BR112012003139B1

BR112012003139B1 - Método para produzir uma planta híbrida, planta, material de planta ou semente

Info

Publication number: BR112012003139B1
Application number: BR112012003139-2A
Authority: BR
Inventors: Bryant Jerome Long
Original assignee: Syngenta Seeds, Llc
Priority date: 2009-08-12
Filing date: 2010-08-06
Publication date: 2019-07-02
Also published as: BR112012003139A2; JP5875661B2; CA2769183A1; WO2011019391A1; JP2015077130A; CL2012000345A1; JP2012516136A; AU2010282964B2; AU2010282964A1; CA2769183C; NZ597802A; ZA201506352B; MX2012001648A; IL217991A0; NZ629020A; IL241095A0; IL217991A; EP2464213A1; EP2464213A4

Abstract

método para produzir uma planta híbrida, planta, material de planta ou semente, planta, semente, material de planta, e, parte de planta" a invenção fornece métodos para produzir plantas, materiais de planta e sementes que têm atributos desejáveis múltiplos para os consumidores destes produtos, assim como para os cultivadores de planta comercial, e para plantas melhoradas, materiais de planta e sementes que são produzidas por estes métodos. estes métodos inventivos fornecem plantas híbridas, materiais de planta e sementes tendo o alelo shrunken-2i (sh2-i) mutante incorporado nos seus genomas, de modo preferível sequencialmente junto com um ou mais outros alelos mutantes, tais como os alelos sugary-1 (sul), realçador de sugary-1 (sel) e/ou shrunken-2 (sh2), e que têm traços benéficos múltiplos, incluindo uma capacidade de retenção de açúcar prolongada no estágio de alimentação pós prime e um vigor e aptidão significantemente realçados para a planta, material de planta e/ou semente durante a germinação da semente, emergência da muda do solo, e desenvolvimento de planta.

Description

“MÉTODO PARA PRODUZIR UMA PLANTA HÍBRIDA, PLANTA, MATERIAL DE PLANTA OU SEMENTE”

FUNDAMENTOS DA INVENÇÃO

Campo da invenção

Este pedido é uma continuação em parte do pedido de patente do pedido de patente não provisório pendente U.S. Serial N^e 12/462.959, depositado em 12 de agosto de 2009. Esta continuação em parte do pedido de patente reivindica o benefício do pedido de patente não provisório anterior U.S. Serial N^Q 12/462.959, depositado em 12 de agosto de 2009, pedido de patente este que é por meio deste aqui incorporado nesta continuação em parte de pedido de patente na sua totalidade por referência, que inclui todos os desenhos, todas as sementes e/ou outros depósitos feitos com a American Type Culture Collection (ATCC) e todas as listagens de sequência.

A presente invenção está direcionada a métodos únicos para produzir plantas, materiais de planta e sementes que muito vantajosamente têm intensificado a produção e traços de consumidor, tais como um vigor e dureza melhorados das sementes, uma emergência da muda intensificada e crescimento de planta em solos tanto quentes quanto frios (isto é, em tipos diferentes de climas e em temperaturas diferentes), combinados com uma qualidade de gosto e maciez do pericarpo do grão superiores, e às plantas, materiais de planta e sementes melhorados que são produzidos de acordo com estes métodos, ou que têm tais traços. A invenção fornece um novo método para combinar uma montagem única de traços genéticos em plantas, materiais de planta e sementes, usando combinações alélicas duplas, triplas e outras, que resultam em potencial de crescimento intensificado junto com qualidades de consumo desejáveis.

Fundamentos

Milho

O milho é uma das mais diversas colheitas de grão que está presente ao natural, e existem vários tipos diferentes de milho, que são no geral classificados pelas características do seu endosperma do grão. Os tipos de milho mais comuns incluem flint, flour, dent, pop, doce, waxy e pod. A aparência física de cada tipo de grão é determinada pelo seu padrão, qualidade e quantidade do endosperma.

O milho doce é um tipo de planta de milho que é classificada como Zea mays, var. rugosa, e que tem grãos brancos, amarelos ou bicoloridos que são doces quando eles estão no estágio leitoso imaturo como um resultado de terem um alto teor de açúcar. Níveis mais altos de açúcar nos grãos de milho doce resultam em um potencial osmótico mais baixo, causando enorme captação de água dentro dos grãos. O milho doce é tipicamente comido pelos seres humanos como um vegetal, diretamente do sabugo de milho, ou tendo-se os grãos doces removidos do sabugo, e é uma colheita vegetal principal que é cultivada por todo o mundo primariamente para o consumo fresco, ao invés de como ração de animal ou para a produção de farinha.

O milho doce ocorre como uma mutação espontânea no milho do campo, e pode ser o resultado de mutações que ocorrem naturalmente nos genes que controlam a conversão de açúcar para amido dentro do endosperma do grão de milho. Diferente das variedades do milho do campo, que são intencionados para os animais de criação, e são tipicamente colhidos quando os seus grão estão secos e totalmente maduros (no estágio de dente), o milho doce é tipicamente apanhado quando está imaturo (no estágio leitoso), e comido como um vegetal, ao invés de como um grão. Porque o processo de maturação envolve a conversão do açúcar em amido, o milho doce tipicamente armazena de modo deficiente, e devem ser comidos em uma maneira fresca, enlatada ou congelada antes que os grãos se tomem duros e/ou rico em amido. A seguir da colheita, ou se deixado no caule muito tempo, a sacarose no milho doce padrão toma-se rapidamente convertido para amido. Os grãos podem perder tanto quanto 50 % da sua sacarose na temperatura ambiente em tomo de 24 horas depois da colheita.

As variedades polinizadas abertas (não híbridas) de milho doce 5 branco começaram a se tomar amplamente disponível nos Estados Unidos no século 19. Duas das variedades mais resistentes, que ainda estão disponíveis nos dias de hoje, são Country Gentleman (um milho Shoepeg com grãos pequenos, brancos em fileiras irregulares) e Evergreen de Stowell. A produção de milho doce no século 20 foi influenciada pelos seguintes desenvolvimentos chave:

(i) hibridização, que permitiu maturidade mais uniforme, qualidade melhorada e resistência à doença; e (ii) identificação das mutações de gene separadas que são responsáveis pela doçura no milho, e a capacidade para cruzar variedades com base nestas características, por exemplo:

• su (sugary normal);

• se (sugary intensificado); e • sh2 (shrunken-2).

Existem correntemente centenas de variedades de milho doce, 20 com mais variedades continuamente sendo desenvolvidas.

O fruto da planta de milho doce é o grão de milho, e a espiga consiste de uma coleção de grãos no sabugo. Porque o milho é um monocotiledôneo, existe sempre um número par de fileiras de grãos. A espiga é coberta pelas folhas firmemente enroladas (a casca).

O milho doce tem atividade antioxidante significante, que pode reduzir as possibilidades de desenvolver doença cardíaca e/ou câncer. O mesmo também libera níveis aumentados de ácido ferúlico, que fornece benefícios de saúde adicionais.

Existem várias mutações genéticas conhecidas que são responsáveis pelos vários tipos de milho doce. As variedades precoces foram o resultado do alelo mutante Sul (sugary-1). As variedades de Sul convencionais contêm cerca de 5 a 10 % de açúcar em peso.

As variedades de milho doce que contêm o gene shrunken-2 5 (sh2) tipicamente produzem níveis mais altos do que o normal de açúcar, e têm uma vida de prateleira mais longa, em comparação com o milho doce convencional, e são frequentemente aludidos como variedades superdoces. Um gene específico no milho doce, o gene shrunken-2 (sh2), faz com que o grão de milho maduro seque e murche conforme o mesmo amadurece passando o estágio leitoso, o que é um traço indesejável para a germinação de muda, emergência e crescimento precoces da planta. O endosperma de grãos de milho doce sh2 convencionais armazenam menos quantidades de amido, e de cerca de 4 a cerca de 10 vezes mais açúcar, do que o milho doce Sul convencional. Isto tem permitido a remessa a longa distância de milho doce, e tem permitido que os fabricantes enlatem milho doce sem a adição de açúcar extra ou sal ao mesmo.

A terceira mutação de gene é o alelo Sei (sugary intensificado-1), que é incorporado no genoma das variedades Everlasting Heritage. As variedades de milho doce convencional com os alelos Sei tipicamente têm uma vida de armazenagem mais longa, e contêm de cerca de 12 % a cerca de 20 % de açúcar (isto é, um nível de açúcar muito mais alto em comparação com as variedades Sul convencionais).

Todos os alelos que são responsáveis pelo milho doce são recessivos, assim milho doce no geral deve ser isolado de qualquer uma das variedades de milho do campo que liberam pólen ao mesmo tempo. O endosperma se desenvolve a partir dos genes de ambos os precursores (masculino e feminino), e os grãos no geral serão duros e ricos em amido.

O milho foi primeiro classificado de acordo com o carboidrato que é armazenado no seu endosperma. O componente de açúcar mais distinguível que está presente no milho doce é a sacarose, que é responsável pela vasta maioria da sua diferenciação de doçura. (Abbott e Cobb, Inc., Plant Protection N° 9600094 (1998)). Os açúcares livres redutores, glicose e frutose, estão presentes no milho doce em níveis significantemente mais baixos. Estes açúcares redutores primariamente resultam da hidrólise natural da sacarose.

Os milhos doces mais comercialmente disponíveis são com base nos alelos recessivos únicos que alteram a composição de carboidrato do endosperma. Até cerca de trinta anos atrás, o milho doce foi tipicamente definido pelo alelo mutante Sul localizado no cromossoma quatro. Embora a diferença primária entre milho doce e milho do campo seja historicamente devido a um único gene, existem muitos outros genes, que exibem efeitos tanto maiores quanto menores que diferenciam as duas classificações de milho. Estes genes afetam a qualidade de ingestão global do milho (sabor, textura, maciez e seus semelhantes) junto com a aparência do grão, espiga e planta, assim como a viabilidade da semente. O milho doce é diferenciado principalmente de outros tipos de milho, isto é,flint,flour, dent, waxy.pop, e seus semelhantes, pela presença de genes que tipicamente alteram a síntese de amido do endosperma e seu uso como um vegetal para o consumo humano.

Muitos dos genes mutantes do endosperma no milho (e em outras plantas de colheita) que presentemente estão sendo usados comercialmente em diferentes variedades de milho doce, e afetam a síntese de carboidrato do endosperma, são listados na Tabela 1 abaixo. Acredita-se que todas estas mutações de endosperma afetem a síntese de amido durante o desenvolvimento do grão, e foram caracterizados e mapeados no milho.

Tabela 1

Genes Mutantes de Endosperma de Milho Doce Usados Comercialmente

Gene Símbolo do Gene Cromossoma

Extensor de amilose ae 5

Brittle bt 5

Brittle-2 bt2 4

Dull du 10

Shrunken-2 sh2 3

Gene Símbolo do Gene Cromossoma

Sugary-1 Sul 4

Sugary enhancer-1 Sei 2

Waxy wx 9

Dos mutantes de endosperma que são listados na Tabela 1, os mutantes que são mais amplamente usados comercialmente são sugary-1 (Sul), sugary enhancer-1 (Sei) e shrunken-2 (sh2).

Mutantes de Endosperma

A qualidade de ingestão do milho doce é de modo típico amplamente determinado pela sua doçura que, por sua vez, é afetada pela quantidade de açúcar e amido que estão presentes no endosperma de seus grãos. O maior e, portanto, mais distinguível componente de açúcar no milho doce é a sacarose, que é responsável pela maior parte da sua diferenciação de doçura. Os açúcares redutores, glicose e frutose, estão tipicamente presentes no milho doce em níveis significantemente mais baixos em comparação com a sacarose. Estes açúcares redutores tipicamente resultam da hidrólise natural da sacarose. Os alelos mutantes sugary-1 (Sul), sugary enhancer-1 (Sei), e shrunken-2 (sh2) foram determinados aumentar acentuadamente o teor de açúcar, e diminuir os níveis de amido, no milho doce em comparação com o milho que não inclui um ou mais destes alelos mutantes no seu genoma.

Uma outra característica determinante do milho doce é que seus grãos (sementes) tendem a ser acentuadamente mais macios em comparação com outros tipos de milho. Graus significantes de níveis de maciez podem ocorrer dentro das variedades de milho doce que expressam um ou mais dos três (ou outros) alelos mutantes acima no endosperma. Os níveis de açúcar elevados e maciez do pericarpo do grão aumentada que tipicamente ocorrem nestas variedades no geral permitem capacidade de ser guardada ou vida de prateleira prolongadas. Uma capacidade de ser guardada ou vida de prateleira prolongadas, tanto na quanto fora de uma planta de milho (ou outra instalação de produção ou distribuição), é no geral extremamente importante quando da consideração de despachar variedades de milho doce em distâncias geográficas potencialmente longas para o mercado, por exemplo, através dos Estados Unidos, ou de um país para um outro país.

Correntemente, por razões relacionadas com os níveis de açúcar e maciez do pericarpo elevados, a classe de milho doce shrunken-2 (sh2) é o tipo mais popular de milho doce comercialmente disponível. Entretanto, como é descrito aqui abaixo, tal classe tem algumas desvantagens muito significantes, que são superadas pelos processos e produtos da presente invenção.

Gene Mutante Sul (Sugary-1)

O milho doce na sua forma original difere do milho do campo primariamente pela presença de um único gene mutante recessivo, o sugary-1 (Sul). O genótipo de sugary-1 (Sul) recessivo que está presente no milho doce tem um efeito de retardar (diminuir significantemente a velocidade) uma conversão normal de açúcar em amido durante o desenvolvimento do endosperma, que muito desejavelmente resulta em um gosto doce, ao invés de em um gosto rico em amido. Este gene foi clonado e mapeado até o ramo curto do cromossoma 4 no milho doce, e a sua sequência genômica e tradução da sequência de aminoácido são apresentados na Patente U.S. N² 5.912.413 intitulado “Isolation of the SU1 Starch Debranching Enzyme, the Product of the Maize Gene Sugary 1,” e aqui.

O gene sugary (Sul) codifica uma enzima de desramificação de amido Classe II que é ativa em plastídeos celulares, a mesma é uma isoamilase que hidrolisa as ligações da ramificação a-(l,6) no amido durante a síntese de amido. (JA Shultz et al., “Current Models for Starch Synthesis and the Sugary Enhancer 1 (sei) Mutation in Zea mays,” Plant Physiology and Biochemistry 42(6), 457-464 (2004)).

O gene sugary-1 (Sul) confere um aumento moderado nos níveis de açúcar global aos grãos de milho, mas desvantajosamente tem apenas cerca de metade do teor de açúcar total das variedades de milho “superdoce” conferidas pelo gene Shrunken-2 (sh2), que é significantemente menos desejável aos consumidores de milho. Também desvantajosamente, a conversão de açúcar para amido nos grãos de milho é comparativamente rápida, resultando no geral em uma janela de colheita reduzida ou estreita antes que a doçura (isto é, os níveis de açúcar) dos grãos de milho deteriorem depois do estágio de alimentação primário (em aproximadamente 75 % da umidade do grão).

O gene sugary-1 (sul), ao contrário do seu nome, portanto, no geral não resulta em níveis excepcionalmente altos de açúcares. Entretanto, o mesmo no geral resulta em níveis enormemente aumentados de fitoglicogênio ou polissacarídeos solúveis em água (WSP). (W. F. Tracey, Em A. R. Hellauer (ED) Specialty Coms (CRC Press, Boca Raton, Flórida) 147-187 (1994)). Fitoglicogênio e WSP tendem a dar ao endosperma dos grãos das variedades de milho doce Sul convencionais a textura macia e a característica cremosa das variedades de milho doce tradicionais. O endosperma maduro do milho não mutante no geral contém aproximadamente 2 % de WSP, ao passo que as linhagens do milho que são homozigotas para o gene sugary-1 (Sul) pode conter até aproximadamente 35 % de WSP.

O gene sugary-1 (Sul) mutante presente nas variedades convencionais de milho doce desvantajosamente tende a resultar em uma qualidade e uso de semente significantemente reduzida comparada com as contrapartes variadas de milho do campo.

Informação adicional a cerca do gene sugary-1 (Sul) recessivo está presente em M. G. James et al., “Characterization of the Maize Gene Sugary-1, a Determinant of Starch Composition in Kemels,” The Plant Cell, Vol. 7, 417-429 (1995); e D. Pan et al., “A Debranching Enzyme Deficiency in Endosperms of the Sugary-1 Mutants of Maize,” Plant Physiol. 74(2), 324328(1984).

Gene Mutante Sei (Sugary enhancer-1)

O gene mutante sugary enhancer-1 (Sei) é um modificador recessivo da mutação de gene sugary-1 (Sul). (J A Shultz et al., “Current Models for Starch Synthesis and the Sugary Enhancer 1 (sei) Mutation in Zea mays,” supra.). Os efeitos do gene mutante sugary enhancer-1 (Sei) foram originalmente observados em 111677a, uma linhagem derivada de um cruzamento de três vias (Bolivia 1035 X Illinois 44b X Illinois 442a). (J. W. Gonzales et al., “A New Inbred Line With High Sugar Content in Sweet Com,” Hort Science 9, 79 (1974)). Quando homozigota, o alelo sugary enhancer-1 (Sei) aumenta o açúcar total em grãos de milho da variedade de milho doce sugary-1 (su-1) convencionais aos níveis que são comparáveis a aqueles nos grãos de milho da variedade de milho doce shrunken-2 (sh2), e sem uma redução no teor de fítoglicogênio ou uma redução apreciável nos níveis de WSP. Este alelo também aumenta o açúcar total em grãos de milho da variedade de milho doce shrunken-2 (sh2) convencional (também sem uma redução no teor de fítoglicogênio ou uma redução apreciável nos níveis de WSP).

Os efeitos do gene sugary enhancer-1 (sei) são grão de milho com açúcar total elevado, cor mais clara, e secagem mais lenta, e foram originalmente observados em uma linhagem de milho pura designada como IL 1677a. Foi apenas mais tarde que estes efeitos foram atribuídos aos gene sugary enhancer-1 (Sei). (Y. Tadmer et al., “RFLP Mapping of the Sugar Enhancer 1 Gene in Maize,” TAG Theoretical and Applied Genetics 91, 489494 (1995); RA Brink, “Identity and Sources of a Sugary Enhancer Gene Located on the Long Arm of Chromosome 4 in Maize,” J. Heredity 82, 176 (1991)).

O gene sugary enhancer-1 (Sei) confere um teor de umidade mais alto aos grãos de milho doce durante períodos de tempo após a colheita, e também mantém níveis relativamente aumentados de fítoglicogênio durante este tempo. Benefícios adicionais deste gene são níveis de pericarpo de grão reduzidos (isto é, espessura), conferindo grãos de milho com uma maciez melhorada, e níveis elevados do açúcar maltose. (JE Ferguson et al., “Genetics of Sugary Enhancer (Se), a Independent Modifier of Sweet Com (Su),” J. Heredity 69(6), 377-380 (1978)).

Quando tanto o gene sugary enhancer-1 (Sei) quanto o gene sugary-1 (Sul) são recessivos, o gene sugary enhancer-1 (Sei) muito vantajosamente confere de cerca de 1,5 a cerca de 2 vezes mais sacarose aos grãos de milho no seu pico de maturidade de colheita em comparação com os grãos de milho mutantes no gene sugary (Sul).

O local do gene sugary enhancer-1 (sei) está situado no ramo longo do cromossoma 2 no milho doce. Variantes identificáveis do gene sugary enhancer-1 (sei) estão correntemente sendo avaliadas e caracterizadas.

As dificuldades aparentes na caracterização genômica do gene sugary enhancer-1 (sei) foram anteriormente encontradas pelos cientistas. Tais dificuldades são consideradas, em parte, serem devidas às suas medições fenotípicas concomitantes bastante difíceis.

A base enzimática para o gene sugary enhancer-1 (sei) correntemente não parece ser conhecida, e a sequência de nucleotídeo do gene sugary enhancer-1 (sei) correntemente não parece ser conhecida, e não está presente nas bases de dados Maize Genetics and Genomics Database ou GenBank. Entretanto, a herança do gene sugary enhancer-1 (sei) pode ser determinada por aqueles tendo habilidade comum na técnica seguindo-se marcadores moleculares próximos no cromossoma 2, como é aqui descrito. Uma tal determinação também pode ser feita para outros genes mutantes.

Informação adicional a cerca do gene sugary enhancer-1 (sei) está presente em D. R. La Bonte et al., “Sugary enhancer (se) Gene Located on the Long Arm of Chromosome 4 in Maize (Zea mays L.), The Journal of Heredity 82, 176-178 (1991); e J. E. Ferguson et al., “The Genetics of Sugary enhancer (se), a Independent Modifier of Sweet Com,” The Journal of Heredity 69(6), 377-380 (1978).

Gene Mutante Sh2 (Shrunken-2)

Em 1953, foi sugerido que o gene mutante, recessivo shrunken-2 (sh2) pudesse ter uma aplicação na indústria do milho doce. (J. R. Laughnan, “The Effects of sh2 Factor on Carbohydrate Reserves in the Mature Endosperm of Maize,” Genetics 38, 485-499 (1953)). Desde então, uma quantidade significante de pesquisa tem sido realizada em conexão com milho de alto teor de açúcar e o gene shrunken-2 (sh2), que está localizado no ramo longo do cromossoma 3 no milho doce, e codifica a subunidade grande da ADP-glicose pirofosforilase (AGP), uma enzima Classe I. Esta enzima é importante no caminho da conversão de sacarose para amido.

A classe shrunken-2 (sh2) convencional de milhos doces (designada como “superdoce”) compreende a vasta maioria do mercado de milho comercial dos U.S. Os grãos de milho da variedade shrunken-2 (sh2) secos maduros contêm aproximadamente duas vezes o teor de açúcar total, aproximadamente 1/3 a 1/2 dos níveis de amido, e apenas níveis traço de fitoglicogênio, em comparação com os grãos de milho da variedade sugary-1 (Sul) convencionais. Os milhos doces do tipo Shrunken-2 (sh2) no geral resultam em níveis de carboidrato total dramaticamente reduzidos na maturidade de pico, e expressam aproximadamente duas ou mais vezes a sacarose em comparação com o milho doce mutante sugary-1 (Sul) convencional. Além disso, a retenção de açúcar no estágio de alimentação pós excelente (isto é, durante o período de tempo imediatamente seguinte ao estágio de alimentação primário) nestes milhos doces é no geral significantemente prolongada em relação aos milhos doces convencionais mutantes em sugary-1 (Sul) e sugary enhancer-1 (sei).

Foi determinado a inclusão do gene shrunken-2 (sh2) na composição genética do milho vantajosamente tem um efeito de aumentar o teor de açúcar total do milho e, assim, a doçura. Também foi determinado, entretanto, que a inclusão deste gene na composição genética do milho de modo muito desvantajosamente significante diminui o teor de polissacarídeo solúvel em água do milho (WSP), reduzindo o seu teor de endosperma, e diminuindo o seu teor de amido (e o seu nível de energia associado). Desvantajosamente, as variedades de shrunken-2 (sh2) convencionais de milho no geral carecem da textura macia e cremosa das variedades de milho mutantes em sugary-1 (Sul) e sugary enhancer-1 (sei) convencionais como um resultado de tais níveis diminuídos de polissacarídeos solúveis em água. (JA Shultz et al., “Current Models for Starch Synthesis and the Sugary enhancer 1 (sei) Mutation in Zea mays,” supra). Também muito desvantajosamente, como um resultado de um teor de amido reduzido, e um nível reduzido associado de energia, as variedades shrunken-2 (sh2) convencionais de milho no geral têm uma germinação e vigor de muda, aptidão e/ou saúde durante a germinação, emergência da muda do solo, e desenvolvimento e crescimento de planta significantemente reduzidos em comparação com as variedades sugary-1 (Sul) e sugary enhancer-1 (Sei) convencionais de milho doce, que resultam em plantas de milho com peso leve, finas e de aparência comprida e estreita, facilmente danificadas, que de modo frequente facilmente morrem quando confrontados com ambiental ou outros estresses, potencialmente fazendo com que os plantadores de milho percam colheitas inteiras de milho, e os potenciais de renda associados de tais colheitas. As variedades Shrunken-2 (sh2) de milho doce no geral expressam uma aparência física de grão acentuadamente colapsado no estágio de semente seca, e esta aparência “enrugada” de semente seca, e reservas de amido no grão reduzidas correspondentes, tendem a tomar uma emergência e vigor da muda relativamente diminuídas no tempo de plantação ou durante a germinação. No geral, a semeadura de precisão mecânica e estabelecimento da posição são acentuadamente mais difíceis devido à aparência física colapsada e “enrugada” da semente seca. A germinação de tais sementes pode ser problemática tanto na produção pura quanto nas híbridas.

Para melhorar o vigor e a germinação, o milho dent (uma espécie de milho do campo) foi usado como o fundo genético para o gene shrunken-2 (sh2). Entretanto, os genes do milho dent dominantes podem muito desvantajosamente necessitar de uma isolação dos híbridos shrunken-2 do milho tanto do campo quanto doce, e qualquer pólen estranho pode fazer com que todos os grãos de milho sejam milho dent no caráter. Além disso, os híbridos shrunken-2 requerem isolação espacial ou temporal das variedades sugary-1 (Sul) e sugary intensificado-1 (Sei) de milho doce devido à presença de alelos Sul Sul dominantes utilizados nas variedades de shrunken2 (sh2) “superdoce” de milho doce.

Comparação dos Níveis de Sacarose, Capacidades de Retenção de Açúcar e Níveis de Pericarpo

As comparações dos níveis de sacarose, capacidades de retenção de açúcar (fixação), níveis de pericarpo e mudanças nos níveis de das variedades de milho doce convencionais contendo o gene sugary-1 (Sul), o gene sugary enhancer-1 (sei) ou o gene shrunken-2 (sh2) no estágio de alimentação primário, ou em um período de sete dias, são mostrados nas FIGS. 1-4, respectivamente. (Abbott e Cobb, Inc., Plant Protection No. 9600094 (1998)).

A FIG. 1 fornece uma comparação generalizada de níveis de sacarose de endosperma representativo para as linhagens mutantes genéticas de sugary-1 (Sul), sugary enhancer-1 (Sei) e shrunken-2 (sh2) convencionais no estágio de alimentação primário (em um nível de aproximadamente 75 % de umidade). A FIG. 1 mostra que a linhagem sugary-1 (Sul) tem o nível mais baixo de sacarose (cerca de 7,5 %), seguido pela linhagem sugary enhancer-1 (Sei) (cerca de 12,5 %), e depois pela linhagem shrunken-2 (sh2), que tem um nível muito mais alto de sacarose em comparação com as outras duas linhagens (cerca de 27,5 %).

A FIG. 2 mostra a retenção ou “capacidade de contenção” de açúcar do endosperma relativas na temperatura ambiente para as linhagens mutantes genéticas sugary-1 (Sul), sugary enhancer-1 (Sei) e shrunken-2 (sh2) convencionais no estágio de alimentação primário (em um nível de aproximadamente 75 % de umidade) em um intervalo de sete dias (Dias 1 a 7). A mesma mostra mudanças representativas nos níveis de sacarose de endosperma em relação ao tempo para os três tipos genéticos diferentes. A FIG. 2 mostra que a linhagem sugary-1 (Sul) tem o nível mais baixo de sacarose em todos os tempos durante o período de 7 dias (variando de cerca de 4 % no Dia 1 a cerca de 1 % no Dia 7), seguido pela linhagem sugary enhancer-1 (Sei) (variando de cerca de 12 % no Dia 1 a cerca de 2 % no Dia 7), e depois pela linhagem shrunken-2 (sh2), que tem um nível muito mais alto de sacarose em cada um dos Dias 1 a 7 em comparação com as outras duas linhas (variando de cerca de 25 % no Dia 1 a cerca de 13 % no Dia 7).

A FIG. 3 fornece uma comparação de níveis de pericarpo representativas para as linhagens mutantes genéticas sugary-1 (Sul), sugary enhancer-1 (Sei) e shrunken-2 (sh2) convencionais no estágio de alimentação primário (em um nível de aproximadamente 75 % de umidade). A FIG. 3 mostra que a linhagem sugary enhancer-1 (Sei) tem o nível mais baixo de pericarpo (cerca de 0,75 %), seguido pela linhagem sugary-1 (Sul) (cerca de 1,1 %), e depois pela linhagem shrunken-2 (sh2), que tem um nível muito maior de pericarpo em comparação com as outras duas linhagens (cerca de 1,6%).

A FIG. 4 mostra os níveis de pericarpo relativas na temperatura ambiente para as linhagens mutantes genéticas sugary-1 (Sul), sugary enhancer-1 (Sei) e shrunken-2 (sh2) convencionais no estágio de alimentação primário (em um nível de aproximadamente 75 % de umidade) em um intervalo de sete dias (Dias 1 a 7). A mesma mostra mudanças representativas nos níveis de pericarpo em relação ao tempo para os três tipos genéticos diferentes. A FIG. 4 mostra que a linhagem shrunken-2 (sh2) no geral tem o nível mais baixo de pericarpo durante o período de 7 dias (variando de cerca de 1,6 % no Dia 1 a cerca de 2,1 % no Dia 7), seguido pela linhagem sugary enhancer-1 (Sei) (variando de cerca de 1,1 % no Dia 1 a cerca de 4,9 % no Dia 7) e a linhagem sugary-1 (Sul) (variando de cerca de 1,7 % no Dia 1 a cerca de 4,9 % no Dia 7).

As maiores vantagens dos tipos de açúcar mais alto de milho, isto é, as variedades sugary enhancer-1 (Sei) e shrunken-2 (sh2), são a sua: (i) doçura maior; (ii) janela de colheita mais longa de tempo; e (iii) vida de prateleira mais longa. Um nível de açúcar inicial mais alto, e uma perda de açúcar mais baixa na colheita, ou durante o período de tempo imediatamente seguinte ao estágio de alimentação primário, fornecendo flexibilidade maior de colheita, e de condições de manuseio, e uma vida de prateleira mais longa para o milho.

Gene Mutante Sh2-i (Shrunken-2i)

A Patente U.S. N² 6.184.438 BI descreve uma identificação e caracterização de uma forma mutante do gene shrunken-2 (sh2), designada como shrunken-2i (sh2-i). Quando presente nas plantas de milho, este alelo mutante (e suas variantes) é dito conferir características de germinação intensificada a estas plantas quando comparadas com as plantas de milho que expressam o sh2. Esta patente descreve métodos para transformar plantas com este alelo mutante (e variantes), e plantas que têm este alelo mutante incorporado nos seus genomas.

A ADP-glicose pirofosforilase é uma enzima do endosperma do milho que é uma enzima importante na síntese de amido, e catalisa uma conversão de ATP e α-glicose-l-fosfato para ADP-glicose e pirofosfato. A ADP-glicose que surge da ação desta enzima é a maior doadora de glicose para a biossíntese de amido em plantas. As enzimas de AGP foram isoladas dos tecidos vegetais fotossintéticos e não fotossintéticos, e é um heterotetrâmero que contém duas subunidades.

A ADP-glicose pirofosforilase de endosperma do milho é composta de duas subunidades dissimilares que são codificadas por dois genes dessemelhantes, shrunken-2 (sh2) e brittle-2 (bt2). (M. Bhave et al., “Identification and Molecular Characterization of Shrunken-2 cDNA Clones of Maize,” The Plant Cell 2: 581-588 (1990); J. Bae et al., “Cloning and Characterization of the Brittle-2 Gene of Maize,” Maydica 35: 317-322 (1990)). Estes genes codificam a subunidade grande e a subunidade pequena desta enzima, respectivamente. A proteína produzida pelo gene shrunken-2 tem um peso molecular prognosticado de 57,179 Da. (J. Shaw et al., “Genomic Nucleotide Sequence of a Wild-Type Shrunken-2 Allele of Zea mays,” Plant Physiol. 98: 1214-1216 (1992)).

Os mutantes do endosperma do milho Shrunken-2 (sh2) e brittle-2 (bt2) no geral têm níveis de amido enormemente reduzidos, que desvantajosamente correspondem com níveis enormemente reduzidos ou deficientes de atividade de AGP. As mutações de cada gene mostraram reduzir a atividade de AGP em cerca de 95 %. (C. Tsai et al., “StarchDeficient Maize Mutant Lacking Adenosine Diphosphate Glycose Pyrophosphorilase Activity,” Science 151: 341-343 (1966); D. Dickinson et al., “Presence of ADP-Glycose Pyrophosphorilase in Shrunken-2 e Brittle-2 Mutants of Maize Endosperm,” Plant Physiol. 44: 1058-1062 (1969)). Também foi observado que as atividades enzimáticas aumentam com a dosagem de alelos shrunken-2 (sh2) e brittle-2 (bt2) do tipo selvagem funcionais, ao passo que enzimas mutantes no geral têm as propriedades cinéticas alteradas. AGP parece ser a etapa limitante de taxa na biossíntese de amido em plantas. (D. Stark et al., “Regulation of the Amount of Starch in Plant Tissues by ADP Glycose Pyrophosphorilase,” Science 258: 287-292 (1992)).

A clonagem e caracterização dos genes que codificam as subunidades de enzima AGP foram relatadas para várias plantas e incluem cDNA de shrunken-2 (sh2), DNA genômico de shrunken-2 (sh2), e cDNA de brittle-2 (bt2) do milho, cDNA da subunidade pequena e DNA genômico do arroz, cDNAs das subunidades pequena e grande da folha do espinafre, e tubérculo da batata. Além disso, os clones de cDNA foram isolados do endosperma e tecido de folha do trigo e folha de Arabidopsis thaliana.

A junção de gene é essencialmente uma reação de duas etapas de clivagem-ligação que pode produzir lesões moleculares nos genes, tais como o gene shrunken-2 (sh2) do tipo selvagem. A primeira etapa envolve a clivagem no sítio de junção 5’ que leva à formação de um intron laço com o resíduo de adenosina da sequência do ponto de ramificação localizado a montante do sítio de junção 3’. Isto é seguido pela ligação do exon e liberação do intron laço. (M. J. Moore et al., “Evidence of Two Active Sites in the Spliceosome Provided by Stereochemistry of Pre-mRNA Splicing,” Nature 365: 364-368 (1993); M. J. Moore et al., “Splicing of Precursors to mRNAs by the Spliceosome” em The RNA World. 303-308 (R. Gesteland e J. Atkins, eds., Cold Spring Harbor Laboratory Press, 1993); P. A. Sharp, “Split Genes and RNA Splicing,” Cell 77: 805-815 (1994); J. W. S. Brown, “Arabidopsis Intron Mutations and Pre-mRNA Splicing,” Plant J. 10(5): 771-780 (1996); G. G. Simpson et al., “Mutation of Putative Branchpoint Consensus Sequences in Plant Introns Reduces Splicing Efficiency,” Plant J. 9(3): 369380 (1996); G. G. Simpson et al., “Splicing of Precursors to mRNA in Higher Plants: Mechanism, Regulation and Sub-nuclear Organization of the Spliceosomal Machinery,” Plant Mol. Biol. 32: 1-41 (1996)). Este conjunto de eventos é realizado pela associação pré-mRNA com uma conglomeração de RNA nuclear pequeno (snRNAs) e proteínas nucleares que forma um complexo de proteína de ribonucleossoma grande dinâmico (um spliceossoma). Este processo fundamental, comum a toda expressão de gene eucariótico, pode ter um impacto diverso na regulagem da expressão de gene. Por exemplo, a junção de pré-mRNA imprecisa ou errada frequentemente comunica um fenótipo mutante, ao passo que a junção alternativa é algumas vezes importante na regulação da expressão de gene. (C. F. Weil et al., “The Effects of Plant Transposable Element Insertion on Transcription Initiation and RNA Processing,” Annu. Rev. Plant Physiol. Plant Mol. Biol. 41: 527552 (1990); R. Nishihama et al., “Possible Involvement of Diferential Splicing in Regulation of the Activity of Arabidopsis ANP1 that is Related to Mitogen-Activated Protein Kinase Kinase Kinases (MAPKKKs),” Plant J. 12(1): 39-48 (1997); M. Golovkin et al., “Structure and Expression of a Plant UI snRNP 70K Gene: Altemative Splicing of UI snRNP 70K Pre-mRNAs Produces Two Different Transcripts,” Plant Cell 8: 1421-1435 (1996); J. Callis et al., “Introns Increase Gene Expression in Cultured Maize Cells,” Genes and Development 1: 1183-1200). Existem diferenças estruturais/de sequência que podem diferenciar introns vegetais daqueles introns de vertebrado e levedura. (G. J. Goodall et al., “The AU-Rich Sequences Present in the Introns of Plant Nuclear Pre-mRNAs Are Required for Splicing,” Cell 58: 473-483 (1989); G. J. Goodall et al., “Different Effects of Intron Nucleotide Composition and Secondary Structure on Pre-mRNA Splicing in Monocot and Dicot Plants,” EMBO J. 10(9): 2635-2644 (1991)). Uma característica que distingue os introns vegetais daqueles de outros organismos é a sua riqueza em AU. Isto foi implicado ser essencial para o processamento de intron, e para uma definição da junção de intron/exon. (H. Lou et al., “3’ Splice Site Selection in Dicot Plant Nuclei is Position Dependent,” Mol. Cell. Biol. 13(8): 4485-4493 (1993); A. J. McCullough, “Factors Affecting Authentic 5’ Splice Site Selection in Plant Nuclei,” Mol. Cell. Biol. 13(3): 1323-1331 (1993); J. C. CarleUrioste et al., “In Vivo Analysis of Intron Processing using Splicing-Dependent Repórter Gene Assays,” Plant Mol. Biol. 26: 1785-1795 (1994)). As exigências de uma região rica em AU parece ser mais severas em dicotiledôneos em comparação com monocotiledôneos, e alguns introns monocotiledôneos são ricos em GC.

O gene shrunken-2 (sh2) do tipo selvagem, a sequência de nucleotídeo do qual é mostrada na SEQ ID NO. 1, tem 16 exons que, em termos, são separados por 15 introns, como é mostrado na FIG. 5. Este gene é estimado ser de aproximadamente 6000 pares de base no comprimento. Um intron, em particular, é de significância para o alelo sh2-i. Este intron, designado “intron 2,” contém pelo menos de cerca de 7.800 pares de base no gene sh2-i.

Em comparação com o gene shrunken-2 (sh2) do tipo selvagem, o gene shrunken-2i (sh2-i) mutante é caracterizado por uma única mudança de par base no final do intron 2, como é mostrado nas FIGS. 5 e 9. O polinucleotídeo mutante compreende uma substituição da base terminal do tipo selvagem no final do intron 2 de um G para uma outra base, tal como para A, C ou T (e não o nucleotídeo G do tipo selvagem), e preferivelmente para A. Por exemplo, se o gene shrunken-2 do milho contém uma mutação de G para A do nucleotídeo terminal deste intron, o resultado seria uma mudança da sequência de nucleotídeo AG que é encontrada no terminal deste intron de gene vegetal para uma sequência AA no terminal 3 ’ deste intron. Em outras palavras, o resultado é uma lesão molecular do alelo sh2-i em que o mesmo sofreu uma mutação de G para A na base terminal do intron 2 no gene sh2 do milho.

O alelo sh2-i mutante (e suas variantes), quando expressado em uma planta, tal como milho, provê a planta com características de crescimento intensificado, tal como uma germinação intensificado, e um vigor de muda, semente e/ou planta intensificado, em comparação com outras variedades de milho doce, em combinação com traços de consumidor desejáveis, tais como doçura.

A linhagens de milho doce puras que contêm o alelo sh2-i mutante (“puros de conversão sh2-i”) no geral demonstram doçura, e os níveis de açúcar, que são similares às contrapartes de shrunken-2 (sh2) convencionais no estágio de ingestão de pico (em aproximadamente 75 % de umidade). Entretanto, em um ponto no tempo apenas passa o estágio de alimentação primário, as linhagens de planta pura sh2-i mutante iniciam uma aceleração rápida da síntese de amido. Isto resulta em fenótipos de semente seca que são de modo físico significantemente mais cheias e mais pesadas do que as suas contrapartes shrunken-2 (sh2) e, em algum grau, lembram a aparência de uma semente de milho flint modificada. O resultado líquido é um realce global de semente e germinação de muda e vigor, e vigor da planta, junto com características de crescimento de planta intensificado associadas. Esta germinação melhorada e o fenômeno de crescimento de planta acelerado, diretamente resulta em potenciais e consistências de rendimento de colheita variada melhorados.

O teste de germinação em solo frio de laboratório conduzido pelo presente inventor que compara as variedades de milho híbridas shrunken2 (sh2) convencionais com as variedades de milho que expressam o gene shrunken-2i (sh2-i) resultou em contagens substancialmente mais fortes para os híbridos sh2-i. A Tabela 2 abaixo fornece as contagens de germinação em solo frio de laboratório para as linhagens de milho híbridas quase isogênicas (NILs) designadas como ACX 5137Y (que não expressam o alelo sh2-i) e ACX SS 7501Y (que expressam o alelo sh2-i). Estas são essencialmente comparações de dois milhos híbridos que diferem apenas na presença do alelo sh2-i. As contagens representam médias de três testes em duplicata de 100 grãos cada um.

Tabela 2

Contagens de Germinação em Solo Frio para Híbridos de Isolinhagem

Híbrido de Isolinhagem Germinação em Solo Frio (% de Germinação)

ACX 5137Y (não contendo o alelo sh2-i no seu genoma) 82

ACX SS 7501Y (contendo o alelo sh2-i no seu genoma) 97

Resultados de laboratório similares foram gerados para numerosos outras comparações de híbridos entre híbridos de shrunken-2 (sh2) convencionais contendo, ou não contendo, o alelo sh2-i. Além disso, os dados de germinação e estabelecimento do nível de campo na Flórida e Califórnia têm substanciado as descobertas de dados de laboratório.

O teste organoléptico de numerosos linhagens de milho híbridas quase isogênicas (NILs) (conversões retrocruzadas híbridas shrunken-2 (sh2) convencionais contendo, e não contendo, o alelo sh2-i), entretanto, desvantajosamente produziram contagens de avaliação de doçura indicando uma rápida formação de amido nos híbridos sh2-i, no geral imediatamente seguinte ao estágio de alimentação primário. Os híbridos sh2-i exibiram doçura reduzida dentro de cerca de 24 a cerca de 48 horas imediatamente a seguir do estágio de alimentação primário, com uma degradação e perda de açúcar significante correspondente em cerca de três dias após o estágio de alimentação primário.

A FIG. 6 apresenta médias organolépticas para o acúmulo de amido para linhagens híbridas quase isogênicas shrunken-2 (sh2) convencionais (NILs) que não contêm o alelo shrunken-2i (sh2-i) mutante em comparação com aquelas para linhagens híbridas quase isogênicas shrunken-2 (sh2) convencionais (NILs) que contêm o alelo shrunken-2i (sh2-i) mutante com o tempo em 17 Dias imediatamente a seguir do estágio de alimentação primário (em um nível de aproximadamente 75 % de umidade). A faixa de contagem organoléptica de 1 (doce com pouco ou nenhum gosto de amido) a 10 (muito pouca doçura com um gosto de amido considerável). A FIG. 6 mostra que as linhagens híbridas quase isogênicas shrunken-2 (sh2) convencionais (NILs) que não contêm o alelo the shrunken-2i (sh2-i) mutante têm contagens organolépticas significantemente mais baixas (variando de cerca de 1 no Dia 1 a cerca de 4 no Dia 7) em comparação com as linhagens híbridas quase isogênicas shrunken-2 (sh2) convencionais (NILs) que contêm o alelo shrunken-2i (sh2-i) mutante (variando de cerca de 1,9 no Dia 1 a cerca de 7,9 no Dia 7).

Em essência, a incorporação do alelo shrunken-2i (sh2-i) nas variedades de milho doce convencionais é considerada ser impraticável devido a um rápido acúmulo de amido no período de tempo imediatamente seguinte ao estado alimentação primário, e a perda associada de capacidade de ser guardada e vida de prateleira.

Descrição de outra Técnica

A Patente U.S. N° 3.971.161 descreve métodos que são ditos produzir sementes híbridas de milho doce em quantidades comerciais, aumentar o teor de açúcar do milho doce sem reduzir seriamente o teor de polissacarídeo solúvel em água, e produzir sementes que forneçam um milho doce adequado para o processamento com uma quantidade mínima de adoçantes externos. A mesma estabelece que o teor de açúcar do milho doce pode ser aumentado sem reduzir seriamente o polissacarídeo solúvel em água pelo uso do gene shrunken-2 (sh2), e que combinando um milho doce que é um puro sugary-1 (Sul) homozigota com um puro de milho doce (homozigota Sul sh2) resultará em um híbrido heterozigoto que tem aproximadamente 50 % mais sacarose, 33 % mais açúcares totais e um nível de polissacarídeo solúvel em água próximo a aquele do milho doce (homozigota Sul). Os níveis de polissacarídeo solúvel em água e sacarose altos são ditos serem particularmente desejáveis nas indústrias de processamento de alimento, tais como nas indústrias de enlatamento e congelamento.

As Patentes U.S. N~ 5.589.618 e 5.650.557 descrevem uma variante do gene shrunken-2 (sh2) do milho que é designado Sh2-ml Rev6, e um método de usar este gene. Sh2-ml Rev6 é dito codificar uma subunidade da enzima ADP-glicose pirofosforilase (AGP) que tem aminoácidos adicionais inseridos no, ou próximo, sítio de ligação alostérico da proteína. A semente de milho que expressa o gene Sh2-mlRev6 é dita ter um aumento de peso de 15 % em relação à semente do tipo selvagem, e o aumento no peso da semente é dito não estar associado simplesmente com um aumento no teor de amido percentual da semente.

A Patente U.S. N^s 5.746.023 descreve um método para identificar marcadores genéticos que são ditos estar ligados aos alelos que conferem potencial de rendimento de uma espécie de colheita. Conduzindo-se a análise de marcador genético de um conjunto de linhagens de elite correntes, e a população ancestral a partir da qual elas foram derivadas por décadas de cruzamento de planta, a patente 5.746.023 estabelece que pode-se determinar e comparar as frequências de alelo esperadas, e observadas, dentro das populações de elite em numerosos locais polimórficos.

A Patente U.S. N^a 5.912.413 descreve a enzima de desramificação de amido codificada pelo gene sugary (Sul) que é ativa no endosperma do milho (Zea mays), e as sequências de cDNA e gene que codificam esta enzima. A sequência de aminoácido da enzima é dita ser significantemente similar àquela de isoamilases bacterianas, enzimas que hidrolisam ligações glicosídicas a-(l—>6). Esta patente estabelece que a similaridade de sequência de aminoácido estabelece Sul como um membro da super família da α-amilase de enzimas hidrolíticas do amido. A patente 5.912.413 também divulga anticorpos que são reativos com a proteína Sul, métodos de produzir anticorpos para a proteína Sul, métodos de produzir proteínas de fusão que incluem Sul, e métodos de produzir plantas transgênicas com um gene Sul modificado.

A Patente U.S. N^s 6.184.438 BI descreve alelos mutantes dos genes que codificam a subunidade grande da AGP-glicose pirofosforilase em plantas, métodos para transformar plantas com os alelos mutantes, e plantas que têm os alelos mutantes incorporados dentro do seu genoma. Quando presentes nas plantas de milho, os alelos mutantes são ditos conferir características de germinação intensificadas às plantas, quando comparadas com as plantas que expressam o gene sh2-R.

A Patente U.S. N² 6.756.524 B2 descreve uma isolação e identificação de uma molécula de ácido nucleico que é dita regular o tamanho da fruta e/ou divisão celular nas plantas, e a proteína codificada por esta molécula de ácido nucleico. A patente 6.756.524 também descreve um vetor de expressão contendo o ácido nucleico codificador, e métodos por meio dos quais o tamanho da fruta é dito ser reduzido e/ou aumentado, e a divisão celular é dita ser regulada, por uma transformação de plantas com esta molécula de ácido nucleico. A mesma também debate células hospedeiras, plantas transgências e sementes de planta contendo esta molécula de ácido nucleico.

A Patente U.S. N^s 7.084.320 B2 descreve métodos para selecionar uma linhagem de planta pura precursora (tendo um fundo genético particular) que tem uma boa capacidade de combinação, por exemplo, para a produção de linhagens híbridas da planta, a partir de uma coleção de linhagens precursoras. Uma tal linhagem de planta pura precursora é aludida como sendo “um combinador excelente” em experimentos de cruzamento que são descritos nesta patente. No cruzamento de tal linhagem de planta pura precursora com uma outra linhagem de planta pura precursora (tendo um fundo genético diferente), as duas linhagens de planta pura precursora são ditas serem capazes de produzir uma linhagem de planta híbrida com alto efeito de heterose, e as sementes das linhagens puras selecionadas cruzadas são coletadas e, opcionalmente, plantadas e cultivadas para se obter as plantas híbridas. A patente 7.084.320 também descreve métodos para determinar o desempenho agronômico de linhagens de planta diferentes, que incluem os híbridos precedentes, que a mesma estabelece poder ser realizado in vitro determinando-se o fluxo de elétron na mitocondria sob condições de controle e estresse. A patente 7.084.320 descreve um objetivo como sendo fornecer um método para selecionar uma linhagem de planta híbrida (ou outra) tendo o vigor de crescimento e rendimento mais altos de uma coleção de linhagens de planta da mesma espécie (variedade). A mesma descreve e mostra (FIG. 1) um ensaio de vigor que a mesma estabelece poder ser usado para identificar linhagens de planta que são afetada no seu vigor.

M. Clancy e LC Hannah, “The Mutations sh2-i e sh2-N2340 Share a Identical Intron Splice Site Mutation and are Most Likely the Same Allele,” Maize Genetics Cooperation Newsletter 80 (2006), estabelece que os alelos mutantes sh2-i e sh2-N2340, que são publicamente disponíveis da Maize Stock Center (Urbana/Champaign, IL), foram gerados usando a mutagênese EMS, e condicionando um fenótipo intermediário ou mal vedado. A mesma estabelece ainda que os grãos sh2-i e sh2-N2340 são visualmente similares, seguem a mesma fonte, e são menos severamente colapsados quando maduros em comparação com um alelo de referência sh2-R. A mesma estabelece que o sequenciamento estabeleceu que sh2-i contém uma transição de G a A no terminal 3 do intron 2 (Lal et al., Plant Physiol. 120: 65-72, 1999), e que aproximadamente 10 % dos transcritos sh2-i são corretamente unidos utilizando o sítio de união de intron mutante, gerando um baixo nível de atividade de adenosina difosfato glicose pirofosforilase que resulta no fenótipo de grão intermediário. A mesma estabelece que, de modo a determinar se os alelos sh2-i e sh2-N2340 contêm ou não a mesma mutação, material de broto jovem foi colhido a partir dos grãos sh2-N2340 germinando, o DNA genômico foi preparado usando Plant DNAZOL Reagent (Invitrogen, Carlsbad, CA), e o DNA que transpõem os exons 1 até 4 foi amplificado via PCR usando os iniciadores descritos por Lal et al. A mesma estabelece que, porque o sequenciamento do produto PCR estabeleceu que sh2-i e sh2-N2340 compartilham a mesma transição de G para A do nucleotídeo final no intron 2, parece que a mesma mutação carrega duas designações diferentes (isto é, existem dois nomes diferentes para o mesmo alelo mutante).

Embora os genes shrunken-2i (sh2-i), sugary-1 (Sul) e sugary enhancer-1 (sei) sejam conhecidos, ninguém até agora foi capaz de combinar com êxito estes genes para produzir plantas, materiais de planta e sementes tendo um vigor intensificado, enquanto também retêm traços de consumidor desejáveis, tais como um nível de açúcar elevado durante o período que segue o estágio de alimentação primário, e isto tem levado à frustração entre criadores de planta, cultivadores de planta e consumidores. Existe, assim, uma necessidade a muito sentida, mas não resolvida, na indústria para os métodos eficazes em custo, confiáveis, eficientes e bem sucedidos para produzir comercialmente plantas puras e híbridas tendo sementes que exibam um teor mais completo (isto é, mais energia armazenada) no estágio de semente seca em comparação com as plantas de contraparte convencionais, que resultam em um vigor intensificado durante a germinação da semente, emergência da muda do solo e desenvolvimento da planta (como o milho doce sh2-i convencional), mas que também retêm traços de consumidor desejáveis, tais como um nível de açúcar elevado durante o período que segue o estágio de alimentação primário, mantendo um sabor doce ou desejável da planta, ou suas partes de planta (sementes, frutas, vegetais, grãos de milho, espigas de milho, ou seus semelhantes). As características de crescimento e gosto melhoradas de plantas, tais como milho doce, conferiríam um avanço significante na produção comercial destas plantas.

Vários criadores e cultivadores de planta comercial, tais como Rogers NK (Boise, ID) e Syngenta Seeds, Inc. (Stanton, MN), têm tentado, e falharam, em combinar com êxito traços para obter uma variedade de planta que seja agradável tanto para produzir quanto consumir. Embora Rogers NK tenha um produto de milho comercial (chamado “Brighton”) que inclui o alelo shrunken-2i (sh2-i) do milho no seu genoma, este produto não foi comercialmente bem sucedido porque a qualidade de ingestão (gosto, textura e seus semelhantes) deste produto não é desejável aos consumidores. Porque este produto não tem gosto bom (isto é, o mesmo tem um gosto rico em amido, não doce), o mesmo foi muito indesejável para os cultivadores e jardineiros de milho que estão plantando o milho doce para aceitação dos consumidores.

Além disso, nenhuma das referências acima, ou outras que são aqui descritas, divulgam ou sugerem os métodos, plantas, materiais de planta ou sementes da presente invenção.

SUMÁRIO DA INVENÇÃO

A presente invenção fornece métodos únicos, eficazes em custo, confiáveis, eficientes e bem sucedidos para desenvolver e produzir plantas, materiais de planta e sementes, tais como grãos de milho doce, e milho doce, que muito vantajosamente recebem, e têm, múltiplos atributos muito desejáveis para os consumidores destes produtos, assim como para os cultivadores de planta comercial e jardineiros domésticos, e para plantas, materiais de planta e sementes melhoradas que são produzidas de acordo com estes métodos. Estes métodos inventivos fornecem novas plantas, materiais de planta e sementes híbridos tendo o alelo shrunken-2i (sh2-i) mutante incorporado nos seus genomas, de modo preferível sequencialmente junto com um ou mais outros alelos mutantes, tais como os alelos sugary-1 (Sul), sugary enhancer-1 (Sei) e/ou shrunken-2 (sh2), e que muito vantajosamente têm múltiplas características muito benéficas e desejáveis, no geral incluindo uma textura macia e cremosa, um nível de açúcar intensificado que resulta em um gosto doce ou outro muito desejáveis, uma capacidade de retenção de açúcar prolongada (e benefícios de gosto associados, tais como o gosto doce do milho doce) no estágio de alimentação pós excelente, uma janela de colheita mais longa da planta, uma capacidade da planta de ser guardada por mais tempo (espigas do milho doce e seus semelhantes), e uma vida de prateleira mais longa da planta antes que a doçura deteriore depois do estágio de alimentação primário, sementes e/ou grãos que fisicamente sejam mais cheios, e tenham um teor de carboidrato e polissacarídeos solúveis em água (WSP) mais altos, no estágio de semente seca, e/ou vigor e aptidão significantemente intensificados para a planta, material de planta e/ou semente durante a germinação da semente, emergência da muda do solo, e desenvolvimento da planta.

A presente invenção também fornece métodos para incorporar o gene sh2-i mutante nos genomas de linhagens precursoras de milho doce feminino (e outro) comercialmente aceitáveis (e outro) que originalmente não inclui o gene sh2-i nos seus genomas, e para identificar linhagens precursoras de milho doce feminino (e outro) dentro das quais o gene sh2-i mutante foi incorporado com êxito (frequentemente aqui aludidos como “linhagens de conversão sh2-i”).

Além disso, a presente invenção fornece processos de construção únicos e bem sucedidos para produzir linhagens de milho doce híbrido (e outra planta) tendo uma série de traços múltiplos muito desejáveis, como são aqui descritos em detalhes, que são opcionalmente, mas preferivelmente, desenvolvidos usando os seguintes tipos de linhagens precursoras de milho doce (ou outro planta) femininas e masculinas:

(i) uma linhagem precursora de milho doce (ou outro planta) feminina contendo o alelo de endosperma sh2-i mutante no seu genoma (isto é, uma “linhagem de conversão de sh2-i”):

preferivelmente como uma conversão de uma linhagem precursora feminina “superdoce” convencional que inclui a combinação alélica de Sul Sul sh2sh2 no seu genoma, opcionalmente, mas preferivelmente, usando marcadores moleculares e sequencialmente estratificar o alelo sh2-i mutante contra um fundo genético (genótipo) de Sul Sul sh2sh2 para produzir, por exemplo, uma linhagem de “conversão Sul Sul sh2-i sh2-i” feminina que inclui o genótipo de alelo mutante de endosperma Sul Sul sh2-i sh2-i desejado no seu genoma, e produzido pela incorporação do gene de endosperma sh2-i mutante em uma linhagem Sul Sul sh2sh2 precursora feminina “superdoce” convencional (isto é, que inclui um fundo genético ou genótipo Sul Sul sh2sh2); e mais preferivelmente como uma conversão de uma linhagem precursora feminina que inclui a combinação alélica homozigota recessiva dupla de sul sul sei sei no seu genoma, tal como sul sul sei sei ou sul sul sei sei sh2sh2, opcionalmente, mas preferivelmente, usando marcadores moleculares e sequencialmente reproduzindo por megulhia o alelo sh2-i mutante contra um fundo genético (genótipo) dos alelos homozigotas recessivos sei sei e sul sul para produzir, por exemplo, uma “linhagem de conversão sul sul sei sei sh2-i sh2-i” feminina que inclui o genótipo do alelo mutante de endosperma desejado sul sul sei sei sh2-i sh2-i no seu genoma, e produzidas pela incorporação do gene de endosperma sh2-i mutante em um linhagem de planta feminina que inclui um genótipo recessivo homozigota de sul sul sei sei no seu genoma (isto é, que inclui um fundo genético ou genótipo sulsul selsel ou sulsul selsel sh2sh2); e (ii) uma linhagem precursora de milho doce (ou outro planta) masculina que inclui no seu genoma uma construção alélica homozigota recessiva único, dupla ou tripla ou combinação em conexão com os alelos de endosperma mutantes de sugary 1 (sul), sugary enhancer-1 (sei) e/ou shrunken-2 (sh2) (ou outro), tais como o genótipo Sul SulSelSelsh2sh2 (construção única), e preferivelmente a combinação alélica homozigota recessiva dupla sulsul Sei Sei sh2sh2 ou sulsul sh2sh2, e ainda mais preferivelmente a combinação alélica homozigota recessiva tripla sulsul selsel sh2sh2 (com ambas de tais combinações alélicas mutantes de endosperma homozigota recessivo duplas e triplas que inclui os alelos mutantes de endosperma homozigota recessivo duplo sulsul e sh2sh2).

As linhagens de milho doce precursor feminino acima (ou outra planta) expressam, e transmitem para os híbridos produzidos com as mesmas (quando construídos na maneira que é aqui descrita), os muitos traços desejáveis de uma germinação de muda intensificada e um vigor de muda intensificado. As linhagens de milho doce (ou outra planta) precursor masculino acima, por outro lado, expressam, e transmitem para os híbridos produzidos com os mesmos (quando construídos na maneira que é aqui descrita), os traços de cultivador e/ou de consumidor muito desejáveis de produzir grãos de milho doce (ou outras partes de planta) que: (i) são excepcionalmente altos no teor de açúcar (sacarose) e, como um resultado, têm um gosto muito doce; (ii) têm pericarpos muito macios; e (iii) têm capacidades de contenção significantes (retenção de açúcares mais altos e pericarpos de grão macios tender). Acredita-se que estes traços precursores masculinos sejam um resultado das combinações alélicas mutantes de endosperma genotípico sul sul e sh2sh2 recessivas homozigotas duplas que estão preferivelmente presentes tanto nas combinações alélicas recessivas das linhagens precursoras masculinas dupla e tripla acima (dupla: sul sul Sei Sei sh2sh2 ou sulsul sh2sh2; tripla: sulsul selsel sh2sh2).

Os alelos de endosperma mutante da linhagem de milho doce (ou outro planta) precursora feminino e masculino acima, quando expressado em uma tal maneira em um híbrido de milho doce (ou outra planta), muito vantajosamente fornecem os híbridos com características de crescimento significantemente intensificados, tais como uma germinação de muda intensificada e um vigor de muda intensificado, em comparação com híbridos de milho doce (ou outra planta) muito similar ou outros que não têm tais alelos de endosperma mutante expressados desta maneira (isto é, que não foram desenvolvidos usando tais linhagens precursoras femininas e masculinas). Isto é muito evidente a partir da comparação de dados de teste que são apresentados na seção de “Exemplos” abaixo, por exemplo, como um resultado de testar tanto no laboratório quanto no campo, e de teste organolépticos, de duas linhagens de milho doce precursoras diferentes ou linhagens de milho doce híbridas que são idênticas com a única exceção de que um inclui o alelo mutante de endosperma sh2-i no seu genoma, e o outro não.

A presente invenção também fornece uma identificação e incorporação do gene do endosperma sh2-i mutante dentro de linhas precursoras de milho doce (ou outra planta) comercialmente aceitável (ou outro) para produzir plantas, materiais de planta e sementes híbridos usando uma combinação de: (i) linhagens precursoras femininas que incluem no seu genoma o alelo de endosperma mutante shrunken-2i (sh2-i) preferivelmente incorporado em um fundo genético (genótipo) “superdoce” (Sul Sul sh2sh2) convencional para fornecer o genótipo Sul Sul sh2-i sh2-i resultante, que é característica da germinação de muda intensificada e vigor de muda intensificado; e (ii) linhagens precursoras masculinas que incluem em seu genoma os genótipos de endosperma mutante homozigota recessiva dupla (sulsul SelSel sh2sh2 ou SulSul sh2sh2) ou tripla (sulsul SelSel sh2 sh2) (ou outros), que são característicos de serem excepcionalmente altos em açúcar, provendo deste modo um gosto doce para os produtos, com pericarpos de grão muito macios. Os produtos híbridos resultantes têm traços benéficos múltiplos, que incluem um vigor e aptidão significantemente intensificados para a planta, material de planta e/ou semente durante a germinação, emergência da muda do solo, e desenvolvimento de planta. Este benefício é ligado com a retenção de açúcar adequada, capacidade do produto de ser guardado e vida de prateleira no estágio de ingestão de pico, por exemplo, em aproximadamente 75 % de umidade do grão, e através de uma janela de colheita de pelo menos 48 horas (e frequentemente mais longa).

Em um aspecto, a presente invenção fornece um método para produzir uma planta, material de planta ou semente híbridos que têm um vigor intensificado em comparação com uma planta, material de planta ou semente híbridos shrunken-2 (sh-2) mutante ou shrunken-2i (sh2-i) mutante convencionais, e uma capacidade intensificada para reter açúcar em um período de tempo imediatamente seguinte a um estágio de alimentação primário destes, em comparação com uma planta, material de planta ou semente híbridos sugary-1 (Sul) ou shrunken-2i (sh2-i) mutantes convencionais, que compreendem opcionalmente usar um ou mais marcadores moleculares para de modo preferível, mas opcional, sequencialmente incluem no genoma da planta, material de planta ou semente um alelo de endosperma de shrunken-2i (sh2-i) mutante e um ou mais outros alelos de endosperma mutante que conferem as características precedentes para a planta, material de planta ou semente. Embora tal uso de marcadores moleculares em conexão com tal reprodução por megulhia sequencial de alelos de endosperma mutante no genoma da planta, material de planta ou semente, são tanto muito desejáveis, quanto são preferíveis, como é aqui debatido em detalhes, particularmente em conexão com o Exemplo 4 e Exemplo 8 aqui abaixo, tal etapa de processo é opcional.

Em um outro aspecto, a presente invenção fornece um método para produzir uma planta híbrida, planta, material de planta ou semente que tenham tanto um vigor intensificado em comparação com uma planta híbrida, planta, material de planta ou semente mutantes shrunken-2 (sh-2) ou shrunken-2i (sh2-i) convencionais, quanto uma capacidade intensificada para reter açúcar em um período de tempo imediatamente seguinte a um estágio de alimentação primário destes (ou um ou mais outros traços desejáveis), em comparação com uma planta híbrida, planta, material de planta ou semente mutantes em sugary-1 (Sul) ou shrunken-2i (sh2-i) convencionais, que compreendem as seguintes etapas em qualquer ordem adequada:

(a) identificar uma linhagem de planta pura que inclui um ou mais alelos mutantes desejados no seu genoma, isoladamente ou em combinação, que inclui, mas não é limitado aos alelos mutantes sugary 1 (Sul), sugary enhancer-1 (Sei) e shrunken 2 (sh2), opcionalmente usando marcadores moleculares;

(b) construir uma ou mais linhagens de planta femininas quase isogênicas (NILs) tendo um genótipo desejado, que inclui, mas não é limitado às seguintes combinações alélicas endospérmicas mutantes triplas:

(i) SulSul SelSel sh2sh2;

(ii) SulSul sei sei sh2sh2; ou (iii) sulsul sei sei sh2sh2 (uma combinação alélica de endosperma mutante homozigota recessivo triplo);

para o uso como um fundo genético (genótipo) em uma combinação com uma linhagem de planta precursora feminina que tem um alelo mutante shrunken-2i (sh2-i) no seu genoma;

(c) opcionalmente, incorporar um alelo mutante shrunken-2i (sh2-i) no genoma da linhagem de planta feminina quase isogênica tendo um fundo genético desejado da etapa (b), por exemplo que inclui um genótipo de sulsul sei sei sh2sh2 ou SulSul sei sei, opcionalmente, usando um ou mais marcadores moleculares;

(d) selecionar uma linhagem de planta feminina quase isogênica da etapa (c) tendo um alelo shrunken-2i (sh2-i) estratificado sobre um fundo genético (genótipo) de sulsul sei sei, ou de um ou mais outro alelos mutantes desejados, individualmente ou em combinação, no seu genoma (uma “linhagem quase isogênica convertida” feminina);

(e) opcionalmente, cruzar a linhagem de planta feminina quase isogênica convertida selecionada da etapa (d) com uma linhagem de planta masculina que inclui uma construção alélica de endosperma mutante homozigota recessivo triplo no seu genoma, em que tal construção alélica de endosperma mutante homozigota recessivo é SulSul SelSel sh2sh2 (ou alguma outra construção alélica homozigota recessiva tripla que possa fornecer uma planta híbrida com uma qualidade de ingestão alta ou intensificada) no seu genoma para produzir uma planta híbrida tendo um ou mais traços de cultivador e/ou consumidor desejados;

(f) opcionalmente, examinar uma aparência física (fenótipo) de sementes (ou grãos) que resultam das plantas da etapa (d) e/ou etapa (e) quanto às características tais como suavidade, plenitude e/ou peso relativo (em comparação com sementes ou grãos de plantas convencionais ou outras);

(g) opcionalmente, conduzir germinações quentes, frias e/ou outras de laboratório e/ou campo de sementes (ou grãos) que resultam das plantas da etapa (d) e/ou etapa (e) para verificar que tais sementes têm um ou mais traços de consumidor e/ou cultivador desejados, tais como uma germinação, emergência da muda e desempenho de crescimento de planta intensificados, e vigor, que estejam associados com um alelo shrunken-2i (sh2-i) mutante; e (h) opcionalmente, conduzir um ou mais de gosto organoléptico, maciez do pericarpo e/ou outros testes nas plantas (ou partes destas, tais como espigas de milho) que são cultivadas a partir de sementes (ou grãos) produzidas pelas plantas da etapa (d) e/ou etapa (e) para determinar seu gosto, maciez do pericarpo e/ou outras características organolépticas, examinar de modo ideal os traços físicos e horticulturais globais (isto é, fenótipo) que sejam compatíveis com plantas que expressam um ou mais traços de cultivador e/ou consumidor desejados.

Seguindo-se os processos acima, uma regulagem de acúmulo de carboidrato e maciez do pericarpo (entre outros traços) pode ser manipulada em uma planta, material de planta e/ou semente, e um alelo shrunken-2i (sh2-i) mutante pode ser incorporado no genoma da planta, material de planta ou semente para dar aos mesmos os traços de produção e de consumo desejados. Plantas, materiais de planta e sementes podem ser cultivados de modo que exibam um teor mais completo no estágio de semente seca em comparação com outras variedades ou linhagens de planta, e resultar em um vigor intensificado durante a germinação da semente, emergência da muda do solo e/ou desenvolvimento de planta, e que também mantenha um nível de açúcar elevado, que resulte em um sabor doce ou outros desejáveis da planta, material de planta e/ou semente em um período de tempo imediatamente a seguir do estágio de alimentação primário destes. Aqueles tendo habilidade comum na técnica podem determinar o número de vezes que uma etapa particular no processo acima, tal como o retro cruzamento de linhagens quase isogênicas, deve ou devem ser realizados de modo a obter um resultado bem sucedido do processo. Como é indicado acima, algumas destas etapas são preferivelmente realizadas múltiplas vezes.

Em um outro aspecto, a presente invenção fornece uma planta híbrida, planta, material de planta ou semente que tenham um vigor intensificado em comparação com uma planta híbrida, planta, material de planta ou semente mutantes shrunken-2 (sh-2) ou shrunken-2i (sh2-i) convencionais, e uma capacidade intensificada para reter açúcar em um período de tempo imediatamente seguinte a um estágio de alimentação primário destes, em comparação com uma planta híbrida, planta, material de planta ou semente mutantes em sugary-1 (Sul) ou shrunken-2i (sh2-i) convencionais, que consistem das etapas (a) até (h) acima, em qualquer ordem adequada.

Já em um outro aspecto, a presente invenção fornece uma semente de planta que é produzida por qualquer um dos métodos que é descrito acima (ou de outro modo aqui).

Em um outro aspecto, a presente invenção fornece uma semente híbrida ou outra semente de planta que compreende um genoma que inclui o alelo shrunken-2i (sh2-i) que é sequencialmente produzido por meio de mergulhia através de um fundo genético de um ou mais alelos mutantes adicionais que provêem a semente de planta com um ou mais traços desejáveis, em que a semente de planta é conferida com um vigor intensificado em comparação com uma semente de planta mutante em shrunken-2 (sh-2) ou shrunken-2i (sh2-i) convencional, e uma capacidade intensificada para reter açúcar em um período de tempo imediatamente seguinte a um estágio de alimentação primário destes, em comparação com uma semente de planta mutante sugary-1 (Sul) ou shrunken-2i (sh2-i) convencional.

Ainda em um outro aspecto, a presente invenção fornece uma semente híbrida ou outra semente de planta que consiste de um genoma que inclui o alelo shrunken-2i (sh2-i) que é sequencialmente produzido por meio de mergulhia através de um fundo genético de um ou mais alelos mutantes adicionais que provêem a semente de planta com um ou mais traços desejáveis, em que a semente de planta é conferida com um vigor intensificado em comparação com uma semente de planta mutante em shrunken-2 (sh-2) ou shrunken-2i (sh2-i) convencional, e uma capacidade intensificada para reter açúcar em um período de tempo imediatamente seguinte a um estágio de alimentação primário desta, em comparação com uma semente de planta mutante sugary-1 (Sul) ou shrunken-2i (sh2-i)) convencional.

Em um outro aspecto, a presente invenção fornece uma planta ou material de planta que é produzida por qualquer um dos métodos que são descritos acima (ou de outro modo aqui).

Já em um outro aspecto, a presente invenção fornece uma planta ou material de planta híbridos ou outros que compreende um genoma que inclui o alelo shrunken-2i (sh2-i) que é sequencialmente produzido por meio de mergulhia através de um fundo genético de um ou mais alelos mutantes adicionais que provêem a planta ou material de planta com um ou mais traços desejáveis, em que a planta ou material de planta são conferidos com um vigor intensificado em comparação com uma planta ou material de planta mutantes shrunken-2 (sh-2) ou shrunken-2i (sh2-i) convencionais e uma capacidade intensificada para reter açúcar em um período de tempo imediatamente seguinte a um estágio de alimentação primário destes, em comparação com uma planta ou material de planta mutantes em sugary-1 (Sul) ou shrunken-2i (sh2-i) convencionais.

Em um outro aspecto, a presente invenção fornece uma planta ou material de planta híbridos ou outros que consistem de um genoma que inclui o alelo shrunken-2i (sh2-i) que é sequencialmente produzido por meio de mergulhia através de um fundo genético de um ou mais alelos mutantes adicionais que provêem a planta ou material de planta com um ou mais traços desejáveis, em que a planta ou material de planta são conferidos com um vigor intensificado em comparação com uma planta ou material de planta mutantes shrunken-2 (sh-2) ou mutantes shrunken-2 i (sh2-i) convencionais e uma capacidade intensificada para reter açúcar em um período de tempo imediatamente seguinte a um estágio de alimentação primário destes, em comparação com uma planta ou material de planta mutantes em sugary-1 (Sul) ou shrunken-2i (sh2-i) convencionais.

Já em um outro aspecto, a presente invenção fornece um método para produzir uma planta híbrida, planta, material de planta ou semente que tenha tanto um vigor intensificado em comparação com uma planta híbrida, planta, material de planta ou semente mutante em shrunken-2 (sh-2) ou shrunken-2i (sh2-i) convencionais, e uma capacidade intensificada para reter açúcar em um período de tempo imediatamente seguinte a um estágio de alimentação primário destes (ou um ou mais outros traços desejáveis), em comparação com uma planta híbrida, planta, material de planta ou semente mutantes em sugary-1 (Sul) ou shrunken-2i (sh2-i) convencionais, que compreendem as seguintes etapas em qualquer ordem adequada:

(a) identificar uma linhagem de planta pura que inclua um ou mais alelos mutantes desejados no seu genoma, isoladamente ou em combinação, que inclui, mas não é limitado aos alelos sugary 1 (Sul), sugary enhancer-1 (Sei) e shrunken 2 (sh2) de endosperma mutante, opcionalmente usando marcadores moleculares;

(b) construir uma ou mais linhagens de planta femininas quase isogênicas (NILs) tendo um genótipo desejado, que inclui, mas não é limitado à seguintes combinações alélicas triplas:

(i) SulSul SelSel sh2sh2;

(ii) SulSul SelSel sh2sh2; ou (iii) SulSul sei sei sh2sh2 (uma combinação alélica de endosperma mutante homozigota recessiva tripla);

para o uso como um fundo genético (genótipo) em uma combinação com uma linhagem de planta precursora feminina que inclui um alelo mutante shrunken-2i (sh2-i) no seu genoma;

(c) incorporar um alelo mutante shrunken-2i (sh2-i) no genoma da linhagem de planta feminina quase isogênica tendo um fundo genético desejado (genótipo) da etapa (b), opcionalmente, usando um ou mais marcadores moleculares, em que o fundo genético desejado é SulSul sei sei sh2sh2, sulsul selsel, SulSul selsel sh2sh2, SulSul selsel, SulSul sh2sh2 ou um outro fundo genético desejável;

(d) selecionar uma linhagem de planta feminina quase isogênica da etapa (c) tendo um alelo shrunken-2i (sh2-i) mutante incorporado em um fundo genético (genótipo) de SulSul sh2 sh2, ou de um ou mais outros alelos mutantes desejados, individualmente ou em combinação, em que a linhagem de planta feminina quase isogênica inclui uma combinação alélica de endosperma de SulSul sh2-i sh2-i, ou uma outra combinação alélica de endosperma desejável, no seu genoma (uma “linhagem quase isogênica convertida” feminina), que é característica de uma germinação e vigor de muda intensificados;

(e) opcionalmente, cruzar a linhagem de planta feminina quase isogênica convertida selecionada da etapa (d) com uma linhagem de planta masculina que inclui uma construção alélica de endosperma homozigoto recessivo no seu genoma, em que tal construção alélica de endosperma homozigoto recessivo é Sul Sul Sei Sei sh2sh2, sulsul Sei Sei sh2 sh2, sulsul SelSel sh2 sh2, ou uma outra combinação alélica de endosperma homozigota recessivo que possa fornecer uma planta híbrida com uma qualidade de ingestão alta ou intensificada, para produzir uma planta híbrida tendo um ou mais traços de planta, traços de consumidor, ou ambos os traços desejados;

(g) opcionalmente, conduzir uma ou mais germinações quentes, frias, ou tanto quentes quanto frias, de laboratório, de campo, ou de laboratório e campo de sementes (ou grãos) produzidas pelas plantas da etapa (d) e/ou etapa (e) para verificar que tais sementes têm um ou mais traços de consumidor e/ou cultivador desejados, tais como uma germinação, emergência da muda e desempenho de crescimento de planta intensificados, e vigor, que estejam associados com um alelo shrunken-2i (sh2-i) mutante, ou uma combinação destes; e (h) opcionalmente, conduzir um ou mais de gosto organoléptico, maciez do pericarpo e/ou outros testes nas plantas, em partes de planta (tais como espigas de milho), ou uma combinação destes, que são cultivadas a partir de sementes (ou grãos) produzidas pelas plantas da etapa (d) e/ou etapa (e) para determinar seu gosto, maciez do pericarpo e/ou outras características organolépticas, examinar de modo ideal os traços físicos e horticulturais globais (isto é, fenótipo) que sejam compatíveis com plantas que expressam um ou mais desejado traços de cultivador e/ou consumidor.

Como com os outros processos que são descritos acima, pelo seguinte processo diretamente acima, uma regulagem do acúmulo de carboidrato e maciez do pericarpo (entre outros traços de cultivador e/ou consumidor desejáveis) podem ser manipulados em uma planta, material de planta e/ou semente, e um alelo shrunken-2i (sh2-i) mutante pode ser incorporado no genoma da planta, material de planta ou semente para dar à mesma os traços de produção e consumo desejados. As plantas, materiais de planta e sementes podem ser cultivados de modo que exibam um teor mais completo no estágio de semente seca em comparação com outras variedades ou linhagens de planta, e resultam em um vigor intensificado durante a germinação da semente, emergência da muda do solo e/ou desenvolvimento de planta, e que também mantém um nível de açúcar elevado, que resulta em um sabor doce ou outros desejáveis da planta, material de planta e/ou semente em um período de tempo imediatamente seguinte ao estágio de alimentação primário destes. Aqueles tendo habilidade comum na técnica podem determinar o número de vezes que uma etapa particular no processo acima, tal como o retro cruzamento de linhagens quase isogênicas, deve ou devem ser realizadas de modo a obter um resultado bem sucedido do processo. Como é indicado acima, algumas destas etapas são preferivelmente realizadas múltiplas vezes.

Em um outro aspecto, a presente invenção fornece uma planta híbrida, planta, material de planta ou semente que tenham um vigor intensificado em comparação com uma planta híbrida, planta, material de planta ou semente mutantes shrunken-2 (sh-2) ou shrunken-2i (sh2-i) convencionais, e uma capacidade intensificada para reter açúcar em um período de tempo imediatamente seguinte a um estágio de alimentação primário destes, em comparação com uma planta híbrida, planta, material de planta ou semente mutantes em sugary-1 (Sul) ou shrunken-2i (sh2-i) convencionais, que consiste da etapas de (a) até (h) acima em qualquer ordem adequada.

Já em um outro aspecto, a presente invenção fornece uma semente de planta que é produzida por qualquer um dos métodos que são descritos acima (ou de outro modo aqui).

Ainda em um outro aspecto, a presente invenção fornece um método para produzir uma planta híbrida, material de planta, ou semente que compreende cruzar uma linhagem de planta pura que é homozigota recessiva para o alelo de endosperma mutante em shrunken2-i, e também homozigota recessivo para um ou mais outros alelos de endosperma, como a linhagem de planta precursora feminina com uma linhagem de planta precursora masculina diferente, que pode ser, por exemplo, uma linhagem de milho doce ou outra planta precursora masculina convencionais.

DESCRIÇÃO RESUMIDA DOS DESENHOS

A FIG. 1 é um gráfico de barra que fornece uma comparação generalizada de níveis de sacarose de endosperma representativos para as linhagens mutantes genéticas sugary-1 (Sul), sugary enhancer-1 (Sei) e shrunken-2 (sh2) convencionais no estágio de alimentação primário (em um nível de aproximadamente 75 % de umidade).

A FIG. 2 é um gráfico de linhagem que mostra a retenção de açúcar no endosperma relativa ou “capacidade de contenção” na temperatura ambiente para as linhagens mutantes genéticas sugary-1 (Sul), sugary enhancer-1 (Sei) e shrunken-2 (sh2) convencionais no estágio de alimentação primário (em um nível de aproximadamente 75 % de umidade) através de um intervalo de sete dias (Dias 1 a 7). A FIG. 2 mostra mudanças representativas nos níveis de sacarose do endosperma com o tempo para os três tipos genéticos diferentes.

A FIG. 3 é um gráfico de barra que fornece uma comparação de níveis de pericarpo representativos para as linhagens mutantes genéticas sugary-1 (Sul), sugary enhancer-1 (Sei) e shrunken-2 (sh2) convencionais no estágio de alimentação primário (em um nível de aproximadamente 75 % de umidade).

A FIG. 4 é um gráfico de linhagem que mostra os níveis de pericarpo relativas na temperatura ambiente para as linhagens mutantes genéticas sugary-1 (Sul), sugary enhancer-1 (Sei) e shrunken-2 (sh2) convencionais no estágio de alimentação primário (em um nível de aproximadamente 75 % de umidade) através de um intervalo de sete dias (Dias 1 a 7). A FIG. 4 mostra mudanças representativas nos níveis de pericarpo com o tempo para os três tipos genéticos diferentes.

A FIG. 5 é um diagrama do gene sh2 do tipo selvagem (sh2R), que é composto de 16 exons (representados pelas caixas na FIG. 5) que são separados pelos introns (representados pelas linhas na FIG. 5). Este gene tem aproximadamente 6.000 pares de base de comprimento. O gene sh2-R tem uma inserção grande (pelo menos 7.800 pares de base) na região do intron 2—exon 4 (representada pelo triângulo na FIG. 5). Os iniciadores (representados pelas setas na FIG. 5) que limitam esta inserção não produzirão um produto da Reação da Cadeia da Polimerase (PCR) por causa do tamanho grande da inserção. Ao contrário, o gene sh2-i tem uma única mudança de par de base no final do intron 2, e os iniciadores que flanqueiam o sítio de inserção de sh2-i produzirão um produto de PCR.

A FIG. 6 é um gráfico de linhagem que mostra as contagens organolépticas de amido médias (médias organolépticas para o acúmulo de amido) para linhagens quase isogênicas shrunken-2 (sh2) híbridas convencionais (NIFs), contendo, ou não contendo, o alelo sh2-i com o tempo nos dias 1 a 7 passado o estágio de alimentação primário (em um nível de aproximadamente 75 % de umidade).

A FIG. 7 é um gráfico de linhagem que mostra as contagens de açúcar (doçura) médias organolépticas para as variedades de milho doce Beyond (que não inclui o gene sh2-i), Passion (que não inclui o gene sh2-i) e ACX SS 7501 Y (que inclui o gene sh2-i) no período de sete dias imediatamente a seguir do estágio de alimentação primário (em um nível de aproximadamente 75 % de umidade). O mesmo ilustra os níveis de açúcar organolépticos comparativos entre estas três variedades de milho doce neste período de sete dias de tempo.

A FIG. 8 é um gráfico de linhagem que mostra as contagens de maciez do pericarpo organolépticas médias para as variedades de milho doce Beyond (que não inclui o gene sh2-i), Passion (que não inclui o gene sh2-i) e ACX SS 7501Y (que inclui o gene sh2-i) no período de sete dias imediatamente a seguir do estágio de alimentação primário (em um nível de aproximadamente 75 % de umidade). O mesmo ilustra os níveis organolépticos de maciez do pericarpo comparativos entre estas três variedades de milho doce durante este período de sete dias.

A FIG. 9 mostra uma representação esquemática da sequência genômica que carrega as alterações de sítio de junção do alelo shrunken-2i (sh2-i) mutante (exon 1-4). A mutação pontual que alterou o sítio de junção 3’ de AG para AA do intron 2 em sh2-i mutante está em caixa. As setas unidas pelas linhas marcam os sítios doador e aceitador usados durante a junção de RNA para gerar os transcritos mutantes.

A FIG. 10 é um mapa molecular de amostras de NILs puros individuais que foram preparados nos experimentos que são descritos no Exemplo 1.

A FIG. 11 é um gráfico de linhagem que mostra as contagens de açúcar (doçura) médias organolépticas para as linhagens precursoras de milho doce puras AC 157Y (que não inclui um gene sh2-i) e AC 157Y-Í (um puro de conversão sh2-i que inclui um gene sh2-i) no período de sete dias imediatamente a seguir do estágio de alimentação primário (em um nível de aproximadamente 75 % de umidade). O mesmo ilustra os níveis de açúcar comparativos organolépticos entre estas duas linhagens precursoras de milho doce puras neste período de sete dias de tempo.

A FIG. 12 é um gráfico de linhagem que mostra as contagens de maciez do pericarpo organolépticas médias para as linhagens precursoras puras de milho doce AC 157Y (que não inclui um gene sh2-i) e AC 157Y-Í (um puro de conversão de sh2-i que inclui um gene sh2-i) no período de sete dias imediatamente a seguir do estágio de alimentação primário (em um nível de aproximadamente 75 % de umidade). O mesmo ilustra os níveis organolépticos de maciez do pericarpo comparativos entre estas duas linhagens precursoras puras de milho doce neste período de sete dias de tempo.

A FIG. 13 é um gráfico de linhagem que mostra contagens de açúcar (doçura) médias organolépticas para as variedades de milho doce Beyond (que não inclui o gene sh2-i), Passion (que não inclui o gene sh2-i) e híbridas ACX SS 1082Y sh2-i (um puro de conversão de sh2-i que inclui o gene sh2-i) no período de sete dias imediatamente a seguir do estágio de alimentação primário (em um nível de aproximadamente 75 % de umidade). O mesmo ilustra os níveis de açúcar comparativos organolépticos entre estas três variedades de milho doce neste período de sete dias de tempo.

A FIG. 14 é um gráfico de linhagem que mostra as contagens de maciez do pericarpo organolépticas médias para as variedades de milho doce Beyond (que não inclui o gene sh2-i), Passion (que não inclui o gene sh2-i) e híbridas ACX SS 1082Y sh2-i (um puro de conversão de sh2-i que inclui o gene sh2-i) no período de sete dias imediatamente a seguir do estágio de alimentação primário (em um nível de aproximadamente 75 % de umidade). O mesmo ilustra os níveis organolépticos de maciez do pericarpo comparativos entre estas três variedades de milho doce neste período de sete dias.

DESCRIÇÃO RESUMIDA DAS SEQUÊNCIAS

A SEQ ID NO. 1 é a sequência de nucleotídeo genômico de 7739 pares de base de um alelo Shrunken-2 (sh2) do tipo selvagem de Zea mays, que também é publicada na Patente U.S. N“ 6.184.438 Bl. (FIG. 1 da

Patente U.S. N² 6.184.438 Bl, que é aqui incorporado na sua totalidade por referência, também mostra a sequência de nucleotídeo genômico de um alelo tipo selvagem Shrunken-2 (sh2) de Zea mays. Os introns são indicados pelas letras minúsculas. O número base 1 é o sítio de início de transcrição. A seta indica a extremidade 3’ de cDNA. As sequências TATA, RY díade e intensificadora putativas são sublinhadas).

A SEQ ID NO. 2 é a sequência de cDNA que codifica o alelo sugary-1 (Sul) de Zea mays, que é também publicada na Patente U.S. N²

5.912.413. A sequência de nucleotídeo de 2712 pares de base do clone de cDNA Sul inclui uma sequência de 14 resíduos T consecutivos localizados em uma extremidade do clone, identificando o sítio de poliadenilação e a extremidade 3’ do mRNA. Uma matriz de leitura aberta contínua (ORF) de 789 códons começa com 88 nucleotídeos a partir da extremidade 5’ do clone de cDNA e termina com 240 nucleotídeos antes do sítio de poli(a) adenilação. Esta ORF corresponde a um polipeptídeo de 789 aminoácidos (SEQ ID NO.

3) . A comparação do cDNA e uma sequência genômica parcial (SEQ ID NO:

4) identifica quatro exons e introns no DNA genômico. Os quatro exons estendem-se do nucleotídeo 658 ao nucleotídeo 1107, nucleotídeo 1352 ao nucleotídeo 1536, nucleotídeo 1657 ao nucleotídeo 1753, e nucleotídeo 2076 ao nucleotídeo 2227. As sequências de exon ou a sequência completa da SEQ ID NO: 4 podem ser usados como sondas para obter a sequência genômica de tamanho natural pelos métodos que são bem conhecidos por aqueles tendo habilidade comum na técnica.

A SEQ ID NO. 3 é uma tradução de aminoácido da sequência de nucleotídeo sugary-1 (Sul) do clone de cDNA que é mostrado na SEQ ID NO. 2, que também é publicada na Patente U.S. N² 5.912.413.

A SEQ ID NO. 4 é uma sequência de nucleotídeo genômico de sugary-1 (Sul) parcial, que também é publicada na Patente U.S. N²

5.912.413.

A SEQ ID NO. 5 é a sequência de aminoácido deduzida de Sul (SEQ ID NO. 4), que também é publicada na Patente U.S. N^s 5.912.413.

A SEQ ID NO. 6 é uma sequência de nucleotídeo do iniciador ume 1551 (um iniciador para marcadores moleculares para o alelo sugary enhancer-1 (sei) no cromossoma 2).

A SEQ ID NO. 7 é uma sequência de nucleotídeo do iniciador ume 1551 (um iniciador para marcadores moleculares para o alelo sugary enhancer-1 (sei) no cromossoma 2).

A SEQ ID NO. 8 é uma sequência de nucleotídeo do iniciador bnlgl520 (um iniciador para os marcadores moleculares para o alelo sugary enhancer-1 (Sei) no cromossoma 2).

A SEQ ID NO. 9 é uma sequência de nucleotídeo do iniciador bnlgl520 (um iniciador para os marcadores moleculares para o alelo sugary enhancer-1 (Sei) no cromossoma 2).

A SEQ ID NO. 10 é uma sequência de nucleotídeo do iniciador phi427434 (um iniciador para os marcadores moleculares para o alelo sugary enhancer-1 (Sei) no cromossoma 2).

A SEQ ID NO. 11 é uma sequência de nucleotídeo do iniciador phi427434 (um iniciador para os marcadores moleculares para o alelo sugary enhancer-1 (Sei) no cromossoma 2).

A SEQ ID NO. 12 é uma sequência de nucleotídeo do iniciador umc2077 (um iniciador para os marcadores moleculares para o alelo sugary enhancer-1 (Sei) no cromossoma 2).

A SEQ ID NO. 13 é uma sequência de nucleotídeo do iniciador umc2077 (um iniciador para os marcadores moleculares para o alelo sugary enhancer-1 (Sei) no cromossoma 2).

A SEQ ID NO. 14 é uma sequência de nucleotídeo do iniciador umc2174 (um iniciador para os marcadores moleculares para o alelo shrunken-2 (sh2) no cromossoma 3).

A SEQ ID NO. 15 é uma sequência de nucleotídeo do iniciador umc2174 (um iniciador para os marcadores moleculares para o alelo shrunken-2 (sh2) no cromossoma 3).

A SEQ ID NO. 16 é uma sequência de nucleotídeo do iniciador dupssr33 (um iniciador para os marcadores moleculares para o alelo shrunken-2 (sh2) no cromossoma 3).

A SEQ ID NO. 17 é uma sequência de nucleotídeo do iniciador dupssr33 (um iniciador para os marcadores moleculares para o alelo shrunken-2 (sh2) no cromossoma 3).

A SEQ ID NO. 18 é uma sequência de nucleotídeo do iniciador bmcl257 (um iniciador para os marcadores moleculares para o alelo shrunken-2 (sh2) no cromossoma 3).

A SEQ ID NO. 19 é uma sequência de nucleotídeo do iniciador bmcl257 (um iniciador para os marcadores moleculares para o alelo shrunken-2 (sh2) no cromossoma 3).

A SEQ ID NO. 20 é uma sequência de nucleotídeo do iniciador umc2277 (um iniciador para os marcadores moleculares para o alelo shrunken-2 (sh2) no cromossoma 3).

A SEQ ID NO. 21 é uma sequência de nucleotídeo do iniciador umc2277 (um iniciador para os marcadores moleculares para o alelo shrunken-2 (sh2) no cromossoma 3).

A SEQ ID NO. 22 é uma sequência de nucleotídeo do iniciador phi295450 (um iniciador para os marcadores moleculares para o alelo sugary-1 (Sul) no cromossoma 4).

A SEQ ID NO. 23 é uma sequência de nucleotídeo do iniciador phi295450 (um iniciador para marcadores moleculares para o alelo sugary-1 (Sul) no cromossoma 4).

A SEQ ID NO. 24 é uma sequência de nucleotídeo do iniciador phi308090 (um iniciador para marcadores moleculares para o alelo sugary-1 (Sul) no cromossoma 4).

A SEQ ID NO. 25 é uma sequência de nucleotídeo do iniciador phi308090 (um iniciador para marcadores moleculares para o alelo sugary-1 (Sul) no cromossoma 4).

A SEQ ID NO. 26 é uma sequência de nucleotídeo do iniciador phi076 (um iniciador para marcadores moleculares para o alelo sugary-1 (Sul) no cromossoma 4).

A SEQ ID NO. 27 é uma sequência de nucleotídeo do iniciador phi076 (um iniciador para marcadores moleculares para o alelo sugary-1 (Sul) no cromossoma 4).

A SEQ ID NO. 28 é uma sequência de nucleotídeo do iniciador phi079 (um iniciador para marcadores moleculares para o alelo sugary-1 (Sul) no cromossoma 4).

A SEQ ID NO. 29 é uma sequência de nucleotídeo do iniciador phi079 (um iniciador para marcadores moleculares para o alelo sugary-1 (Sul) no cromossoma 4).

As sequências que estão presentes nas SEQ ID NOS. 1 a 29 usam abreviações que estão descritas no World Intellectual Property Organization (WIPO) Handbook on Industrial Property Information and Documentation, Standard ST.25, que é por meio deste aqui incorporado por referência em sua totalidade.

DESCRIÇÃO DETALHADA DAS FORMAS DE REALIZAÇÃO

PREFERIDAS

A presente invenção pode ser entendida mais facilmente por referência à seguinte descrição detalhada das formas de realização preferidas da invenção, e aos exemplos aí incluídos.

Definições

Para os propósitos de clareza, vários termos e frases que são usados por todo este relatório descritivo e nas reivindicações anexas são definidos na maneira que é apresentada abaixo. Se um termo ou frase que são usados neste relatório descritivo, ou nas reivindicações anexas, não estiverem definidos abaixo, ou de outro modo neste relatório descritivo, ao termo ou frase deve ser dado o seu significado comum.

O termo “agronomia” como é aqui usados significa a ciência da produção de colheita.

O termo “alelo” como é aqui usado refere-se a uma das múltiplas formas alternativas de um gene (um membro de um par) que está localizado em uma posição ou local específicos em um cromossoma específico, e controla o mesmo fenótipo (com efeitos potencialmente diferentes). Alelos são variantes de um gene que produzem traços diferentes em uma das características do gene, e podem diferir nas sequências codificadoras ou sequências não codificadoras.

A frase “aminoácido” como é aqui usada significa uma molécula que no geral contém o grupo amino básico (NH₂), o grupo carboxílico ácido (COOH), um átomo de hidrogênio (-H) e um grupo lateral orgânico (R) ligado ao átomo de carbono, tendo assim a fórmula básica de NH₂CHRCOOH. Os aminoácidos são os blocos de construção das proteínas em que cada um é codificado por um códon e ligados entre si através de ligações peptídicas. Mais do que 100 aminoácidos foram descobertos ocorrer naturalmente, com cada um deles diferindo em seu grupo R. Vinte deles estão envolvidos na composição de uma proteína, e são classificados como se eles fossem não essenciais ou essenciais. Os aminoácidos não essenciais incluem alanina, arginina, ácido aspártico, asparagina, cisteína, ácido glutâmico, glutamina, glicina, prolina, serina e tirosina. Os aminoácidos essenciais incluem histidina, isoleucina, leucina, lisina, metionina, fenilalanina, treonina, triptofano e valina. As abreviações para aminoácidos são bem conhecidas por aqueles tendo habilidade comum na técnica.

A frase “retrocruzamento” como é aqui usada significa cruzar (um híbrido ou outra planta) com um de seus precursores, ou com um indivíduo que é geneticamente idêntico ou similar a um de seus precursores. O mesmo é um cruzamento de um Fj com cada precursor usado para gerá-lo.

O termo “reprodução” como é aqui usado significa a ciência e/ou técnica de manipular a hereditariedade de um organismo para um propósito específico.

O termo “carboidratos” como é aqui usado significa compostos orgânicos simples que compreendem carbono, oxigênio e hidrogênio, no geral com muitos grupos hidroxila adicionado (usualmente um em cada átomo de carbono que não é parte do grupo funcional de aldeído ou cetona). As unidades de carboidrato básicas são monossacarídeos, tais como glicose, galactose e ffutose. Os carboidratos têm numerosos papéis nas coisas vivas, tais como a armazenagem e transporte de energia (por exemplo, amido ou glicogênio) e componentes estruturais (por exemplo, celulose em plantas). Eles servem como depósitos de energia, combustíveis, e intermediários metabólicos. Os açúcares de ribose e desoxirribose formam parte da matriz estrutural do RNA e DNA. Os polissacarídeos são elementos estruturais que estão presentes nas paredes celulares de plantas. Os carboidratos são ligados a muitas proteínas e lipídeos, onde eles desempenham papéis chave em mediar interações entre células e interações entre as células e outros elementos no ambiente celular. Os monossacarídeos podem ser ligados entre si em polissacarídeos em uma ampla variedade de modos.

O termo “respiração celular” como é aqui usado significa uma série de processos metabólicos que no geral ocorrem dentro de uma célula em que a energia bioquímica é colhida de uma substância orgânica, tal como glicose, e é armazenada como carregadores de energia (ATP) para o uso em atividades que requeiram energia da célula, a mesma consiste de glicólise, ciclo do ácido cítrico ou Ciclo de Krebs, e fosforilação oxidativa. A célula parece “respirar” em um modo que a mesma absorve o oxigênio molecular (como um aceitador de elétron) e libera dióxido de carbono (como um produto final) (um processo aeróbico). A respiração celular é essencial para as células tanto eucarióticas quanto procarióticas porque a energia bioquímica é produzida para alimentar muitos processos metabólicos, tais como biossíntese, locomoção, transporte de moléculas através das membranas, e seus semelhantes. Embora o processo inteiro no geral ocorra no citoplasma de procariotas, nos eucariotas, no geral a glicólise ocorre no citoplasma, ao passo que o Ciclo de Krebs e a fosforilação oxidativa ocorrem na mitocôndria. Enquanto as células procarióticas podem no geral produzir um máximo de 38 moléculas de ATP, as células eucarióticas no geral podem produzir um máximo de 36 moléculas de ATP.

A frase “sequência codificadora” como é aqui usada refere-se a uma porção de um gene ou um mRNA que codifica uma proteína.

O termo “códon” como é aqui usado significa um conjunto de três nucleotídeos adjacentes (tripletos), no mRNA este par de base com o anticódon correspondente da molécula de tRNA que carrega um aminoácido particular, consequentemente especificando o tipo e sequência de aminoácidos para a síntese de proteína. Por exemplo, GCC (GuaninaCitocina-Citocina) —> alanina, GUU (Guanina-Uracila-Uracila) —* valina, CUA (Citosina-Uracila-Adenina) leucina e UCA (Uracila-CitosinaAdenina) serina.

As frases “DNA complementar” e “cDNA” como são aqui usadas significam uma única molécula de DNA de filamento que é complementar a uma molécula de RNA específica, e que é sintetizada a partir da mesma. DNAs complementares são ferramentas de laboratório importantes como sondas de DNA e para isolar e estudar vários genes.

A frase “planta híbrida, material de planta, semente, linhagem ou variedade mutantes convencionais” como é aqui usada em conexão com um sugary-1 (Sul), sugary enhancer-1 (Sei), shrunken-2 (sh2), shrunken-2i (sh2-i) ou outro alelo mutante significa que a planta híbrida, material de planta, semente, linhagem ou variedade são uma planta híbrida, material de planta, semente, linhagem ou variedade típicas que no geral apenas incluem um alelo mutante no seu genoma que confere os traços que são aqui descritos, ao invés de uma sequencial ou outra combinação de dois ou mais alelos mutantes, por exemplo, um que inclui o alelo shrunken-2i (sh2-i) mutante no seu genoma, mas não os alelos mutantes sugary-1 (Sul), sugary enhancer-1 (Sei) ou shrunken-2 (sh2), ou um que inclui o alelo sugary-1 (Sul) mutante no seu genoma, mas não os alelos mutantes sugary enhancer-1 (Sei), shrunken-2 (sh2) ou shrunken-2i (sh2-i).

O termo “milho” como é aqui usado significa qualquer uma de numerosas formas cultivadas de uma gramínea cereal anual amplamente cultivada, usualmente alta (Zea mays) que carrega grãos em espigas grandes, e inclui as numerosas variedades do milho doce e milho superdoce. Os grãos desta planta podem ser usados como alimento para seres humanos e animais de criação, ou para a extração de um óleo comestível ou amido. Os grãos podem ser comido crus ou cozidos, e podem ser enlatados, congelados e/ou armazenados de outras maneiras que são conhecidas por aqueles de habilidade comum na técnica.

O termos “cruzar,” “cruzando,” “interreprodução” e “reprodução cruzada” como são aqui usados significam o ato de misturar espécies ou variedades diferentes de plantas para produzir híbridos. Um cruzamento mono-híbrido é um experimento de reprodução entre organismos de geração precursores que diferem em um traço. Em um cruzamento monohíbrido, no geral existe um cruzamento genético entre precursores que diferem nos alelos que eles possuem para um gene particular, com um precursor tendo dois alelos dominantes, e o outro precursor tendo dois alelos recessivos. Todos da descendência (mono-híbridos) depois têm um alelo dominante e um recessivo para aquele gene (isto é são híbridos naquele único local). O cruzamento entre estas descendências produz uma razão 3:1 (monohíbridos) característica na geração seguinte de fenótipos dominantes:recessivos. Por exemplo, o alelo para a cor de vagem verde (G) é dominante, e o alelo para a cor de vagem amarela (g) é recessiva. A polinização cruzada entre uma planta de vagem verde da geração precursora e uma planta de vagem amarela da geração precursora resulta em todos os descendentes verdes (isto é, todos os genótipos são Gg). Um cruzamento dihíbrido é um experimento de reprodução entre organismos da geração precursora que diferem em dois traços. Em um cruzamento di-híbrido, existe no geral um cruzamento genético entre precursores que diferem em duas características, controladas pelos genes em locais diferentes. Gregor Mendel realizou um cruzamento di-híbrido usando plantas de ervilha e as características de cor e textura de semente. As plantas precursoras tiveram sementes amarelas lisas (SSYY) (as características dominantes) ou sementes v/erdes enrugadas (ssyy) (as características recessivas). Todos os descendentes tiveram sementes amarelas lisas, sendo heterozigotos (SsYy) para os dois alelos. O cruzamento entre estes descendentes produziu uma geração F2 de plantas com sementes amarelas lisas, verdes lisas, amarelas enrugadas, e verdes enrugadas na proporção 9:3:3:1. Mendel usou estes resultados como a base para a sua Lei de Classificação Independente. Um cruzamento tri-híbrido é um experimento de reprodução entre organismos da geração precursora que diferem em três traços, e assim por diante.

O termo “colheita” como é aqui usado significa a produção periódica, tal como anual ou sazonal, de qualquer planta que é cultivada em quantidades significantes para serem colhidas como alimento, como forragem para animais de criação, como combustível ou para qualquer outro propósito econômico (ou outro). Muitos tipos de colheitas são usadas com propósitos industriais, por exemplo, elas são cultivadas e colhidas para o único propósito de dar lucro e alimentar pessoas, e são cultivadas em grandes quantidades em certas áreas que são adequadas para cultivar colheitas.

O termo “dominante” como é aqui usado significa um alelo ou um gene que é expressado em um fenótipo do organismo, no geral mascarando o efeito do alelo ou gene recessivos, quando presente. O mesmo é um fenótipo que é expressado em um organismo cujo genótipo pode ser homozigota ou heterozigota para o alelo correspondente. Na genética, o alelo ou gene dominantes é aquele que determina o fenótipo de um organismo. Seus efeitos são facilmente reconhecidos em comparação com os efeitos do alelo ou gene recessivos. Usualmente, um alelo dominante é simbolizado com uma letra maiúscula, e um alelo recessivo é simbolizado com uma letra minúscula, por exemplo: Hh (onde H refere-se ao alelo dominante e h referese ao alelo recessivo).

A frase “estágio de semente seca” como é aqui usada significa o primeiro evento temporal na germinação de uma planta, tal como o milho doce, e em que a semente ou grão contém um teor de umidade que é no geral menor do que cerca de 12 %.

As frases “sonda de DNA,” “sonda de gene” e “sonda” como são aqui usadas significam uma molécula de DNA de filamento único usada em experimentos de laboratório para detectar a presença de uma sequência complementar entre uma mistura de várias moléculas de DNA de filamento único.

A frase “sequenciamento de DNA” como é aqui usada significa uma determinação da ordem dos nucleotídeos em uma molécula de DNA específica.

As frases “Teste de Faixa Múltipla Nova de Duncan” e “MRT” como são aqui usadas significam um procedimento estatístico de comparação múltipla que usa a estatística de faixa studentizada q, para comparar conjuntos de médias, e é particularmente protetivo contra erro falso negativo (Tipo II). Este teste é habitualmente usado em agronomia e em outros tipos de pesquisa agrícola, e é bem conhecido por aqueles tendo habilidade comum na técnica. Informação adicional a cerca deste teste está presente em D. B. Duncan, “Multiple Range and Multiple F Tests,” Biometrics 11: 1-42, 1955. Os procedimentos estatísticos que são aqui utilizados, e cálculos relacionados, podem ser realizados em computadores em uma maneira, e usando software, que é conhecida por aqueles tendo habilidade comum na técnica.

O termo “embrião” como é aqui usado significa uma planta jovem desenvolvida a partir de um óvulo sexual ou assexualmente e, em plantas de semente, contidas dentro da semente.

O termo “endosperma” como é aqui usado significa o tecido nutritivo que é encontrado em muitas sementes de plantas, e que circunda o embrião dentro de tais sementes. O mesmo fornece nutrientes para o embrião. O endosperma é no geral o local da deposição da maior parte do amido durante o desenvolvimento do grão no milho, e o teor de amido do endosperma compreende aproximadamente 70 % do peso seco do grão ou semente.

O termo “energia” como é aqui usado significa a capacidade para trabalhar ou produzir mudança. A energia existe em formas diferentes, mas não é criada nem destruída. Ela simplesmente se converte em uma outra forma, e pode ser expressada em joules ou ergs. A energia é frequentemente armazenada pelas células em biomoléculas, tais como carboidratos (açúcares) e lipídeos. A energia é no geral liberada quando estas moléculas foram oxidadas durante a respiração celular, e é carregada e transportada pelo ATP, uma molécula carregadora de energia.

O termo “enzima” como é aqui usado significa uma proteína (ou molécula com base em proteína) que no geral acelera uma reação química em um organismo vivo, tal como uma planta. As enzimas no geral atuam como catalisadores para as reações químicas específicas, convertendo um conjunto específico de reagentes (substratos) em produtos específicos. A enzima no geral tem uma sequência característica de aminoácidos que dobram para produzir uma estrutura tridimensional específica, que dá à molécula propriedades únicas, e são usualmente classificadas e nomeadas de acordo com a reação que elas catalisam.

O termo “epistase” como é aqui usado significa que uma mutação em um gene mascara a expressão de um gene diferente. (Ao contrário, com dominância, um alelo de um gene mascara a expressão de um outro alelo do mesmo gene).

O termo “exon” como é aqui usado refere-se àquelas porções de uma sequência de DNA genômico que serão representadas em um mRNA final, maduro (isto é, um segmento contíguo de DNA genômico que codifica um polipeptídeo em um gene). O termo “exon” também pode referir-se aos segmentos equivalentes em um RNA final. Os exons podem incluir sequências codificadoras, uma região não traduzida 5’ e/ou uma região não traduzida 3’.

O termo “expressar” como é aqui usado significa manifestar os efeitos de um gene, para causar a produção de um efeito ou um fenótipo, ou para manifestar um traço genético, dependendo do contexto. A expressão de um gene é a tradução de informação codificada no gene em proteína ou RNA. Os genes expressados incluem genes que são transcritos em RNA mensageiro (mRNA) e depois traduzido em proteína, assim como genes que são transcritos em tipos de RNA, tais como RNA transferidor (tRNA) e RNA ribossômico (rRNA) que não são traduzidos em proteína. Varias etapas no processo da expressão de gene podem ser moduladas, que inclui a transcrição, junção de RNA, tradução e modificação pós-traducional de uma proteína. A regulagem de gene dá o controle de célula em estrutura e função, e é a base para a diferenciação, morfogênese celulares e a versatilidade e adaptabilidade de um organismo, tal como uma planta.

O termo “aptidão” como é aqui usado refere-se a uma medida do sucesso de reprodução relativa de um organismo, tal como uma planta, ou genótipo, em uma dada população em um dado tempo. Indivíduos que contribuem com a maior parte da descendência para a geração seguinte são os mais aptos. A aptidão reflete portanto quão bem um organismo é adaptado ao seu ambiente, o que determina a sua sobrevivência.

O termo “gene” como é aqui usado refere-se à unidade básica de hereditariedade (traços genéticos) em um organismo vivo (planta, animal ou micro-organismo) que mantém a informação que é requerida para passar traços genéticos para a descendência. O mesmo é um segmento do ácido desoxirribonucleico (DNA) que contribui para um fenótipo/função. O DNA é uma molécula na forma de uma hélice dupla, com cada degrau da escada em espiral tendo duas bases emparelhadas selecionadas de adenina (a), timina (T), citosina (C) ou guanina (G). Certas bases sempre formam par juntas (AT e GC), e sequências diferentes de pares de base formam mensagens codificadas. Os genes são dispostos em arranjos precisos todos ao longo do comprimento dos cromossomas, que são estruturas muito maiores.

A frase “expressão de gene” como é aqui usada significa o processo em que uma célula produz a proteína e, assim, a característica, que é especificada por uma sequência de nucleotídeo do gene.

A frase “mapa genético” como é aqui usada significa um diagrama que mostra as relações de ligação genética entre locais no cromossomas (ou grupos de ligação) dentro de uma dada espécie. “Mapeamento” é o processo de definir as relações de ligação de locais através do uso de marcadores genéticos, populações que estão segregando para tais marcadores, e princípios genéticos padrão de frequência de recombinação. Uma “localização de mapa” é um local específico em um mapa genético onde um alelo pode ser encontrado dentro de uma dada espécie.

A frase “marcador genético” como é aqui usada significa um fragmento específico de DNA que pode ser identificado dentro de um genoma inteiro. O mesmo é um fator genético que pode ser identificado e, assim, atuar para determinar a presença de genes ou traços ligados com eles, mas não facilmente identificados.

O termo “genoma” como é aqui usado significa o conjunto completo de genes em um organismo, tais como uma planta, ou o teor genético total em um conjunto de cromossomas, dependendo do contexto. O mesmo é o conjunto completo dos cromossomas encontrados em cada núcleo de célula de um indivíduo ou organismo.

O termo “genótipo” como é aqui usado refere-se a uma das instruções herdadas do organismo que o mesmo carrega dentro do seu código genético. Um genótipo para um gene é no geral o conjunto de alelos que o mesmo possui. Um genótipo é a combinação específica de alelos presentes em um único local no genoma.

O termo “germinação” como é aqui usado significa o processo pelo qual uma semente dormente emerge de um período de dormência, e começa a brotar e crescer em um muda sob as condições certas de cultivo. O exemplo mais comum de germinação é o brotamento de uma muda a partir de uma semente de um angiosperma ou gimnosperma. A mesma é o crescimento de uma planta embrionária contida dentro de uma semente, e resulta na formação de uma muda.

O termo “glicose” como é aqui usado significa um açúcar monossacarídico simples que serve como a fonte principal de energia, e como um importante substrato metabólico para a maioria das coisas vivas. A sua fórmula química é C₆H₁₂O6· A glicose é um dos produtos da fotossíntese em plantas, e as moléculas de glicose são armazenadas como unidades de repetição de açúcar (por exemplo amido). A glicose também serve como um intermediário metabólico importante da respiração celular.

O termo “gluma” como é aqui usado significa uma casca ou bráctea basal, membranosa, externa estéril nas flores de gramíneas, ciperáceas e milho.

O termo “colheita” como é aqui usado significa a apanhadura (coleta e/ou ajuntamento) de uma colheita de qualquer tipo, por exemplo, de milho.

O termo “heterozigoto” como é aqui usado significa ter alelos dissimilares que codificam o mesmo gene ou traço. O mesmo é uma situação em que os dois alelos em um local genético específico não são os mesmos. Um exemplo é um zigota tendo um alelo dominante e um alelo recessivo, isto é, Aa, para um traço particular.

O termo “heterozigosidade” como é aqui usado significa a presença de alelos diferentes em um ou mais locais nos cromossomas homólogos.

O termo “homólogo” como é aqui usado em conexão com cromossomas significa aqueles que contêm sequências lineares idênticas de genes, e que formam par durante a meiose. O mesmo significa trechos de DNA que são muito similares em sequência, tão similares que eles tendem a grudar entre si em experimentos de hibridização. Cada homólogo é uma duplicata de um dos cromossomas contribuídos por um dos precursores, e cada par de cromossomas homólogos é normalmente idêntico na forma e tamanho. Homólogo também pode ser usado para indicar genes relacionados em organismos separados que controlam fenótipos similares.

A frase “cromossomas homólogos” como é aqui usado significa um par dos cromossomas contendo as mesmas sequências de gene linear, cada um derivado de um precursor.

O termo “homozigota” como é aqui usado significa uma situação em que dois alelos em um local genético específico são idênticos um ao outro.

O termo “homozigosidade” como é aqui usado significa a presença de alelos idênticos em um ou mais locais (um local específico em um cromossoma onde um gene é localizado) em segmentos cromossômicos homólogos.

O termo “híbridos” como é aqui usado significa uma descendência ou progênie que resultam de um cruzamento entre precursores de duas espécies, subespécies, raças, cultivados ou linhagens de reprodução (isto é, de reprodução cruzada) diferentes. Um híbrido de cruzamento único é uma primeira geração de descendência que resulta de um cruzamento entre precursores de criação puros. Um híbrido de cruzamento duplo é descendência que resulta de um cruzamento entre dois híbridos de cruzamento único. Um híbrido de cruzamento de três vias é descendência de um cruzamento entre um híbrido de cruzamento único e uma linhagem pura. Um híbrido de cruzamento triplo é descendência que resulta do cruzamento de dois híbridos de cruzamento de três vias diferentes.

O termo “hibridização” como é aqui usado significa o processo de transferência de pólen da antera da flor de uma planta para o estigma da flor de uma planta diferente com o propósito de transferência de gene para produzir uma descendência (“híbridos”) tendo um genótipo precursor misto. Um exemplo de um cruzamento de duas linhagens precursoras para produzir um híbrido que é debatido na Patente U.S. N^s 4.630.393, por exemplo, é o seguinte:

sul sul sh2sh2 x sul sul Sh2Sh2 (precursor masculino) f (precursor feminino) sul sul Sh2sh2 (semente híbrida: heterozigota para Sh2sh2) (semente da geração Fl)

A composição genética do endosperma triplóide (3N) de espigas de milho F2 produzidas a partir de plantas cultivadas usando a semente acima é como segue, e as espigas são caracterizadas por uma segregação 3:1 de grãos normais para grãos shrunken (sh2sh2):

Genótipo Fenótipo Razão sulsulsul Sh2Sh2Sh2 Sugary sulsulsul Sh2Sh2sh2 Sugary . sulsulsul Sh2sh2sh2 Sugary 1 sulsulsul sh2sh2sh2 Sugary, shrunken 1 (têm um teor de açúcar mais alto)

Muitos outros exemplos de cruzamentos estão presentes nesta patente. Dependendo do contexto, que pode facilmente ser determinado por aqueles tendo habilidade comum na técnica, o termo “hibridização” pode altemativamente significar levar filamentos únicos complementares de ácido nucleico juntos de modo que eles grudem e formem um filamento duplo. Desta maneira, a hibridização é usada em conjunção com sondas de DNA e RNA para detectar a presença ou ausência de sequências de ácido nucleico complementares específicas.

A frase “Classificação Independente” como é aqui usada refere-se a uma separação dos alelos de um gene dentro das células reprodutivas (gametas) independentemente do modo em que os alelos de outros genes tenham segregados. Por este processo, todas as combinações possíveis de alelos deve ocorrer de modo igualmente frequente nos gametas. Na prática, isto nem sempre acontece porque os alelos que estão situados no , 15 mesmo cromossoma tendem a serem herdados juntos. Entretanto, se os pares de alelo Aa e Bb estão em cromossomas diferentes, as combinações AB, Ab, aB, e ab normalmente serão igualmente prováveis de ocorrer nos gametas.

O termo “puro” como é aqui usado significa descendência produzida pela procriação consanguínea (gerações sucessivas de organismos, tais como plantas, que são todas derivadas pela reprodução do mesmo grupo de organismos intimamente relacionados). Quando as linhagens são suficientemente puras, uma condição homozigota de alelos particular no geral pode ser assumida.

O termo “procriação consanguínea” como é aqui usado significa a reprodução de plantas, materiais de planta ou organismos que são relacionados, dependendo do contexto (isto é, de plantas, materiais de planta ou organismos dentro de um grupo isolado ou um grupo fechado de plantas, partes de planta ou organismos). O mesmo é a reprodução continuada de plantas intimamente relacionadas, partes de planta ou organismos, de modo a preservar traços desejáveis em um neste ponto.

O termo “intron” como é aqui usado refere-se às porções de DNA genômico que não são sequências codificadoras. Embora eles não sejam transcritos (e assim presentes no transcrito primário), eles são mais tarde unidos. Eles, assim, não estão presentes no mRNA maduro correspondente.

O termo “isogênico” como é aqui usado significa ter o mesmo genótipo (isto é, geneticamente uniforme), como todos os organismos produzidos por uma cepa pura.

Os termos “biblioteca,” “biblioteca de DNA” e “biblioteca de gene” como são aqui usados referem-se a uma pluralidade ou coleção de fragmentos de DNA de um ou mais organismos, cada um no geral carregado por um plasmídeo ou vírus e clonado em um hospedeiro apropriado. Uma sonda de DNA é no geral usada para localizar uma sequência de DNA específica na biblioteca. Uma coleção que representa o genoma inteiro de um organismo é conhecido como uma biblioteca genômica, e uma classificação de cópias de DNA de RNA mensageiro produzidas por uma célula é conhecida como uma biblioteca de DNA complementar (cDNA).

Um “mapa de ligação” como é aqui usado significa um mapa das posições relativas de locais genéticos em um cromossoma, determinadas com a base de quão frequentemente os locais são herdados juntos. A distância pode ser medida em centimorgans (cM).

O termo “local” como é aqui usado refere-se a uma localização de cromossoma específico no genoma de uma espécie onde um tipo específico de gene pode ser encontrado. O mesmo é a posição no cromossoma onde o gene para um traço particular reside. Um local pode ser ocupado por qualquer um de vários alelos (variantes) para um dado gene.

A frase “Leis de Mendel” como é aqui usada refere-se às duas leis que resumem a teoria de Gregor Mendel de herança, que são os fundamentos da genética. A Lei de Segregação estabelece que cada característica hereditária é controlada por dois ‘fatores’ (alelos), que segregam (separado) e passam para dentro de duas células germinativas (reprodutivas) separadas. A Lei da Classificação Independente estabelece que pares de ‘fatores’ (alelos) segregam independentemente um do outro quando as células germinativas são formadas.

A frase “marcador molecular” como é aqui usada significa um fragmento específico de DNA que pode ser identificado dentro de um genoma inteiro. O mesmo é uma localização física identificável em um cromossoma (isto é, o sítio de corte da enzima de restrição, gene, ou seus semelhantes) cuja herança pode ser monitorada. Os marcadores moleculares são no geral encontrados em locais específicos de um genoma, e são usados para ‘assinalar’ a posição de um gene particular ou a herança de uma característica particular. Em um cruzamento genético, os genes que produzem características de interesse usualmente ficarão ligados com os marcadores moleculares em proximidade relativamente imediata no cromossoma. Assim, variedades podem ser selecionadas em que o marcador molecular está presente, visto que o marcador indica a presença da característica desejada. Os exemplos de marcadores moleculares incluem repetições de sequência simples (SSRs), polimorfismos de nucleotídeo único (SNPs), DNA polimórfico aleatoriamente amplificada (RAPDs), e polimorfismos de comprimento de fragmento de restrição (RFLPs). Informação adicional a cerca do uso de marcadores moleculares para o uso na caracterização e identificação de linhagens puras de milho, validação de linhagem e mostrar associações entre linhagens puras está presente em J. S. Smith et al., “A Evaluation of the Utility of SSR loci as Molecular Markers in Maize (Zea mays L).: Comparations with Data ffom RELPS and Pedigree,” Theor Appl Genet 95: 163-173 (1997). Microssatélites, ou repetições de sequência simples (SSRs) são sequências de nucleotídeo relativamente curtas, usualmente de 2 a 3 bases no comprimento que são no geral repetidas em arranjos em tandem. Os polimorfismos amplificáveis são revelados por causa das diferenças no número de repetições em tandem que residem entre as sequências que são de outro modo conservadas para cada local. Os locais de microssatélite são altamente polimórficos e são úteis como marcadores genéticos em muitas espécies vegetais, que incluem o milho.

Os termos “múltiplo,” “número” e “pluralidade” como são aqui usados significam mais do que um, por exemplo, dois, três, quatro, cinco, seis, sete, oito, nove, dez, onze, doze, treze, catorze, quinze, dezesseis, dezessete, dezoito, dezenove, vinte, vinte um, trinta, trinta e cinco, quarenta, quarenta e cinco, cinquenta, cinquenta e cinco, sessenta e assim por diante. O termo “número” também pode incluir um.

O termo “mutação” como é aqui usado refere-se a uma mudança permanente, hereditário de material genético, em um único gene ou nos números ou estruturas dos cromossomas. Uma mutação ocorre quando um gene é mudado em um tal modo como para alterar a mensagem genética carregada por este gene. Uma vez que o gene foi mudado, o mRNA transcrito a partir deste gene carregará agora uma mensagem alterada, e o polipeptídeo fabricado pela tradução do mRNA alterado conterá agora uma sequência diferente de aminoácidos. A função da proteína fabricada pela dobra deste polipeptídeo também pode ser mudada ou perdida. Em modos sutis ou muito óbvios, o fenótipo do organismo que carrega a mutação pode ser mudado. A mutação pode ser de escala pequena (afetando a sequência de nucleotídeo de um gene) ou de escala grande (envolvendo uma mudança no cromossoma). O mesmo pode surgir de deleções (a deleção de um ou mais nucleotídeos no material genético), inserções (uma inserção de um ou mais nucleotídeos extras em um novo lugar no material genético) ou substituições (uma troca de um ou mais nucleotídeos por um outro no material genético, por exemplo, trocando um A para um G), como pode ser causado pela exposição ao ultravioleta ou radiação de ionização, mutágenos químicos, vírus ou seus semelhantes. Por exemplo, uma substituição pode: (i) mudar um códon para um que codifica um aminoácido diferente, e causar uma mudança pequena na proteína produzida; (ii) mudar um códon para um que codifica o mesmo aminoácido, e não causa nenhuma mudança nas proteínas produzidas; ou (iii) mudar um códon que codifica o aminoácido para um único códon de “parada” e causar uma proteína incompleta. As mutações podem resultar na criação de um novo caracter ou traço. As mutações podem aumentar uma aptidão do organismo, que pode se espalhar através da população em gerações sucessivas pela seleção natural. A mutação é a última fonte de variação genética, e um gene ou alelo mutantes particulares podem ser comparados com o seu gene ou alelo do tipo selvagem correspondente para determinar as diferenças entre os dois genes ou alelos. Existem tipos diferentes de mutações. Por exemplo, uma mutação pontual é uma única substituição de nucleotídeo dentro de um gene, e podem haver várias mutações pontuais dentro de um único gene. As mutações pontuais no geral não levam a uma mudança nas matrizes de leitura e, assim, no máximo no geral causam apenas uma única substituição de aminoácido. Porque o DNA que codifica a proteína é dividido em códons que são três bases longas, as inserções e deleções podem alterar um gene de modo que a sua mensagem não seja mais corretamente analisada. Estas mudanças são conhecidas como “mudanças de matriz.” Em mudanças de matriz, um erro similar ocorre ao nível do DNA, fazendo com que os códons sejam analisados incorretamente. Isto usualmente gera proteínas truncadas que não são funcionais. Informação adicional com respeito às mutações está presente em Mutation: Science of Everyday Things (Gale Group, 2002).

O termo “NILs” como é aqui usado significa linhagens quase isogênicas, que são linhagens de uma planta, tal como milho doce, que são geneticamente idênticas, exceto quanto a um local ou uns poucos locais.

A frase “teste organoléptico” como é aqui usado significa um teste das mudanças físicas e/ou químicas que são inerentes à decomposição. O mesmo pode ser realizado em alimentos, tais como milho doce, para medir e avaliar a temperatura, gosto, cheiro, textura e/ou outras propriedades que são capazes de evocar uma resposta nos órgãos sensoriais de seres humanos ou animais. Organoléptico refere-se às propriedades sensoriais de uma substância, tais como gosto, cor, odor e/ou tato, e o teste organoléptico envolve a inspeção através de degustação, tato, olfação e/ou examinação visual de uma substância.

O termo “fenótipo” como é aqui usado significa uma característica ou traço observáveis de um organismo, tal como milho doce, tal como a sua morfologia, desenvolvimento e/ou propriedades bioquímicas ou fisiológicas. O mesmo é um traço ou característica biológicos possuídos por um organismo (que inclui uma planta) que resulta da expressão de um gene específico. Fenótipos no geral resultam da expressão de um dos genes do organismo, assim como da influência de fatores ambientais, e possíveis interações entre os dois. Em populações naturais, a maior parte da variação fenotípica é contínua, e é efetuada pelos alelos em um ou múltiplos locais de gene.

O termo “planta” como é aqui usado significa qualquer organismo que pertence ao Reino Plantae, e que é frequentemente caracterizado por uma ou mais das seguintes características:

• uma capacidade para fabricar o seu próprio alimento pela fotossíntese (isto é capaz de capturar energia via o pigmento verde (clorofila) dentro do cloroplasto, e de usar dióxido de carbono e água para produzir açúcares como alimento e açúcares oxigenados como alimento, e oxigênio como subproduto;

• os alimentos são armazenados nas formas de açúcares e amido;

• uma presença de paredes de célula rígidas separado da membrana celular;

• tem células eucarióticas (isto é a presença de um núcleo distinto circundado por uma membrana);

• na maior parte são multicelulares (isto é compostas de muitas células que são organizadas para realizar uma função específica como uma unidade);

• crescimento ilimitado nos meristemas (quando presentes);

• os órgãos são especializados para ancoragem, sustentação e fotossíntese (por exemplo raízes, caules, folhas, etc);

• a resposta aos estímulos é bastante lenta devido à ausência de órgãos sensoriais e sistemas nervosos;

• movimentos limitados devido a uma falta de órgãos para a mobilidade; e/ou • tem um ciclo de vida que envolve fases tanto esporofíticas quanto gametofíticas.

As plantas são os maiores produtores em um ecossistema, e elas incluem, por exemplo, árvores, ervas, arbustos, gramas, videiras, samambaias e musgos. Os exemplos de plantas particulares incluem, mas não são limitadas às plantas de alface, tabaco, algodão, milho, arroz, trigo, cenoura, pepino, alho-poró, ervilha, melão, batata, tomate, sorgo, centeio, aveia, cana de açúcar, amendoim, linho, feijão, beterrabas açucareiras, soja e girassol.

O termo “plasmídeo” como é aqui usado significa qualquer uma das diversas organelas citoplasmáticas no geral pigmentadas que são encontradas nas células vegetais, tendo várias funções fisiológicas, tais como a síntese e armazenagem de alimento.

O termo “pleotrópico” como é aqui usado significa produzir efeitos múltiplos de um único gene. Por exemplo, em seres humanos, o gene Marfan é pleotrópico e pode causar dedos das mãos e dedos dos pés longos, deslocamento das lentes do olho e aneurisma dissecante da aorta.

O termo “pólen” como é aqui usado significa o material como pó fino que consiste de grãos de pólen que contêm as células reprodutivas masculinas da maioria das plantas. O pólen é no geral produzido pelas anteras das plantas de semente.

O termo “polinização” como é aqui usado significa o processo pelo qual o pólen da planta é transferido, no geral da antera para o estigma (dos órgãos reprodutivos masculinos para os órgãos reprodutivos femininos) de uma flor da planta para produzir descendência (para formar sementes). Nas plantas de flor, o pólen é transferido da antera para o estigma, frequentemente pelo vento ou pelos insetos. Em plantas que carregam cone, os cones masculinos liberam pólen que é usualmente transportado pelo vento para os óvulos de cones femininos. O grão de pólen no geral contém duas células: uma célula generativa e uma célula de tubo. O núcleo generativo no geral divide-se para formar dois núcleos de esperma. A célula tubo no geral crescem para baixo dentro do pistilo até que o mesmo atinge um dos óvulos contidos no ovário. Os dois espermas no geral viajam para baixo do tubo e entram no óvulo, onde um núcleo de esperma no geral se liga com o ovo. O outro núcleo de esperma no geral combina com os núcleos polares que existem no óvulo, completando um processo conhecido como “dupla fertilização”. Estes núcleos fertilizados depois no geral desenvolvem-se no endocarpo, o tecido que alimenta o embrião. O próprio óvulo no geral se desenvolve em uma semente que está contida no ovário da flor (que amadurece em uma fruta). Nos gimnospermas, o óvulo é exposto (não contido em um ovário), e o pólen produzido pelas estruturas reprodutivas masculinas pousa diretamente no óvulo nas estruturas reprodutivas femininas.

As frases “reação da cadeia da polimerase” e “PCR” como são aqui usadas referem-se a uma técnica que é bem conhecida por aqueles tendo habilidade comum na técnica para duplicar um pedaço específico do DNA in vitro, mesmo na presença de excesso de DNA não específico. Os iniciadores são adicionados (que iniciam a cópia de cada filamento) junto com nucleotídeos e Taq polimerase estável ao calor. Ciclando-se a temperatura, o DNA alvo é repetitivamente desnaturado e copiado. Porque os filamentos de DNA recém sintetizados podem servir subsequentemente como padrões adicionais para as mesmas sequências iniciadoras, rodadas sucessivas de recozimento de iniciador, alongamento de filamento, e dissociação para produzir amplificação rápida e altamente específica da sequência desejada. A PCR também pode ser usada para detectar a existência da sequência definida em uma amostra de DNA. Uma única cópia do DNA alvo, mesmo se misturado com outro DNA indesejável, pode ser amplificado para se obter bilhões de réplicas. A PCR pode ser usada para amplificar as sequências de RNA se elas são primeiro convertidas para DNA via transcriptase reversa. Os tampões de PCR, iniciadores, sondas, controles, marcadores, kits de amplificação, kits de síntese de sDNA, kits de PCR gerais, e seus semelhantes são disponíveis a partir de fontes que são conhecidas por aqueles tendo habilidade comum na técnica, tais como Applied Biosystems (Foster City, CA), e podem facilmente usados por aqueles tendo habilidade comum na técnica de acordo com a presente invenção.

O termo “iniciador” como é aqui usado significa uma cadeia de polinucleotídeo pré-existente relativamente curta à qual novos desoxirribonucleotídeos podem ser adicionados pela DNA polimerase.

As frases “estágio de alimentação primário” e “estágio de ingestão de pico” como são aqui usadas significam o estágio quando uma planta, tal como milho doce, tem o gosto mais favorável ou mais doce, o que pode ser facilmente determinado por aqueles tendo habilidade comum na técnica e, para o milho doce, pode ser quando os grãos de milho contêm aproximadamente 75 % de umidade. Por exemplo, o milho doce tende a maturar todo de uma vez, e quando passou o seu estágio de alimentação primário, a doçura no geral toma-se diminuída ou ausente, e é substituída por um sabor insosso, rico em amido, que não é desejável para os consumidores.

O termo “nucleotídeo” como é aqui usado significa o bloco de construção básico (subunidades) de ácidos nucleicos, tais como DNA e RNA. O mesmo é um composto orgânico que é no geral composto de base nitrogenada, um açúcar e um grupo fosfato. A molécula de DNA consiste de nucleotídeos em que o componente de açúcar é desoxirribose, ao passo que a molécula de RNA tem nucleotídeos em que o açúcar é ribose. Os nucleotídeos mais comuns são divididos em purinas e pirimidinas com base na estrutura da base nitrogenada. No DNA, as bases de purina incluem adenina e guanina, enquanto que as bases de pirimidina são timina e citosina. O RNA inclui adenina, guanina, citosina e uracila ao invés de timina. Além de servir como precursores de ácidos nucleicos, os nucleotídeos também servem como cofatores importantes na sinalização e metabolismo celulares. Estes cofatores incluem flavina adenina dinucleotídeo (FAD), flavina mononucleotídeo, trifosfato de adenosina (ATP) e fosfato de nicotinamida adenina dinucleotídeo (NADP). Para formar uma molécula de DNA ou RNA, no geral milhares de nucleotídeos são unidos entre si em uma cadeia longa. Um oligonucleotídeo de DNA é um pedaço curto de DNA composto de relativamente poucas bases de (oligo-) nucleotídeo.

O termo “pericarpo” como é aqui usado significa a parede de uma fruta de planta, tal como um grão de milho, que no geral é desenvolvida a partir de uma parede do ovário, e contém um exocarpo externo, um mesocarpo central e um endocarpo interno.

O termo “fitoglicogênio” como é aqui usado significa um polissacarídeo vegetal tendo uma estrutura que é similar ao glicogênio, e propriedades similares. Por exemplo, o fitoglicogênio presente no milho doce é um glicano solúvel em água tendo um comprimento de cadeia unitária médio de 13, refletindo um grau no geral alto de ramificação.

O termo “polinucleotídeo” como é aqui usado significa uma molécula polimérica orgânica que é composta de monômeros de nucleotídeo covalentemente ligados em uma cadeia. O DNA (ácido desoxirribonucleico) e RNA (ácido ribonucleico) são exemplos de polinucleotídeos que tem uma função biológica distinta.

O termo “polissacarídeo” como é aqui usado significa qualquer um de uma classe de carboidratos, tais como amido e celulose, consistindo de vários monossacarídeos que são unidos pelas ligações glicosídicas.

O termo “proteína” como é aqui usado refere-se a uma molécula grande composta de uma ou mais cadeias de aminoácidos em uma ordem específica, que é determinada pela sequência base de nucleotídeos no gene que está codificando a proteína. As proteínas são requeridas para a estrutura, função, e regulagem de células, e cada proteína tem funções únicas.

O termo “recessivo” como é aqui usado em conexão com um gene significa um gene cujo efeito fenotípico é expressado no estado homozigota, mas é mascarado na presença do alelo dominante (isto é quando o organismo é heterozigoto para aquele gene). O mesmo é um fenótipo que é expressado no organismos (que inclui plantas) apenas se o mesmo for homozigota para o alelo correspondente. Usualmente o gene dominante produz um produto funcional ao passo que o alelo recessivo não: tanto 1 dose quanto 2 doses por núcleo do alelo dominante, portanto, no geral leva a uma expressão do seu fenótipo, ao passo que o alelo recessivo é no geral observado apenas na ausência completa do alelo dominante.

A letra “R” como aqui usada em conexão com uma designação de um híbrido de milho doce indica que tal híbrido é resistente à ferrugem da folha comum (isto é, que o mesmo é resistente á ferrugem). A ferrugem comum, causada pelo Puccínia sorghi, é conhecida ser um patógeno principal para, e pode reduzir significantemente os rendimentos de, Zea mays, milho doce. Epidemias desta doença pode causar perdas sérias no rendimento e qualidade do milho doce. A alta suscetibilidade à ferrugem de muitos híbridos de milho doce populares é um fator principal que contribui para as epidemias de ferrugem. Um outro fator é que o milho doce é usualmente plantado em um período prolongado de Maio até Junho para os usos fresco e em processamento. Os programas de plantação escalonada resultam em altas concentrações de esporos fungicos no ar, que se origina dos campos plantados mais cedo, no tempo quando os campos plantados mais tarde contêm plantas jovens ativamente em crescimento suscetíveis. A ferrugem comum no milho doce aparece no campo como pústulas marrons canela ovais a alongadas dispersas nas superfícies superiores e inferiores das folhas. As pústulas se rompem e expõem esporos vermelhos pulverulentos (uredinioesporos), que são espalhados pelo vento e têm a capacidade para infectar outras folhas de milho diretamente. Conforme as pústulas amadurecem, elas se tomam preto amarronzadas e liberam os esporos hibemantes marrom escuros (telioesporos). Nas epidemias graves, as pústulas também podem aparecer nas espigas e franjas, e as folhas podem amarelar e tomarem-se facilmente esfarrapadas em ventos fortes. A resistência parcial é expressada como manchas cloróticas ou necróticas hipersensíveis com pouca ou nenhuma esporulação. As epidemias de ferrugem no milho doce foram severas no passado. Três fatores principais interagem para influenciar o surto de epidemias de ferrugem no milho doce: (1) a quantidade de uredinioesporos disponível para iniciar as epidemias de ferrugem; (2) fatores ambientais; e (3) o nível de susceptibilidade à ferrugem nas variedades de milho doce em uso. Os uredinioesporos são incapazes de hibernar com êxito nos climas setentrionais. A cada primavera os uredinioesporos movem-se para o norte a partir do sudoeste dos Estados Unidos e México, que segue as plantações sequenciais de milho do sul até o Canadá. As temperaturas de 60° a 75°F (16 a 24°C) e orvalhos pesados ou umidade relativa alta (próxima a 100 %) favorecem o desenvolvimento de ferrugem. As condições de tempo correntes influenciam a germinação do esporo e a taxa na qual a epidemia de ferrugem se desenvolve. A umidade é requerida para a germinação do esporo. A infecção no geral ocorrerá quando as folhas estão úmidas por um mínimo de cerca de 3 a cerca de 6 horas. Embora a maior parte dos híbridos de milho doce populares correntes são susceptíveis à ferrugem, variedades resistentes estão se tomando disponíveis. Dois tipos de resistência estão sendo usadas pelo produtores de milho doce comercial: a resistência específica de gênero e resistência à ferrugem parcial. O controle modesto de ferrugem no milho doce pode ser obtido com aplicações de fungicidas. Os testes conduzidos a oeste de Nova Iorque têm mostrado que três aplicações de mancozeb aplicadas pelo ar significantemente reduziram a severidade da doença em todas as folhas das plantas de milho doce. As aplicações de fungicida também significantemente aumentaram o número de espigas colhíveis e o peso das espigas colhidas. Pesquisas conduzidas em outros estados tem mostrado que, controlando-se a ferrugem com fungicidas, melhorias no teor de umidade, teor de açúcar, e enchimento da ponta da espiga foram observados. Entretanto, o controle do tempo da primeira aplicação de fungicida é crítico porque o mesmo precisa ser aplicado cedo o bastante para reduzir a taxa de desenvolvimento epidêmico. Porque os esporos de ferrugem no geral chegam de fora da área imediata plantada para o milho, é frequentemente difícil prognosticar quando esta pulverização deve ser aplicada.

As letras “SS” como são aqui usadas em conexão com uma designação de um híbrido de milho doce indica que tais híbridos incluem o gene mutante sh2-i.

O termo “semente” como é aqui usado significa um órgão de propagação formado no ciclo reprodutivo sexual de gimnospermas e angiospermas (células sexuais masculino e feminino) que inclui um revestimento protetivo que inclui um embrião e reservas de alimento. O mesmo é uma fruta dura pequena que no geral está localizada em um óvulo fertilizado de uma planta. Uma semente tem dois componentes principais, o embrião e o endosperma. O endosperma atua como um armazém de alimento para o embrião que, com o tempo, crescerá a partir desta fonte rica de alimento que permitirá que o mesmo assim o faça. A maior parte das sementes passam através de um período de repouso em que não há nenhum crescimento ativo. Durante este tempo, a semente pode ser transportada com segurança para uma nova localização e/ou sobrevive condições climáticas adversas até que seja favorável para o crescimento. A semente contém um embrião e, na maioria das plantas, reservas de alimento armazenadas enroladas em um revestimento da semente. Sob condições de crescimento favoráveis, uma semente começa a germinar, e os tecidos embrionários retomam o crescimento, desenvolvem-se em uma muda. Informação adicional a cerca de sementes, mudas, germinação e crescimento de planta está presente em P. Raven et al., Biology of Plants (7^a Edição, Nova Iorque: W. H. Freeman and Company), 504-508 (2005); e B. Larkins et al., Cellular and Molecular Biology of Plant Seed Development (Kluwer Academic Publishers, 1997).

O termo “muda” como é aqui usado significa uma planta jovem esporófita que se desenvolve a partir de um embrião de planta a partir de uma semente. O desenvolvimento da muda começa com a germinação da semente. Uma muda jovem típica consiste de três partes principais: (i) o radículo (raiz embrionária); (ii) o hipocotilo (broto embrionário); e (iii) os cotilédones (folhas de semente). Durante a germinação, a planta jovem emerge do seu revestimento de semente protetivo no geral com seu radículo primeiro, seguido pelos cotilédones. O radículo se oriente na direção da gravidade, enquanto os hipocotilos se orientam na direção oposta da gravidade e alonga-se através da expansão celular para empurrar os cotilédones para fora do solo. Tipicamente, o desenvolvimento da muda começa com escotomorfogênese enquanto a muda está crescendo através do solo e tentando atingir a luz tão rápido quanto possível. No geral durante esta fase, os cotilédones são firmemente fechados e formam um gancho apical para proteger o meristema apical do broto de dano enquanto o empurra através do solo. Em muitas plantas, o revestimento da semente ainda cobre os cotilédones para proteção extra. Ao romper a superfície e atingir a luz, o programa desenvolvimental da muda é no geral ligada à fotomorfogênese. os cotilédones no geral se abrem no contato com a luz (dividindo a semente o revestimento abre, se ainda presente) e tomam-se verdes, formando os primeiros órgãos fotossintéticos da planta jovem. Até este estágio, a muda no geral vive às custas das reservas de energia que são armazenadas na semente. A abertura dos cotilédones no geral expõe o meristema apical do broto e a plúmula, consistindo das primeiras folhas verdadeiras da planta jovem. As mudas sentem a luz através dos receptores de luz fitocromo (luz vermelha e vermelha remota) e criptocromo (luz azul). Uma vez que uma muda começa a realizar a fotossíntese, a mesma no geral não é mais dependente das reservas de energia da semente. No geral, os meristemas apicais começam a crescer e dão origem às raízes (o órgão da planta que tipicamente reside abaixo da superfície do solo) e brotos (novo crescimento de planta, tal como hastes e folhas). As primeiras folhas “verdadeiras” no geral expandem-se, e podem ser frequentemente distinguidas dos cotilédones redondos através das suas formas distintas dependentes da espécie. Enquanto a planta está crescendo e desenvolvendo folhas adicionais, os cotilédones eventualmente envelhecem e caem.

A frase “análise de segregação” como é aqui usada significa um método para confirmar alelismo. Isto pode ser realizado cruzando-se duas linhagens que são homozigota mas contêm alelos diferentes em um local em questão. Pode-se então monitorar a segregação dos alelos em gerações segregantes para testar quanto ao padrão de segregação Mendeliana esperado. A homologia de fragmentos de DNA para a mesma sonda e exclusividade mútua entre diversas linhagens puras é no geral um teste razoável de alelismo.

O termo “auto-polinização” como é aqui usado significa a polinização manual de uma planta colocando-se o seu pólen no seu próprio estigma (auto polinização), e é uma estratégia de reprodução que pode levar à homozigosidade de um alelo. Se um conjunto de precursores são homozigota para o mesmo alelo, este alelo é simplesmente transmitido e a progênie no geral será homozigota para este mesmo alelo. Por outro lado, se os precursores são homozigotas, mas para alelos diferentes, A e B, então a progênie é um heterozigota A/B se um único cruzamento é feito, mas é homozigota A ou B, cada um com uma expectativa de 1/2 se o cruzamento é seguido por muitas auto-polinizações.

As frases “alelo mutante sh2-i,” “alelo sh2-i,” “gene mutante sh2-i” e “gene sh2-i” como são aqui usadas significam alelos mutantes ou genes que contêm a mesma mutação pontual de sítio de junção de intron que é aqui descrita e mostrada, e conferem o(s) mesmo(s) traço(s) como são aqui descritos, sejam designados como sh2-i ou por alguma outra designação, tal como por sh2-N2340.

O termo “solo” como é aqui usado significa qualquer tipo de um meio, ou mistura de meios, em que uma semente de planta, tal como uma semente de milho, de modo tipicamente razoável crescerá em uma planta, tal como o material mineral ou orgânico não consolidado que está presente na superfície da Terra, que serve como um meio natural para o crescimento de plantas de terra. Tais meios são conhecidos por aqueles tendo habilidade comum na técnica.

O termo “amido” como é aqui usado significa um carboidrato polissacarídico que no geral inclui um grande número de unidades de glicose monossacarídeo que são unidos entre si pelas ligações glicosídicas, e é encontrado nas semente, bulbos e tubérculos de plantas. O amido é no geral predominantemente presente como amilase e amilopectina. As plantas usam amido como um modo para armazenar a glicose em excesso, e como alimento durante a fosforilação oxidativa mitocondrial.

O termo “sacarose” como é aqui usado significa um dissacarídeo composto de glicose e frutose que está presente em muitas plantas, e é amplamente usado como um adoçante ou preservante.

O termo “açúcar” como é aqui usado significa qualquer dissacarídeo (por exemplo sacarose) e monossacarídeos (por exemplo frutose ou glicose). Açúcares são componentes estruturais essenciais das células vivas, e são uma fonte de energia para muitos organismos, tais como plantas. As plantas usam açúcares para armazenar energia. Os açúcares são classificados com base no número de unidades de monossacarídeo que estão presentes na molécula. Os monossacarídeos unem-se para formar açúcares mais complexos, por exemplo dissacarídeos.

A frase “cruzamento de teste” como é aqui usada significa o cruzamento de um organismo, tal como uma planta, com um genótipo desconhecido, com um organismo homozigota recessivo (testador). O mesmo é um cruzamento entre um indivíduo de genótipo desconhecido ou um heterozigota (ou um heterozigota múltiplo) com um indivíduo homozigota recessivo.

O termo “traço” como é aqui usado refere-se a uma qualidade ou característica distinguível, e é no geral uma variante distinta de um caráter fenotípico de um organismo, tal como milho doce, que pode ser herdado e/ou ambientalmente determinado, por exemplo, o teor de açúcar do milho doce. A meta de reprodução de planta no geral é produzir progênie que excede seus precursores em termos de desempenho quanto a um ou mais traços. Tal progênie (segregantes transgressivos) podem ser identificados usando técnicas que são conhecidas por aqueles tendo habilidade comum na técnica, tais como análises de segregação. De moda a observar a segregação transgressiva, precursores que se complementam um ao outro em termos de alelos favoráveis em vários locais no geral devem ser selecionados. Cruzamento e recombinação podem então resultar em progênie que contenha alelos mais favoráveis do que o seu precursor.

O termo “transcrição” como é aqui usado significa a síntese de RNA sob a direção do DNA. A síntese de RNA, ou transcrição, é o processo de transcrever a informação da sequência de nucleotídeo do DNA na informação de sequência do RNA. Ambas as sequências de ácido nucleico usam linguagem complementar, e a informação é simplesmente transcrita, ou copiada, de uma molécula para a outra. A sequência de DNA é enzimaticamente copiada pela RNA polimerase para produzir um filamento de RNA de nucleotídeo complementar (RNA mensageiro ou mRNA) porque o mesmo carrega uma mensagem genética do DNA para o mecanismo que sintetiza a proteína da célula. Uma diferença significante entre as sequências de RNA e DNA é a presença de U, ou uracila no RNA ao invés do T, ou timidina do DNA. No caso de DNA que codifica proteína, a transcrição é a primeira etapa que usualmente leva à expressão dos genes, pela produção do intermediário de mRNA, que é um transcrito fiel da instrução de construção da proteína do gene. O trecho de DNA que é transcrito em uma molécula de RNA é a unidade de transcrição. Uma unidade de transcrição de DNA que é traduzida em proteína contém sequências que direcionam e regulam a síntese de proteína além de codificar a sequência que é traduzida em proteína. A sequência regulatória que está antes (a montante (-), da extremidade 5’ do DNA) a sequência codificadora é a região não traduzida 5’, e a sequência reguladora que é encontrada a seguir (a jusante (+), da extremidade 3’ do DNA) a sequência codificadora é a região não traduzida 3’. Como na replicação do DNA, o RNA é sintetizado na direção 5’ —> 3’. Apenas um dos dois filamentos de DNA é transcrito. Este filamento é o filamento padrão porque o mesmo fornece o padrão para arrumar a sequência de nucleotídeos em um transcrito de RNA. O outro filamento é o filamento codificador porque a sua sequência é a mesma como o transcrito de RNA recém criado (exceto quanto à uracila que é substituída no lugar da tiamina). O filamento padrão de DNA é lido de 3’ —» 5’ pela RNA polimerase e o novo filamento de RNA é sintetizado na direção 3’. Uma polimerase liga-se à extremidade 3’ de um gene (promotor) no filamento padrão de DNA e move-se para a extremidade 5’. A transcrição é dividida em 5 estágios: pré-iniciação, iniciação, depuração de promotor, alongamento e terminação. Informação adicional a cerca da transcrição está presente em J. Berg J et al., Biochemistry (6^a ed., San Francisco: W. H. Freeman, 2006); e R. J. Brooker, Genetics: Analysis and Principies (2^a ed., Nova Iorque: McGraw-Hill, 2005).

O termo “tradução” como é aqui usado significa o processo pelo qual as cadeias de polipeptídeo são sintetizadas, a sequência de aminoácidos que é determinada pela sequência de bases em um RNA mensageiro, que por sua vez é determinada pela sequência de bases no DNA do gene a partir do qual o mesmo foi transcrito. Informação adicional com respeito à tradução está presente em D. V. Lim, Microbiology (3^a ed., Kendal/Hunt, 2003).

O termo “vigor” como é aqui usado significa uma aplicação de força ou uma medida do aumento no crescimento de planta e/ou volume da folhagem através do tempo depois da plantação (isto é, depois da colocação apropriada de sementes no solo para a propagação), e/ou de alguma outra qualidade superior relacionada com a força e/ou crescimento da semente, muda e/ou planta, tal como uma germinação e/ou emergência intensificadas da muda fora do solo, dependendo do contexto. Uma linhagem de planta pode ser chamada de “vigorosa” quando a linhagem cresce vigorosamente, saudável, é tolerante aos vários estresses bióticos e abióticos e/ou tem um alto rendimento, possivelmente mesmo enquanto sob condições subótimas. O vigor pode ser medido, e comparado com diferentes variedades de planta (ou com linhagens particulares dentro de uma variedade de planta particular), pelos métodos que são conhecidos por aqueles tendo habilidade comum na técnica, em termos de porcentagens (de 0 % a 100 %), ou de outro modo, e quanto mais alto o crescimento e rendimento de uma variedade (ou linhagem) de planta particular (em sementes, frutas, vegetais, plantas e/ou seus semelhantes), mais vigor a planta no geral tem. Por exemplo, uma variedade ou linhagem de milho doce pode produzir aproximadamente 10 % menos grãos quando comparada com uma outra variedade ou linhagem de milho doce. Um método para determinar plantas híbridas com “vigor de rendimento” (e outro vigor) está descrito na Patente U.S. N° 7.084.320 B2. Outros métodos para determinar vigor são conhecidos por aqueles tendo habilidade comum na técnica.

O termo “rendimento” como é aqui usado refere-se à produtividade da planta, material de planta e/ou semente, tal como a produtividade por área unitária de um produto de planta particular de significância comercial. Por exemplo, rendimento de soja é habitualmente medido em bushels de semente por acre, ou toneladas métricas de semente por hectare, por estação.

O termo “do tipo selvagem” como é aqui usado refere-se a uma constituição nativa ou predominante genética antes das mutações, usualmente no que se refere à constituição genética normalmente existente ao natural.

A letra “Y” como é aqui usada em conexão com uma designação de um híbrido de milho doce indica que tal híbrido é amarelo na cor.

Abreviações

A tabela abaixo lista muitas das abreviações que são aqui utilizadas junto com seus significados.

• Alelo sul (sugary-1): um alelo recessivo no cromossoma 4 (um mutante), que produz um aumento moderado nos níveis de açúcar global, e que resulta em gosto doce, no milho, com a doçura deteriorando-se rapidamente (assim, uma vida de prateleira curta), e que dá aos grãos de milho uma textura e aparência lisa e cremosa (desejáveis);

• Alelo Sul (starchy-1): um alelo dominante no cromossoma 4, que é encontrado no milho de campo (dent) (não é um mutante);

• Alelo sei (sugary enhancer-1): um alelo recessivo no cromossoma 2 (um mutante), que aumenta o açúcar total, e fornece uma doçura intensificada, para a variedade grãos de milho sul convencional quando o genótipo é homozigota sei sei);

• Alelo Sei: um alelo dominante no cromossoma 2 (não é um mutante) que impede uma expressão de doçura e maciez elevadas;

• Alelo sh2 (shrunken-2): um alelo recessivo no cromossoma 3 (um mutante) que produz cerca de duas vezes o teor de açúcar das variedades de milho sul, e um gosto muito mais doce associado, quando o genótipo é homozigota sh2sh2, que tem sementes com peso leve, facilmente danificadas tendo uma aparência “enrugada” devido a uma redução no peso do endosperma e nos níveis de amido, e um vigor de muda, aptidão e/ou saúde significantemente reduzidos associados durante a germinação, emergência da muda do solo, e desenvolvimento e crescimento de planta em comparação com as variedades de milho doce sul e sei convencionais, e que tem uma retenção de açúcar no estágio de alimentação pós excelente que é significantemente prolongado em relação aos milhos doces mutantes sul e sei convencionais;

• Alelo Sh2: um alelo dominante presente em plantas de milho doce normais (isto é, que não inclui o alelo mutante sh2) (não é um mutante) (Ver a Patente U.S. N“ 4.630.393, col. 3);

• Alelo sh2-i: uma forma recessiva do gene sh2 (um mutante) que produz características de germinação e crescimento intensificadas com plantas de milho em comparação com as plantas de milho que expressam o gene sh2.

Reprodução de Planta: Plantas Femininas e Masculinas As três estruturas que no geral compreendem o sistema reprodutivo de uma planta feminina, que é conhecido como o pistilo, são o estigma, estilo e ovário. O estigma é tipicamente aquela parte da estrutura reprodutiva feminina na qual o pólen adere e germina, e é no geral terminal em localização. O estilo é a parte como o talo da estrutura reprodutiva feminina, e conecta o estigma com o ovário, que no geral inclui um ou mais óvulos.

As duas estruturas que no geral compreendem o sistema reprodutivo de uma planta masculina, que é conhecida como o estamen, são a antera e o filamento. A antera é o pólen contendo parte do sistema reprodutivo masculino, e tipicamente inclui um ou mais sacos. O pólen toma-se formado e amadurece dentro desta parte da planta masculina. O filamento é uma porção como haste deste sistema reprodutivo, e tipicamente inclui a antera na sua ponta.

Durante a polinização e fertilização, o pólen da estrutura reprodutiva masculina chega no topo do estigma da estrutura reprodutiva feminina e, se as condições são condutivas, o pólen germinará. Na germinação, o pólen forma um tubo de pólen e cresce para baixo através do estilo da planta feminina e, quando o mesmo atinge o ovário feminino, libera os núcleos masculinos dentro do óvulo, com a fertilização ocorrendo.

O pericarpo de milho (uma semente monocotiledônea) é a parede da fruta ou revestimento da semente, que é desenvolvida a partir da parede do ovário. O endosperma está localizado dentro do pericarpo, e funciona para fornecer uma fonte de material e energia reservas para o processo de germinação, durante o qual o mesmo será metabolizado e usado pelo embrião em desenvolvimento para o crescimento. O endosperma mole é o tecido nutritivo mole formado dentro do saco embrionário de plantas de semente, e o endosperma duro é o mesmo tecido nutritivo formado no saco embrionário, mas é de uma consistência dura. O embrião é a planta rudimentar localizada dentro de uma semente que desenvolver-se-á em uma muda, e depois subsequentemente em uma planta.

Informação adicional com respeito às plantas femininas e masculinas, e a sua reprodução, é descrita em T. A. Kiesseelbach, The Structure and Reproduction of Com (Cold Spring Harbor Laboratory Press, 1999); e J. E. Bradshaw, Root and Tuber Crops (Handbook of Plant Reproduction).

Informação a cerca da genética vegetal e várias técnicas de reprodução de planta é descrita, por exemplo, em Jack Brown et al., A Introduction to Plant Reproduction (Blackwall Publishing LTD, 2008, ISBN 978-1-4051-3344-9); e George Acquaah, Principies of Plant Genetics and Reproduction (Blackwall Publishing LTD, 2007, ISBN 13-978-1-4051-36464), que inclui um glossário extensivo de termos de genética vegetal e reprodução de planta. Detalhes com respeito ao cultivo de milho doce são fornecidos no site da web sweetcomgrowingtips dot com.

Descrição Geral e Utilidade

A presente invenção fornece métodos únicos, eficazes em custo, confiáveis, eficientes e bem sucedidos para desenvolver e produzir plantas, materiais de planta e sementes, tais como grãos de milho, e milho, que recebem, e têm, atributos múltiplos muito desejáveis para os consumidores destes produtos, assim como para os cultivadores de planta comercial, e para plantas, materiais de planta e sementes melhoradas e/ou intensificadas que são produzidas de acordo com estes métodos. Estes métodos inventivos muito vantajosamente fornecem plantas, materiais de planta e sementes puras, híbridas e outras que têm características ou traços múltiplos muito benéficos e desejáveis, no geral incluindo aqueles que são descritos abaixo (assim como outros), mesmo quando submetidos às quantidades razoáveis de estresses ambientais ou outros, tais como temperaturas mais frias, condições de seca, nutrientes baixos e outras condições de solo deficientes, apinhamento, doença, insetos, amimais, poluição e/ou seus semelhantes. Embora estes traços benéficos sejam descritos abaixo em conexão com as plantas de milho, tais traços também podem ser produzidos em conexão com outros tipos de plantas.

• Os grãos de milho fisicamente são mais cheios, e têm um teor mais alto de carboidrato e polissacarídeos solúveis em água (WSP), no estágio de semente seca em comparação com variedades de milho de gene mutante em shrunken-2 (sh2) e shrunken-2i (sh2-i) convencionais (e outras variedades de milho, tais como variedades de milho do tipo selvagem), que têm carboidrato e, assim níveis de energia e/ou níveis de polissacarídeos solúveis em água iniciais e subsequentes enormemente reduzidos. Isto muito vantajosamente resulta em um nível de energia e características de crescimento iniciais e subsequentes significantemente intensificados para as plantas, tais como um vigor e aptidão mais fortes (e maximizados) para o milho durante a germinação da semente, emergência da muda do solo, e desenvolvimento da planta em comparação com as variedades de milho do gene mutante em shrunken-2 (sh2) e shrunken-2i (sh2-i) (e outras variedades de milho). As plantas germinam para uma emergência mais vigorosa e mais uniforme por causa de suas reservas de amido mais altas, que correlaciona-se com plantas mais robustas, uma colheita maior e mais rendimento de planta, todas as quais são muito desejáveis para os cultivadores de planta e jardineiros domésticos.

Surpreendentemente, os grãos de milho se comparam favoravelmente em qualidade de ingestão com as variedades de milho doce sugary-1 (sul), sugary enhancer-1 (sei) e Shrunken-2 (sh2) convencionais, e ainda com as variedades de milho doce que incluem todos os três destes alelos mutantes, e em alguns casos são melhores em qualidade de ingestão do que tais variedades de milho doce (e outras variedades de milho doce, tais como variedades de milho do tipo selvagem). Os grãos de milho contêm níveis de açúcar total elevados (2 a 3 vezes os níveis de açúcar de muitas variedades de milho convencionais), que resultam em um sabor e gosto doce muito desejável destes grãos, em comparação com as variedades de milho de gene mutante sugary-1 (sul) convencionais, e outras variedades de milho, que são muito desejáveis para os consumidores quando da ingestão dos grãos de milho. (Os níveis de açúcar do grão de milho podem ser quantificados usando métodos que são conhecidos por aqueles tendo habilidade comum na técnica, tais como cromatografia gasosa). A retenção de açúcar, e o gosto doce associado, dos grãos de milho no estágio de alimentação pós excelente (particularmente nos dias 1 a 14 imediatamente a seguir do estágio de alimentação primário) é significantemente prolongado em comparação com as variedades de milho de gene mutante sugary-1 (sul) e shrunken-2i (sh2-i) convencionais (e outras variedades de milho), que têm uma rápida conversão de açúcar para amido durante este período de tempo (que resulta em uma perda de açúcar), e uma redução associada no gosto doce dos grãos de milho, e uma janela de colheita estreita antes que a doçura se deteriore muito rapidamente depois do estágio de alimentação primário. Esta retenção de açúcar muito vantajosamente resulta em um gosto doce mais longo dos grãos de milho, que é muito desejável para os consumidores, uma janela de colheita mais longa do milho, uma capacidade de ser guardado por mais tempo do milho, e uma vida de prateleira mais longa do milho antes que a doçura se deteriore depois do estágio de alimentação primário, que muito vantajosamente fornece uma flexibilidade muito maior da colheita, e condições de manuseio, do milho para os cultivadores de milho. Os grãos de milho têm um acúmulo de amido reduzido no estágio de alimentação primário e até um ponto prático a seguir (qualidade de ingestão de pico), tal como de cerca de 1 a 14 dias imediatamente a seguir do estágio de alimentação primário, em comparação com variedades de milho de gene mutante sugary-1 (sul) e shrunken-2i (sh2-i) convencionais (e outras variedades de milho).

Os grãos de milho de variedades de milho híbridas que são produzidas de acordo com os métodos da invenção são lisos e atraentes, doces, macios, rechonchudo e cremoso, e têm uma alta qualidade de ingestão, todas as quais são muito desejáveis pelos consumidores do mundo todo.

Os criadores de milho, produtores de milho, cultivadores de milho, cientistas e outros não foram capazes de produzir um milho doce que incluísse cada um dos acima, e traços de produção e de consumidor muito desejáveis (isto é, estes traços combinados). Além disso, o presente inventor gastou mais do que quatro anos conduzindo experimentos para tentar desenvolver e produzir com êxito variedades híbridas do milho doce que incluíssem estes traços muito desejáveis combinados, e que incluíssem o alelo mutante shrunken-2i (sh2-i) junto com um ou mais outros alelos mutantes, e foi finalmente de modo surpreendente e inesperado capaz de realizar esta meta.

Os métodos da presente invenção combinam alelos mutantes específicos que estão presentes no milho doce, ou outras plantas, com o gene shrunken-2i (sh2-i). Os alelos mutantes, que incluem, mas não são limitados aos alelos sugary-1 (sul), sugary enhancer-1 (sei), e shrunken-2 (sh2) de endosperma mutante, quando expressados em um híbrido de milho doce (ou outra planta) em combinação com o gene shrunken-2i (sh2-i), fornecem características de crescimento intensificado, tais como uma germinação de muda intensificada e vigor de muda, em relação ao milho doce (ou outras plantas), assim como as outras características muito benéficas que são aqui descritas acima. Os métodos da presente invenção preferivelmente fornecem uma reprodução por megulhia única, sequencial dos alelos mutantes sul sul, Sul Sul e/ou sei sei, em combinação com o alelo de endosperma mutante sh2-i, que preserva uma germinação e vigor de muda intensificados junto com capacidade do produto de contenção e vida de prateleira.

Os métodos da invenção envolvem o uso, e identificação de, híbridos, puros e outras linhagens de planta comerciais (e outros) contendo os alelos mutantes acima, isoladamente ou em combinação, e excederam as expectativas convencionais em relação ao crescimento de muda e planta característico. Estes alelos mutantes conferem doçura elevada, e pericarpo de grão reduzido, diferencialmente em combinação específica.

O problema a ser resolvido pela presente invenção, e sua meta, foi manipular a regulagem do acúmulo de carboidrato e maciez do pericarpo nos milhos doces contendo o gene shrunken-2i (sh2-i). Os exemplos que são aqui apresentados descrevem experimentos que foram realizados de modo a resolver este problema e alcançar esta meta.

As sementes de planta, materiais de planta e plantas que pode ser produzidas de acordo com os métodos da presente invenção incluem aquelas que são capazes de ter o alelo mutante shrunken-2i (sh2-i), e pelo menos um outro alelo mutante benéficos, que inclui, mas não é limitado aos alelos mutantes sugary-1 (sul), sugary extender-1 (sei) e/ou shrunken-2 (sh2) de endosperma mutante, incorporado no seu genoma, e expressado, em uma maneira que produza os traços de cultivador e consumidor benéficos combinados que são aqui descritos, que podem ser determinados por aqueles tendo habilidade comum na técnica.

Em uma forma de realização preferida, a invenção envolve uma combinação sequencial única ou reprodução por megulhia do alelo shrunken-2i (sh2-i) mutante com os alelos mutantes sugary (sul), sugary enhancer-1 (sei) e/ou shrunken-2 (sh2) no milho doce. A reprodução por megulhia sequencial única de sulsul, SulSul e/ou selsel em combinação com as funções do alelo sh2-i mutante para preservar a germinação e vigor de muda intensificados junto com capacidade de contenção e vida de prateleira do produto, e fornecem milho doce (e outra plantas) com os outros traços benéficos que são aqui descritos.

Sequências de nucleotídeo de Genes Mutantes

As sequências de nucleotídeo de alguns dos genes mutantes que podem ser utilizados nos métodos da presente invenção são aqui apresentados. As sequências de nucleotídeo de outros genes mutantes que podem ser utilizados na invenção, e relacionados ou outras sequências de nucleotídeo, podem ser facilmente obtidos a partir de fontes que são conhecidas por aqueles tendo habilidade comum na técnica, tais como a partir das bases de dados da Maize Genetics and Genomics e/ou GenBank.

A base de dados da Maize Genetics and Genomics é uma base de dados comunitária para informação biológica a cerca da planta de colheita Zea mays, e é fundada pelo USDA Agricultural Research Service. Os seguintes tipos de dados são acessíveis através deste sítio: caracterização genética, genômica, de sequência, produto de gene, funcional, referência de literatura, e informação de contato pessoal/ organização.

A base de dados de sequência do GenBank é uma coleção de acesso aberto, anotada de todas as sequências de nucleotídeo publicamente disponíveis e as suas traduções de proteína. Esta base de dados é produzida no National Centers for Biotechnology Information, que é um ramo do National Institutes of Health (Betesda, MD), e está disponível na linhagem por intermédio do mecanismo de busca Entrez. O GenBank e seus colaboradores recebem as sequências produzidas em laboratórios por todo o mundo de mais do que 100.000 organismos distintos, e continua a cultivar em uma taxa exponencial, que duplica a cada 18 meses. A mesma contém mais de 65 bilhões de bases de nucleotídeo em mais do que 61 milhões de sequências.

Trabalho Molecular Vegetal e Marcadores Moleculares

Materiais e métodos padrão para o trabalho molecular vegetal são descritos por R. D. D. Croy, “Plant Molecular Biology Labfax” (publicado em conjunto pela BIOS Scientific Publications Ltd (UK) e Blackwell Scientific Publications, UK (1993)) e pelo D. R. Duncan et al., “Methods in Molecular Biology, Plant Cell na Tissue Culture” (Humana Press, Clifton, NJ (1990)).

Os experimentos que levam aos métodos da presente invenção foram facilitados pelo uso de seleção auxiliada por marcador genômico.

Marcadores moleculares podem ajudar aos criadores de planta selecionar de modo relativamente rápido e preciso traços críticos que realçam plantas para as indústrias agrícolas, hortículas, vitículas, e ornamentais. Eles também podem ajudar a que o pessoal da garantia da qualidade tomem decisões apropriadas com respeito à pureza de híbridos, varietais e puros.

A aplicação de marcadores com base em DNA permite que um criador de planta identifique características físicas ao nível molecular, acrescentando assim uma mão científica na criação e replicação de variedades de planta. Os programas de reprodução de planta e produção de semente podem ser intensificados pela aplicação de marcadores moleculares para a seleção e mapeamento de traço, ou genotipagem de variedade e híbridos. Eles fornecem veículos que para localizar e comparar locais que regulam traços quantitativos requerem uma população segregante de plantas. Cada um pode ser genotipado usando marcadores moleculares.

Um marcador molecular que mostra polimorfismo entre os precursores de uma população que está intimamente ligado a um gene que regula um traço particular principalmente co-segregarão com este gene e o traço observável (isto é, segregam de acordo com o fenótipo se o gene tem um grande efeito). Assim, se plantas são agrupadas de acordo com a expressão do traço, e grupos extremos são testados com este marcador polimórfico, a frequência dos dois alelos marcadores presentes dentro de cada um dos dois volumes deve desviar significantemente da razão de 1:1 esperada para a maioria das populações. Como localizações cromossômicas de muitos marcadores moleculares foram agora determinados em muitas espécies, a localização de mapa de genes intimamente ligados, portanto, pode ser deduzida sem ter que genotipar cada indivíduo nas populações segregantes. Isto pode ser usado com populações compósitas de milho e outras colheitas e plantas para localizar locais de traço quantitativos que são associados com vários traços.

A reprodução de planta convencional, ao contrário, é primariamente fundamentada na seleção fenotípica de indivíduos desejados entre as progênies segregantes que resultam da hibridização direcionada. Em alguns casos, as plantas de populações segregantes podem ser agrupadas de acordo com a expressão fenotípica de um traço, e testadas quanto as diferenças na frequência de alelo entre os volumes de população usando a análise segregante de volume (BSA) ou outros métodos. As mesmas sondas usadas para fabricar um mapa genético, tal como isozima, RFLP, RAPD, e seus semelhantes, podem ser usadas para BS A. Entretanto, embora avanços tenham sido feitos na melhora de colheita através de seleções fenotípicas quanto a traços agronomicamente desejáveis, dificuldades consideráveis são frequentemente encontradas durante tal processo. Estas dificuldades podem surgir de interações genótipo-ambientais, efeitos epistáticos e pleotrópicos, ou um hospedeiro de outros fatores. A identificação e quantificação do alelo mutante do milho doce é particularmente dificultado pela falta de identificação e seleção fenotipicamente assistida.

Mesmo se uma base enzimática para um gene mutante particular não é conhecida, e a sequência de nucleotídeo para o gene que codifica a enzima não é conhecida, e não está presente na base de dados Maize Genetics and Genomics ou GenBank, a herança do gene pode ser ainda determinada por aqueles tendo habilidade comum na técnica pelos seguintes marcadores moleculares próximos no cromossoma que inclui o gene, como é descrito aqui na seção de Exemplos em detalhes.

Iniciadores para os marcadores moleculares que foram usados nos Exemplos que aqui aparecem são publicamente disponíveis, e podem ser encontrados na base de dados Maize Genetics and Genomics no sítio da Internet maizegdb dot org. Os seguintes são iniciadores para exemplos de marcadores moleculares úteis.

Iniciadores para Marcadores Moleculares para o Alelo sei no

Cromossoma 2 umcl551:

CACCGGAACACCTTCTTACAGTTT

CGAAACCTTCTCGTGATGAGC bnlgl520:

TCCTCTTGCTCTCCATGTCC

ACAGCTGCGTAGCTTCTTCC phi427434:

CAACTGACGCTGATGGATG

TTGCGGTGTTAAGCAATTCTCC umc2077:

CTGGTTCGGATGCAAGTAGTCAG

AAACTCACTGAACATGATCCTGGC

Iniciadores para Marcadores Moleculares para o Alelo sh2 no

Cromossoma 3 umc2174:

ACATAAATAAAACGTGTGCCGCAG

GTACGTACGCAGCCACTTGTCAG dupssr33:

GTGCTTGGGACAAAAAGG

AGTCCACTCCAGAGGATG bmcl257:

CGGACGATCTTATGCAAACA

ACGGTCTGCGACAGGATATT umc2277:

CTCTTCACGCTCAATAAACCCAGT

TAACTGCAGAAACGGTGGTCAATA

Iniciadores para Marcadores Moleculares para o Alelo sul no

Cromossoma 4 phi295450:

CCTTTTCATGTTGCTTTCCC

GCCCAATCCTTCCTTCCT phi308090:

CAGTCTGCCACGAAGCAA

CTGTCGGTTTCGGTCTTCTT phiO76:

TTCTTCCGCGGCTTCAATTTGACC

GCATCAGGACCCGCAGAGTC phiO79:

TGGTGCTCGTTGCCAAATCTACGA

GCAGTGGTGGTTTCGAACAGACAA

As bibliotecas de marcador de milho comercialmente disponíveis, especificamente, repetições de sequência simples (SSR), podem ser usados para identificações de traço, e podem ser procurados a partir de fontes que são conhecidas por aqueles tendo habilidade comum na técnica. Por exemplo, STA Laboratories (Longmont, CO) fornece serviços de marcador molecular e mapeamento comercialmente disponíveis em conexão com sementes e reprodução de planta, assim como pureza de híbridos e identificação de varietais usando a Eletroforese de Focalização Isoelétrica (IEF) de alta resolução. Esta empresa fornece serviços moleculares para uma identificação, e incorporação de, alelos mutantes específicos do milho doce.

Nos experimentos que levam aos métodos da presente invenção, bibliotecas de marcadores de milho comercialmente disponíveis, especificamente, as repetições de sequência simples (SSR), foram obtidas para identificações de traço, e aproximadamente 330 marcadores SSR foram testados, primariamente alvejando os sítios cromossômicos genômicos publicados de alelo de endosperma mutante sugary-1 (Sul), sugary enhancer1 (Sei) e shrunken-2 (sh2).

Em conjunção com as bibliotecas de marcador SSR, NILs (linhagens quase isogênicas) de milho doce patenteadas foram utilizadas para avaliar as eficácias de marcador, assim como para gerar alelos mutantes específicos desejados para a combinação com o gene mutante sh2-i. As linhagens quase isogênicas de interesse específicas foram:

(i) SulSul sei sei sh2sh2; e (ii) sulsul sei sei sh2sh2.

Informação adicional a cerca do uso de bibliotecas de marcador molecular para plantas e mapas genéticos está presente em, A. Kalinski, “Molecular Markers in Plant Genome Analysis” (Diane Publishing Co., 1995); e H. Lorz et al., “Molecular Marker Systems in Plant Breeding and Crop Improvement,” (Springer, 2007).

Condições para Cultivo e Colheita de Plantas

Aqueles tendo habilidade comum na técnica sabem como plantar, cultivar e colher plantas convenientemente e com êxito, tais como milho doce. Tipicamente, por exemplo, o milho doce é cultivado em solo tendo um pH variando de cerca de 6 a cerca de 6,5 em pleno sol, com uma profundidade de plantio de cerca de 1 polegada. A fertilização é tipicamente realizada quando as plantas de milho doce atingem cerca de 12” (30 cm) de altura para as variedades altas, e de cerca de 18” (46 cm) a cerca de 24” (61 cm) de altura para as outras variedades. As plantas de milho doce são tipicamente colhidas em aproximadamente 64 dias depois da emergência das mudas. Como é conhecido por aqueles tendo habilidade comum na técnica, as condições precedentes podem ser variadas.

Publicações que descrevem como o milho doce e outras plantas podem ser plantadas, cultivadas e colhidas incluem B. R. Lemer et al., “Growing Sweet Com,” Department of Horticulture, Purdue University Cooperative Extension Service, Vegetais HO-98-W, 1-3 (2001); J. R. Schultheis, “Sweet Corn Production,” North Carolina Cooperative Extension Service, North Carolina State University, Revised 12/94; D. L. Larson, “Supersweet Sweet Com: 50 Years in the Making,” Inside Illinois Vol. 23, N° 3 (2003), University of Illinois at Urbana-Champaign News Bureau; e “Sweet Com,” Oregon State University, Horticulture 233 webpage.

O STA Laboratories (Longmont, CO) realiza a análise de pureza física e vigor usando o Sistema de Formação de Imagem de Muda (SVIS), assim como outros serviços de análise de semente. A Registered Seed Technologists (RST) garante padrões de teste uniformes para atingir os regulamentos de rotulação de semente no Estados Unidos e no exterior. STA Seed Health Laboratories são credenciados pelo USDA através do National Seed Health System (NSHS).

Outras Variações

Deleções, adições, e substituições das sequências de nucleotídeo que codificam porções ou todos dos alelos mutantes que são aqui descritos são considerados como estando dentro do escopo da presente invenção, contanto que substancialmente o mesmo fenótipo e características observados com a sequência de nucleotídeo convencional (não alterado) é exemplificado.

As mutações de nucleotídeo de introns considerados dentro do . escopo da presente invenção também podem ser associadas com, ou usadas em conjunção com, outras mutações dos genes que codificam polipeptídeo AGP de planta ou que codificam outras proteínas ou enzimas. Estas outras mutações incluem, mas não são limitadas a, mutações na sequência do tipo selvagem que conferem outros traços agronomicamente desejáveis, tais como estabilidade ao calor, resistência à doença, e outras características desejáveis em uma planta que expressam estes alelos mutantes.

Uma mutação do nucleotídeo terminal do intron 2 da sequência de nucleotídeo genômico Shrunken-2 (sh2) é aqui especificamente exemplificado. Entretanto, as mutações do nucleotídeo terminal em outros introns Shrunken-2 (sh2) também estão dentro do escopo da invenção, contanto que estes confiram substancialmente as mesmas características a uma planta que expressa o alelo como aquele associado com a mutação no intron 2, isto é, germinação e vigor de muda comparáveis a ou melhores do que as plantas que expressam o alelo Shrunken-2 (sh2) do tipo selvagem, mas com qualidade de alimento ou gosto intensificados do vegetal comparável com, ou melhor do que, aquele associado com mutantes que fornecem doçura intensificada, tais como o alelo Sh2-R, em relação ao do tipo selvagem. Aqueles tendo habilidade comum na técnica, e tendo o benefício das divulgações que são aqui descritas, podem facilmente preparar mutações em outros introns do gene, e determinar se os introns mutados conferem as características desejadas às plantas.

As plantas que são consideradas dentro do escopo da invenção incluem, por exemplo, milho, ervilhas doces, tomates, bananas e qualquer outra planta em que um alto teor de sacarose do vegetal ou fruta e germinação, vigor de crescimento da muda e planta, são características desejadas. Outras plantas que são consideradas dentro do escopo da invenção incluem aquelas que são aqui descritas em outro lugar. Também considerado dentro do escopo da invenção é material de planta, tal como tecido, células ou sementes de planta, que contêm os polinucleotídeos que são aqui descritos.

Referências Adicionais

As referências adicionais que seguem podem ser de interesse ou útil na realização da presente invenção: T. Maniatis et al., “Molecular Cloning: A Laboratory Manual” (2^a Edição, Cold Spring Harbor Laboratory, Cold Spring Harbor, N.Y., 1989); D. R. McCarty, “A Simple Method for Extraction of RNA from Maize Tissue,” Maize Genet. Coop. Newslett. 60: 61 (1986); A. Gutierrex-Rojas, “Phenotypic Characterization of Quality Protein Maize Endosperm Modification and Amino Acid Contents in a Segregating Recombinant Inbred Population,” Crop Sei 48, 1714-1722 (2008); L. Hannah et al., “Characterization of Adenosine Diphosphate Glucose Pyrophosphorylases from Developing Maize Seeds,” Plant Physiol. 55: 297302 (1975); L. Hannah et al., “Characterization of ADP-Glucose Pyrophosphorylase from Shrunken-2 and Brittle-2 Mutants of Maize,” Biochemical Genetics 14(7,8): 547-560 (1976); M. J. Giroux et al., “ADPGlucose Pyrophosphorylase in Shrunken-2 and Brittle-2 Mutants of Maize,” Molecular & General Genetics 243(4): 400-408 (1994); L. Shailesh et al., “The AG Dinucleotide Terminating Introns is Important but not always Required for Pre-mRNA Splicing in the Maize Endosperm,” Plant Physiology 120(1): 65-72 (1999); M. Clancy et al., “Maize Shrunken-1 Intron and Exon Regions Increase Gene Expression in Maize Protoplasts,” Plant Science 98:

151-161 (1994); J. Callis et al., “Introns Increase Gene Expression in Cultured Maize Cells.” Genes & Development 1: 1183-1200 (1987); K. R. Luehrsen et al., “Intron Creation and Polyadenylation in Maize are Directed by AU-rich RNA,” Genes & Development 8: 1117-1130 (1994); V. L. Van

Santen et al., “Splicing of Plant Pre-mRNAs in Animal Systems and Vice Versa” Gene 56: 253-265 (1987); V. Vasil et al., “Increased Gene Expression by the First Intron of Maize Shrunken-1 Locus in Grass Species” Plant Physiol. 91: 1575-1579 (1989); J. Anderson et al., “The Encoded Primary Sequence of a Rice Seed ADP-glucose Pyrophosphorylase Subunit and Its

Homology to the Bacterial Enzyme,” The Journal of Biological Chemistry 264(21): 12238-12242 (1989); J. Anderson et al., “Molecular

Characterization of the Gene Encoding a Rice Endosperm-Specific ADP Glucose Pyrophosphorylase Subunit and its Developmental Pattem of Transcription,” Gene. 97: 199-205 (1991); L. Copeland et al., “Purification of

Spinach Leaf ADPglucose Pyrophosphorylase,” Plant Physiol. 68: 996-1001 (1981); M. Morell et al., “Affinity Labeling of the Allosteric Activator Site(s) of Spinach Leaf ADP-glucose Pyrophosphorylase,” The Journal of Biological Chemistry 263(2): 633-637 (1988); B. Muller-Rober et al., “One of two Different ADP-Glucose Pyrophosphorylase Genes from Potato Responds

Strongly to Elevated Leveis of Sucrose,” Mol. Gen. Genet., 224: 136-146 (1990); P. Nakata et al., “Comparison of the Primary Sequences of Two Potato Tuber ADP-Glucose Pyrophosphorylase Subunits,” Plant Molecular Biology 17: 1089-1093 (1991); T. Okita et al., “The Subunit Structure of Potato Tuber ADPglucose Pyrophosphorylase,” Plant Physiol. 93: 785-790 (1990); M. Olive et al., “Isolation and Nucleotide Sequences of cDNA Clones

Encoding ADP-Glucose Pyrophosphorylase Polypeptides from Wheat Leaf and Endosperm,” Plant Molecular Biology 12: 525-538 (1989); B. Keith et al., “Monocot and Dicot Pre-mRNAs are Processed with Different Efficiencies in Transgenic Tobacco,” EMBO J. 5(10): 2419-2425 (1986); e Z.

Kiss-Laszlo et al., “Splicing of Cauliflower Mosaic Virus 35S RNA is Essential for Viral Infectivity,” EMJO J. 14(14): 3552-3562 (1995).

Fontes de Ingredientes, Materiais e Equipamento

Todos os ingredientes, materiais e equipamento que são utilizados nos exemplos, e no geral utilizados nos métodos da invenção, são comercialmente disponíveis de fontes que são conhecidas por aqueles tendo habilidade comum na técnica, tais como Abbott e Cobb, Inc. (Trevose, PA), a Maize Stock Center (Urbana/Champaign, IL), STA Laboratories (Longmont, CO), GenBank (Betesda, MD), The Maize Genetics and Genomics Database, the American Tissue Culture Collection (ATCC) (Rockville, MD), Applied Biosystems (Foster City, CA), Response Genetics, Inc. (Los Angeles, CA), Transgenomic (Omaha, NE), DiaPharma Group, Inc. (West Chester, OH), Biomol GmbH (Hamburg, Alemanha), DxS Ltd. (Manchester, UK), Invitrogen (Carlsbad, CA), Syngenta Seeds, Inc. (Stanton, MN), Rogers (Wilmington, DE), Monsanto Corporation (St. Louis, MO), Garst Seed Company (Slater, IA), Holden Foundation Seed (Williamsburg, IA), The University of Florida (Gamesville, FL), Life Technologies (Gaithersburg, MD), Alpha Innotech Corporation (San Leandro, CA), Amersham International PLC (Arlington Heights, IL), and Molecular Dynalics (Sunnyvalle, CA). Por exemplo, a Applied Biosystems vende intemacionalmente via seu sítio na web (applied biosystems dot com) e de outro modo uma ampla variedade de produtos diferentes e software de computador para conduzir o sequenciamento de DNA, síntese de DNA (por ligação, Eletroforese Capilar ou seus semelhantes), modificação e rotulação de DNA e RNA, purificação de DNA e RNA, expressão de gene, genotipagem, PCR, síntese de peptídeo, sequenciamento de proteína, transcrição, tradução, vários ensaios, e seus semelhantes, tais como vetores de expressão, sondas, iniciadores, que podem ser facilmente utilizados por aqueles tendo habilidade comum na técnica para realizar a presente invenção.

Os seguintes exemplos descrevem e ilustram os métodos da presente invenção. Estes exemplos são intencionados a serem meramente ilustrativos da presente invenção, e não seus limitantes no escopo ou espírito. Aqueles de habilidade comum na técnica facilmente entenderão que variações de certas das condições e/ou etapas utilizadas nos procedimentos descritos nos exemplos podem ser utilizados. Embora estes experimentos tenham sido realizados usando grãos e plantas de milho doce, os mesmos procedimentos que são aí descritos podem ser utilizados com outras sementes de planta e plantas, por exemplo, aquelas que são aqui descritas em outro lugar.

As tabelas abaixo resumem diferentes linhagens NIL precursoras de milho doce e variedades híbridas de milho doce, e suas várias características (aludidas nos Exemplos como as “Tabelas de Características”), que foram preparadas nos vários exemplos que são apresentados abaixo, e que foram determinadas designações particulares, que incluem várias combinações alélicas recessivas homozigotas únicas, duplas ou triplas dos genes mutantes sugary (su), sugary enhancer-1 (se) e shrunken-2 (sh2) utilizados nas linhagens precursoras masculinas, com todos os híbridos que incluem o gene sh2-i em seus genomas. Nestas tabelas, “in.” refere-se a polegadas e “N°” refere-se ao número.

Os depósitos de semente feitos com a American Type Culture

Collection (ATCC) são descritos em duas seções separadas da seção de “Exemplos” do pedido, com alguns (que dizem respeito aos Exemplos de 1 a

5) sendo debatidos no final do Exemplo 5 e outros (que dizem respeito aos

Exemplos de 6 a 8) sendo debatidos no final do Exemplo 8.
Número do	Precursor ou Híbrido	Designação	Combinação Alélica	Uso de Marcadores
Exemplo				Moleculares
2	Híbrido	ACX SS 7501Y	sul sul sei sei sh2sh2-i	Sim
	Precursor (Masculino)	AC 199Y	sul sul sei sei sh2-i sh2-i	Sim
	Precursor (Feminino)	AC 195Y	sul sul sei sei sh2sh2	Sim
3	Híbrido	ACX SS 7078Y	sulsul selsel sh2sh2-i	Sim
	Precursor (Masculino)	AC 199Y	sulsul selsel sh2-i sh2-i	Sim
	Precursor (Feminino)	AC 128Y	sulsul selsel sh2sh2	Sim
3	Híbrido	ACX SS 7403RY	sulsul selsel sh2sh2-i	Sim
	Precursor (Masculino)	AC 199Y	sulsul selsel sh2-i sh2-i	Sim
	Precursor (Feminino)	AC215Y	sulsul selsel sh2sh2	Sim
4	Híbrido	AC 151Y	Sulsul Selsel sh2sh2-i	Não

100

Número do	Precursor ou Híbrido	Designação	Combinação Alélica	Uso de Marcadores
Exemplo	Precursor (Masculino)	AC 103Y	SulSul Sei Sei sh2-i sh2-i	Moleculares Não
	Precursor (Feminino)	AC107Y	sulsul selsel sh2sh2	Não
4	Híbrido	AC 188W	Sulsul Sei Sei sh2sh2-i	Não
	Precursor (Masculino)	AC 106 W	SulSul SelSel sh2-i sh2-i	Não
	Precursor (Feminino)	AC163W	sulsul SelSel sh2sh2	Não
7	Híbrido	ACX SS 1082Y	sh2-i SulSul SelSel sh2sh2-i	Não
	Precursor (Masculino)	AC 157Y-Í	SulSul SelSel sh2-i sh2-i	Não
	Precursor (Feminino)	AC 144Y	SulSul Sei Sei sh2sh2	Não
8	Híbrido	ACR SS 4500Y	Sulsul Selsel sh2sh2-i	Não
	Precursor (Masculino)	AC 098Y-Í	SulSul SelSel sh2-i sh2-i	Não
	Precursor (Feminino)	AC 233Y	sulsul selsel sh2sh2	Não
8	Híbrido	ACR SS 4501Y	Sulsul Sei Sei sh2sh2-i	Não
	Precursor (Masculino)	AC 157Y-Í	SulSul SelSel sh2-i sh2-i	Não
	Precursor (Feminino)	AC 241Y	sulsul SelSel sh2sh2	Não

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102

Tabela de Características (Linhagens Híbridas de Milho Doce)

	ACX SS 7501Y	ACX SS 7078Y	ACX SS 7403 RY	ACX SS 4500Y	ACXSS 4501Y	ACX SS 1082Y
Maturidade	76 Dias	78 Dias	75 Dias	77 Dias	78 Dias	79 Dias
Altura	72 in.	80 in.	84 in.	77 in.	73 in.	84 in.
N² de brotos	1,5	0,8	1,5	1,5	1,0	1,0
Cor da Gluma	Verde	Verde	Verde	Verde	Verde	Verde
Laterais de franja	18	14	12	24	28	22
Comprimento da espiga	8,0 in.	8,25 in.	8,25 in.	8,25 in.	8,5 in.	8,5 in.
Diâmetro da espiga	1,8 in.	2,0 in.	1,9 in.	1,8 in.	2,1 in.	1,78 in.
Formato da espiga	Cilíndrico	Cilíndrico	Cilíndrico	Cilíndrico	Cilíndrico	Cilíndrico
Profundidade do Grão	9 mm	12 mm	10 mm	9 mm	11 mm	10 mm
N^fi de grãos nas fileiras	16	16-18	16-18	16-18	16-18-20	16-18
Cor do grão	Amarela	Amarela	Amarela	Amarela	Amarela	Amarela

Exemplo 1

Construção de Linhagens Quase Isogênicas Precursoras/Congênitas (NILs) (Combinações alélicas triplas dos Genes Mutantes de Endosperma Sugary (su), Sugary enhancer-1 (Sei) e Shrunken-2 (sh2))

Nos experimentos que são descritos neste exemplo, de modo a tentar resolver o problema de manipular a regulagem de acúmulo de carboidrato, e maciez do pericarpo, nas variedades de milho doce contendo o gene mutante sh2-i, as linhagens quase isogênicas (NILs) precursoras apropriadas foram construídas e testadas, usando métodos que são descritos abaixo e/ou conhecidos por aqueles tendo habilidade comum na técnica, das seguintes combinações de genótipo alélico triplo:

(1) SulSul SelSel sh2sh2 = tipo “superdoce” comercial convencional com qualidade de ingestão padrão (que inclui um alelo mutante de endosperma recessivo homozigota) (2) SulSul sei sei sh2sh2 = tipo “superdoce” comercial convencional com qualidade de ingestão muito boa (que inclui uma combinação alélica mutante de endosperma recessivo homozigota duplo) (3) sulsul sei sei sh2sh2 = tipo comercial limitado exótico com qualidade de ingestão excepcional (que inclui uma combinação alélica

103 mutante de endosperma recessivo homozigota tripla)

Construção de NILs Precursoras

A STA Laboratories (Longmont, CO) ajudou fornecendo os serviços moleculares envolvidos na identificação, e incorporação, de alelos mutantes de milho doce específicos nos genomas de plantas de milho. As bibliotecas de marcador de milho apropriadas comercialmente disponíveis, especificamente, repetições de sequência simples (SSR), foram obtidas para as identificações de traço da STA Laboratories, e originaram de bibliotecas publicadas pela Pioneer Hi-Bred International, Inc. (Johnston, IA), um desenvolvedor e fornecedor de genética vegetal avançada para os fazendeiros no mundo todo. Os marcadores foram todos publicamente disponíveis do sítio da web de genética e genômica do milho milhogdb dot org. Os marcadores que começam com a designação “phi” foram desenvolvidos e liberados para o público pela Pioneer Hi-Bred International, Inc. Aproximadamente 330 marcadores SSR foram testados, primariamente alvejando os sítios cromossômicos genômicos publicados sul, sei e sh2.

As NILs acima foram retro cruzadas e auto polinizadas um número suficiente de vezes em uma maneira conhecidas por aqueles de habilidade comum na técnica para efetuar uma reconstituição adequada dos precursores recorrentes.

Os marcadores moleculares foram utilizados de uma maneira conhecida por aqueles de habilidade comum na técnica para ajudar na identificação dos alelos mutantes sul e sei, em particular. Estes marcadores moleculares foram úteis na identificação genotípica mutante em que a incorporação do gene mutante sh2-i fornece um fenótipo dominante que mascara a expressão dos genes mutantes sul, sei ou sh2.

Especificamente considerado para o uso inicialmente foi a combinação alélica recessiva tripla NIL sul sul sei sei sh2sh2. Esta combinação específica foi escolhida para combinar genes defeituosos em

104 amido que possivelmente poderíam compensar a formação rápida de amido que está associada com a incorporação do gene mutante sh2-i dentro do genoma do milho. O retrocruzamento das NILs recessivas triplas sulsul sei sei sh2sh2 como precursores recorrentes foi depois iniciada usando uma fonte doadora de gene sh2-i fornecida pelo Dr. C. L. Hanna da University of Florida (Gainesville, FL). (O gene mutante sh2-i, e a sua sequência, são mostrados e descritos em detalhes na Patente U.S. N²6.184.438 Bl). Esta fonte doadora foi cruzada em teste com linhagens genéticas apropriadas para determinar a situação dos genes sul e sei. Os resultados do cruzamento de teste confirmaram que a fonte doadora de gene sh2-i teve um genótipo de SulSul SelSel em relação aos genes sugary-1 (sul) e sugary enhancer-1 (sei).

As espigas de milho das populações BC1-S1 foram fenotipicamente examinadas (BC1-S1 é uma população de reprodução A&C, fo e o termo “BC1-S1” é uma palavra genética ou do criador de planta para ponto no tempo com respeito ao progresso do produto final. O produto final neste exemplo é uma reconstrução do precursor recorrente em que o alelo mutante sh2-i deva ser adicionado). Apenas aquelas espigas BC1-S1 que segregam os tipos sul, sh2 e sh2-i de grãos foram selecionadas para a continuação do retro cruzamento. A aparência do grão de milho doce morfológico sh2sh2 mutante é distinto de outras variedades do milho doce em que as sementes secas (grãos) parecem ser translúcidos, altamente colapsados, e enrugados. Os fenótipos de grão de milho doce sh2-i mutantes, ao contrário, são lisos, mais pesados, bem cheios e quase como aquele do milho do campo flint na aparência (tendo grãos redondos com coberturas lisas). Os fenótipos de grão foram confirmados com marcadores moleculares, como é aqui debatido em outro lugar, e como é mostrado na FIG. 10. A limitação de apenas dois fenótipos em espigas selecionadas BC2-S1 resultou na verificação de que os grãos que expressam o gene sh2-i foram produzidos por

105 meio de mergulhia em um fundo genético sul sul sh2sh2.

Grãos dos fenótipos sh2-i selecionados em BC1-S1 acima (grãos de conversão de sh2-i puros de NIL sul sul sei sei sh2sh2) foram depois plantados e cruzados em teste para puros sei sei geneticamente confirmados. As confirmações de marcador molecular genético foram conduzidas concomitantemente. Apenas as plantas que exibem cruzamento de teste sei homozigota positivo e confirmações moleculares de sei foram mantidas para retrocruzamento continuado, auto-polinização e cruzamento de teste. O retrocruzamento, auto-polinização e cruzamento de teste, e confirmações moleculares, foram continuadas através de seis ciclos. Neste ponto, foi considerado que as NILs sul sul sei sei sh2sh2 alélicas triplas originais foram adequadamente convertidas com a inclusão do gene mutante sh2-i nos seus genomas. Estas espigas de milho fenotípica e molecularmente confirmadas resultaram em grãos sh2-i sendo produzidos por meio de mergulhia em fundos genéticos sulsul selsel. O fenótipo de grão resultante foi predominantemente similar a aquele de grãos que expressam o gene sh2-i em aparência, com os grãos sendo macios, cheios, e relativamente pesados na aparência.

Teste de Germinação e Quente e Fria de Laboratório e Teste de Gosto Qrganoléptico

As germinações em toalha quente e solo frio de laboratório foram conduzidas usando métodos conhecidos por aqueles tendo habilidade comum na técnica nos grãos de conversão de sh2-i puros de NIL sulsul selsel sh2sh2 para verificar desempenhos de muda intensificados que são associados com o gene mutante sh2-i (e o doador de sh2-i). O teste de solo de campo frio real foi conduzido, também, para verificação adicional de germinação e vigor de muda intensificados. As germinações de toalha quente e solo frio de laboratório foram conduzidas a 45°F (7,22°C) e 80°F (26,67°C), respectivamente. Os níveis de umidade foram medidos de acordo com as

106 recomendações publicadas para os protocolos de teste de germinação da Association of Official Seed Analysts, Inc. (AOSA) (Ithaca, NY). Os grãos de milho doce foram plantados em uma maneira convencional conhecida por aqueles tendo habilidade comum na técnica usando bandejas plásticas de germinação certificadas sancionadas pela AOSA. Em alguns destes testes, em particular, uma linhagem de milho doce precursora feminina designada como AC 199Y (debatida nos Exemplos 2 e 3), tendo o gene mutante sh2-i incorporado no seu genoma, foi testada contra a sua contraparte isogênica, que não incluiu o gene sh2-i no seu genoma.

O teste de gosto organoléptico dos grãos de NIL sulsul selsel sh2sh2 em comparação com os grãos da sua contraparte sh2-i (grãos de conversão de sh2-i puros de NIL sulsul selsel sh2sh2) foi conduzido usando métodos conhecidos por aqueles tendo habilidade comum na técnica, e muito vantajosamente resultou em elevações apenas leves na síntese de amido, que não foram consideradas serem significantes. O teste organoléptico foi conduzido por um painel de gosto de equipe experiente de pessoal (5 a 8 indivíduos) utilizados pela Abbott & Cobb, Inc. (Trevose, PA). No geral, seis espigas de milho por item foram selecionadas de três réplicas cada para qualquer sítio de plantação particular. As espigas de milho de teste foram mantidas nas temperaturas ambiente (variando de cerca de 80 a 88°F ou 26,66 a 31,11°C). as linhagens dos materiais de teste foram ocultadas dos participantes do painel de gosto para reduzir qualquer tendência ou predisposição de gosto por varietais.

A germinação e viabilidade de semente podem ser determinadas por meio de empreendimentos de laboratório universitários ou comerciais selecionados bem conhecidos que estão de acordo com as regras da Association of Official Seed Analysis (AOSA) quanto aos protocolos de teste de genninação, tais como STA Laboratories (Longmont, CO), Midwest Laboratories (Omaha, NE), Biogenetic Services Inc. (Brookings, SD) e

107 outros.

Association of Offícial Seed Analysts, Inc. (AOSA): Protocolos de Teste de Semente

Como é bem conhecido por aqueles tendo habilidade comum na técnica, os protocolos de teste de semente da Association of Offícial Seed Analysts, Inc. (AOSA) (Ithaca, NY), uma organização de laboratórios membros, serve universalmente como o padrão para germinação de semente, vigor de muda, gosto organoléptico de grão e maciez do pericarpo e outros testes de semente e planta. Os membros desta organização incluem estado oficial, federal, universidade e outros laboratórios de semente por todo os Estados Unidos e Canadá. Para garantir um alto padrão de qualidade, muitos membros dos laboratórios membros da AOSA adquiriram o status de Analista de Semente Certificado pela AOSA através de treinamento extensivo seguido por um processo de teste de certificação obrigatória.

As funções primárias da AOSA são: (i) estabelecer as Regras para Teste de Sementes da AOSA que são no geral adotadas pela maioria dos estados dos Estados Unidos como as regras para testar sementes em seus respectivos estados; (ii) contribuir para o refinamento e modificação das regras e procedimentos para o teste de semente; (iii) garantir que os procedimentos de teste de semente sejam padronizados entre os analistas e entre laboratórios; e (iv) influenciar e ajudar na aplicação de legislação de semente apropriadas aos níveis estadual e federal.

O sítio da web na internet oficial da AOSA (aosaseed dot com) fornece links da Internet diretos para vários outros sítios da web na internet oficiais que dizem respeito às sementes e/ou plantas, que incluem aqueles para o United States Department of Agriculture (USDA) Seed Regulatory and Testing Programs, a Association of American Seed Control Officials (AASCO), a Association of Offícial Seed Certifying Agencies (AOSCA), the American Seed Trade Association (ASTA), a Canadian Food Inspection

108

Agency (CFIA), a Commercial Seed Analysts Association of Canada (CSAAC), a National Association of State Departments of Agriculture (NASDA), a Front Range Seed Analysis, a International Seed Testing Association (ISTA), Seed Quest Seedlmages dot com e a Society of Commercial Seed Technologists (SCST). O sítio da web na Internet da AOSA oficial também inclui um sítio da web de produto e venda extensivo, que inclui produtos direcionados para o software de computador de análise de semente, produtos de DNA, marcadores, reagentes, sequenciamento, Western blots e seus semelhantes.

Os livros textos da AOSA e as regras com respeito a uma variedade de tópicos diferentes, que incluem suas regras de 2009 para testar sementes, um livro texto sobre vigor de semente, um livro texto sobre umidade de semente, e um jornal de tecnologia de semente, são publicamente disponíveis para download em computador e/ou leitura a partir do seu sítio da web na Internet oficial em aosaseed.com. Por exemplo, o livro texto de Teste do Vigor de Semente AOSA é uma revisão compreensiva das suas versões de 1983 e 2002 que apresentam o padrão da indústria para o teste de vigor da semente. Além disso, o Seed Technology Journal, que também está disponível no sítio da web na Internet seedtechnology dot net é um jornal internacional contendo documentos científicos e tecnológicos em todas as áreas de ciência e tecnologia de semente. A ênfase neste jornal está na pesquisa aplicada e básica na fisiologia, patologia e biologia de semente que pode dizer respeito ao desenvolvimento, maturação, germinação, dormência e deterioração de semente. Estudos sobre a produção, amostragem, teste, condicionamento, distribuição e armazenagem de semente também são incluídos. As comunicações curtas de analistas de semente e tecnologistas são encorajados e publicados como Seed Tech Notes. Estas notas incluem novas técnicas, padronização de testes de laboratório e documentação de observações anatômicas e patológicas de semente e desenvolvimento de muda. O jornal

109 também inclui artigos revisados atuais em todas as áreas da tecnologia de semente que possam dizer respeito diretamente à indústria de semente.

Mapa Molecular de Amostras de NILs Precursoras Congênitas tendo Várias Combinações Alélicas de Endosperma Mutante Triplo (FIG. 10)

A FIG. 10 fornece um mapa molecular para amostras de NILs precursoras puras individuais tendo as combinações alélicas de endosperma mutante triplo mostradas abaixo. Neste mapa molecular:

• As amostras 1 e 2 (017 e 044, respectivamente) são geneticamente: Sul Sul Sei Sei sh2sh2 (que inclui um único alelo homozigota recessivo de endosperma mutante).

• As amostras de 3 a 7 (006, 007, 009, 047 e 637, respectivamente) são geneticamente: Sul Sul sei sei sh2sh2 (que inclui uma combinação alélica de endosperma mutante homozigota recessiva dupla).

• As amostras de 8 a 13 (001, 046, 048, 049, 109 e 354, respectivamente) são geneticamente: sul sul sei sei sh2sh2 (que inclui uma combinação alélica de endosperma mutante homozigota recessiva tripla).

• A amostra 14 é a fonte doadora para o gene mutante sh2-i (recebido da The University of Florida, Gainesville, FL).

São salientados na FIG. 10 as regiões cromossômicas supostas caracterizadas como os sítios Sei, Sul e Sh2. Numerosos marcadores moleculares foram úteis na identificação genotípica. Em particular, o marcador molecular designado como “ume 1551” foi eficaz nas caracterizações sei sei, e o marcador molecular designado como “phi 079” foi similarmente útil na fabricação de identificações sul sul. Numerosos outros marcadores moleculares que são mostrados na FIG. 10 foram úteis isoladamente, ou em combinação, na fabricação de atribuições auxiliadas por marcador.

110

Exemplo 2

Produção usando Marcadores moleculares, e um Fundo genético sei sei/sul sul, e Testando Híbridos do milho doce ACX SS 7501Y (Precursores Femininos sh2-i em combinação com Precursores Masculinos tendo Combinações Alélicas Recessivas Triplas)

Nos experimentos que são descritos neste exemplo, a NIL híbrida de milho doce designada como ACX SS 7501Y tendo uma combinação alélica tripla desejada foi desenvolvida utilizando o gene sh2-i, as

NILs de milho doce precursoras tendo as designações mostradas abaixo e marcadores moleculares, e depois testados na maneira descrita abaixo.

sul sul sei sei sh2-i sh2-i (Linhagem precursora feminina) (puro de conversão de sh2-i) sul sul sei sei sh2sh2 (Linhagem precursora masculina) (NIL pura “superdoce” que inclui uma combinação alélica recessiva tripla e que não inclui um gene sh2-i)

AC 195Y

AC 199Y

ACXSS 7501Y (Híbridos de milho doce Sh2-i tendo uma Combinação alélica tripla desejada)

Construção de Ehbridos ACX SS 7501Y

O gene mutante sh2-i foi incorporado em uma série de linhagens de milho doce de NIL precursora pura selecionadas na maneira que é debatida no Exemplo 1. Estas linhagens de milho doce NIL pura precursora foram escolhidas com base em critérios de produção horticultural e de semente desejáveis, como é debatido no Exemplo 1 e aqui em outro lugar.

O mesmo foi descoberto através de uma quantidade significante de experimentação e gosto organoléptico e maciez do pericarpo testando de vários híbridos de milho doce diferentes produzidos usando uma linhagem precursora feminina e uma linhagem precursora masculina que incluíram ambas o gene sh2-i no seu genoma que a síntese de amido inaceitável e a formação que segue o estágio de ingestão de pico do qual resultam híbridos desenvolvidos a partir destas linhagens (produzir um gosto rico em amido e grãos de milho doce que não foram macios) reprovou o

111 processo de montar híbridos com base no uso de duas linhagens de milho precursoras sh2-i. A melhor alternativa foi determinada por esta experimentação e teste como sendo a geração de híbridos compreendidos de:

(i) uma linhagem de milho doce pura de conversão de sh2-i feminino; e (ii) uma linhagem de milho doce precursora masculina convencional de alta qualidade.

Em vista dos resultados da experimentação descrita acima e teste de gosto organoléptico e maciez do pericarpo, o inventor decidiu usar apenas o alelo sh2-i mutante nas linhagens precursoras de milho doce femininas (isto é, que as linhagens de milho doce puras de conversão de sh2-i podem ser usadas apenas como as linhagens precursoras femininas, e não como as linhagens precursoras masculinas, na produção de milho comercial. Esta decisão foi com base em vários fatores, que incluem aqueles debatidos acima. Um tal fator para o uso dos precursores de conversão sh2-i como fêmeas foi com base no fato de que o pericarpo do grão e o revestimento de semente resultante é 2N e matemalmente herdados. A utilização dos precursores de conversão sh2-i como precursores femininos, assim, preserva as características de germinação e vigor de muda muito vantajosas intensificadas fornecidas pelo gene sh2-i, e expressado como uma função da linhagem precursora feminina. Além disso, rendimentos de produção de semente comercial parecem ser enormemente intensificados como um artefato dos traços de germinação e vigor de muda superiores fornecidos aos híbridos de milho doce pelas linhagens precursoras de semente feminina sh2-i. As linhagens de milho doce precursoras femininas puras de conversão de sh2-i foram determinadas para fornecer híbridos desenvolvidos com as mesmas com os traços benéficos múltiplos de ter uma germinação intensificada, um vigor de muda intensificado e um rendimento de produção de semente comercial intensificado.

Em vista do acima, os genótipos das linhagens precursoras

112 masculinas selecionadas para o uso em combinações híbridas com as linhagens femininas de conversão de sh2-i foram escolhidos com base na sua capacidade para fornecer qualidades horticulturais desejáveis aos híbridos de milho doce produzidos usando tais linhagens, mas primariamente pela sua contribuição para produzir híbridos de milho doce tendo uma alta qualidade de ingestão, tal como um gosto doce e um pericarpo de grão macio. Assim, genótipos precursores masculinos foram utilizados que contiveram a combinação alélica de endosperma mutante homozigota recessiva tripla sulsul sei sei sh2sh2. As linhagens homozigotas recessivas triplas sulsul sei sei sh2sh2 no geral tendem a ser proporcionalmente mais altas em sacarose quando comparadas com as linhagens de endosperma mutantes homozigotas recessivas duplas similares, tais como sulsul sei sei sh2sh2 ou sulsul sh2sh2, e assim foram determinadas serem mais desejáveis para o uso como as linhagens precursoras masculinas para produzir híbridos nas maneiras que são aqui descritas. (W. F. Tracy, A. R. Hellaurer (ED) Specialty Coms, 147-187 (CRS Press, Boca Raton, Florida (1994)). (Os genótipos sulsul sh2sh2 homozigotas recessivos duplos, entretanto, que incluem sulsul sei sei sh2sh2, assim como os genótipos homozigotas recessivos triplos sulsul sei sei sh2sh2, que são característicos das linhagens precursoras de milho doce masculinas que são aqui descritas, também são desejáveis para o uso na produção de híbridos do milho doce em que eles são excepcionalmente altos em açúcar com pericarpos de grão muito macios. Os componentes genotípicos homozigotas recessivos sulsul sh2sh2 (isto é, os alelos de endosperma mutante sulsul e sh2sh2 homozigotas recessivos duplos presentes em ambas as combinações alélicas mutantes de endosperma homozigota recessivo dupla e tripla acima) de todas estas linhagens precursoras de milho doce masculinas fornecem capacidades de contenção significantes (retenção de açúcares mais alta e pericarpos de grão macios) em combinação híbrida com as linhagens de milho doce de conversão de sh2-i

113 femininas que são aqui descritas (isto é, os híbridos resultantes incluem estes traços)).

Um híbrido de milho resultante contendo o gene sh2-i de interesse particular foi designado como híbrido ACX SS 7501Y. Esta linhagem híbrida diferiu em uma maneira benéfica de outros híbridos preparados neste exemplo em desempenho relativo às regiões de crescimento geográficos e/ou exigências de mercado, e as suas características são descritas em detalhes na Tabela de Características (linhagens de milho doce híbridas) que é apresentada acima antes do Exemplo 1. A Tabela de Características (Linhagens de milho doce precursoras) descreve as características em detalhes das linhagens de milho doce precursoras que foram utilizadas para desenvolver esta linhagem híbrida.

Teste de Germinação Quente e Fria de Laboratório e Teste de Gosto Organoléptico e Teste de Maciez de Pericarpo

A avaliação organoléptica dos híbridos do milho doce que foram montados na maneira acima, que inclui híbridos ACX SS 7501Y, foi determinada usando métodos que são conhecidos por aqueles de habilidade comum na técnica, como é debatido em maiores detalhes no Exemplo 1. Tais híbridos foram mostrados fornecer benefícios significantes para cultivadores de milho em que a germinação, vigor de muda, e produtividade de colheita global foi elevada em comparação com o mesmo ou variedades similares de milho doce que não incluem o gene sh2-i em seus genomas. Adicionalmente, consumidores destes produtos de híbridos de milho doce recebem benefícios valiosos com respeito à qualidade de ingestão do produto (gosto doce e maciez do pericarpo do grão) e vida de prateleira prolongada.

A FIG. 7 ilustra as contagens de doçura (açúcar) organoléptica comparativa entre três variedades de milho doce em um período de sete dias diretamente a seguir do estágio de ingestão de pico. A variedade comercial Passion é vendida e distribuída através da Monsanto (St. Louis, MO). A

114 variedade comercial Beyond é vendida e distribuída pela Abbott e Cobb, Inc. (Trevose, PA), e tem servido como um padrão, primariamente nos mercados de remessa comercial do sudeste. A variedade designada como ACX SS 7501Y é uma variedade híbrida que foi produzida de acordo com os Exemplos 1 e 2 usando uma linhagem precursora feminina designada como AC 199Y e uma linhagem precursora masculina designada como AC 195Y. As contagens de doçura organoléptica (açúcar) variam de 1 (muito pouco doçura com um gosto de amido considerável) a 10 (doce com pouco ou nenhum gosto de amido). A FIG. 7 mostra que a variedade de milho híbrido ACX SS 7501 Y muito vantajosamente manteve uma contagem de doçura organoléptica acima tanto as variedades de milho Passion e Beyond em todas as vezes durante este período de 7 dias e, em contraste com as variedades de milho Passion e Beyond, mantiveram uma contagem de 10 nos Dias 1 e 2 decorrido o estágio de alimentação primário. A FIG. 7 também mostra que a variedade de milho híbrido ACX SS 7501Y teve uma contagem de doçura organoléptica de quase 8 no Dia 7 (em comparação com uma contagem de cerca de 5 para Passion, e uma contagem de cerca de 3 para Beyond). Acima do sétimo dia do período de teste, a variedade de milho híbrido ACX SS 7501 Y reteve, e manteve, níveis de doçura muito altos comparados com as variedades de comparação de Passion e Beyond.

A FIG. 8 mostra as contagens organolépticas e de maciez de pericarpo comparativas entre as mesmas três variedades de milho doce que são mostradas na FIG. 7 em um período de sete dias diretamente a seguir do estágio de ingestão de pico. As contagens organolépticas e de maciez de pericarpo variam de 1 (pericarpo muito duro) a 10 (pericarpo muito macio).

A FIG. 8 mostra que a variedade de milho híbrido ACX SS 7501Y muito vantajosamente manteve uma contagem organoléptica e de maciez de pericarpo acima de ambas as variedades de milho Passion e Beyond em todos os tempos durante este período de 7 dias. A mesma também

115 mostra que a variedade de milho híbrido ACX SS 7501Y teve uma contagem organoléptica e de maciez de pericarpo de cerca de 7 no Dia 7 (em comparação com uma contagem de cerca de 5 para Passion, e uma contagem de cerca de 2 para Beyond). Acima do período de teste de sete dias, a variedade de milho híbrido ACX SS 7501Y reteve, e manteve, níveis de maciez do pericarpo muito altos comparado com as variedades de comparação de Passion e Beyond. A variedade de milho híbrido ACX SS 7501 Y foi observada ser muito mais macia, e ter uma excelente capacidade de contenção. Esta linhagem híbrida diferiu em uma maneira benéfica dos outros híbridos preparados neste exemplo em desempenho relativo às regiões de crescimento geográfico e/ou exigências de mercado, e as suas características são descritas em detalhes na Tabela de Característica (Linhagens de Milho Doce Híbridas) que é apresentada acima antes do Exemplo 1.

Exemplo 3

Produção Usando Marcadores Moleculares, e um Fundo Genético selsel/sulsul, e Teste dos Híbridos ACX SS 7078Y e ACX SS 7403RY do milho doce (Precursores Femininos sh2-i em combinação com Precursores

Masculinos tendo Combinações Alélicas Recessivas Triplas)

Nos experimentos que são descritos neste exemplo, NIFs híbridas de milho doce adicionais tendo combinações alélicas triplas desejadas foram desenvolvidas utilizando o gene sh2-i e marcadores moleculares, e depois testadas na maneira descrita abaixo.

Construção de Híbridos ACX SS 7078Y e ACX SS 7403RY

Os híbridos de milho doce adicionais foram montados de acordo com os mesmos procedimentos de reprodução que são descritos nos Exemplos 1 e 2 para híbridos do milho doce ACX SS 7501 Y. Estas variedades de milho doce foram montadas reproduzindo-se por megulhia o gene sh2-i em fundos genéticos selsel e sulsul utilizando marcadores moleculares, como foi aqui anteriormente descrito.

116

Dois híbridos do que milho doce sh2-i resultantes de interesse particular foram designados como ACX SS 7078Y e ACX SS 7403RY, e foram desenvolvidos usando as NILs de milho doce precursoras tendo as designações mostradas abaixo. Estas linhagens híbridas diferiram em uma maneira benéfica de outros híbridos preparados neste exemplo no desempenho relativo às regiões geográficas de crescimento e/ou exigências de mercado, e suas características são descritas em detalhes na Tabela de Características (linhagens de Milho Doce Híbridas) que é apresentada acima antes do Exemplo 1. A Tabela de Características (Linhagens de Milho Doce

Precursoras) descreve as características em detalhes das linhagens de milho doce precursoras que foram utilizadas para desenvolver estas linhagens híbridas.

ACX SS 7078Y sul sul sei sei sh2-i sh2-i (Linhagem precursora feminina) (puro de conversão de sh2-i)

AC 199Y sul sul sei sei sh2sh2 (Linhagem precursora masculina) (NIL puro “superdoce” que inclui uma combinação alélica recessiva tripla e que não inclui um gene sh2-i)

AC 128Y

ACX SS 7078Y (Híbridos de Milho Doce Sh2-i tendo uma Combinação Alélica Tripla Desejada) ACX SS 7403RY sul sul sei sei sh2-i sh2-i (Linhagem precursora feminina) (puro de conversão de sh2-i)

AC 199Y sul sul sei sei sh2sh2 (Linhagem precursora masculina) (NIL pura “superdoce” que inclui uma combinação alélica recessiva tripla e que não inclui um gene sh2-i) AC215Y

ACX SS 7403RY (Híbridos tendo uma Combinação Alélica Tripla Desejada)

Híbridos de milho doce ACX SS 7078Y, que tem o alelo mutante sh2-i incorporado no seu genoma, é uma conversão isogênica dos híbridos comercialmente disponíveis da Abbott e Cobb, Inc. designados ACX 1073Y, que não têm o alelo mutante sh2-i incorporado no seu genoma. Similarmente, os híbridos do milho doce ACX SS 7403RY, que tem o alelo

117 mutante sh2-i incorporado no seu genoma, é uma conversão isogênica da variedade comercialmente disponível da Abbott e Cobb, Inc. designada ACX 7473RY, que também não tem o alelo mutante sh2-i incorporado no seu genoma. Em ambos os genes sh2-i contendo desenvolvimentos híbridos, estes dois híbridos de milho doce isogênicos foram descobertos ser quase idênticos para todas as características horticulturais e morfológicas, foram identificados usando métodos que são aqui descritos e/ou são conhecidos por aqueles tendo habilidade comum na técnica. Os métodos de identificação e caracterização diferencial de comparações isogênicas e nomenclatura são bem conhecidos por aqueles tendo habilidade comum na reprodução de planta e artes similares, assim como nas comunidades científicas no geral.

Teste de Germinação Quente e Fria De Laboratório e Teste Organoléptico de Gosto e Maciez de Pericarpo

A Tabela 3 abaixo fornece dados que resultam das comparações reais de dados de germinação quente e fria de laboratório, assim como testes organolépticos de gosto e maciez do pericarpo, para as variedades de milho doce ACX 1073Y, ACX SS 7078Y, ACX 7473RY e ACX SS 7403RY. Os dados de germinação refletem a média de três réplicas de 100 grãos cada, e as contagens de germinação não seguidas pela mesma letra são significantemente diferentes ao nível de probabilidade de 0,05 via o Teste de Faixa Múltipla Nova de Duncan. Na Tabela 3 (e em outras tabelas que são aqui apresentadas), as designações “a” e “b” indicam que os valores médios são significantemente diferentes ao nível de probabilidade de 0,05. (O mesmo é verdadeiro de uma designação “c” que aparece em outras tabelas aqui apresentadas). Os testes organolépticos com respeito a doçura e maciez do pericarpo são aqui anterionnente descritos.

A Tabela 3 mostra que, em ambos os casos em que o gene mutante sh2-i foi adicionado aos genomas de milho doce (híbridos ACX SS 7078Y e ACX SS 7403RY), as contagens quente e fria de laboratório de

118 comparação de híbrido isogênico muito vantajosamente foram elevados em comparação com as contagens das variedades de milho doce comercialmente disponíveis que não incluem o gene mutante sh2-i em seus genomas (ACX 1073 e ACX 7473RY), que é indicativo de emergência e vigor de campo intensificados. A Tabela 3 também mostra que as duas variedades de milho doce que incluem o gene mutante sh2-i em seus genomas (híbridos ACX SS 7078Y e ACX SS 7403RY) muito vantajosamente retiveram a sua doçura (os níveis de açúcar) significantemente mais tempo (tendo contagens de 8 no Dia 7 no período de sete dias imediatamente a seguir do estágio de alimentação primário) do que as duas variedades de milho doce que não incluem este gene sh2-i em seus genomas (tendo contagens de 6 ou 5 no Dia 7), e tiveram pericarpos que retiveram a sua maciez significantemente mais tempo (tendo contagens de 7 no Dia 7 no período de sete dias imediatamente a seguir do estágio de alimentação primário) do que as duas variedades de milho doce que não incluíram este gene sh2-i em seus genomas (tendo contagens de 6 ou 5 no Dia 7). As contagens de doçura e maciez do pericarpo organolépticas que estão presentes na Tabela 3 muito vantajosamente demonstram níveis de qualidade de ingestão aceitáveis junto com capacidades de vida de prateleira e de contenção concomitantemente desejáveis para os híbridos ACX SS 7078Y e ACX SS 7403RY.

Tabela 3

Comparações Isogênicas de Variedades de Milho Doce Incluindo, ou Não

Incluindo, o Gene sh2-i

Contagem de doçura Contagem de Maciez de

Variedade Germinação quente Germinação fria organoléptica Pericarpo Organoléptica

Dia 1 Dia 4 Dia 7 Dia 1 Dia 4 Dia 7

ACX 1073Y	92a	59b	9	8	6	9	8	6
(Não contém o gene sh2-i) ACX SS 7078Y	98a	91a	9	8	8	9	8	7
(Contém o gene sh2-i) ACX 7473RY	91a	62b	9	7	5	8	6	5
(Não contém o gene sh2-i) ACX SS 7403RY	97a	94a	10	8	8	9	7	7

119

Variedade

Contagem de doçura

Germinação quente Germinação fria organoléptica

Dia 1 Dia 4 Dia 7

Contagem de Maciez de Pericarpo Organoléptica Dia 1 Dia 4 Dia 7 (Contém o gene sh2-i)

Exemplo 4

Produção sem o Uso de Marcadores Moleculares, e um Fundo Genético selsel/sulsul e Teste dos Híbridos de Milho Doce AC 151Y e AC 188W (Precursores sh2-i Femininos em combinação com Precursores Masculino tendo Combinações Alélicas Recessivas Duplas ou Triplas)

Nos experimentos que são descritos neste exemplo, NILs híbridas de milho doce adicionais tendo combinações alélicas duplas e triplas foram desenvolvidas utilizando o gene sh2-i, mas sem o uso de marcadores moleculares, e depois testadas na maneira descrita abaixo.

Construção de Híbridos AC 151Y e AC 188W

Estes híbridos de milho doce adicionais foram montados de acordo com os mesmos procedimentos de reprodução que são descritos nos Exemplos 1, 2 e 3, com as exceções de que as linhagens híbridas contendo o gene mutante sh2-i em seus genomas não foram montados utilizando marcadores moleculares, como anteriormente aqui descritos (Exemplos 1, 2 e

3), e não incorporaram alelos selsel /sulsul.

Dois híbridos sh2-i do milho doce resultantes de interesse particular foram designados AC 151 Y e AC 188W, e foram desenvolvidos usando as NILs de milho doce precursoras tendo as designações mostradas abaixo. Estes híbridos foram desenvolvidos a partir das linhagens precursoras de conversão sh2-i femininas não contendo os genes sul e sei para testar a qualidade de ingestão em comparação com puros precursores sh2-i femininos construídos utilizando a incorporação dos genes sul e sei. Também foi considerado importante testar o efeito de usar linhagens masculinas recessivas homozigotas duplas e triplas com as linhagens femininas de conversão de sh2-i que não foram construídas utilizando a reprodução por megulhia sequencial nos genes Sul e Sei.

120

AC 151Y

X sul sul sei sei sh2sh2 (Linhagem precursora masculina) (linhagem “superdoce” pura que utiliza uma combinação alélica recessiva tripla e não incluindo um gene sh2-i) AC107Y

Sul Sul Sei Sei sh2-i sh2-i (Linhagem precursora feminina) (puro de conversão de sh2-i sem reprodução sequencial por megulhia e utilidade dos genes sul e sei)

AC 103Y

AC 151Y (Híbrido sh2-i de Milho Doce Construído com Reprodução por Megulhia Não Sequencial da Linhagem Precursora Feminina, e em combinação com uma Linhagem Precursora Masculina Recessiva Tripla)

AC 106W

AC 188W

X sul sul Sei Sei sh2sh2 (Linhagem precursora masculina) (linhagem “superdoce” puro que utiliza uma combinação alélica recessiva dupla e não incluindo um gene sh2-i)

AC 163W

AC 188W (Híbrido sh2-i de Milho Doce Construído com Reprodução por Megulhia Não Sequencial da Linhagem Precursora Feminina, e em combinação com uma Linhagem Precursora Masculina Recessiva Dupla)

Estas linhagens híbridas diferiram em uma maneira benéfica de outros híbridos preparados neste exemplo em desempenho relativo às regiões geográficas de crescimento e/ou exigências de mercado.

Com ambas as linhagens híbridas AC 151Y e AC 188W, linhagens precursoras femininas foram construídas usando o gene mutante sh2-i não em combinação com os genes sul e/ou sei. A linhagem híbrida AC 151 Y, entretanto, foi desenvolvida usando uma linhagem precursora masculina recessiva tripla, ao passo que a linhagem híbrida AC 188W foi desenvolvida usando uma linhagem precursora masculina recessiva dupla.

A linhagem híbrida AC 151 Y (um puro de conversão de sh2-i que inclui o gene mutante sh2-i no seu genoma) é um gene de conversão isogênico sh2-i de, e comparação com, um híbrido da Abbott e Cobb, Inc. designado como ACR 5132Y (que não inclui o gene mutante sh2-i no seu genoma). A única diferença genética significante entre estas duas linhagens

121 híbridas neste exemplo é a presença do gene mutante sh2-i na linhagem híbrida AC 151 Y e a ausência do gene sh2-i na linhagem híbrida ACR 5132Y.

A linhagem híbrida AC 188W (que inclui o gene mutante sh2-i no seu genoma) é um gene de conversão isogênico sh2-i de, e comparação com, um híbrido Abbott e Cobb, Inc. designado como ACR 5147W (que não inclui o gene mutante sh2-i no seu genoma). Mais uma vez, a única diferença genética significante entre estas duas linhagens híbridas neste exemplo é a presença do gene mutante sh2-i na linhagem híbrida AC 188W e a ausência do gene sh2-i na linhagem híbrida ACR 5147 W.

A Tabela 4 abaixo fornece dados que resultam das comparações reais de dados de germinação quente e fria de laboratório, assim como testes organolépticos de gosto e maciez do pericarpo, para os milho doces AC 151Y, ACR 5132Y, AC 188W e ACR 5147W. As contagens de germinação são médias de três réplicas de 100 grãos cada. As contagens de laboratório não seguidas pelo mesmo número são significantemente diferentes ao nível de probabilidade de 0,05 via o Teste da Faixa Múltipla Nova de Duncan.

Os testes organolépticos com respeito à doçura (teor de açúcar) e maciez do pericarpo são aqui anteriormente descritos.

A Tabela 4 mostra que, em ambos os casos em que o gene mutante sh2-i foi adicionado aos genomas de milho doce (híbridos AC 151 Y e AC 188W), as contagens de comparação quente e fria de laboratório híbridas isogênicas foram elevadas, que é indicativo de emergência e vigor de campo intensificados.

Entretanto, a Tabela 4 também mostra que estas duas variedades de milho doce que incluem o gene mutante sh2-i não retiveram a

122 sua doçura por mais tempo (tendo contagens de 2 e 3 no Dia 7 no período de sete dias imediatamente a seguir do estágio de alimentação primário) em comparação com as duas variedades de milho doce que não incluíram este gene (híbridos ACR 5132Y e ACR 5147W) (tendo contagens de 5 e 7 no Dia

7), e tiveram pericarpos que não retiveram a sua maciez por mais tempo (tendo contagens de 1 e 2 no Dia 7 no período de sete dias imediatamente a seguir do estágio de alimentação primário) em comparação com as duas variedades de milho doce que não incluem este gene (tendo contagens de 3 e 2 no Dia 7). As contagens de doçura e maciez do pericarpo que estão presentes na Tabela 4 sugerem que uma inserção dentro das linhagens puras do gene mutante sh2-i sem uma reprodução por megulhia sequencial contra um fundo genético de sei sei e sul sul, como foi aqui descrito anteriormente, resulta em efeitos menos eficazes e algum efeito nocivo em conexão com a qualidade de ingestão global (doçura e maciez do pericarpo).

Em vista do acima, é considerado ser muito desejável (ou, em alguns casos, como pode facilmente ser determinado por aqueles tendo habilidade comum na técnica, até necessário) para montar e direcionar a construção de materiais de gene mutante sh2-i na maneira que foi aqui anteriormente descrita de modo a obter os benefícios máximos desejados pelos cultivadores e consumidores de planta (isto é, usando marcadores moleculares e um fundo genético selsel e sulsul).

123

Tabela 4

Comparações Isogênicas de Variedades de Milho Doce Incluindo, ou Não

Incluindo, o Gene sh2-i

Variedade	Germinação quente	Germinação fria	Contagem de doçura organoléptica	Contagem de Maciez de Pericarpo Organoléptica
Dia 1	Dia 4	Dia 7	Dia 1	Dia 4	Dia 7
AC 151Y	99a	90a	8	5	2	7	3	1
(Contém o gene sh2-i) ACR5132Y	98a	82b	8	6	5	8	5	3
(Não Contém o gene sh2-i) AC 188W	96a	88b	9	4	3	6	4	2
(Contém gene sh2-i) ACR5147W (Não Contém o gene sh2-i)	88b	47c	10	8	7	9	4	2

Exemplo 5

Comparação de Várias Características Físicas de Etíbridos de Milho Doce

ACX SS 7501Y, ACX SS 7078Y e ACX SS 7403RY (Precursores sh2-i Femininos em Combinação com Precursores Masculinos tendo Combinações Alélicas Recessivas Triplas)

Nos experimentos que são descritos neste exemplo, as características físicas dos híbridos de milho doce ACX SS 7501Y, ACX SS 7078Y e ACX SS 7403RY, todos os quais incluem o gene mutante sh2-i em seus genomas, e muito vantajosamente têm os numerosos e variados benefícios benéficos que são aqui descritos, foram examinadas e comparadas usando métodos que são bem conhecidos por aqueles tendo habilidade comum na técnica. A maior parte das examinações e comparações foram conduzidas usando técnicas convencionais de observação visual, contagem e medição de milho, todos os quais são conhecidos por aqueles tendo habilidade comum na técnica. Os resultados destas examinações e comparações são apresentados na Tabela 5 abaixo. Em cada coluna na Tabela 5, os dados para os híbridos de milho doce ACX SS 7501Y são seguidos pelos dados para o híbrido de milho doce ACX SS 7078Y, que é seguido pelos dados para o híbrido de milho doce ACX SS 7403RY. Na Tabela 5, o termo “Maturidade” refere-se ao número de dias que decorreram do tempo que os híbridos foram

124 plantados até que os mesmos amadureceram. As classificações quanto a resistência à doença foram realizadas pelo Dr. Jerald Pataky na University of Illinois (Urbana-Champaign, IL) usando métodos bem conhecidos em um ambiente patológico de planta independente e controlado.

Tabela 5

Dados Comparativos para Três Híbridos de Milho Doce Incluindo o gene mutante sh2-i

HÍBRIDOS	MATURIDADE	CONTAGEM DE FILEIRAS	COMPRIMENTO DA ESPIGA	FORMA DA ESPIGA
ACX SS 7501Y	76 dias	16	8,0” (20,3 cm)	Cilíndrico
ACX SS 7078Y	78 dias	16 a 18	8,25” (21,0 cm)	Cilíndrico
ACX SS 7403RY	75 dias	16al8	8,25” (21,0 cm)	Cilíndrico

Tabela 5 (Continuação)

EMPACOTAMENTO	DA	COR DO GRÃO	TAMANHO DA	RESISTÊNCIA À DOENÇA
ESPIGA			PLANTA
Cor das penugens,	casca	Amarelo	Médio	Resistência intermediária à ferrugem das
excelente				folhas do milho setentrional e ferrugem
				comum
Cor e comprimento da muito boas	casca	Amarelo	Médio/alto	Nenhuma reivindicada
Casca e penugens	verde	Amarelo	Médio	Resistência intermediária à ferrugem das
escuras				folhas do milho setentrional, resistência às raças múltiplas de ferrugem comum
		DEPÓSITOS

(Depósitos feitos com a American Type Culture Collection (ATCC) em

Conexão com os Exemplos de 1 a 5)

Os depósitos de semente debatidos abaixo, que dizem respeito aos Exemplos 1 a 5, foram feitos com a American Type Culture Collection (ATCC) (Manassas, VA, USA) pelo Requerente Bryant J. Long em nome do cessionário Abbott & Cobb, Inc. (Wellington, FL) para os híbridos de milho doce Zea mays, identificados abaixo tendo combinações alélicas triplas desejadas, que cada um inclui o gene sh2-i em seus genomas, e as linhagens de precursor de milho doce Zea mays, correspondentes que foram utilizadas para desenvolver estes híbridos de milho doce. Nas tabelas mostradas abaixo, em conexão com os genes sugary (sul), sugary enhancer-1 (sei) e shrunken-2 (sh2), a designação “D” indica que a linhagem precursora masculina incluiu uma combinação alélica recessiva dupla destes três genes, e a designação “T” indica que a linhagem precursora masculina incluiu uma combinação alélica

125 recessiva tripla destes três genes.

Exemplo Depósito Combinação

Híbridos_Linhagens Precursoras_N^e_Feito Alélica

ACX SS 7501Y AC 199Y (Feminino) X AC 195 Y (Masculino) 2

ACX SS 7078Y AC 199Y (Feminino) X AC 128Y (Masculino) 3

ACX SS 7403RY AC 199Y (Feminino) X AC 215Y (Masculino) 3

AC 151Y AC 103Y (Feminino) X AC 107Y (Masculino) 4

AC 188 W AC 106W (Feminino) X AC 163W (Masculino) 4

Sim*

Não

T

D * Todas as três linhagens (os dois precursores e o híbrido identificado) foram depositadas.

Referência de Identificação usada pelo

Depositante/ Inventor (1) Milho Doce, Zea mays: ACX SS 7501Y (2) Milho Doce, Zea mays: ACX SS 7078Y (3) Milho Doce, Zea mays: ACX SS 7403RY (4) Milho Doce, Zea mays: AC 128Y (5) Milho Doce, Zea mays: AC 195Y (6) Milho Doce, Zea mays: AC 199Y (7) Milho Doce, Zea mays: AC 215Y

Designação de Depósito de Patente ATCC

PTA-10507 PTA-10506 PTA-10508 PTA-10981 PTA-10982 PTA-10983 PTA-10984

Quantidade Recebida

100 pacotes/25 sementes em cada pacote 100 pacotes/25 sementes em cada pacote 100 pacotes/25 sementes em cada pacote 100 pacotes/25 sementes em cada pacote 100 pacotes/25 sementes em cada pacote 100 pacotes/25 sementes em cada pacote 100 pacotes/25 sementes em cada pacote

Linhagens Híbridas

Sementes do milho doce, Zea mays, híbridos ACX SS 7501Y,

ACX SS 7078Y e ACX SS 7403RY (100 pacotes para cada um destes três híbridos, com 25 sementes em cada pacote) foram depositadas em nome da Abbott & Cobb, Inc. com a American Type Culture Collection (ATCC) (10801 University Boulevard, Manassas, VA, 20110-2209, Estados Unidos da

América) sob o Tratado de Budapest sobre o Reconhecimento Internacional do Depósito de Microrganismos em 30 de novembro de 2009, e foram dadas as Designações de Depósito de Patente ATCC PTA-10507, PTA-10506 e

PTA-10508, respectivamente, pela ATCC. As sementes depositadas foram testadas em 14 de dezembro de 2009 pela ATCC e, nesta data, elas foram viáveis. O depositante foi a Abbott & Cobb, Inc., 11460 Fortune Circle,

Wellington, Flórida, 33414, Estados Unidos da América.

Linhagens Precursoras

Sementes do milho doce, Zea mays, linhagens precursoras femininas e masculinas que foram utilizadas para desenvolver milho doce, Zea mays, híbridos ACX SS 7501Y (100 pacotes, com 25 sementes em cada pacote), designadas AC 199Y (feminina) e AC 195Y (masculina), foram depositadas em nome da Abbott & Cobb, Inc. com a American Type Culture Collection (ATCC) (10801 University Boulevard, Manassas, VA, 20110126

2209, USA) sob O Tratado de Budapest sobre o Reconhecimento Internacional do Depósito de Microrganismos em 19 de maio de 2010, e foram dadas as designações de Depósito de Patente ATCC PTA-10983 e PTA-10982 pela ATCC, respectivamente. As sementes depositadas foram testadas em 1 de junho de 2010 pela ATCC e, nesta data, elas foram viáveis.

As sementes do milho doce, Zea mays, linhagens precursoras femininas e masculinas que foram utilizadas para desenvolver milho doce, Zea mays, híbridos ACX SS 7078Y (100 pacotes, com 25 sementes em cada pacote), designadas AC 199Y (feminina) e AC 128Y (masculina), foram depositadas em nome da Abbott & Cobb, Inc. com a American Type Culture Collection (ATCC) (10801 University Boulevard, Manassas, VA, 201102209, USA) sob O Tratado de Budapest sobre o Reconhecimento Internacional do Depósito de Microrganismos em 19 de maio de 2010, e foram dadas as designações de Depósito de Patente ATCC PTA-10983 e PTA-10981, respectivamente, pela ATCC. As sementes depositadas foram testadas em 1 de junho de 2010 pela ATCC e, nesta data, elas foram viáveis.

As sementes do milho doce, Zea mays, linhagens precursoras femininas e masculinas que foram utilizadas para desenvolver milho doce, Zea mays, híbridos ACX SS 7403RY (100 pacotes, com 25 sementes em cada pacote), designadas AC 199Y (feminina) e AC 215Y (masculina), foram depositadas em nome da Abbott & Cobb, Inc. com a American Type Culture Collection (ATCC) (10801 University Boulevard, Manassas, VA, 201102209, USA) sob O Tratado de Budapest sobre o Reconhecimento Internacional do Depósito de Microrganismos em 19 de maio de 2010, e foram dadas as Designações de Depósito de Patente ATCC PTA-10983 e PTA-10984, respectivamente, pela ATCC. As sementes depositadas foram testadas em 1 de junho de 2010 pela ATCC e, nesta data, elas foram viáveis.

Os certificados de Depósito foram recebidos da American Type Culture Collection (ATCC) para cada um dos depósitos que são

127 descritos acima.

Exemplo 6

Construção e Teste da Linhagem Congênita Precursora de Milho Doce AC

157Y e Linhagem Precursora Quase Isogênica (NIL) AC 157Y-Í (Precursores Femininos sh2-i em combinação com Precursores Masculinos não tendo Combinações Alélicas Recessivas Duplas ou Triplas)

Nos experimentos que são descritos neste exemplo, de modo a tentar resolver o problema de manipular a regulagem do acúmulo de carboidrato, e maciez do pericarpo, nas variedades de milho doce contendo o gene mutante sh2-i, linhagens precursoras apropriadas quase isogênicas (NILs) foram construídas e testadas, usando métodos que foram anteriormente aqui descritos ou que são descritos abaixo e/ou são conhecidos por aqueles tendo habilidade comum na técnica, das quais seguem as combinações genotípicas:

Linhagens precursoras femininas (NILs)

AC 157Y: SulSul SelSel sh2sh2

AC 157Y-Í: SulSul SelSel sh2-i sh2-i

Construção de NILs Precursoras

O gene mutante sh2-i foi incorporado dentro de linhagens precursoras puras selecionadas tendo as combinações de gene acima. Tais puros precursores foram também selecionados com base em critérios de produção horticulturais e de semente desejáveis, que incluem aqueles que são aqui debatidos. Foi descoberto através de uma quantidade significante de experimentação e teste organolépticos que a síntese de amido e o acúmulo de amido inaceitáveis ocorreram imediatamente a seguir do estágio de ingestão de pico com alguns híbridos de milho doce produzidos usando os puros de conversão de sh2-i descritos acima, particularmente aqueles híbridos produzidos usando duas linhagens precursoras de puros de conversão de sh2-i (isto é, duas linhagens precursoras que incluem ambas um gene mutante sh2-i

128 em seus genomas), desaprovando assim uma montagem de híbridos usando duas linhagens precursoras sh2-i. Através desta experimentação e teste organolépticos, foi eventualmente determinado que um genótipo potencialmente desejável para usar as linhagens precursoras de milho doce femininas foi Sul Sul Sei Sei sh2-i sh2-i, e que a utilização das linhagens precursoras masculinas tendo um conjunto de alelos homozigotas recessivos mutantes (Sul Sul Sei Sei sh2sh2) puderam se mostrar benéficos. O genótipo híbrido correspondente é da seguinte composição:

Sul Sul Sei Sei sh2-i sh2-i X Sul Sul Sei Sei sh2sh2 (Linhagem precursora feminina) (Linhagem precursora masculina) (puro de conversão de sh2-i) (puro que não inclui um gene sh2-i)

Linhagem precursora feminina

Em vista do acima e abaixo, o inventor decidiu usar as linhagens de milho doce puras de conversão de sh2-i apenas como os precursores femininos (isto é, não como os precursores masculinos) na produção de milho comercial. Esta decisão foi com base em vários fatores, que inclui aquelas debatidas acima e aqui anteriormente. Um tal fator para o uso dos precursores puros de conversão de sh2-i como fêmeas foi com base no fato de que o pericarpo de grão e o revestimento de semente resultante é 2N e matemalmente herdado. A utilização dos puros de conversão de sh2-i como precursores femininos, assim, preserva as características de germinação e vigor de muda intensificados muito vantajosas fornecidas pelo gene sh2-i, e expressadas como uma função da linhagem precursora feminina. Além disso, os rendimentos de produção de semente comerciais parecem ser enormemente intensificados como um artefato dos traços de germinação e vigor de muda superiores fornecidos aos híbridos de milho doce pelas linhagens precursoras de semente feminina sh2-i. As linhagens de milho doce precursoras puras de conversão de sh2-i femininas foram determinadas para fornecer híbridos desenvolvidos a partir delas com os traços benéficos múltiplos de ter uma germinação intensificada, um vigor de muda intensificado e um rendimento

129 de produção de semente comercial intensificado.

O retrocruzamento de várias linhagens puras comerciais foi iniciado usando a fonte de gene doador sh2-i fornecida pelo Dr. C. L. Hanna da University of Florida (Gainesville, FL). Esta fonte doadora foi testada de modo cruzado com as linhagens genéticas apropriadas para determinar a situação dos genes sul e sei. Os resultados do cruzamento de teste confirmaram que a fonte de gene doador sh2-i teve um genótipo de Sul Sul Sei Sei relativo aos genes sugary-1 (sul) e sugary enhancer-1 (sei).

As espigas de milho das populações BC1-S1 foram fenotipicamente examinadas. (BC1-S1 é uma população de reprodução da Abbott e Cobb, Inc., e o termo “BC1-S1” é uma palavra genética ou de criador de planta para ponto no tempo que diz respeito ao progresso do produto final. O produto final neste exemplo é uma reconstrução do precursor recorrente em que o alelo mutante sh2-i deva ser adicionado). Apenas grãos que expressam uma característica de revestimento de semente duro de milhos flint ou dent foram salvos e utilizados em outros ciclos de retrocruzamento. Um mínimo de cinco ciclos de retrocruzamento envolvendo precursores recorrentes foi realizado para garantir a reconstituição adequada de linhagens de milho doce comerciais que incorporam o gene mutante sh2-i nele. O fenótipo de grão resultante foi predominantemente similar a aquele da aparência sh2-i, que é macio, cheio e relativamente pesado. (A aparência do grão de milho doce morfológico sh2sh2 mutante é distinto de outras variedades do milho doce em que as sementes secas (grãos) parecem ser translúcidas, altamente colapsadas, e enrugadas. Os fenótipos de grão milho doce sh2-i mutantes, ao contrário, são macios, mais pesados, bem cheios e quase como aquele do milho do campo flint na aparência (tendo grãos redondos com revestimentos lisos)). Os fenótipos de grão foram confirmados com marcadores moleculares, como é aqui debatido em outro lugar, e como é mostrado na FIG. 10.

130

Os testes de germinação em solo quente e frio de laboratório foram conduzidos nas linhagens de conversão sh2-i para verificar desempenhos de muda intensificados associados com a fonte doadora sh2-i. O teste de solo frio de campo real foi conduzido para verificação adicional de germinação e vigor de muda intensificados. O teste de gosto organoléptico das linhagens de conversão Sul Sul sh2-i sh2-i resultantes e as linhagens de comparação recorrentes Sul Sul sh2sh2 foram conduzidos para a verificação de açúcar, pericarpo e capacidade de contenção.

Uma linhagem de conversão sh2-i precursora feminina de interesse particular foi designada como AC 157Y-L A Tabela de Características (Linhagens de milho doce precursoras) apresentadas acima antes do Exemplo 1 descreve as características em detalhes desta linhagem de milho doce precursora particular.

Teste de Germinação e Vigor de Muda de Linhagens precursoras femininas

A Tabela 6 e Tabela 7 abaixo mostram valores de germinação quente e fria de laboratório comparativos, e os dados de germinação em solo de campo e vigor de muda, respectivamente para: (i) uma linhagem precursora pura “superdoce” comercial (Sul Sul sh2sh2) designada AC 157Y (que não inclui o gene sh2-i no seu genoma); e (ii) a linhagem precursora pura NIL feminina (SulSul sh2-i sh2-i) (um puro de conversão de sh2-i) designada AC 157Y-Í (que inclui o gene sh2-i no seu genoma). Estas linhagens precursoras são as mesmas, com a exceção de que uma não inclui o gene sh2-i no seu genoma, e a outra inclui o gene sh2-i no seu genoma. Estes testes foram realizados da mesma maneira como é anteriormente descrito em outro lugar. Médias não seguidas pela mesma letra são significantemente diferentes ao nível de probabilidade de 0,05 via o Teste Estatístico de Faixa Múltipla de Duncan.

Tanto a vantagem muito significante dos dados de germinação

131 fria de laboratório (Tabela 6), assim como a distinção morfológica de semente fenotípica muito desejável, de linhagem precursora pura de conversão de sh2i feminina AC 157Y-Í em comparação com linhagem pura precursora AC 157Y é claramente evidente a partir destes dados. Além disso, a linhagem precursora de conversão pura AC 157Y-Í muito desejavelmente exibe um revestimento de semente duro macio quando comparada com a aparência encolhida, colapsada muito indesejável da semente da linhagem precursora pura convencional AC 157Y. Além disso, os dados para a germinação em solo de campo e desempenho de vigor de muda (Tabela 7) mostram uma germinação em solo de campo e vigor de muda significantemente intensificados, e muito mais desejáveis, de solo de campo e para a linhagem precursora pura de conversão de sh2-i AC 157Y-Í em comparação com a linhagem pura precursora AC 157Y.

Tabela 6

Linhagem Congênita Precursora	Germinação Quente	Germinação Fria
	(Porcentagem)* ^**	(Porcentagem)*
AC 157Y	94a	71a
(que não inclui um gene sh2-i)
AC 157Y-Í	98a	94b
(que inclui um gene sh2-i) (Linhagem precursora feminina)

* As contagens representam a média de três réplicas de 100 grãos cada.

Tabela 7

Linhagem Congênita Precursora	Germinação em solo de Campo Porcentagem*	Vigor de Muda
AC 157Y	86a	3a
(que não inclui um gene sh2-i) AC 157Y-Í	97b	5b
(que inclui um gene sh2-i) (Linhagem precursora feminina)

* As contagens representam a média de três réplicas de 100 grãos cada. As temperaturas do solo importaram em média aproximadamente 50°F (10°C).

** Vigor de muda foi classificado em uma escala de 1 a 5, com 5 representando excelente vigor de muda e 1 representando vigor de muda deficiente.

Linhagem precursora masculina

Em vista do acima, o genótipo das linhagens precursoras masculinas selecionadas para o uso em combinações híbridas com as linhagens femininas de conversão sh2-i foram escolhidas com base na sua capacidade para fornecer qualidades horticulturais desejáveis aos híbridos de milho doce produzidos usando tais linhagens. Assim, genótipos de linhagem

132 precursora masculinos foram utilizados que incluíram genéticas “superdoce” mais convencionais da composição SulSul SelSel sh2sh2. As linhagens de milho doce masculinas desta classe que são apresentadas neste exemplo são tipicamente materiais puros que são comercialmente disponíveis da Abbott e Cobb, Inc. (ver o Exemplo 7). Estes genótipos precursores masculinos têm apenas um conjunto de alelos homozigotas recessivos mutantes. A doçura e maciez de grãos de tais linhagens precursoras masculinas são no geral significantemente menores em comparação com a doçura e maciez das linhagens de milho doce precursoras masculinas que incluem uma composição genética contendo dois ou três genes mutantes recessivos homozigotas, tais como SulSulselselsh2sh2 ou sulsulselselsh2sh2, respectivamente. Com respeito aos traços de milho doce diferentes desejáveis possíveis, tais como um vigor intensificado, este genótipo de linhagem precursora masculina foi escolhida como um resultado da sua capacidade para fornecer híbridos desenvolvidos a partir deste com: (i) características planta e espiga horticulturais desejáveis; e (ii) altas capacidades de rendimento.

Teste Organoléptico de Linhagens Precursoras femininas (Doçura e Maciez de Pericarpo)

A FIG. 11 é um gráfico de linhagem que ilustra contagens de açúcar (doçura) médias organolépticas comparativas para a linhagem de milho doce pura precursora AC 157Y (que não inclui o gene sh2-i no seu genoma) e a linhagem NIL feminina pura precursora (puro de conversão de sh2-i) designada AC 157Y-Í (que inclui o gene sh2-i no seu genoma) no período de sete dias imediatamente a seguir do estágio de alimentação primário (em um nível de aproximadamente 75 % de umidade). A FIG. 11 ilustra os níveis de açúcar comparativos organolépticos entre estas duas linhagens precursoras puras de milho doce neste período de tempo de sete dias. As contagens de doçura organolépticas variaram de 1 (muito pouca doçura com um gosto de amido considerável) a 10 (doce com pouco ou

133 nenhum gosto de amido). A FIG. 11 mostra que, nos Dias 1 e 2 passados o estágio de alimentação primário, a linhagem precursora feminina AC 157Y sh2-i teve contagens de doçura organolépticas comparativamente altas (cerca de 8,5 no Dia 1 e cerca de 7,5 no Dia 2), que foram as mesmas contagens mostradas pela linhagem precursora AC 157Y. A contagem de doçura organoléptica para a linhagem precursora feminina AC 157Y-Í no Dia 3 foi um pouco mais alta do que 5, e nos Dias 4 e 5 foi de cerca de 2, e nos Dias 6 e 7 foi de cerca de 1,5. A contagem de doçura organoléptica para a linhagem precursora AC 157Y no Dia 3 foi de cerca de 7, no Dia 4 foi cerca de 5, nos Dias 5 e 6 foi cerca de 4, e no Dia 7 foi um pouco mais alta do que 3.

A FIG. 12 é um gráfico de linhagem que mostra as contagens organolépticas comparativas de maciez do pericarpo para as mesmas linhagens precursoras puras de milho doce no período de sete dias imediatamente a seguir do estágio de alimentação primário (em um nível de aproximadamente 75 % de umidade). As contagens organolépticas de maciez variaram de 1 (pericarpo muito duro) a 10 (pericarpo muito macio). A FIG. 12 mostra que a linhagem precursora de milho doce feminina AC 157Y-Í manteve uma contagem organoléptica de maciez do pericarpo de cerca de 6 a cerca de 7 nos dias 1, 2 e 3 passado o estágio de alimentação primário, e contagens de cerca de 5 no Dia 4, cerca de 4 no Dia 5, cerca de 2 no Dia 6, e cerca de 1,5 no Dia 7. Contagens similares são mostradas para a linhagem precursora AC 157Y nos Dias 1, 2 e 3 passado o estágio de alimentação primário. A linhagem de milho doce precursora AC 157Y-Í foi de maciez inicial comparativa para a linhagem precursora de milho doce AC 157Y, mas com um declínio considerável com o tempo.

Exemplo 7

Produção usando Marcadores Moleculares e Teste de Híbridos ACX SS

1082Y e Híbridos ACX SS 1Q82Y sh2-i da Linhagem Quase Isogênica (NIL) de Milho Doce

134 (Combinações Alélicas Específicas)

Nos experimentos que são descritos neste exemplo, NILs híbridas do milho doce tendo combinações alélicas específicas foram desenvolvidas utilizando o gene sh2-i e marcadores moleculares, e depois testadas na maneira descrita abaixo.

Construção de Híbridos ACX SS 1082Y sh2-i

Os híbridos do milho doce tendo combinações alélicas específicas foram montados de acordo com os mesmos procedimentos de reprodução que são anteriormente aqui descritos. Uma NIL híbrida do milho doce sh2-i resultante (um puro de conversão de sh2-i) de interesse particular foi designada como ACX SS 1082Y sh2-i e foi desenvolvida usando a linhagem NIL de milho doce precursora feminina AC 157Y-Í que é debatida no Exemplo 6 junto com a linhagem precursora masculina AC 144Y (uma linhagem pura que é comercialmente disponível da Abbott e Cobb, Inc), ambos os quais também são identificados abaixo.

SulSul SelSel sh2-i sh2-i X SulSul SelSel sh2sh2 (Linhagem precursora feminina) (Linhagem precursora masculina)

AC 157Y-Í AC 144Y (puro de conversão de sh2-i) (puro que não inclui um gene sh2-i)

ACXSS 1082Y sh2-i (Híbrido Sh2-i do Milho Doce)

Teste de Germinação e Vigor de Muda

A Tabela 8 e Tabela 9 abaixo mostram valores de germinação quente e fria de laboratório comparativos, e dados de germinação em solo de campo e vigor de muda, respectivamente para: (i) uma NIL híbrida de milho doce designada ACX 1082Y (que não inclui o gene sh2-i no seu genoma); e (ii) a NIL milho doce híbridas designada ACX SS 1082Y sh2-i (um puro de conversão de sh2-i que inclui o gene sh2-i no seu genoma). Estes híbridos são os mesmos, com a exceção de que um não inclui o gene sh2-i no seu genoma, e o outro inclui o gene sh2-i no seu genoma. Estes testes foram realizados da mesma maneira como foi anteriormente aqui descrito. Médias não seguidas

135 pela mesma letra são significantemente diferentes ao nível de probabilidade de 0,05 via o Teste Estatístico de faixa Múltipla de Duncan.

Tanto as vantagens muito significantes dos dados de germinação fria de laboratório (Tabela 8), assim como as distinções morfológicas de semente fenotípicas muito desejáveis, do híbrido ACX SS 1082Y sh2-i do milho doce (que inclui o gene sh2-i no seu genoma) em comparação com o híbrido ACX 1082Y milho doce (que não inclui o gene sh2-i no seu genoma) estão claramente evidentes a partir destes dados. Além disso, híbridos do milho doce ACX SS 1082Y sh2-i muito desejavelmente exibem um revestimento de semente duro liso quando comparado com a aparência enrugada, colapsada muito indesejável dos híbridos da semente do milho doce ACX 1082Y. Além disso, os dados para o desempenho da germinação em solo de campo e vigor de muda (Tabela 9) mostra uma germinação em solo de campo e vigor de muda para o híbrido ACX SS 1082Y sh2-i do milho doce significantemente intensificados, e muito mais desejáveis, em comparação com o híbrido ACX 1082Y do milho doce.

Tabela 8

Híbrido	Germinação Ouente	Germinação Fria
	(Porcentagem)*	(Porcentagem)*
ACX 1082Y	93a	77a
(NIL que não inclui um gene sh2-i)
ACXSS 1082Y sh2-i	99a	96b
(NIL que inclui um gene sh2-i)

* As contagens representam a média de três réplicas de 100 grãos cada.

Tabela 9

Híbrido Germinação em solo de Campo Vigor de Muda

Porcentagem*

ACX 1082Y 90a 3a (NIL que não inclui um gene sh2-i)

ACX SS 1082Y sh2-i 97b 5b (NIL que inclui um gene sh2-i)_ * As contagens representam a média de três réplicas de 100 grãos cada. As temperaturas do solo importaram em média aproximadamente 50°F (10°C).

Teste Organoléptico (Doçura e Maciez de Pericarpo)

A FIG. 13 é um gráfico de linhagem que mostra contagens de açúcar (doçura) médias organolépticas para as variedades de milho doce

136

Beyond (que não inclui o gene sh2-i), Passion (que não inclui o gene sh2-i) e híbrido ACX SS 1082Y sh2-i (um puro de conversão de sh2-i que inclui o gene sh2-i) no período de sete dias imediatamente a seguir do estágio de alimentação primário (em um nível de aproximadamente 75 % de umidade). O mesmo ilustra os níveis de açúcar comparativos organolépticos entre estas três variedades de milho doce neste período de sete dias de tempo. A contagem de doçura organoléptica variou de 1 (muito pouca doçura com um gosto de amido considerável) a 10 (doce com pouco ou nenhum gosto de amido). A variedade comercial Passion é vendida e distribuída através da Monsanto (St. Louis, MO), e a variedade comercial Beyond é vendida e distribuída pela Abbott e Cobb, Inc. (Trevose, PA), e tem servido como um padrão, primariamente nos mercados de remessa comercial do sudeste. A FIG. 13 mostra que, nesta comparação, a variedade Passion permaneceu muito doce através dos primeiros quatro dias que seguem o estágio de alimentação primário, e depois diminuíram gradualmente nos dias 5, 6 e 7. A variedade Beyond não foi considerada como doce inicialmente como a variedade Passion, mas seguiu um padrão geral de retenção de açúcar através dos primeiros quatro dias depois do estágio de alimentação primário, e depois também diminuiu gradativamente através dos dias 5, 6 e 7. O híbrida ACX SS 1082Y sh2-i de milho doce foi similar em doçura à variedade Beyond nos dias 1, 2 e 3 que seguem o estágio de alimentação primário (tendo uma contagem de cerca de 7, 6 e 5,5 nestes dias, respectivamente), e depois diminuíram gradativamente nos dias 4, 5, 6 e 7 (para contagens de cerca de 4, 3, 2 e 2, respectivamente). O início de um gosto um pouco rico em amido foi detectado no híbrido de milho doce ACX SS 1082Y sh2-i começando no Dia

3.

A FIG. 14 é um gráfico de linhagem que mostra contagens de maciez do pericarpo organolépticas médias para as mesmas variedades de milho doce no período de sete dias imediatamente a seguir do estágio de

137 alimentação primário (em um nível de aproximadamente 75 % de umidade). O mesmo ilustra os níveis organolépticos de maciez do pericarpo comparativos entre estas três variedades de milho doce neste período de sete dias. As contagens organolépticas de maciez variaram de 1 (pericarpo muito duro) a 10 (pericarpo muito macio). A FIG. 14 mostra que o nível de maciez da variedade Passion foi de uma contagem de cerca de 9,5 no Dia 1 passado o estágio de alimentação primário a um contagem de cerca de 7 no Dia 7, com mantendo o nível de maciez através dos primeiros quatro dias, e depois caindo moderadamente nos Dias 5, 6 e 7. Esta variedade foi considerada ser a mais macia das três variedades de comparação. A variedade Beyond teve uma contagem de maciez de cerca de 6,5 no Dia 1 passado o estágio de alimentação primário, e uma contagem de cerca de 6 no Dia 2, e depois diminuíram gradativamente com contagens de cerca de 5 no Dia 3, cerca de 4,5 no Dia 4, e cerca de 4 nos Dias 5, 6 e 7. Assim, esta variedade foi moderadamente macia nos dias 1 e 2, e depois tomou-se substancialmente menos macia começando no Dia 3 e terminando no Dia 7. O híbrido de milho doce ACX SS 1082Y sh2-i teve contagens de maciez de cerca de 8 no Dia 1 a seguir do estágio de alimentação primário, cerca de 7 no Dia 2, cerca de 6 no Dia 3, cerca de 5 no Dia 4, e cerca de 4 (ou um pouco mais alto) nos Dias 5, 6 e 7. Assim, esta variedade foi muito macia nos Dias 1 e 2, levemente menos macia nos Dias 3 e 4, e depois moderadamente macia nos Dias 5, 6 e 7.

Estes dados indicam um benefício de emergência no campo e vigor muito benéficos para os híbridos tais como ACX SS 1082Y sh2-i. Entretanto, a construção de tais híbridos como descrito nos Exemplos 6 e 7 indicam que as linhagens precursoras masculinas contendo apenas um conjunto de alelos homozigotas recessivos mutantes, por exemplo SulSulSelSelsh2sh2, resulta em um nível reduzido de doçura e maciez globais nas combinação híbridas. As contagens da doçura e maciez do pericarpo que são apresentadas também sugerem que uma inserção dentro de

138 linhagens puras femininas do gene mutante sh2-i sem uma reprodução por megulhia sequencial contra um fundo genético de selsel e sulsul, como foi aqui anteriormente descrito, resulta em efeitos menos eficazes e alguns nocivos em conexão com a qualidade de ingestão global (doçura e maciez do pericarpo).

Exemplo 8

Produção sem o Uso de Marcadores Moleculares, e um Fundo Genético selsel/sulsul e Teste dos híbridos de milho doce ACR SS 4500Y e ACR SS

4501Y (Precursores sh2-i Femininos em Combinação com Precursores

Masculinos tendo Combinações Alélicas Recessivas Duplas ou Triplas)

Nos experimentos que são descritos neste exemplo, híbridos sh2-i de milho doce adicional foram desenvolvidos usando genótipos precursores dupla e tripla recessiva masculino.

Construção de Híbridos ACR SS 4500Y e ACR SS 4501Y

Estes híbridos de milho doce adicionais foram montados de acordo com os mesmos procedimentos de reprodução que são descritos nos Exemplos 1, 2 e 3, com as exceções de que as linhagens híbridas contendo o gene mutante sh2-i em seus genomas não foram montados utilizando marcadores moleculares, como anteriormente aqui descritos (Exemplos 1, 2 e 3), e não incorporaram os alelos selsel/sulsul.

Dois híbridos de milho doce sh2-i resultantes de interesse particular foram designados ACR SS 4500Y e ACR SS 4501 Y, e foram desenvolvidos usando puros de milho doce precursores não construídos com fundos sul e sei. Estes híbridos foram desenvolvidos a partir das linhagens de precursor de conversão sh2-i femininas não contendo os genes sul e sei para testar a qualidade de ingestão em comparação com puros precursores sh2-i femininos construídos utilizando a incorporação dos genes sul e sei. Também foi considerado importante testar o efeito de usar as linhagens masculinas recessivas homozigotas duplas e triplas com as linhagens de

139 conversão de sh2-i femininas que não foram construídas utilizando a reprodução sequencial por megulhia nos genes sul e sei.

X sul sul selsel sh2sh2 (Linhagem precursora masculina) (linhagem “superdoce” pura que utiliza uma combinação alélica recessiva tripla e não incluindo um gene sh2-i)

AC 098Y-Í

ACR SS 4500Y sul sul selsel sh2sh2 (Linhagem precursora masculina) (linhagem pura “superdoce” que utiliza uma combinação alélica recessiva tripla e que não inclui um gene sh2-i)

AC 233Y

ACR SS 4500Y (Híbridos Sh2-i de milho doce construídos com reprodução não sequencial por megulhia da linhagem precursora feminina, e em combinação com uma linhagem precursora masculina recessiva Tripla)

ACRSS4501Y

AC 157Y-Í sulsul Sei Sei sh2sh2 (Linhagem precursora masculina) (linhagem pura “superdoce” que utiliza uma combinação alélica recessiva dupla e que não inclui um gene sh2-i)

AC 241Y

ACRSS 4501Y (Híbridos de milho doce Sh2-i construídos com reprodução por megulhia não sequencial da linhagem precursora feminina, e em combinação com uma linhagem precursora masculina recessiva dupla)

Estas linhagens híbridas diferiram em uma maneira benéfica de outros híbridos preparados neste exemplo em desempenho relativo às regiões de crescimento geográfico e/ou exigências de mercado, e as suas características são descritas em detalhes na Tabela de Características (linhagens de híbrido de milho doce) que é acima apresentada antes do 10 Exemplo 1. A Tabela de Características (Linhagens de milho doce precursoras) descreve as características em detalhes das linhagens de milho doce precursoras que foram utilizadas para desenvolver estas linhagens híbridas.

Com ambas as linhagens híbridas ACR SS 4500Y e ACR SS

140

4501Υ, as linhagens precursoras femininas foram construídas usando o gene mutante sh2-i não em combinação com os genes sul e/ou sei. A linhagem ACR SS 4500Y híbrida, entretanto, foi desenvolvida usando uma linhagem precursora masculina recessiva tripla, ao passo que a linhagem ACR SS 4501Y híbrida foi desenvolvida usando uma linhagem precursora masculina recessiva dupla.

A linhagem feminina precursora AC 098Y-i (um puro de conversão de sh2-i que inclui o gene mutante sh2-i no seu genoma) é um gene sh2-i de conversão isogênica de, e comparação com, uma linhagem precursora feminina pura comercialmente disponível (da Abbott e Cobb, Inc) designada como AC 098Y (que não inclui o gene mutante sh2-i no seu genoma). A única diferença genética significante entre estas duas linhagens precursoras femininas puras neste exemplo é a presença do gene mutante sh2-i na linhagem precursora feminina pura AC 098Y-i e a ausência do gene sh2-i em linhagem precursora feminina pura AC 098Y.

A linhagem precursora feminina AC 157Y-Í (um puro de conversão de sh2-i que inclui o gene mutante sh2-i no seu genoma) é um gene sh2-i de conversão isogênica de, e comparação com, uma linhagem precursora feminina da Abbott e Cobb, Inc. designada como AC 157Y (que não inclui o gene mutante sh2-i no seu genoma). A única diferença genética significante entre estas duas linhagens precursoras femininas puras neste exemplo é a presença do gene mutante sh2-i na linhagem precursora feminina pura AC 157Y-Í e a ausência do gene sh2-i na linhagem precursora feminina pura AC 157Y.

A Tabela 10 abaixo fornece dados que resultam das comparações reais dos dados de germinação quente e fria de laboratório, assim como testes organolépticos de gosto e maciez do pericarpo, para as

141 linhagens precursoras femininas puras de milho doce AC 098Y-Í, AC 098Y, AC 157Y-Í, e AC 157Y. As contagens de germinação são médias de três réplicas de 100 grãos cada. As contagens de laboratório não seguidas pelo mesmo número são significantemente diferentes ao nível de probabilidade de 0,05 via o Teste de Faixa Múltipla Nova de Duncan. Os testes organolépticos com respeito à doçura (teor de açúcar) e maciez do pericarpo são aqui anteriormente descritos.

A Tabela 10 mostra que, em ambos os casos em que o gene mutante sh2-i foi adicionado aos genomas do milho doce (as linhagens precursoras femininas puras AC 098Y-i e AC 157Y-Í), as contagens quente e fria de laboratório de comparação isogênica pura foram significantemente elevadas em comparação com as linhagens precursoras femininas puras que não incluem o gene mutante sh2-i nos seus genomas (AC 098Y e AC 157Y), que é indicativo de uma emergência de campo e vigor intensificados. A Tabela 10 também mostra que estas duas linhagens puras de milho doce que incluem o gene mutante sh2-i não retiveram a sua doçura por muito tempo (tendo contagens de 2 e 2, respectivamente, no Dia 7 no período de sete dias imediatamente a seguir do estágio de alimentação primário) como as duas linhagens puras de milho doce que não incluíram este gene nos seus genomas (puro AC 098Y e AC 157Y) (tendo contagens de 5 e 4 no Dia 7), e tiveram pericarpos que não retiveram a sua maciez por muito tempo (tendo contagens de 1 e 2, respectivamente, no Dia 7 no período de sete dias imediatamente a seguir do estágio de alimentação primário) como os dois puros de milho doce que não incluíram este gene nos seus genomas (tendo contagens de 3 e 4, respectivamente, no Dia 7). As contagens de doçura e maciez do pericarpo que estão presentes na Tabela 10 sugerem que uma inserção dentro das linhagens puras do gene mutante sh2~i sem uma reprodução sequencial por megulhia contra um fundo genético de sei sei e sulsul, como foi aqui anteriormente descrito, resulta em efeitos menos eficazes e alguns nocivos em

142 conexão com a qualidade de ingestão global (doçura e maciez do pericarpo) em comparação com uma inserção dentro das mesmas linhagens puras do gene mutante sh2-i com uma reprodução sequencial por megulhia contra um fundo genético de sei sei e sul sul. Todas elas, entretanto, muito vantajosamente exibem uma emergência de campo e vigor intensificados.

Em vista do acima, é considerado ser muito desejável montar e direcionar a construção de materiais de gene mutante sh2-i na maneira que foi aqui anteriormente descrita de modo a obter benefícios máximos desejados pelos cultivadores e consumidores de planta (isto é, usando marcadores moleculares e um fundo genético sei sei e sul sul).

Tabela 10

Comparações Isogênicas de Congênitos do Milho Doce Incluindo, ou Não

Incluindo, o gene sh2-i

Congênitos	Germinação quente	Germinação fria	Contagem de doçura organoléptica	Contagem de Maciez de Pericarpo Organoléptica
Dial	Dia 4	Dia 7	Dia 1	Dia 4	Dia 7
AC 098Y-Í (contém o gene sh2-i)	99a	90a	8	5	2	7	3	1
AC 098Y (Não contêm o gene sh2-i)	98a	82b	8	6	5	8	5	3
AC 157Y-Í (Contém o gene sh2-i)	98a	94a	8	2	2	7	5	2
AC 157Y (Não contêm o gene sh2-i)	94a	71c	8	5	4	7	6	4

DEPÓSITOS ADICIONAIS (Depósitos feitos com a American Type Culture Collection (ATCC) em Conexão com os Exemplos 6 a 8)

Os depósitos de semente debatidos abaixo, que dizem respeito aos Exemplos 6 a 8, foram/estão sendo feitos com a American Type Culture Collection (ATCC) (Manassas, VA, USA) pelo Requerente Bryant J. Long em nome do cessionário Abbott & Cobb, Inc. (Wellington, FL) para os híbridos de milho doce Zea mays identificados abaixo tendo as combinações alélicas específicas desejadas, que cada uma inclui o gene sh2-i em seus genomas, e as linhagens precursoras de milho doce Zea mays, correspondentes que foram utilizadas para desenvolver estes híbridos de

143 milho doce. Nas tabelas mostradas abaixo, em conexão com os genes sugary (sul), sugary enhancer-1 (sei) e shrunken-2 (sh2), a designação “S” indica que a linhagem precursora masculina incluiu uma única combinação alélica recessiva destes três genes, a designação “D” indica que a linhagem precursora masculina incluiu uma combinação alélica recessiva dupla destes três genes, e a designação “T” indica que a linhagem precursora masculina incluiu uma combinação alélica recessiva tripla destes três genes.

Exemplo Depósito Combinação

Híbridos_Linhagens Precursoras_N^a_Feito Alélica

ACX SS 1082Y sh2-i

ACR SS 4500Y ACRSS 4501Y

AC 157Y-Í (Feminino) X AC 144Y (Masculino)

AC 098Y-Í (Feminino) X AC 233Y (Masculino) AC 157Y-Í (Feminino) X AC 241Y (Masculino)

Sim/Não*

Sim/Não* * Todas as três linhagens (dois precursores e híbridos) foram/estão sendo depositados.

Referência de Identificação usada pelo Depositante/ Inventor

Designação de

Depósito de

Patente ATCC

Quantidade Recebida (1) Milho doce, Zea mays:

(2) Milho doce, Zea mays:

(3) Milho doce, Zea mays:

(4) Milho doce, Zea mays:

(5) Milho doce, Zea mays:

(6) Milho doce, Zea mays:

(7) Milho doce, Zea mays:

(8) Milho doce, Zea mays:

ACX SS 1082Y sh2-i AC 157Y-Í AC 144Y ACR SS 4500Y AC 098Y-Í AC 233Y ACR SS 4501Y AC 241Y

PTA-_

PTA100 pacotes/25 sementes em cada pacote 100 pacotes/25 sementes em cada pacote 100 pacotes/25 sementes em cada pacote 100 pacotes/25 sementes em cada pacote 100 pacotes/25 sementes em cada pacote 100 pacotes/25 sementes em cada pacote 100 pacotes/25 sementes em cada pacote 100 pacotes/25 sementes em cada pacote

Linhagens Híbridas

Sementes do milho doce, Zea mays, híbridos ACX SS 1082Y sh2-i, ACR SS 4500Y e ACR SS 4501Y (100 pacotes para cada um destes três híbridos, com 25 sementes em cada pacote) foram/estão sendo depositadas em nome da Abbott & Cobb, Inc. com a American Tipo Culture Collection (ATCC) (10801 University Boulevard, Manassas, VA, 201102209, Estados Unidos da América) sob o Tratado de Budapest sobre o Reconhecimento Internacional do Depósito de Microrganismos em _, 2010, e foram/estão sendo dadas as Designações de Depósito de Patente ATCC PTA-_, PTA-_ e PTA-_ respectivamente, pela ATCC. As sementes depositadas foram/estão sendo testadas em _, 2010 pela ATCC e, nesta data, elas foram/são viáveis. O depositante foi/é a Abbott & Cobb, Inc., 11460 Fortune Circle, Wellington, Flórida, 33414, Estados Unidos da América.

144

Linhagens Precursoras ₄ As sementes do milho doce, Zea mays, linhagens precursoras femininas e masculinas que foram/estão sendo utilizadas para desenvolver milho doce, Zea mays, híbrido ACX SS 1082Y sh2-i (100 pacotes, com 25 sementes em cada pacote), designado AC 157Y-Í (feminino) e AC 144Y (masculino), foram/estão sendo depositados em nome da Abbott & Cobb, Inc. com a American Type Culture Collection (ATCC) (10801 University Boulevard, Manassas, VA, 20110-2209, USA) sob o Tratado de Budapest sobre o Reconhecimento Internacional do Depósito de Microrganismos em _, 2010, e foram/estão sendo dadas as Designações de Depósito de

Patente ATCC PTA-_e PTA-_pela ATCC, respectivamente. As sementes depositadas foram/estão sendo testadas em_, 2010 pela

ATCC e, nesta data, elas foram/são viáveis.

As sementes do milho doce, Zea mays, linhagens precursoras femininas e masculinas que foram/estão sendo utilizadas para desenvolver milho doce, Zea mays, híbrido ACR SS 4500Y (100 pacotes, com 25 sementes em cada pacote), designado AC 098Y-Í (feminino) e AC 233Y (masculino), foram/estão sendo depositados em nome da Abbott & Cobb, Inc. com a American Type Culture Collection (ATCC) (10801 University . Boulevard, Manassas, VA, 20110-2209, USA) sob o Tratado de Budapest sobre o Reconhecimento Internacional do Depósito de Microrganismos em _, 2010, e foram/estão sendo dadas as Designações de Depósito de Patente ATCC PTA-_e PTA-_pela ATCC, respectivamente.

As sementes depositadas foram/estão sendo testadas em_, 2010 pela ATCC e, nesta data, elas foram/são viáveis.

As sementes do milho doce, Zea mays, linhagens precursoras femininas e masculinas que foram/estão sendo utilizadas para desenvolver milho doce, Zea mays, híbrido ACR SS 4501Y (100 pacotes, com 25 sementes em cada pacote), designado AC 157Y-Í (feminino) e AC 241Y

145 (masculino), foram/estão sendo depositados em nome da Abbott & Cobb, Inc. com a American Type Culture Collection (ATCC) (10801 University Boulevard, Manassas, VA, 20110-2209, USA) sob o Tratado de Budapest sobre o Reconhecimento Internacional do Depósito de Microrganismos em _, 2010, e foram/estão sendo dadas as Designações de Depósito de Patente ATCC PTA-_e PTA-_pela ATCC, respectivamente.

As sementes depositadas foram/estão sendo testadas em_, 2010 pela ATCC e, nesta data, eles foram/são viáveis.

Os Certificados de Depósito foram/estão sendo recebidos da American Type Culture Collection (ATCC) para cada um dos depósitos que são descritos acima.

Traços e Características Benéficos de Híbridos que Incluem o gene sh2-i

Os dados que estão presentes nas Tabelas 6 e 7 (Exemplos 7 e 8 -linhagens de milho doce precursoras puras) e Tabelas 8 e 9 (Exemplo 7 linhagens de milho doce híbridas), e nas outras tabelas e figuras aqui descritas e ilustradas, claramente demonstram a germinação quente e fria de laboratório e em solo de campo, vigor de muda e força de planta enormemente intensificados de sementes de milho doce precursoras puras e híbridas individuais e variedades contendo o gene sh2-i em várias combinações alélicas tanto duplas quanto triplas em comparação com as mesmas sementes de milho doce precursoras puras e híbridas ou similares e variedades (em combinações alélicas tanto duplas quanto triplas) que não contenham o gene sh2-i. Estes traços múltiplos muito importantes e muito vantajosamente significantes de semente e planta de milho doce e benefícios de crescimento são extremamente benéficos e úteis para os cultivadores e produtores de milho doce no mundo todo, e em muitos tipos e climas de várias áreas e regiões geográficas utilizadas para cultivar milho doce no mundo todo, por exemplo, em áreas ou regiões do norte de vários países e/ou estados, tais

146 como nos Estados Unidos, onde as temperaturas e/ou climas de cultivo de milho doce são de modo frequente significantemente mais frias em comparação com as regiões do sul, onde as temperaturas e climas de cultivo são de modo frequente significantemente mais quentes, e onde se mantém um estabelecimento de resistência de milho doce uniforme, compatível é frequentemente difícil para os produtores de milho doce. As expectativa de doçura e maciez do pericarpo destas variedades de milho doce são consideradas ser excelentes, particularmente em situações em que os produtos de milho doce podem ser liberados aos mercados consumidores dentro de um período de tempo de aproximadamente 48 horas.

Em conclusão, as sementes e variedades de milho doce que são aqui debatidas e ilustradas (que inclui um gene sh2-i) muito vantajosamente têm numerosos traços muito vantajosos e muito benéficos em comparação com outras sementes e variedades de milho doce conhecidas ou outras (que não incluem o gene sh2-i): (i) uma germinação quente de laboratório em solo intensificada; (ii) uma germinação fria de laboratório em solo intensificada;

(iii) um germinação em solo geralmente no campo intensificada; (iv) um vigor de muda intensificado; (v) um rendimento de produção de semente comercial intensificado; (vi) uma força de planta intensificada; (vii) uma vida de prateleira prolongada; (viii) um gosto doce enquanto também mantém os traços benéficos de (i) a (vii) e (ix); e (ix) um pericarpo macio enquanto também mantém os traços benéficos de (i) a (viii). Muitas destas sementes e variedades de milho doce adicionalmente e muito vantajosamente exibem resistência à doença, por exemplo, à ferrugem da folha de milho do norte e/ou às múltiplas raças de ferrugem comum.

Além disso, as sementes híbridas produzidas de acordo com os métodos da invenção no geral têm uma aparência acentuadamente diferente de outros tipos de semente de milho. A partir de uma observação visual das sementes, pode-se observar a diferença em sua aparência de outra semente de

147 milho. Elas não parecem ter uma aparência enrugada, armazena amido, são no geral triangulares na forma.

Estratégia Utilizada e Falha de Outras

Embora os genes shrunken-2i (sh2-i) e sugary (sul) sejam conhecidas, ninguém até agora foi capaz de combinar com êxito estes genes para produzir híbridos de milho doce que expressam a germinação de muda intensificada e vigor junto com a retenção de traços de consumidor e/ou cultivadores desejáveis. Tem sido a muito tempo sentido, mas não resolvidas necessidades da indústria quanto a híbridos eficazes em custo, confiáveis que expressam uma germinação de muda, vigor, e desenvolvimento de planta intensificados (como milho doce sh2-i convencionais), mas com uma capacidade de contenção intensificada de níveis altos de açúcar e pericarpo macio tanto ligada quanto desligada na planta. Características de crescimento e gosto do milho doce melhoradas podem conferir um avanço significante na produção comercial destas plantas.

Vários criadores de planta comerciais e companhias, tais como Syngenta Seeds Inc., que têm pelo menos “capacidade comum na técnica,” têm tentado e falharam em combinar com êxito traços para obter variedades de milho doce utilizando sh2-i que sejam agradáveis tanto aos criadores quanto aos consumidores. Embora Syngenta tenha uma variedade comercial (chamada “Brighton”) que inclui o alelo sh2-i no seu genoma, este produto não foi comercialmente bem sucedido porque a qualidade de ingestão e, especificamente, a sua capacidade de contenção não são desejáveis para os consumidores.

Pelo menos uma outra companhia que utiliza cruzadores de planta que tenham pelo menos “capacidade comum na técnica” também procuraram o gene sh2-i em uma fonte doadora da The University of Florida (como o inventor o fez). Entretanto, ao contrário dos presentes inventores, esta companhia foi incapaz de usar com êxito o gene sh2-i para produzir

148 linhagens precursoras e híbridas de milho doce desejáveis. Ao contrário, o presente inventor foi capaz de incorporar o gene sh2-i muito êxito dentro de genomas de planta em uma maneira para produzir sementes da linhagem de milho doce precursora e híbrida, materiais de planta e plantas tendo traços múltiplos intensificados, tais como aqueles que são debatidos acima, que inclui um crescimento e vigor intensificado de sementes e plantas (um traço fornecido pelo alelo homozigota recessivo sh2-i). O presente inventor foi capaz de realizar isto depois de uma quantidade significante de experimentação e teste e uma formulação e instituição de uma estratégia para usar: (i) o alelo homozigota recessivo sh2-i em uma linhagem precursora feminina, e apenas em uma linhagem precursora feminina (isto é, não em uma linhagem precursora masculina), como é debatido aqui na seção “Exemplos” (que fornece um crescimento e vigor intensificados para as sementes e plantas); e (ii) formas recessivas homozigotas de alelos de milho doce diferentes que fornecem traços diferentes para os híbridos desenvolvidos a partir destes, tais como tendo um gosto doce, um pericarpo macio e uma vida de prateleira longa (características fornecidas por outros alelos de milho doce, que o presente inventor usou em híbridos nas formas homozigotas recessivas junto com o gene sh2-i).

Além disso, quando a Elniversity of Florida forneceu uma “fonte doadora” do alelo sh2-i aos seus vários licenciados (que inclui o presente inventor e pelo menos uma companhia não relacionada que utiliza criadores de planta), a mesma forneceu o alelo sh2-i em uma forma que é homozigota recessiva para o alelo sh2-i, mas que foi homozigota dominante (SulSul SelSel) em relação aos alelos sugary-1 (sul) e sugary enhancer-1 (sei) de endosperma mutante (isto é, a mesma teve formas homozigotas dominantes destes dois alelos). Porque o alelo sh2-i foi homozigota recessivo (sh2-i sh2-i), o mesmo forneceu desempenho de muda intensificado que está associado com o gene mutante sh2-i (que é recessivo e, assim, deve ser

149 homozigota recessivo de mo a ter este traço expressado). Assim, a fonte doadora do alelo sh2-i teve o genótipo SulSul SelSel sh2-i sh2-i. Até agora, nenhuma das companhias que licenciaram o alelo sh2-i da University of Florida separadamente do cessionário da presente invenção foi capaz de desenvolver uma variedade de híbrido de milho doce comercialmente aceitável contendo o gene sh2-i para o mercado.

Usando marcadores moleculares, o presente inventor foi capaz de determinar o genótipo da fonte doadora do alelo sh2-i. Como é descrito na seção de Exemplos desta, o inventor foi capaz de compreender que o alelo homozigota recessivo sh2-i sh2-i (que produz o traço de vigor de muda desejável, visto que ambos os alelos são recessivos) deve estar presente contra um fundo genético de: (i) sulsul sei sei (uma combinação alélica homozigota recessiva dupla) em uma linhagem precursora feminina para produzir um genótipo de sulsul sei sei sh2-i sh2-i (uma combinação alélica homozigota recessiva tripla, de modo que os traços benéficos individuais de cada um dos três tipos de alelos foram cada um expressados, e não mascarados por uma inclusão de qualquer um dos alelos dominantes); ou (ii) sulsul (único alelo homozigota recessivo) em uma linhagem precursora feminina para produzir um genótipo de sulsul sh2-i sh2-i (uma combinação alélica homozigota recessiva dupla, de modo que os traços benéficos individuais de ambos dos dois tipos de alelos fossem cada um expressados, e não mascarados por uma inclusão de qualquer um dos alelos dominantes).

O inventor também realizou vários testes organolépticos de gosto e maciez do pericarpo e descobriu que a síntese e acúmulo de amido inaceitáveis que seguem o estágio de ingestão de pico reprovou o processo de montagem de híbridos com base no uso de duas linhagens de milho precursoras sh2-i (isto é, com ambas as linhagens precursoras masculina e feminina que incluem os alelos sh2-i). O inventor subsequentemente determinou que a melhor alternativa foi uma geração de híbridos do milho

150 doce compreendidos de uma linhagem de milho doce feminina sh2-i por uma linhagem de milho precursora masculina convencional de alta qualidade.

Assim, embora a University of Florida tenha posse do alelo sh2-i de milho doce, ela não o tem (ou não o usa) em um genótipo que fosse homozigota recessivo para todos os alelos que afetam traços do milho doce, que foram determinados pelo presente inventor como sendo um dos aspectos mais significantes de fazê-los funcionar quando usados em uma linhagem precursora para produzir sementes, plantas e materiais de planta híbridos tendo um vigor de muda e crescimento intensificados quando do cruzamento com uma outra linhagem precursora tendo um ou mais traços benéficos diferentes, tais como doçura, maciez do pericarpo e/ou vida de prateleira intensificados. O inventor determinou que um outro aspecto muito importante foi incluir o alelo sh2-i (em uma forma recessiva homozigota) apenas na linhagem precursora feminina. Um outro aspecto importante foi determinado cruzando-se uma tal linhagem precursora feminina com uma outra linhagem precursora que inclui um ou mais alelos, ou combinações alélicas, que fossem todas em uma forma homozigota recessiva (isto é homozigota recessiva tripla, homozigota recessiva dupla, homozigota recessiva única, ou seus semelhantes). Em uma tal combinação de linhagens precursoras, nenhum traços dominante resultaria e mascararia qualquer um dos traços recessivos desejáveis, e o genótipo recessivo resultaria em um fenótipo que inclui traços benéficos desejados fornecidos pelos alelos recessivos. (Ao contrário, quando cada uma ou ambas das linhagens precursoras que são cruzadas para produzir híbridos incluem alelos em uma forma heterozigota (isto é, que inclui um alelo dominante para um ou mais tipos de alelo), ou em uma forma dominante homozigota (isto é, que inclui dois alelos dominantes para um ou mais tipos de alelos), o fenótipo resultante de algumas ou todas das sementes de milho doce híbridas resultantes resultariam dos alelos dominantes (isto é, que não fornecem um traço benéfico aos híbridos de milho doce desenvolvidos a partir

151 destes), não dos alelos recessivos (que fornecem um traço benéfico quando presentes em uma forma homozigota recessiva). Os alelos dominantes têm um efeito de mascarar os traços dos alelos recessivos, que fornecem os traços fenotípicos benéficos.

Outros que licenciaram o gene sh2-i da University of Florida tiveram o mesmo problema que o presente inventor inicialmente teve com a fonte doadora de alelo sh2-i, mas não foram capazes de compreender como solucionar este problema, ou produzir sementes, materiais de planta ou plantas de milho doce híbridos tendo o traço benéfico de um vigor de muda intensificado quando do uso do alelo sh2-i licenciado. Ao contrário, o presente inventor solucionou este problema muito difícil usando marcadores moleculares e uma variedade de testes diferentes (teste organoléptico de gosto e maciez do pericarpo, teste de germinação quente e fria de laboratório, teste de campo, teste de vigor de muda e seus semelhantes), como é descrito na seção “Exemplos” aqui. O presente inventor foi capaz de usar o alelo sh2-i em uma linhagem precursora em uma forma homozigota recessiva e cruzar a mesma com uma outra linhagem precursora para produzir sementes, materiais de planta e plantas tendo: (i) um gosto doce (devido a um ou mais alelos diferentes em uma forma recessiva homozigota); (ii) uma vida de prateleira longa (devido a um ou mais alelos diferentes em uma forma homozigota recessiva); e (iii) um vigor de muda intensificado (devido ao alelo sh2-i em uma forma homozigota recessiva usada em uma linhagem precursora feminina), assim como os outros traços benéficos que são aqui descritos.

Além disso, todas as entidades que licenciaram o alelo sh2-i da University of Florida não esperavam que um alelo licenciado teria os problemas debatidos acima.

Embora a presente invenção tenha sido aqui descrita com especificidade, e com referência a certas de suas formas de realização

152 preferidas, aqueles de habilidade comum na técnica reconhecerão numerosas variações, modificações e substituições do que foi descrito que podem ser feitas, e que estão dentro do escopo e espírito da invenção. E intencionado que todas destas modificações e variações estejam dentro do escopo da presente invenção como a mesma é aqui descrita e reivindicada, e que a invenção seja limitada apenas pelo escopo das reivindicações que seguem, e que tais reivindicações sejam interpretadas tão amplamente quanto seja razoável.

Por todo este documento, vários livros, patentes, artigos de jornal, sítios da web e outras publicações foram citadas. As totalidades de cada um destes livros, patentes, artigos de jornal, sítios da web e outras publicações são por meio deste aqui incorporados por referência.

Claims

REIVINDICAÇÕES

1. Método para produzir uma planta de milho híbrida, material de planta ou semente que têm um vigor de muda intensificado em comparação com uma planta de milho híbrida, material de planta ou

5 semente mutantes convencionais shrunken-2 e capacidade intensificada para reter açúcar em um período de tempo seguindo um estágio de alimentação primário dos mesmos em comparação com uma planta de milho híbrida, material de planta ou semente mutantes convencionais sugary-1 ou shrunken-2i, caracterizado por compreender as seguintes

10 etapas:

(a) identificar uma linhagem de planta de milho pura que inclui um ou mais alelos de endosperma mutantes desejados no seu genoma, isoladamente ou em combinação, em que os alelos do endosperma mutantes são sugary-1 (su1), enhancer-1 (se1) ou shrunken-2 (sh2), ou

15 qualquer combinação dos mesmos, em que:

(i) su1 é ligado a um ou mais marcador molecular phi295450, que podem ser detectados por primers de SEQ ID NO: 22 e 23; marcador molecular phi308090, que pode ser detectado por primers de SEQ ID NO: 24 e 25; marcador molecular phi076, que pode ser detectado

20 por primers de SEQ ID NO: 26 e 27; e marcador molecular phi079, que pode ser detectado por primers de SEQ ID NO: 28 e 29;

(ii) se1 é ligado a um ou mais do marcador molecular umc1551, que pode ser detectado por primers de SEQ ID NO: 6 e 7; marcador molecular bnlg1520, que pode ser detectado por primers de SEQ

25 ID NO: 8 e 9; marcador molecular phi427434, que pode ser detectado por primers de SEQ ID NO: 10 e 11; e marcador molecular umc2077, que pode ser detectado por primers de SEQ ID NO: 12 e 13; e (iii) sh2 é ligado a um ou mais do marcador molecular umc2174, que pode ser detectado por primers de SEQ ID NO: 14 e 15;

Petição 870190021433, de 01/03/2019, pág. 14/52
2/4 marcador molecular dupssr, que pode ser detectado por primers de SEQ ID NO: 16 e 17; marcador molecular bmc1257, que pode ser detectado por primers de SEQ ID NO: 18 e 19; e o marcador molecular umc2277, que pode ser detectado por primers de SEQ ID NO: 20 e 21;

5 (b) identificar uma linhagem de planta de milho precursora que inclui um alelo mutante shrunken-2i (sh2-i) no seu genoma, em que:

sh2-i tem como característica uma mutação G para A no nucleotídeo terminal 3 ’ no íntron 2 da sequência nucleotídica genômica sh2 do tipo selvagem da SEQ ID NO: 1;

10 (c) retro cruzar o alelo mutante shrunken-2i a partir da linhagem de plantas precursoras de milho da etapa (b) no genoma da linhagem de planta de milho pura tendo um ou mais dos alelos de endosperma mutantes desejados da etapa (a), em que a planta de milho pura da etapa (a) tem um fundo genético desejado de su1su1 se1se1 sh2sh2,

15 su1su1 se1se1, Su1Su1 se1se1 sh2sh2, Su1Su1 se1se1, Su1Su1 sh2sh2;

(d) selecionar uma linhagem de planta de milho produzida pelo retro cruzamento da etapa (c) tendo um alelo mutante shrunken-2i em um estado homozigoto incorporado no fundo genético desejado de (c), em que a linhagem de planta de milho selecionada inclui uma combinação

20 alélica de endosperma de su1su1 se1se1 sh2-1sh2-1, Su1Su1 se1se1 sh2ish2-i, Su1Su1 sh2-ish2-i no seu genoma; e (e) cruzar a linhagem de planta de milho convertida selecionada da etapa (d) como uma fêmea com uma linhagem de planta de milho masculina que não inclui um alelo mutante shrunken-2i no seu

25 genoma e que inclui uma construção alélica de endosperma homozigoto recessivo no seu genoma, em que tal construção alélica de endosperma homozigoto recessivo é Su1Su1 Se1Se1 sh2sh2, su1su1 Se1Se1 sh2sh2, su1su1 se1se1 sh2sh2, su1su1 sh2sh2, para produzir uma planta de milho híbrida

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3/4 em que a planta de milho híbrida, material de planta ou semente têm um vigor de muda intensificado em comparação com uma planta de milho híbrida, material de planta ou semente mutantes convencionais shrunken-2; e em que a planta de milho híbrida, material de

5 planta ou semente têm uma capacidade intensificada para reter açúcar em um período de tempo seguindo um estágio de alimentação primário dos mesmos em comparação com uma planta de milho híbrida, material de planta ou semente mutantes convencionais sugary-1 ou shrunken-2i.

2. Método, de acordo com a reivindicação 1, caracterizado 10 pelo fato dos marcadores moleculares serem utilizados na etapa (a) para identificar a linhagem de planta de milho pura que inclui um ou mais alelos de endosperma mutantes desejados no seu genoma.

3. Método, de acordo com a reivindicação 1, caracterizado pelo fato de um ou mais marcadores moleculares serem utilizados para

15 retro cruzar o alelo mutante shrunken-2i no genoma da linhagem de planta de milho pura tendo um fundo genético desejado.
4. Método, de acordo com a reivindicação 1, caracterizado pelo fato da planta de milho, material de planta ou semente ser classificado como Zea mays, var. rugosa.

20 5. Método, de acordo com a reivindicação 4, caracterizado pelo fato da planta de milho híbrida, material de planta ou semente ter uma capacidade intensificada para reter açúcar nos dias 1-7 ou dias 1-14 imediatamente após um estágio de alimentação primário destes em comparação com uma planta de milho híbrida, material de planta ou

25 semente mutantes convencionais sugary-1 ou shrunken-2i.

6. Método, de acordo com a reivindicação 4, caracterizado pelo fato do método produzir Híbrido de Milho Doce ACX SS 1082Y sh2i, depositado no ATCC sob PTA-11467.

7. Método, de acordo com a reivindicação 4, caracterizado

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4/4 pelo fato do método produzir Híbrido de Milho Doce ACR SS 4500Y, depositado no ATCC sob PTA-11472.

8. Método de acordo com a reivindicação 4, caracterizado por produzir Híbrido de Milho Doce ACR SS 4501 Y, depositado no
5 ATCC sob PTA-11468.