胞呼吸更低的、优选地是显著地更低的细胞呼吸；
f.种植所选择的植物并且从每一所选择的植物中繁殖出克隆的后代植物品系；
g.测定克隆的后代植物的每一品系的能量使用效率；
h.选择克隆植物的品系，其中所述能量使用效率高于克隆的后代植物的所有品系的能量使用效率的平均值，优选地选择具有最高能量使用效率的克隆后代植物的品系；
i.从所述经选择的克隆后代植物的品系种植出个体植物的种群；并且
j.在所述随后的种群上将步骤b到步骤i重复至少一次。
如在此使用的，“遗传上均匀的植物的种群”是这样的植物种群，其中个体植物是纯育的(即在基因组核苷酸序列水平显示很小的或没有变异)，至少对于作为数量性状基础的遗传因子，特别是作为高能量使用效率和低细胞呼吸速率基础的遗传因子是纯育的。遗传上均匀的植物可以是近交植物，还可以是遗传上相同的植物(例如双单倍体植物)的种群。双单倍体植物是通过在单倍体植物品系(它可以从配子或它的前体细胞(例如小孢子)产生)中的自发的或诱导的单倍体基因组加倍而获得的植物。通过染色体加倍，可以在一个世代中产生完全纯合的植物，并且自交的双单倍体的所有后代植物是基本上遗传相同的(保存罕见突变、缺失或基因组重排)。通过营养繁殖或增殖(例如像马铃薯、甘蔗、包括白杨或桉树的树中那样)获得其他遗传上均匀的植物。
如在此使用的，“能量使用效率”是“能量含量”和“细胞呼吸”的商。当植物细胞的能量含量保持约等于对照植物的能量含量，但是在通过更低的细胞呼吸达到这样的能量含量时，在植物中可以达到高能量使用效率。
“细胞呼吸”是指使用氧作为电子受体，并且可以通过测量通过线粒体呼吸链的电子转运来方便地定量，例如通过测量组织样品还原2，3，5氯化三苯基四氮唑(TTC)的能力。虽然相信对于在此定义的测定的目的，TTC是最合适的物质，但是其他指标分子(例如MTT(3-(4，5-二甲基噻唑-2-基)-2，5联苯-2H-四氮唑)也可以被用于测量线粒体电子转运链中的电子流(参见Musser和Oseroff，1994Photochemistry and Photobiology59，第621-626页)。TTC还原发生在处于线粒体呼吸链的末端的复合体IV处。因此，TTC还原反映通过线粒体呼吸链(包括备选的氧化呼吸途径)的总电子流。电子通过复合体I、复合体II、以及内部的和外部的备选的NAD(P)H脱氢酶进入线粒体电子转运链。已经由De Block和De Brouwer，2002(Plant Physiol.Biochem.40，845-852)描述了合适的TTC还原测定法。
植物细胞的“能量含量”是指通常用于储存能量的分子(例如ATP、NADH和NADPH)的量。可以通过测量样品的NAD(P)H含量来方便地测定样品的能量含量。已经由Nakamura等人在2003年描述了合适的测定(Quantification of intracellular NAD(P)H can monitor an imbalance of DNAsingle strand break repair in base excision repair deficient cells in real time.Nucl.Acids Res.31，17e104)。
应选择其中能量使用效率至少与测定的对照植物的能量使用效率一样好的植物或植物亚种群，优选高于对照植物的能量使用效率。虽然相信能量使用效率没有特定的上限，但是已经观察到可以获得能量使用效率比对照植物的能量使用效率高约5％至约15％、特别是高约10％的亚种群或植物。如在此使用的，对照植物或对照种群是遗传上均匀的但未进行具有更高能量使用效率的植物的反复选择的植物的种群。
可以最初选择细胞呼吸低于测定的对照植物的细胞呼吸的植物或植物亚种群。通常，具有高能量使用效率的植物具有在对照植物的细胞呼吸速率的85％和95％之间的细胞呼吸速率。已经观察到，使具有较低呼吸速率的种群接受额外选择循环以产生具有甚至更低的呼吸速率的植物种群通常是可行的，然而其中能量含量水平也下降了。此类经选择的植物种群具有不优于未经选择的对照植物种群的产量潜能，并且在特定情况下，产量可能甚至更差。特别是在伴有能量含量水平的下降时，选择具有过低细胞呼吸的种群不是有益的。优选地应当避免低于对照植物的呼吸速率的75％的呼吸速率，特别是其与低于对照植物的能量含量的75％的能量含量组合。
通常重复用来选择具有在此描述的高能量使用效率的植物亚种群或植物的方法至少一次；然而可以使植物接受至少三或四或五个选择循环。为了避免选择具有过低呼吸的植物或植物种群的循环，预期应当避免多于五个选择循环(取决于植物种类)。
已经观察到，经选择的具有高能量使用效率的种群的特征还在于较之对照植物的增加的呼吸链复合体I活性，以及增加的抗坏血酸含量。这些特征可以用作选择具有增加的能量使用效率的植物或植物(亚)种群的备选的或补充的标志物。可以使用来自Merck(Darmstadt，德国)的反射抗坏血酸测试对抗坏血酸盐含量进行定量。可以使用MitoSciences(Eugene，oregon，美国)的复合体I活性MitoProfile Dipstick测定试剂盒定量复合体I活性。
已经观察到，经选择的亚种群比经选择的对照植物更耐受不利的非生物条件。因此，本发明还提供了这样的方法，其通过根据在此描述的方法选择植物或植物种群来生产具有对不利的非生物条件的增加的耐受性的植物或种子的种群。如在此使用的，“不利的非生物条件”包括干旱、缺水、低氧或缺氧条件、洪水、高或低的欠佳温度、高盐度、低养分水平、高臭氧浓度、高或低光密度等等。
此外，可以通过在模拟不利的生长条件的条件下，同时选择高能量使用效率来改进根据本发明的选择方法。例如通过将聚乙二醇，例如PEG6000，优选以4％至8％，特别是5％至7.5％的范围包括到在此描述的选择方案中所使用的培养基中，可以选择具有高能量使用效率的耐旱植物。通过在含有PEG的培养基上生长来单独选择的植物(没有测定和选择能量使用效率)通常具有致密的生长表型并且发展成厚的角质层和细胞壁。通过组合在PEG6000上生长与高能量使用效率而选择的植物具有正常的生长表型，但是在干旱条件下胜过对照植物(参见例如图13)。
因为在有性杂交中通过选择具有高能量使用效率的植物亚种群或植物而获得的产量改进可以传递给后代(表现为显性或共显性因子)，并且此外因为由于杂种优势，杂种植物中的产量改进是正常产量增加以外的，本发明进一步的实施方案提供了用于生产具有高产量或对不利的非生物条件的耐受性的杂种植物或杂种种子的方法，包括：
a.根据在此描述的方法，选择具有高能量使用效率的植物种群用于至少一种亲本近交植物；
b.将该种群的植物与另一株近交植物进行杂交；
c.分离杂交种的杂种种子；并且
d.任选地，从种子种植出杂种植物。
可以将该选择方案进一步应用于两株亲本品系并且如果杂种生产涉及需要使用保持系来保持母本的雄性不育，那么还可以有益地对保持系使用在此描述的选择方案。
优选地，组织样品或外植体是下胚轴外植体，但是可以使用其他外植体(例如愈伤组织、苗、叶盘或整叶)以产生相同效果。对于单子叶植物，第一片真叶的叶基是合适的组织样品或外植体。另外优选的是，外植体应当来源于具有高呼吸速率或活性新陈代谢的无菌的体外生长材料。这可以通过首先在包含合适的碳水化合物(例如蔗糖)的培养基上培养外植体来增强呼吸速率或新陈代谢来实现。更优选地，在愈伤组织诱导培养基上培养外植体足以活化新陈代谢的一段时间，特别是培养约0至10天，优选约4至6天，特别是约5天。优选地，该愈伤组织诱导培养基包含蔗糖，特别是约2％至3％w/w。用于培养外植体的优选的温度范围是约24℃至25℃。
当在此描述的方法被应用于有性繁殖的植物时，可以通过自花传粉(自交)并且收获产生的种子来实现从每一经选择的植物至产生克隆的后代植物品系的繁殖步骤。当在此描述的方法被应用于营养繁殖的植物时，可以通过将植物分为合适的繁殖单位并且将它们栽培直至获得完整植物来实现从每一经选择的植物至产生克隆的后代植物品系的繁殖步骤。
本发明还提供了具有高能量使用效率的经选择的植物或植物种群，如其可以通过在此描述的选择方法获得。此类植物特征在于低细胞呼吸(低于如在此描述的对照植物的细胞呼吸)和至少一种以下特征：高于对照植物的抗坏血酸；高于对照植物的NAD(P)H含量；高于对照植物的呼吸链复合体I活性；以及低于对照植物的光呼吸。
该选择方案已经被成功地应用于稻植物种群、欧洲油菜(Brassica napus)植物种群和番茄(Lycopersicon esculentum)植物种群。然而，相信在此描述的方法和手段适合所有植物细胞和植物、裸子植物和被子植物、双子叶和单子叶植物细胞和下述植物，包括但不局限于拟南芥属、苜蓿、大麦、豆、玉米或玉蜀黍、棉花、亚麻、燕麦、豌豆、欧洲油菜(rape)、稻、黑麦、红花、高粱、大豆、向日葵、烟草和其他烟草属种类(包括本塞姆氏烟草)、小麦、芦笋、甜菜、嫩茎花椰菜、甘蓝、胡萝卜、花椰菜、芹菜、黄瓜、茄子、莴苣、洋葱、油菜(oilseed rape)、胡椒、马铃薯、南瓜、小萝卜、菠菜、南瓜类植物、番茄、西葫芦、扁桃、苹果、杏、香蕉、黑莓、蓝莓、可可、樱桃、椰子、酸果蔓、海枣、葡萄、葡萄柚、番石榴、猕猴桃、柠檬、青柠、芒果、甜瓜、油桃、桔子、番木瓜、西番莲、桃、花生、梨、菠萝、阿月浑子、李子、覆盆子、草莓、红橘、核桃和西瓜，芸苔属植物、甘蔗、蔬菜(包括菊苣、莴苣、番茄)、浮萍科(包括来自浮萍属、扁平无根萍属(Wolffiella)、紫萍属(Spirodela)、Landoltia、芜萍属(Wolffia)的种类)和甜菜。
以下非限制性实例描述了根据本发明的方法和手段。除非在实例中另外指出，所有技术都根据本领域的方案标准进行。
实施例
实施例1.方法学
呼吸和EUE的人工选择。幼苗在补充有2％蔗糖的琼脂培养基半浓缩的Murashige和Skoog培养基(MS培养基)上在体外生长两周。将幼苗的芽尖放在上面的培养基上用于生根，同时将每株幼苗的五个下胚轴外植体在愈伤组织诱导培养基(补充有3％蔗糖和1mg/L2，4-D、0.25mg/L NAA和1mg/LBAP的Murashige和Skoog培养基)上培养五天。对下胚轴外植体的细胞呼吸进行了测量。将分别具有最高最低呼吸的大约五株幼苗的生根的芽尖转移到温室中用于通过自交生产种子。对获得的后代的大约35-40株幼苗的呼吸和NAD(P)H含量都进行了测量。保留分别具有最低、最高的呼吸以及分别具有最高、最低的能量使用效率的品系。为了更低或更高的呼吸，在一个方向上使用分别具有最低、最高呼吸的品系进行下一轮选择(图1)。三到五轮选择就足以生成具有不同的呼吸和EUE的品系。在图9中表示了杂种种子生产中对呼吸和EUE的选择。
生理和生化测定。通过如(De Block和De Brouwer，见上文)所描述的测量2，3，5-氯化三苯基四氮唑(TTC)的还原来对下胚轴外植体的细胞呼吸进行了定量。如(Nakamura等人，见上文)所描述的对总NAD(P)H含量进行了定量。能量使用效率被表示为对NAD(P)H含量的标准化值与被还原的TTC的量的对照的％比例。使用来自Merck(达姆施塔特，德国)的反射抗坏血酸测试对抗坏血酸含量进行了定量。使用MitoSciences(Eugene，oregon，美国)的用于复合体I活性的MitoProfile Dipstick测定试剂盒对复合体I活性进行了定量。通过将子叶或叶片漂浮在含有3-5mg/L草铵膦的无铵培养基上对光呼吸强度进行了在体外测量。在连续光照下(大约70μmol m-2sec-1)进行了24小时的培养。如(De Block等人，1995.The selection mechanism ofphosphinothricin is influenced by the metabolic status of the tissue.Planta197，619-626)所描述对铵生产进行了定量。光呼吸被表示为产生的铵与对照的百分比。
田间试验。在具有不同土壤性质的五个位置处(从多沙的到肥沃的土壤)进行了田间试验。每个位置上每种品系含有六块土地。每块土地是10m2大小，对于每个位置，对土地进行了不同的安排。产量表示为kg种子/块土地
统计学。通过使用Prism5.00版本(GraphPad软件，圣地亚哥，美国)带有Dunnett事后测试的单向ANOVA对数据进行了统计学分析。
实施例2.具有高和低的能量使用效率的所选择的欧洲油菜植物的选择知表征
从同基因的双单倍体欧洲油菜品系开始来消除由于遗传水平上的差异引起的变异，对具有最低和最高的细胞呼吸的幼苗进行鉴定和保留(见“方法概述”-图1显示了选择方案的示意性介绍)。总之，从来自双单倍体种群的200株幼苗开始对具有最低和最高的细胞呼吸的“Simon”幼苗进行了鉴定和保留。将分别具有最高和最低呼吸的五株幼苗的生根的芽尖转移到温室中用于通过自交生产种子。对分别具有最高和最低EUE的两个种群进行了鉴定。这两个种群是用于对具有更高和更低的呼吸速率的品系分别地进行五轮额外选择的起始材料。图2显示了生成的六个品系的呼吸：相对于从其开始选择的对照，具有较低呼吸的四个品系(LR76、破碎的LR76、LR77、LR79)以及具有较高呼吸的三个品系(HR80、HR82、HR83)。“破碎的LR76”品系来源于从品系LR76开始的对更低呼吸的进一步的选择。如将在下面显示的，破碎的LR76品系的呼吸落入到临界阈值以下，这导致了降低的活力。在个体植物水平上，在高呼吸品系中存在巨大的变异(例如，相对于对照，品系HR82平均值为125％并且标准差为74％)，然而这种变化在低呼吸品系中是最小的(例如，相对于对照，品系LR76平均值为90％并且标准差为18％)。从育种者的角度来看，高呼吸品系中的高变异表明了负面的行为，然而低呼吸品系中的有限的变异将会被评分为正面的。该高效率提示没有涉及到任何突变，伴随着高效率产生了这些品系(每个选择循环仅从200株幼苗开始)。除了非常高的呼吸品系HR83之外(在HR83中检测到了一些染色体缺失和染色体倒位)，广泛的AFLP-分析不能鉴定出这些品系与对照之间的差异。这些植物有规则地显示了异常的发育和不育性。因此，由于其与对照相比相似的呼吸速率，HR83连同LR79没有被保留用于进一步的分析。
据预期高细胞呼吸将与高能量生产有关并且反之亦然。然而，当对反映能量含量的NAD(P)H总量进行测量时(表1；图3)，注意到具有较高呼吸的品系具有较低的NAD(P)H水平。除品系“破碎的LR76”之外，具有较低呼吸的品系具有较高的NAD(P)H含量。当对NAD(P)H对呼吸的比率(能量使用效率(EUE))进行计算时，除去品系“破碎的LR76”之外在呼吸与EUE之间发现了逆相关(表1-图3)。可能地，品系破碎的LR76中的呼吸落入到了维持足够的能量生产的临界阀值以下。
在选择过程中，通过测量下胚轴外植体对2，3，5-氯化三苯基四氮唑(TTC)的还原，对呼吸进行了定量。TTC还原发生在处于线粒体呼吸链的末端的复合体IV处(Rich，P.R.，Mischis，L.A.，Purton，S.&Wiskich，J.T.Thesites of interaction of triphenyltetrazolium chloride with mitochondrial respiratorychains.FEMS Microbiol.Lett.202，181-187(2001))。因此，TTC还原反映了流过该线粒体呼吸链的总电子流，包含备选的氧化呼吸途径。电子通过复合体I、复合体II以及内部的和外部的备选的NAD(P)H脱氢酶进入线粒体电子转运链。在对照和经选择的品系的第三个叶片中对复合体I(是主要的脱氢酶)的活性进行了测量(表1)。发现了在呼吸与复合体I活性之间的逆相关。最近，发现L-半乳糖酸-1，4-内酯脱氢酶(植物抗坏血酸盐生物合成途径的最后的酶)与复合体I的800-kDa的亚复合体缔合并且在复合体I的积累过程中具有重要的功能，由于L-半乳糖酸-1，4-内酯脱氢酶的拟南芥属无效突变未能积累复合体I(Pineauet al.L-galactono-1，4-lactone dehydrogenase is requiredfor the accumulation of plant respiratory complex I.J.Biol.Chem.283，32500-32505(2008)；Millar等人，Control of ascorbate synthesis by respiration and itsimplications for stress responses.Plant Physiol.133，443-447(2003))。在抗坏血酸盐生物合成与复合体I积累之间的这种明显的相互关系促使我们对这些不同品系叶片中的抗坏血酸盐含量进行测定(表1-图6)。具有最高呼吸和最低复合体I活性的品系具有最低的抗坏血酸盐含量。反之也是正确的，具有低呼吸和高复合体I活性的品系具有高抗坏血酸盐含量。总之，这些结果提示分别具有高的、低的呼吸速率的品系分别具有降低的、增加的复合体I含量。高呼吸品系与缺乏复合体I的NAD7亚基的Nicotiana sylvestris的细胞质雄性不育II(CMSII)突变体相似(Guitierres等人，Lack of mitochondrial and nuclear-encoded subunits of complex I and alteration of the respiratory chain in Nicotianasylvestris mitochondrial deletion mutants.Proc.Natl.Acad.Sci.USA94，3436-344l(1997)；Sabar等人，Complex I impairment，respiratory compensations，andphotosynthetic decrease in nuclear and mitochondrial male sterile mutants ofNicotiana sylvestris.Plant Physiol.124，1239-1249(2000))5。CSMII突变体不具有复合体I活性，但是由于复合体IV(细胞色素氧化酶)的补偿的增强的活性，该突变体仍然具有高呼吸。高呼吸可能是由于为了满足了细胞的ATP需要的备选的NAD(P)H脱氢酶的增强的活性。具有高复合体I含量的品系在生产ATP方面是更加有效，并导致更低的呼吸速率。
在烟草以及黄瓜中，发现降低的复合体I能力导致了光呼吸的增加(Juczczuk等人，Effect of mitochondrial genome rearrangement on respiratoryactivity，photosynthesis，photorespiration and energy status of MSC16cucumber(Cucumis sativus)mutant.Physiol.Plant.131，527-541(2007)；Priault等人，The lack of mitochondrial complex I in a CMSII mutant of Nicotiana sylvestrisincreases photorespiration through an increased internal resistance to CO diffusion.J.Exp.Bot.57，3195-3207(2006))。类似地，我们还发现高呼吸芸苔属品系具有显著增加的光呼吸，然而这些低呼吸品系具有大大减少的光呼吸(表1-图7)。这暗示低呼吸(但并不是如在破碎的LR76品系中的过低的呼吸)与有利的生理状态相关，而高呼吸与较低的适合度相关。生理状态的特异性特性表明这些品系分别具有较高的、较低的胁迫耐性(图4)以及田间性能(表1-图5)。在三年中在田间试验(五个位置，每个品系10平方米的三个到六个重复)中对这些经选择的品系以及该对照品系进行了种子产量测试(表1-图5)。具有高EUE的低呼吸品系具有比该对照高平均多达8％的种子产量，而具有低EUE的高呼吸品系具有平均多达10％的种子产量减少。在中等干旱胁迫的田地中，最好的高EUE品系具有比对照高20％产量，而该高呼吸和低EUE品系的种子产量降低20％。在EUE与种子产量之间存在很强的正相关(Pearson相关性＝0.96)。
基于我们的AFLP结果，从同基因的品系开始产生的高和低的呼吸品系的高效率、以及经选择的品系相互不可区分的事实，提示品系的不同生理特性具有表观遗传学的基础。
从温室中种子大约八代的放大以及三年精心进行的田间试验，显而易见的是品系的表观遗传学状态通过自交被稳定地遗传。如先前对拟南芥属中表观遗传学重组组分所描述的(Molinier等人.Transgeneration memory of stressin plants.Nature442，1046-1049(2006))，油菜的表观遗传学呼吸组分可以在与未经选择的对照品系的相互回交中被传递。例如，在高呼吸品系HR82中，自交和用HR82作为雄性和雌性对原始的Simon品系的回交导致了分别具有相对该对照的127％、124％以及128％的呼吸的后代。同样对于低呼吸品系LR77也是正确的，其中自交和用LR77作为雄性和雌性对Simon的回交导致了分别具有相对该对照的89％、91％以及92％的后代(图8)。
我们的结果显示仅仅基于定向表观遗传学组分来选择复杂的性状是可行的。与经典的育种方案中的选择的主要差异是选择不仅可以在种群上进行还可以主要在植物水平并且以递归的方式进行。通过将相同的选择方案应用于卡诺拉油菜的原种亲本品系(图9)，我们生产了杂种，其具有在杂种优势所导致的产量增加上添加了多达5％的更高的产量(图10-11以及表2)。这显示卡诺拉油菜中的选择方法的普遍实用性并且证实了表观遗传学呼吸组分的跨代稳定性。实验进一步表明在其他植物物种中(例如：稻以及番茄)这种类型的选择也是可行的。
Figure GDA00003214342000201
表2：通过杂交已经对高能量使用效率轮回选择的近交的雄性和雌性品系而获得的杂种卡诺拉油菜品系的生理学以及农学性质。
相对对照杂种的％a)
呼吸 91***
NAD(P)H含量 100
能量使用效率 110
复合体I活性 125**
抗坏血酸含量 115**
光呼吸 72**
种子产量b) 105*
a)通过杂交原始的未经选择的雌性和雄性获得的杂种
b)4个位置，4个重复/位置，1年
*P＜0.05相对对照
**P＜0.01相对对照
***P＜0.001相对对照
实施例3.经选择的具有高能量使用效率与增强的耐旱性的组合的欧洲油菜植 物的选择以及表征
除了愈伤组织诱导培养基现含有5％的终浓度的PEG6000，模仿干旱条件以外，如在实施例2中描述的对欧洲油菜植物进行了选择。较之在正常灌溉条件下和在受限制的水供给的条件下生长的对照植物，生长在这些条件下显示出高能量使用效率的最佳的品系(LR-PEG_1574)。图12和13提供了这些实验的结果的概述，证明了在干旱条件下LR-PEG_1574优于对照植物(同基因的但没有接受高能量使用效率选择方法)。

Claims (26)

1.选择具有高能量使用效率的植物或种子的种群的方法，该方法包括以下步骤： 
a.提供由大量遗传上均匀的个体植物组成的种群； 
b.以允许进一步培养所述经取样的个体植物的方式从所述种群的个体植物中分离出组织样品或外植体； 
c.通过分析所述植物的所述样品测定所述个体植物的细胞呼吸速率，其中所述细胞呼吸速率是由测量通过线粒体呼吸链的电子转运来测定的； 
d.选择多株植物，其中所述样品显示了比来自所述种群的样品的平均细胞呼吸显著地更低的细胞呼吸； 
e.生长所选择的植物并且从每株所选择的植物中繁殖出克隆的后代植物品系； 
f.测定克隆的后代植物的每种品系的能量使用效率,其中所述能量使用效率如下测定： 
i)通过 
1.由测量通过线粒体呼吸链的电子转运来测定所述样品中的细胞呼吸速率； 
2.测定所述样品中的NADH和NADPH的含量；和 
3.用NADH和NADPH的含量除以呼吸作用速率以确定能量使用效率； 
ii.通过测量所述样品中的抗坏血酸盐含量; 
iii.通过测量所述样品中的NADH和NADPH含量； 
iv．通过测量所述样品中的线粒体呼吸链的复合体I的活性；或 
v.通过测量所述样品中的光呼吸； 
g.选择克隆植物的品系，其中所述能量使用效率高于克隆的后代植物的所有品系的能量使用效率的平均值； 
h.从所述经选择的克隆后代植物的品系生长个体植物的种群；并且 
i.对所述随后的种群重复步骤b到步骤h至少一次; 
其中所述抗坏血酸盐含量是在对照植物的抗坏血酸盐含量的150%至220%之间，或其中所述NADH和NADPH含量是在对照植物的NADH和NADPH含量的95%至105%之间，或其中所述线粒体呼吸链活性的所述复合体I的活性是在对照植物的活性的120%至140%之间，或其中所述光呼吸是在对照植物的光呼吸的80%至92%之间，或其中所述细胞呼吸速率是在对照植物的细胞呼吸速率的85%与95%之间。 
2.根据权利要求1的方法，其中所述个体植物在遗传上是相同的。 
3.根据权利要求1或权利要求2的方法，其中所述个体植物是双单倍体植物。 
4.根据权利要求1或权利要求2的方法，其中通过营养繁殖生产所述个体植物。 
5.根据权利要求1或2的方法，其中所述植物是近交植物。 
6.根据权利要求1或2的方法，其中重复所述步骤i至少两次。 
7.根据权利要求1或2的方法，其中重复所述步骤i至少五次。 
8.根据权利要求1或2的方法，其中所述从每个经选择的植物繁殖克隆的后代植物的品系是通过所述植物的自花传粉并且收获种子来实现的。 
9.根据权利要求1或2的方法，其中所述从每个经选择的植物繁殖克隆的后代植物的品系是通过营养增殖来实现的。 
10.根据权利要求1或2的方法，其中在步骤b和c之间，在激活所述植物中新陈代谢的条件下对所述组织样品或外植体进行培养。 
11.根据权利要求1或2的方法，其中在步骤h中，选择具有最高能量使用效率的克隆后代植物的品系。 
12.根据权利要求1或2的方法，其中通过将下胚轴从上胚轴切断将所述组织样品分离，从而下胚轴构成了所述样品并且上胚轴进一步生长成植物。 
13.根据权利要求1或2的方法，其中所述植物是芸苔属油菜，番茄植物或水稻植物。 
14.根据权利要求10的方法，其中在模仿干旱条件的条件下进行在激活所述植物中的新陈代谢的条件下的所述组织样品或外植体的所述培养。 
15.根据权利要求10的方法，其中在含有聚乙二醇的培养基上进行在激活所述植物中的新陈代谢的条件下的所述组织样品或外植体的所述培养。 
16.生产具有增加的产量潜能的植物或种子的种群的方法，该方法包括根据权利要求1至15中任何一项选择具有高能量使用效率的植物或种子的种群。 
17.根据权利要求16的方法，其中将所述植物与另一种植物进一步杂交。 
18.生产具有增加的活力和/或对不利的非生物条件的增加的耐受性的植物或种子的种群的方法，该方法包括根据权利要求1至15中任何一项选择具有高能量使用效率的植物或种子的种群。 
19.用于增加收获产量的方法，该方法包括 
a.根据权利要求18生产植物或种子的种群； 
b.在田地中生长所述植物或种子； 
c.从所述植物或种子中生产收获物。 
20.用于生产具有高产量或对不利的非生物条件的耐受性的杂种植物或杂种种子的方法，该方法包括： 
a.根据权利要求1至15中任何一项选择具有高能量使用效率的植物的种群用于至少一种亲本近交植物； 
b.将所述种群的植物与另一种近交植物杂交； 
c.分离所述杂交的杂种种子；并且 
d.任选地，从所述种子生长杂种植物。 
21.根据权利要求20的方法，其中所述根据权利要求1至15的任一项的具有高能量使用效率的植物的种群被选择用于所述两种亲本近交植物。 
22.根据权利要求20或权利要求21的方法，其中所述一种亲本植物是雄性不育的植物并且保持所述雄性不育植物需要使用保持系，所述方法特征还在于根据权利要求1至13的任一项的具有高能量使用效率的植物的种群也被选择用于该保持系。 
23.植物的细胞，所述植物通过权利要求1至22的方法中的任何一项而获得。 
24.具有高能量使用效率的植物的细胞，所述植物的特征在于所述植物具有低细胞呼吸以及以下特性的至少一项： 
i.高抗坏血酸盐含量； 
ii.高NADH和NADPH含量； 
iii.高呼吸链复合体I活性；或 
iv.低光呼吸; 
其中所述细胞呼吸速率是由测量通过线粒体呼吸链的电子转运来确定的并且在对照植物的细胞呼吸速率的85%与95%之间，其特征还在于所述抗坏血酸盐含量是在对照植物的抗坏血酸盐含量的150%至220%之间，或所述NADH和NADPH含量是在对照植物的NADH和NADPH含量的95%至105%之间，或所述呼吸链复合体I的活性是在对照植物的呼吸链复合体I活性的120%至140%之间，或其中所述光呼吸是在对照植物的光呼吸的80%至92%之间。 
25.根据权利要求24的植物的细胞，其中所述植物是杂种植物。 
26.根据权利要求24或25的植物的细胞，所述植物是在水受限制的条件下相比同基因的对照植物具有更高的生长、产量或生物量生产的植物。 
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