CN102449460A

CN102449460A - 微生物浓集方法和装置

Info

Publication number: CN102449460A
Application number: CN201080022685XA
Authority: CN
Inventors: 曼基里·T·克什尔萨嘉; 安德鲁·W·拉宾斯
Original assignee: 3M Innovative Properties Co
Current assignee: 3M Innovative Properties Co
Priority date: 2009-04-03
Filing date: 2010-03-22
Publication date: 2012-05-09
Anticipated expiration: 2030-03-22
Also published as: CN102449460B; EP2414809A1; US20180224360A1; EP2414809B1; JP2012522506A; JP5800796B2; US9964474B2; US20120009569A1; EP2414809A4; WO2010114725A1

Abstract

本发明公开了用于捕集或浓集微生物的方法，以用于检测或测定，所述方法包括：(a)提供浓集装置，所述浓集装置包括烧结的多孔聚合物基质，所述烧结的多孔聚合物基质含有至少一种浓集剂，所述至少一种浓集剂包含硅藻土，所述硅藻土在其表面的至少一部分上载有表面处理剂，所述表面处理剂包括表面改性剂，所述表面改性剂包含氧化铁、二氧化钛、细纳米级金或铂、或它们的组合；(b)提供样品，所述样品包含至少一种微生物菌株；以及(c)使所述浓集装置与所述样品接触，使得所述至少一种微生物菌株的至少一部分被结合到所述浓集装置或被所述浓集装置捕集。

Description

微生物浓集方法和装置

优先权声明

本专利申请要求2009年4月3日提交的美国临时专利申请号61/166,262的优先权，籍此将该临时专利申请的内容以引用方式并入本文。

技术领域

本发明涉及用于捕集或浓集微生物的方法，使得微生物保持活力以用于检测或测定。在其他方面，本发明还涉及可用于实施这种方法的浓集装置(以及包括该装置的诊断试剂盒)以及涉及用于装置制备的方法。

背景技术

由微生物污染导致的食源性疾病和医院内获得性感染为世界各地许多地方所关注。因此，常常需要或必要的是，测定多种临床样品、食品样品、环境样品或其他样品中细菌或其他微生物的存在，以确定所存在的微生物的身份和/或量。

例如，甚至在存在其他细菌种类的情况下，也可测定细菌DNA或细菌RNA，以评估特定细菌种类的存在与否。然而，检测特定细菌的存在的能力至少部分取决于所分析的样品中细菌的浓度。可对细菌样品进行铺板或培养，以增加样品中细菌的数量，来确保足够的检测水平，但培养步骤通常需要大量的时间且因此会显著耽搁评估结果。

使样品中的细菌浓集可缩短培养时间或甚至消除对于培养步骤的需要。因此，已经开发了通过使用特定细菌株系的特异性抗体(例如，为抗体包被的磁性颗粒或非磁性颗粒的形式)来分离(并由此浓集)该株系的方法。然而，这些方法往往昂贵，而且对于至少一些诊断应用来说速度仍比期望的稍慢。

也已经使用了非菌株特异性的浓集方法(例如，以获得对样品中所存在的微生物的更总体性的评估)。在浓集了微生物混合群体之后，如果需要，通过使用株系特异性探针来测定特定株系的存在。

已经通过基于碳水化合物和凝集素蛋白相互作用的方法实现了微生物的非特异性浓集或捕集。涂覆脱乙酰壳多糖的载体已经用作非特异性捕集装置，并且用作微生物营养素的物质(例如，碳水化合物、维生素、铁螯合化合物以及铁载体)也已经被描述为可用作配体，以进行微生物的非特异性捕集。

多种无机材料(例如，羟基磷灰石和金属氢氧化物)已经用于非特异性结合和浓集细菌。物理浓集方法(例如，过滤法、色谱法、离心法和重力沉降法)也已经被用于非特异性捕集，其使用和/或不使用无机结合剂。这些非特异性浓集方法具有不同的速度(至少一些食品检测程序仍需要至少过夜孵育作为原代培养富集步骤)、成本(至少一些需要昂贵的设备、材料和/或受过训练的技术人员)、样品要求(例如，样品特性和/或体积限制)、空间要求、易于使用性(至少一些需要复杂的多步骤方法)、就地使用的适用性和/或有效性。

发明内容

因此，我们认识到迫切需要用于快速检测病原性微生物的方法。这种方法将优选为不仅操作迅速而且成本低廉、操作简单(不涉及复杂的设备或程序)和/或在多种条件下(例如，不同类型样品基质和/或病原性微生物、不同微生物负荷和不同样品体积)有效。

简而言之，在一个方面，本发明提供了用于非特异性浓集样品中存在的微生物株系(例如，细菌、真菌、酵母菌、原生动物、病毒(包括无包膜病毒和有包膜病毒)和细菌内生孢子的菌株)的方法，使得微生物保留活力，以用于检测或测定该株系中的一者或多者。所述方法包括：(a)提供浓集装置，所述浓集装置包括烧结的多孔聚合物基质，所述烧结的多孔聚合物基质含有至少一种浓集剂，所述至少一种浓集剂包含硅藻土，所述硅藻土在其表面的至少一部分上载有表面处理剂，所述表面处理剂包括表面改性剂，所述表面改性剂包含氧化铁、二氧化钛、细纳米级金或铂、或它们的组合；(b)提供样品，所述样品包含至少一种微生物菌株(优选以流体形式)；以及(c)使浓集装置与样品接触(优选通过使样品穿过浓集装置)，使得至少一种微生物菌株的至少一部分被结合到浓集装置或被浓集装置捕集。

优选的是，所述方法还包括检测至少一种结合的微生物菌株的存在(例如，通过基于培养的检测方法、显微镜/成像检测方法、基因检测方法、基于发光的检测方法或免疫检测方法)。所述方法还可任选地包括将浓集装置与样品分隔开和/或培养性地富集至少一种结合的微生物菌株(例如，通过在通用或微生物特异性的培养基中孵育分离的浓集装置，这取决于需要通用的微生物富集还是选择性的微生物富集)和/或在样品接触(例如，通过使洗脱剂或裂解剂穿过浓集装置)之后将捕集的微生物(或其一种或多种组分)与浓集装置隔离或分隔开。

本发明的方法不靶向特定的微生物菌株。相反，已经发现，烧结的多孔聚合物基质中包含某些成本相对低廉的无机材料的浓集装置可在捕集多种微生物中惊人地有效(并且相对于不含无机材料的对应装置而言，在通过洗脱隔离或分离捕集的微生物中惊人地有效)。这种装置可以以非菌株特异性方式浓集存在于样品(例如，食品样品)中的微生物株系，以使得可更容易快速地测定该微生物株系中的一者或多者(优选一种或多种细菌株系)。

本发明的方法相对简单且成本低廉(不需要复杂的设备或昂贵的菌株特异性材料)，并且可相对快速(相对于未接触浓集装置的对应对照样品，优选的实施例在少于约30分钟内捕集存在于相对均匀的流体样品中的微生物的至少约70％(更优选地至少约80％；最优选至少约90％))。另外，所述方法可对于多种微生物(包括(例如)革兰氏阳性菌和革兰氏阴性菌两者的病原体)和多种样品(不同的样品基质，并且与至少一些现有技术的方法不同，甚至对微生物含量低和/或体积大的样品)也有效。因此，本发明的方法的至少一些实施例可满足上述对于在多种条件下快速检测病原性微生物的成本低廉、方法简单的迫切需要。

本发明的方法可尤其有利于浓集食品样品中的微生物(例如，含颗粒的食品样品，尤其是包含相对较粗颗粒的那些)，因为所述方法中所用的浓集装置与至少一些过滤装置(例如，绝对微米过滤器)相比可具有至少稍高的抗阻塞性。这可有利于更完整的样品处理(这对于消除食品检测中的假阴性测定至关重要)和体积相对较大的样品处理(例如，在现场条件下)。

在另一方面，本发明还提供浓集装置，所述浓集装置包括烧结的多孔聚合物基质，所述烧结的多孔聚合物基质含有至少一种浓集剂，所述至少一种浓集剂包含硅藻土，所述硅藻土在其表面的至少一部分上载有表面处理剂，所述表面处理剂包括表面改性剂，所述表面改性剂包含氧化铁、二氧化钛、细纳米级金或铂、或它们的组合。本发明还提供可用于实施本发明的浓集方法的诊断试剂盒，所述诊断试剂盒包括：(a)本发明的至少一种所述浓集装置；和(b)用于实施上述浓集方法的至少一种检测容器或检测试剂。

在另一方面，本发明提供用于制备浓集装置的方法，所述方法包括：(a)提供混合物，所述混合物包含(1)至少一种颗粒状的可烧结聚合物(优选以粉末形式)和(2)至少一种颗粒浓集剂，所述颗粒浓集剂包含硅藻土，所述硅藻土在其表面的至少一部分上载有表面处理剂，所述表面处理剂包括表面改性剂，所述表面改性剂包含氧化铁、二氧化钛、细纳米级金或铂、或它们的组合；以及(b)将混合物加热到足以烧结聚合物的温度，以便形成包含颗粒浓集剂的烧结的多孔聚合物基质。

附图说明

参照以下描述、所附权利要求书和附图，将会更好地理解本发明的这些和其他特征、方面以及优点，其中：

图1以侧面剖视图示出用于制备浓集剂的设备，所述浓集剂用于实施下文实例部分中所述的本发明的方法的实施例。

图2以透视图示出图1的设备。

这些理想化的图形未按比例绘制，并且旨在仅为示例性而非限制性。

具体实施方式

在以下详细说明中，描述了各组数值范围(例如，特定部分中的碳原子数的数值范围、特定组分的量的数值范围等等)，并且在每一组数值范围内，范围的任何下限都可与范围的任何上限配对。

定义

如本专利申请中所用：

“浓集剂”意指用于浓集微生物的组合物；

“检测”意指识别微生物的至少一种组分，由此确定微生物的存在。

“基因检测”意指对衍生自靶微生物的遗传物质组分例如DNA或RNA的识别。

“免疫检测”意指对衍生自靶微生物的抗原物质例如蛋白质或蛋白多糖的识别。

“微生物”意指具有适用于分析或检测的遗传物质的任何细胞或粒子(包括(例如)细菌、酵母、病毒和细菌内生孢子)；

“微生物菌株”意指可通过检测方法分辨的特定类型的微生物(例如，不同属的微生物，属内不同种的微生物或种内不同分离物的微生物)；

“样品”意指所采集的(例如，待分析的)物质或材料；

“样品基质”意指除微生物之外的样品组分；

“烧结”(关于大量的聚合物粒子)意指通过应用加热来引起聚合物粒子中的至少一些的粒间组合或粘合、而未引起完全的粒子熔融(例如，通过将大量的聚合物粒子加热到介于聚合物的玻璃化转变温度和熔点之间的温度以对粒子进行软化)；

“可烧结的”(关于聚合物)意指可被烧结的聚合物；

“被烧结的”(关于基质)意指通过烧结形成；

“靶微生物”意指需要检测的任何微生物；

“穿透孔”(关于多孔基质)意指包括穿过基质的通道或沟槽(具有单独的入口和出口)的孔；

“弯曲通道基质”意指具有至少一个曲折穿透孔的多孔基质。

浓集剂

适用于实施本发明的方法的浓集剂包括下述物质，所述物质包含硅藻土，所述硅藻土在其表面的至少一部分上载有表面处理剂，所述表面处理剂包括表面改性剂，所述表面改性剂包含氧化铁、二氧化钛、细纳米级金或铂、或它们的组合(优选二氧化钛、细纳米级金或铂、或它们的组合)。使用这种浓集剂进行的浓集或捕集通常不特异性针对任何特定菌株、种或类型的微生物，因此提供了对样品中微生物全体群落的浓集。然后，可使用任何已知的检测方法用特异性探针从捕集的微生物群落当中检测特定的微生物株系。因此，所述浓集剂可用于检测临床样品、食品样品、环境样品或其他样品中的微生物污染物或病原体(特别是食源性病原体，例如细菌)。

在实施本发明的方法中，浓集剂可以基本上任何颗粒形式(优选相对干燥或不含挥发物的形式)使用，所述颗粒形式适于与颗粒聚合物共混，以形成用于所述方法中的浓集装置。例如，浓集剂可以粉末形式使用或可应用到例如微珠等等之类的颗粒载体。优选浓集剂以粉末形式使用。

当分散于或悬浮于水系中时，无机材料显示具有材料和水系pH特征性的表面电荷。整个材料-水界面上的电势称为“ζ电势”，该电势从电泳迁移率(即，材料颗粒在置于水系中的带电电极之间移动的速率)计算得出。用于实施本发明的方法的浓集剂中的至少一些与未经处理的硅藻土相比具有带至少稍高正电的ζ电势，并且浓集剂可令人惊讶地比未经处理的硅藻土能显著更有效地浓集表面通常趋于带负电的微生物(例如细菌)。优选的是，这种浓集剂在pH值为约7时的ζ电势为负ζ电势(更优选地在pH值为约7时的ζ电势为在约-5毫伏至约-20毫伏的范围内；甚至更优选地在pH值为约7时的ζ电势为在约-8毫伏至约-19毫伏的范围内；最优选在pH值为约7时的ζ电势为在约-10毫伏至约-18毫伏的范围内)。

因此，已经发现，包含特定类型的表面处理的或表面改性的硅藻土(即，具有包括表面改性剂(包括氧化铁、二氧化钛、细纳米级金或铂、或它们的组合)的表面处理剂)的浓集剂可令人惊讶地比未经处理的硅藻土能更有效地浓集微生物。表面处理物还优选包括选自以下物质的金属氧化物：氧化铁、氧化锌、氧化铝等等、以及它们的组合(更优选地为氧化铁)。尽管已知例如金之类的贵金属具有抗微生物特性，但令人惊讶的是，用于本发明的方法中的含金浓集剂不仅可有效用于浓集微生物而且还可使得它们保留活性，以用于检测或分析。

可用的表面改性剂包括：细纳米级金；细纳米级铂；与至少一种金属氧化物(优选二氧化钛、氧化铁、或它们的组合)组合的细纳米级金；二氧化钛；与至少一种其他金属氧化物(即，除二氧化钛之外)组合的二氧化钛；氧化铁；与至少一种其他金属氧化物(即，除氧化铁之外)组合的氧化铁等等；以及它们的组合。优选的表面改性剂包括：细纳米级金；细纳米级铂；与至少氧化铁或二氧化钛组合的细纳米级金；二氧化钛；与至少氧化铁组合的二氧化钛；氧化铁；以及它们的组合。

更优选的表面改性剂包括：细纳米级金；细纳米级铂；与氧化铁或二氧化钛组合的细纳米级金；二氧化钛；与氧化铁组合的二氧化钛；以及它们的组合(甚至更优选地为细纳米级金；与氧化铁或二氧化钛组合的细纳米级金；与氧化铁组合的二氧化钛；以及它们的组合)；最优选的是细纳米级金、与氧化铁或二氧化钛组合的细纳米级金、以及它们的组合。

金和/或铂

包含细纳米级金或铂的浓集剂可通过以下方法制备：通过物理气相沉积(任选地，通过氧化气氛中的物理气相沉积)将金或铂沉积在硅藻土上。

如本文所用，术语“细纳米级金或铂”是指使所有维度上的尺寸均为小于或等于5纳米(nm)的金或铂团粒(例如，粒子或原子簇)。优选所沉积金或铂的至少一部分在所有维度(例如，粒径或原子簇直径)上的平均尺寸范围为至多(小于或等于)约10nm(更优选地至多约5nm；甚至更优选地至多约3nm)。

在最优选的实施例中，金的至少一部分是超纳米级的(即，使至少两个维度上的尺寸为小于0.5nm，并且使所有维度上的尺寸为小于1.5nm)。如本领域所熟知，可通过透射电子显微镜(TEM)分析法来测定单个金或铂纳米粒子的尺寸。

提供于硅藻土上的金或铂的量可在宽范围内变化。由于金和铂的价格昂贵，因此期望使用不超过实现所需浓集活性程度而所需要的合理量。另外，因为纳米级金或铂在使用PVD沉积时可具有高度移动性，如果使用过多的金或铂，则活性可因金或铂中的至少一些聚结成较大团粒而损失。

由于这些原因，基于硅藻土和金或铂的总重量，硅藻土上的金或铂的载重优选为在约0.005重量％(更优选地为0.05重量％)至约10重量％、更优选地为约0.005重量％(甚至更优选地为0.05重量％)至约5重量％、并且甚至更优选地为约0.005重量％(最优选地为0.05重量％)至约2.5重量％的范围内。

可以通过PVD技术(例如，通过溅射)沉积金和铂，以在载体表面上形成浓集活性的细纳米级粒子或原子簇。据信，金属主要以元素形式沉积，但也可存在其它氧化态。

除了金和/或铂之外，还可在同一硅藻土载体和/或与含金和/或含铂载体混合的其他载体上提供一种或多种其他金属。这种其它金属的实例包括银、钯、铑、钌、锇、铜、铱等等，以及它们的组合。如果使用这些其它金属，则可从与所使用的金或铂源靶相同或不同的靶源将它们共沉积到载体上。或者，可在沉积金和/或铂之前或之后将这些金属设置在载体上。可在沉积金和/或铂之前有利地将需热处理活化的金属施加到载体上并进行热处理。

物理气相沉积是指金属从含金属的源或靶向载体介质的物理转移。尽管在实际操作当中，金属可以作为极其细小的团粒(每个团粒由不止一个原子构成)转移，但物理气相沉积可以被视为涉及按原子接着原子的方式沉积。沉积的金属可以与载体介质的表面发生物理、化学、离子和/或其它形式的相互作用。

物理气相沉积优选发生在下述温度和真空条件下，其中金属具有相当的移动性并倾向于在载体介质的表面上迁移直到以某种方式(例如通过粘附于载体表面上的或非常接近载体表面的位点)被固定。粘附位点可以包含缺陷(例如表面空位)、结构间断(例如台阶和位错)和介于相或晶体或其它金属物质(例如小金属簇)之间的界面边界。显著通过PVD沉积的金属为足够固定的，使得金属可保持高水平的活性。相比之下，常规的方法往往使金属聚结成会使活性受损甚至失去活性的这种大团粒。

可以各种不同的方式进行物理气相沉积。代表性的方法包括溅射沉积(优选的)、蒸镀和阴极电弧沉积。可使用这些或其他PVD方法中的任何者来制备用于实施本发明的方法的浓集剂，但PVD技术的特性可赋予所得活性。

例如，物理气相沉积技术的能量可影响沉积的金属的移动性，并从而影响其聚结的趋势。较高的能量趋于对应于增加的金属聚结趋势。增加的聚结继而趋于降低活性。一般来说，由蒸镀沉积物质的能量最低，更高的是溅射沉积(其可以包含一些离子含量，其中碰撞金属物质中的一小部分被离子化)，而最高的是阴极电弧沉积(其可以包含数十个百分比的离子含量)。因此，如果某种PVD技术产生的沉积金属的移动性超出所需，则采用能量较少的PVD技术代替之可能是有用的。

为了确保载体表面得到足够的处理，优选在充分混合(例如，翻滚、流化、碾磨等)待处理的载体介质的同时进行物理气相沉积。用于PVD沉积的翻滚粒子的方法在美国专利No.4,618,525(Chamberlain等人)中有所描述，其说明书以引用的方式并入本文。

当在细粒子或细粒子聚集体(例如，平均直径为小于约10微米)上实施PVD时，优选在PVD过程中的至少一部分期间对载体介质既进行混合又进行粉碎(例如，研磨或碾磨到一定程度)。这可有助于在沉积期间保持粒子或聚集体的分离和自由流动。就细粒子或细粒子聚集体而言，可能有利的是可以尽可能剧烈和迅速地混合粒子，同时仍保持金属的受控沉积。

可通过利用目前使用的或将来为此目的开发的任何类型的设备来实施PVD。然而，优选的设备10示于图1和图2中。设备10包括限定真空室14的壳体12，该真空室14容纳有粒子搅拌器16。壳体12(其可根据需要用铝合金制成)为竖直取向的中空圆柱体(例如，高为45cm，直径为50cm)。基座18包含用于高真空闸阀22(其后接六英寸扩散泵24)的端口20以及用于粒子搅拌器16的支承体26。真空室14能够被抽空到在10-6托的范围内的背景压力。

壳体12的顶部包括可拆卸的橡胶L垫圈密封的板28，其上配有外部安装的直径为3英寸的直流(dc)磁控溅射沉积源30(一种US Gun II沉积源，US，INC.(San Jose，CA))。金或铂溅射靶32(例如，7.6cm(3.0英寸)直径×0.48cm(3/16英寸)厚)固定到溅射沉积源30中。溅射沉积源30由配有Sparc-le 20消弧系统(Advanced Energy Industries，Inc(Fort Collins，CO))的MDX-10Magnetron Drive(MDX-10磁控管驱动器)(Advanced Energy Industries，Inc(Fort Collins，CO))供电。

粒子搅拌器16是带有矩形开口34(例如，6.5cm×7.5cm)的中空滚筒(例如，12cm长×9.5cm横向直径)。开口34设置在溅射靶32的表面36的正下方约7cm处，从而溅射的金属原子可进入搅拌器空间38。搅拌器16配有与其轴线对准的轴40。轴40具有矩形横截面(例如，1cm×1cm)，与四个矩形叶片42螺栓连接，所述矩形叶片形成了被翻滚的载体粒子的搅拌装置或搅拌叶轮。桨片42各包含两个洞44(例如，直径为2cm)，以促进包含在由桨片42与粒子搅拌器16形成的四个象限中的每一个中的粒子空间之间的流通。选择叶片42的尺寸以使其与搅拌器壁48之间的侧部间距和端部间距为2.7mm或1.7mm。

可以在宽范围内的基本上任意所需的温度条件下进行物理气相沉积。然而，如果在相对较低的温度下沉积金属(例如，温度为低于约150℃、优选低于约50℃、更优选地在环境温度(例如，约20℃至约27℃)或更低)，则沉积的金属可具有更大的活性(或许是由于缺陷更多和/或移动性及聚结程度更低)。基于有效性和经济性的考虑，环境条件下的操作通常可以是优选的，因为在沉积过程中不需要进行加热或冷冻。

可在惰性溅射气体气氛中(例如，在氩、氦、氙、氡或它们中的两者或更多者的混合物(优选氩)中)进行物理气相沉积，并且可任选在氧化气氛中进行物理气相沉积。氧化气氛中优选包含至少一种含氧气体(更优选地含氧气体选自氧、水、过氧化氢、臭氧、以及它们的组合；甚至更优选地含氧气体选自氧、水、以及它们的组合；最优选的是氧)。氧化气氛中还包含惰性溅射气体，如氩、氦、氙、氡或它们中的两种或更多种的混合物(优选为氩)。在PVD过程期间，真空室中的(所有气体的)总气压可以为约1毫托至约25毫托(优选为约5毫托至约15毫托)。基于真空室中所有气体的总重量，氧化气氛中可以包含约0.05重量％至约60重量％的含氧气体(优选为约0.1重量％至约50重量％；更优选地为约0.5重量％至约25重量％)。

硅藻土载体介质可任选在金属沉积之前进行煅烧，但这可增加其结晶二氧化硅的含量。由于金和铂在通过PVD沉积时立即具有活性，因此通常不需要在金属沉积之后进行热处理，这与通过一些其他方法的沉积不同。然而如果需要，也可实施这种热处理或煅烧，以提高活性。

通常，热处理可涉及在约125℃至约1000℃的范围内的温度下对载体加热约1秒至约40小时、优选为约1分钟至约6小时的时间段，加热可以在任何合适的气氛中进行，例如空气、惰性气氛(例如氮、二氧化碳、氩)、还原性气氛(例如氢)等等。采用的具体热条件可取决于包括载体性质在内的各种因素。

一般来讲，热处理可以在低于使载体组分发生分解、降解或者说是不当地受到热损害的温度下实施。根据例如载体性质、金属量等等之类的因素，如果在过高的温度下对系统进行热处理，则活性可能会在一定程度上受到损害。

二氧化钛、氧化铁和/或其他金属氧化物

包含金属氧化物的浓集剂可通过下述方式制备，所述方式为通过水解可水解金属氧化物前体化合物将金属氧化物沉积于硅藻土上。合适的金属氧化物前体化合物包括可被水解以形成金属氧化物的金属络合物和金属盐。可用的金属络合物包括下述络合物，其具有醇盐配体、过氧化氢配体、羧酸盐官能化配体等等，以及它们的组合。可用的金属盐包括金属硫酸盐、硝酸盐、卤化物、碳酸盐、草酸盐、氢氧化物等等、以及它们的组合。

使用金属盐或过氧化氢或羧酸盐官能化配体的金属络合物时，可通过化学方法或热方法中的任一者来诱导水解。在化学诱导水解中，可将金属盐以溶液形式引入硅藻土的分散体中，并且通过加入碱溶液来增加所得组合的pH值直至金属盐作为金属的氢氧化物络合物沉淀于硅藻土上。合适的碱包括碱金属和碱土金属的氢氧化物和碳酸盐、铵和烷基铵的氢氧化物和碳酸盐等等、以及它们的组合。金属盐溶液和碱溶液的浓度通常可为约0.1M至约2M。

优选在搅拌(优选快速搅拌)硅藻土分散体的情况下实施将金属盐加入至硅藻土中。可将金属盐溶液和碱溶液单独(以任一顺序)或同时引入到硅藻土分散体中，以便使所得金属氢氧化物络合物与硅藻土的表面进行优选基本上均匀的反应。在反应期间可任选加热反应混合物，以加快反应速度。通常，所添加的碱量可等于金属的摩尔数乘以金属盐或金属络合物上的非氧或非羟基抗衡离子数。

或者，当使用钛或铁的盐时，可热诱导金属盐水解以形成金属的氢氧化物络合物并且与硅藻土的表面相互作用。在这种情况下，通常可将金属盐溶液加入到下述硅藻土分散体(优选经过搅拌的分散体)中，所述硅藻土分散体已被加热到足够高的温度(例如，大于约50℃)，以促进金属盐的水解。优选温度为介于约75℃和100℃之间，但如果在高压釜设备中进行反应，则可使用较高的温度。

当使用金属醇盐络合物时，可诱导金属络合物水解以通过金属醇盐在醇溶液中的部分水解来形成金属的氢氧化物络合物。在存在硅藻土的情况下，金属醇盐溶液的水解可产生沉积于硅藻土表面上的金属氢氧化物物质。

或者，在存在硅藻土的情况下，可通过使金属醇盐在气相中与水反应来将金属醇盐水解并沉积到硅藻土表面上。在这种情况下，可在(例如)流化床反应器和转筒式反应器中的任一者中于沉积期间搅动硅藻土。

在存在硅藻土的情况下，金属氧化物前体化合物进行上述水解之后，可通过沉淀或通过过滤或通过其他已知的技术来分离所得的经表面处理的硅藻土。分离的产物可通过用水洗涤来进行纯化并且随后可进行干燥(例如，在50℃至150℃下)。

虽然通常经表面处理的硅藻土在干燥之后可以是官能化的，但可任选通过在空气中加热到约250℃至650℃进行煅烧来去除挥发性副产物，而通常不会损失官能性。当将金属醇盐用作金属氧化物前体化合物时，优选进行该煅烧步骤。

通常，利用铁的金属氧化物前体化合物时，所得的表面处理包括氧化铁纳米颗粒。当氧化铁与硅藻土的重量比为约0.08时，X射线衍射图案(XRD)不显示明确的氧化铁材料的存在。相反，在

和

下观察到额外的X射线反射。该材料的TEM检查显示出硅藻土表面相对均匀地涂布有球形纳米颗粒状氧化铁材料。氧化铁材料的微晶尺寸为小于约20nm，其中大部分微晶的直径为小于约10nm。这些球形微晶在硅藻土表面上的堆积具有致密的外观，并且硅藻土表面由于这些微晶的存在而看起来为粗糙的表面。

通常，利用钛的金属氧化物前体化合物时，所得的表面处理包括纳米颗粒二氧化钛。当将二氧化钛沉积到硅藻土上时，所得产物在煅烧至约350℃之后的XRD可显示出存在锐钛型二氧化钛的小微晶。利用相对较低的钛/硅藻土比率时或在其中使用钛和铁氧化物前体的混合物的情况下，通过X射线分析通常观察不到锐钛的迹象。

由于二氧化钛为熟知的强效光氧化催化剂，因此经二氧化钛改性的硅藻土浓集剂可用于浓集微生物以进行分析，并且随后还可任选地用作光活化剂，以用于杀灭残余微生物和去除使用之后的有害的有机杂质。因此，经二氧化钛改性的硅藻土可分离待分析的生物材料并随后进行光化学清洁以便重复利用。另外可将这些材料用于其中可能需要微生物去除以及抗微生物效果的过滤应用中。

硅藻土

硅藻土为由硅藻(一种海洋栖居微生物)残余物产生的天然硅土材料。因此，其可得自天然来源并且也为市售的(例如，得自Alfa Aesar(Ward Hill，MA)，它是Johnson Matthey Company旗下的公司)。硅藻土粒子通常具有小的、开放的二氧化硅网络(形式为对称立方体、圆柱体、球体、板、矩形盒等等)。这些粒子的孔结构通常可为显著均匀的结构。

硅藻土可以作为开采的原材料或以纯化和任选研磨的粒子用于实施本发明的方法。优选硅藻土为碾磨粒子形式，该粒子的直径尺寸为在约1微米至约50微米(更优选地约3微米至约10微米)的范围内。

可任选将硅藻土在使用之前进行热处理，以去除有机残余物的任何遗迹。如果使用热处理，则可优选热处理为500℃或更低，因为较高温度可能不利地产生高含量的结晶二氧化硅。

浓集装置

适用于实施本发明的方法的浓集装置包括具有烧结的多孔聚合物基质的那些，所述烧结的多孔聚合物基质包含上述浓集剂中的至少一种。例如，可通过下述方式来制备这种浓集装置：将至少一种颗粒状的可烧结聚合物(优选以粉末形式)与至少一种颗粒浓集剂混合或共混，随后将所得混合物加热到足以烧结该聚合物的温度。此方法以及其他已知或将来开发的烧结方法可用于在冷却时提供包含颗粒浓集剂的烧结的多孔聚合物基质。

例如，烧结可引起聚合物粒子在其接触点处软化，并且后续的冷却可随后引起粒子的熔合。可产生包含颗粒浓集剂的硬化或自支承的多孔聚合物主体(例如，其中浓集剂被嵌入聚合物主体内或聚合物主体的表面上)。这会形成具有相对复杂孔结构(优选包括弯曲通道基质的浓集装置)和相对良好机械强度的浓集装置。

用于制备浓集装置的聚合物包括可烧结聚合物及其组合。优选的可烧结聚合物包括热塑性聚合物及其组合。更优选地，热塑性聚合物可被选择为具有相对较高的粘度和相对较低的熔融流动速率。这可有利于烧结过程期间的粒子形状保持。

可用的可烧结聚合物包括聚烯烃(包括烯烃均聚物和共聚物以及烯烃与其他乙烯基单体的共聚物)、聚砜、聚醚砜、聚苯硫醚等等，以及它们的组合。可用聚合物的代表性实例包括乙烯醋酸乙烯酯(EVA)聚合物、乙烯丙烯酸甲酯(EMA)聚合物、聚乙烯(包括(例如)低密度聚乙烯(LDPE)、线性低密度聚乙烯(LLDPE)、高密度聚乙烯(HDPE)和超高分子量聚乙烯(UHMWPE))、聚丙烯、二元乙丙橡胶、三元乙丙橡胶、聚苯乙烯、聚(1-丁烯)、聚(2-丁烯)、聚(1-戊烯)、聚(2-戊烯)、聚(3-甲基-1-戊烯)、聚(4-甲基-1-戊烯)、1，2-聚-1，3-丁二烯、1，4-聚-1，3-丁二烯、聚异戊二烯、聚氯丁二烯、聚(醋酸乙烯酯)、聚(偏二氯乙烯)、聚(偏二氟乙烯)、聚(四氟乙烯)等等，以及它们的组合。

优选的聚合物包括烯烃均聚物和共聚物(具体地讲，聚乙烯、聚丙烯、乙烯醋酸乙烯酯聚合物、以及它们的组合)。更优选的聚合物包括烯烃均聚物及其组合(甚至更优选地聚乙烯及其组合；最优选超高分子量聚乙烯(UHMWPE)及其组合)。可用的超高分子量聚乙烯包括分子量为至少约750,000(优选至少约1,000,000；更优选地至少约2,000,000；最优选至少约3,000,000)的那些。

可使用宽范围的聚合物粒度，这取决于烧结的多孔聚合物基质中所需的孔(例如，洞、凹陷或优选地沟槽)尺寸。较细小粒子在烧结的基质中会形成较细小的孔尺寸。一般来讲，聚合物粒子可为微粒(例如，粒度或直径范围为约1微米至约800微米；优选约5微米至约300微米；更优选地约5微米至约200微米；最优选约10微米至约100微米或200微米)，从而得到微米或更低量级的孔尺寸。可使用不同的均值(平均)和/或中值粒度(例如，可使用约30微米至约70微米的平均粒度)。如果需要，则可通过使用较高和较低熔融流动速率的聚合物的共混物来改变或控制烧结的基质的孔隙度。

可将聚合物粒子和颗粒浓集剂(以及任何可选的添加剂，例如润湿剂或表面活性剂)进行混合和机械性共混(例如，使用商业混合设备)以形成混合物(优选均匀混合物)。一般来讲，基于混合物中的所有粒子的总重量，混合物中存在的颗粒浓集剂的浓度可为至多约90重量％(优选约5重量％至约85重量％；更优选地约10重量％至约80重量％；最优选约15重量％至约75重量％)。如果需要，可在混合物中包含少量(例如，至多约5重量％)的常规添加剂(例如，润湿剂、表面活性剂等等)。

可将所得混合物设置在模具或其他合适的容器或基底中。可用的模具可由碳素钢、不锈钢、黄铜、铝等制成，并且可具有单个腔体或多个腔体。腔体可具有基本上任何所需形状，前提条件是在完成处理之后可将其烧结的内容物从模具移出。优选的是，可通过使用商业粉末处理和/或振动设备来辅助模具填充。

可通过将热引至模具(例如，通过电阻加热、电感应加热或蒸汽加热)来进行热处理。可将模具加热到足以烧结聚合物的温度(例如，通过加热到略低于聚合物的熔点的温度)。烧结方法为已知的并且可根据所用聚合物的特性和/或形式进行选择。任选的是，可在加热过程期间将压力施加至混合物。在热处理之后，可允许模具自然地或通过使用基本上任何方便的冷却方法或装置冷却至环境温度(例如，约23℃的温度)。

可通过使用美国专利No.7,112,272、No.7,112,280和No.7,169,304(Hughes等人)中所述的聚合物粒子和处理方法来制备优选的浓集装置，所述粒子和方法的描述以引用方式并入本文中。可将两种不同类型的超高分子量聚乙烯(UHMWPE)粒子共混在一起，其中一种为“爆米花形”(具有表面卷积)并且另一种为基本球形的。优选的“爆米花形”和球形UHMWPE分别以PMX CF-1(堆密度为0.25-0.30克/立方厘米、平均直径为约30至40微米，在约10微米至约100微米的范围内)和PMX CF-2(堆密度为0.40-0.48克/立方厘米、平均直径为约55至65微米，在约10微米至约180微米的范围内)得自Ticona(Celanese的分部，总部位于德国的法兰克福)。还可使用得自其他制造商的具有类似形态、堆密度和粒度并且分子量为在约750,000至约3,000,000的范围内的UHMWPE。两种类型的UHMWPE粒子可被选择为具有相同或不同的分子量(优选两者均具有在所述范围内的相同分子量；更优选地两者均具有约3,000,000的分子量)。

可将两种类型的UHMWPE粒子以不同的相对量(例如，等量)进行混合并且随后与浓集剂以上述比率进一步地混合。任一种UHMWPE都可以相比另一种较小的量使用或甚至可从混合物中省去，这取决于浓集装置的所需特性。

可将选定的粒子共混在一起以形成优选均匀的混合物。例如，可使用带状共混器等等。然后可将所得的混合物置于模具腔体中，此时优选利用基本上任何标准的机械振动器同时进行振动。在填充和振动周期结束时，可将模具加热到足以烧结聚合物的温度(一般来讲，温度为在约225℉至约375℉或更高的范围内，这取决于聚合物的分子量)。

冷却时，可获得自支承的烧结的多孔聚合物基质。基质可显示具有复杂的内部结构(包括具有不同直径的互连的多向穿透孔)并且可因而包括优选的弯曲通道基质(用作本发明的浓集方法中的浓集装置)。如果需要，浓集装置还可包括一种或多种其他组件，例如为一种或多种预滤器(例如，以在样品穿过多孔基质之前从样品移除相对较大的食品粒子)、用于在整个装置上施加压差的歧管(例如，以有助于使样品穿过多孔基质)和/或外部壳体(例如，容纳和/或保护多孔基质的一次性料筒)。

样品

本发明的方法可应用到多种不同类型的样品，包括(但不限于)医学样品、环境样品、食品样品、饲料样品、临床样品和实验室样品，以及它们的组合。医学或兽医样品可包括(例如)来自生物来源(例如，人或动物)的有待测定以用于临床诊断的细胞、组织或流体。环境样品可为(例如)来自医学或兽医设施、工业设施、土壤、水源、食品制备区(食品接触区和非接触区)、实验室或已潜在遭受生物恐怖活动的区域。优选的是食品加工、处理以及制备区样品，这是因为这些在细菌病原体导致的食品供应污染方面常常受到特别的关注。

以液体形式或以固体在液体中的分散体或悬浮液形式获得的样品可直接使用或可进行浓集(例如，通过离心法)或稀释(例如，通过添加缓冲(pH值受控的)溶液)。固体或半固体形式的样品可直接使用或可根据需要通过(例如)用流体介质(例如，缓冲溶液)洗涤或冲洗或悬浮或分散于流体介质中的方法来提取。可从表面(例如，通过擦拭或冲洗)获取样品。优选样品为流体(例如，液体、气体或固体或液体在液体或气体中的分散体或悬浮液)。

可用于实施本发明的方法的样品的实例包括食品(例如，新鲜农产品或即食型午餐或“熟食”肉)、饮料(例如，果汁或充碳酸气的饮料)、饮用水和生物流体(例如，全血或其组分，例如血浆、富含血小板的血液级分、血小板浓缩液或浓集人类红细胞；细胞制剂(例如，分散的组织、骨髓抽吸物或椎体骨髓)；细胞悬浮液；尿液、唾液和其他体液；骨髓；肺液；脑液；伤口渗出液；伤口活检样品；眼液；脊髓液等等)以及可使用已知程序(例如使用裂解缓冲液等等)形成的裂解制剂(例如细胞裂解物)等。优选的样品包括食品、饮料、饮用水、生物流体、以及它们的组合(更优选地为食品、饮料、饮用水，以及它们的组合)。

样品体积可根据具体应用而不同。例如，当本发明的方法用于诊断或研究应用时，样品的体积通常可在微升范围内(例如，10微升或更大)。当所述方法用于食品病原体检测分析或用于饮用水安全性检测时，样品的体积通常可在毫升至升的范围内(例如，100毫升至3升)。在工业应用中，例如生物工艺或制药配方中，所述体积可为成千上万升。

本发明方法可从浓集状态的样品中分离微生物，并且还可使得能从可抑制拟用检测程序的样品基质组分中分离微生物。在所有这些情况中，本发明的方法都可伴随或替代其他的微生物浓集方法而使用。因此，任选地，如果需要另外的浓集，可在实施本发明方法之前或之后从样品培养培养物。这种培养富集可为一般或初等的(以便富集大部分或基本上所有微生物的浓度)或可为特异性或选择性的(以便仅富集一种或多种选定微生物的浓度)。

接触操作

可通过多种已知的或将来开发的提供两种材料之间接触的方法中的任何者来实施本发明的方法。例如，可将浓集装置添加至样品或可将样品添加至浓集装置。可将浓集装置浸入样品中、可将样品倾注到浓集装置上、可将样品倾注到含有浓集装置的管或孔内或优选可使样品在浓集装置之上或之内(优选之内)穿过(或反之亦然)。优选以下述方式进行接触，使得样品穿过烧结的多孔聚合物基质的至少一个孔(优选穿过至少一个穿透孔)。

可在多种容器或储存器中的任何者(任选地，带盖、闭合或密封的容器；优选设计用于容纳基本上不具有样品渗漏的装置的圆柱、注射筒或另一个储存器)中组合(使用任何添加顺序)浓集装置和样品。用于实施本发明的方法的合适容器将由具体样品决定，并且可在尺寸和性质上大不相同。例如，所述容器可为小容器(例如10微升容器(例如，试管或注射器))或较大容器(例如100毫升至3升容器(例如，锥形瓶或环状圆柱形容器)。

直接接触样品的容器、浓集装置和任何其他装置或添加剂可在使用前进行灭菌(例如，通过受控热、环氧乙烷气体或辐射来进行)，以便减少或防止任何可导致检测误差的样品污染。浓集装置中足以捕集或浓集特定样品的微生物以便成功检测的浓集剂的量是可变动的(取决于(例如)浓集剂和浓集装置的性质和形式以及样品的体积)，并且可由本领域的技术人员容易地确定。

可进行接触操作达所需的时间(例如，对于体积为等于或小于约100毫升的样品，最多约60分钟的接触操作是可用的操作；优选约15秒至约10分钟或更长时间；更优选约15秒至约5分钟；最优选约15秒至约2分钟)。任选且可优选的是，可通过混合(例如，通过搅动、通过摇动或通过在整个装置上都施加压差以有利于样品穿过其多孔基质)和/或通过孵育(例如，在环境温度下)来增强接触，以便增加微生物与浓集装置的接触。

优选的是，可通过以下方法来实现接触操作：使样品穿过浓集装置(例如，通过泵送)至少一次(优选仅一次)。可使用用于在整个装置(例如，注射器或柱塞)上都建立压差的泵(例如，蠕动泵)或其他设备中的基本上任何一种。以高达约100毫升/分钟或更高的样品流速穿过所述装置可能是有效的方法。优选可使用约10-20毫升/分钟的流速。

优选的接触操作方法包括使样品如此穿过浓集装置(例如，通过泵送)并且随后利用浓集装置(例如，在上述容器中的一者内)孵育(例如，约3小时至约24小时；优选约4小时至约20小时)含微生物的样品(优选流体)。如果需要，在接触操作期间，可在浓集装置和样品的组合中添加一种或多种添加剂(例如，裂解试剂、生物发光测定试剂、核酸捕集试剂(例如，磁珠)、微生物生长培养基、缓冲液(例如，用于润湿固体样品)、微生物染色试剂、洗涤缓冲液(例如，用于洗除未组合材料)、洗脱剂(例如，血清白蛋白)、表面活性剂(例如，可得自Union Carbide Chemicals and Plastics(Houston，TX)的Triton^TMX-100非离子型表面活性剂)、机械磨蚀/洗脱剂(例如，玻璃珠)等等)。

本发明的方法还可任选地包括分隔开所得的组合微生物的浓集装置与样品。可通过本领域中熟知的多种方法来实施分隔(例如，通过泵送、滗析或虹吸流体样品，以便将组合微生物的浓集装置留在用于实施所述方法的容器或储存器中)。另外可以在样品接触操作之后从浓集装置隔离或分隔开(例如，通过使洗脱剂或裂解剂在浓集装置之上或之内穿过)捕集的微生物(或其一种或多种组分)。

本发明的方法可手动(例如，以批次方式)或可自动(例如，以便能够进行连续或半连续处理)进行。

检测

可通过使用本发明的方法来浓集以及任选且优选地检测多种微生物，包括(例如)细菌、真菌、酵母菌、原生动物、病毒(包括无包膜和有包膜的病毒)、细菌内生孢子(例如，芽孢杆菌属(包括炭疽芽胞杆菌、蜡状芽孢杆菌和枯草芽孢杆菌)和梭状芽孢杆菌(包括肉毒梭状芽孢杆菌、艰难梭状芽孢杆菌和产气荚膜梭状芽孢杆菌))等等、以及它们的组合(优选细菌、酵母菌、病毒、细菌内生孢子、真菌、以及它们的组合；更优选地细菌、酵母菌、病毒、细菌内生孢子、以及它们的组合；甚至更优选地细菌、病毒、细菌内生孢子、以及它们的组合；最优选革兰氏阴性菌、革兰氏阳性菌、无包膜病毒(例如，诺罗病毒、脊髓灰质炎病毒、甲型肝炎病毒、鼻病毒、以及它们的组合)、细菌内生孢子、以及它们的组合)。所述方法具有检测病原体的实用性，这对于食品安全或对于医学、环境或反恐活动的原因来说是重要的。所述方法尤其可用于检测病原性细菌(例如，革兰氏阴性菌和革兰氏阳性菌两者)以及多种酵母、霉菌和支原体(以及这些中的任何者的组合)。

待检测的靶微生物属包括(但不限于)李斯特菌属、埃希氏杆菌属、沙门氏菌属、弯曲杆菌属、梭状芽孢杆菌属、螺杆菌属、分枝杆菌属、葡萄球菌属、志贺氏菌属、肠球菌属、芽孢杆菌属、奈瑟氏菌属、志贺氏菌属、链球菌属、弧菌属、耶尔森氏菌属、博德特氏菌属、包柔氏螺旋体属、假单胞菌属、酵母菌属、念珠菌属等等、以及它们的组合。样品可含有多种微生物菌株，并且任何一种菌株都可独立于任何其他菌株而被检测到。可作为检测靶的具体微生物株系包括大肠杆菌、小肠结肠炎耶尔森氏菌、假结核耶尔森氏菌、霍乱弧菌、副溶血性弧菌、创伤弧菌、单核细胞增多性李斯特菌、金黄色葡萄球菌、肠道沙门氏菌、酿酒酵母菌、白色念珠菌、葡萄球菌肠毒素亚种、蜡样芽孢杆菌、炭疽芽孢杆菌、萎缩芽孢杆菌、枯草芽孢杆菌、产气荚膜梭状芽孢杆菌、肉毒梭状芽孢杆菌、艰难梭状芽孢杆菌、阪崎肠杆菌、绿脓假单胞菌等、以及它们的组合(优选金黄色葡萄球菌、肠道沙门氏菌、酿酒酵母菌、萎缩芽孢杆菌、枯草芽孢杆菌、大肠杆菌、人类感染性无包膜肠道病毒(大肠杆菌噬菌体为替代物)、以及它们的组合)。

已被浓集装置捕集或组合(例如，通过吸附或通过筛分)的微生物可通过基本上任何目前已知或将来开发的所需方法来检测。这类方法包括(例如)基于培养的方法(当时间允许时可为优选的)、显微镜法(例如，使用可用于观察标记有荧光染料的微生物的透射光显微镜或落射荧光显微镜)以及其他成像方法、免疫检测方法和遗传检测方法。微生物捕集后的检测过程可任选地包括洗涤以移除样品基质组分、切片或者说是打碎浓集装置中烧结的多孔聚合物基质、染色等。

免疫检测是对衍生自靶生物体的抗原物质的检测，该抗原物质通常是充当细菌或病毒颗粒的表面上的标志的生物分子(例如，蛋白质或蛋白多糖)。抗原物质的检测通常可通过抗体、选自例如噬菌体展示之类的过程的多肽或来自筛选过程的适体来进行。

免疫检测方法是熟知的，并且包括(例如)免疫沉淀和酶联免疫吸附测定(ELISA)。可以多种方式(例如，通过用荧光染料、用量子点或用可产生化学发光的酶或有色底物来标记第一抗体或第二抗体和使用酶标仪或侧向流装置)来检测抗体组合。

还可通过基因检测(例如，通过核酸杂交或引物指导的扩增)来进行检测，基因检测常常是优选的方法。可将捕集或组合的微生物裂解，以使它们的遗传物质可供检测。裂解方法是熟知的，包括(例如)下述处理：声裂法、渗压震扰、高温处理(例如，约50℃至约100℃)和与酶一起孵育，该酶例如为溶菌酶、葡萄糖酶、藤黄节杆菌酶、溶细胞酶、蛋白酶K、蛋白酶E和病毒内溶素。

许多常用的基因检测分析可检测特定微生物的核酸，包括DNA和/或RNA。基因检测方法中使用的条件的严格性与所检测的核酸序列的变异水平相关。高度严格的盐浓度和温度条件可使检测限于靶标的精确核酸序列。因此，使用高度严格的基因检测可区分靶核酸序列存在小变异的微生物菌株。基因检测可以基于核酸杂交，其中单链核酸探针与微生物的变性核酸杂交，使得产生包含探针链的双链核酸。本领域技术人员应熟悉用于在凝胶电泳、毛细管电泳或其他分离方法之后检测杂交物的探针标记，例如放射性标记、荧光标记以及化学发光标记。

特别有用的基因检测方法是基于引物指导的核酸扩增。引物指导的核酸扩增方法包括(例如)热循环方法(例如，聚合酶链反应(PCR)、逆转录酶聚合酶链反应(RT-PCR)、连接酶链反应(LCR))以及等温法和链置换扩增(SDA)(以及它们的组合，优选为PCR或RT-PCR)。用于检测扩增产物的方法包括(但不限于)(例如)凝胶电泳分离和溴化乙锭染色以及检测产物中掺入的荧光标记或放射性标记。还可使用在检测扩增产物之前不需要分离步骤的方法(例如，实时PCR或均相检测)。

生物发光检测方法是熟知的，并且包括(例如)三磷酸腺苷(ATP)检测方法，包括美国专利No.7,422,868(Fan等人)中所描述的那些，其说明内容以引用方式并入本文。也可使用其他基于发光的检测方法。

由于本发明方法是非菌株特异性的，它提供了容许在同一样品中靶向多种微生物菌株以便检测的通用捕集系统。例如，在测定食品样品的污染时，将同一样品中的单核细胞增多性李斯特菌、大肠杆菌和沙门氏菌一并检测可能是所需方法。在单个捕集步骤之后接着可进行(例如)PCR或RT-PCR测定，其使用特异性引物来扩增来自这些微生物菌株中的每一个的不同核酸序列。因此，可避免需要对每一个菌株都分开进行样品处理和制备程序。

诊断试剂盒

用于实施本发明的浓集方法的诊断试剂盒包括：(a)至少一种上述浓集装置；和(b)用于实施本发明的浓集方法的至少一种检测容器或检测试剂(优选无菌检测容器或检测试剂)。优选诊断试剂盒还包括用于实施所述方法的说明书。

可用的检测容器或储存器包括上文所述的那些并且可用于(例如)接触、孵育、采集洗脱液或其他所需的方法步骤。可用的检测试剂包括微生物培养基或生长培养基、裂解剂、洗脱剂、缓冲液、发光检测分析组分(例如，发光剂、裂解试剂、荧光素酶、酶底物、反应缓冲液等等)、基因检测分析组分等等、以及它们的组合。优选的裂解剂是在缓冲液中提供的分解酶或化学品，并且优选的基因检测分析组分包括靶微生物的一种或多种特异性引物。所述试剂盒还可任选地包括无菌镊子等等。

实例

下面的实例将进一步说明本发明的目的和优点，但这些实例中列举的具体材料及其量以及其他条件和细节不应被解释为是对本发明的不当限制。所有微生物培养物均购自American Type Culture Collection(ATCC)(Manassas，VA)(美国标准生物品收藏中心)。

浓集剂的制备

硅藻土粉(硅藻土)以白色粉末(325目；所有粒子的粒度均为小于44微米)购自Alfa Aesar(Ward Hill，MA)(它是Johnson MattheyCompany旗下的公司)。此材料通过X射线衍射(XRD)显示包含无定形二氧化硅以及结晶α-方石英和石英。煅烧的硅藻土购自Solvadis，GmbH(Frankfurt，Germany)(并且据观察，包括：长度为约5微米至约80微米、宽度为约3微米至约8微米的小杆；主长度为至多约60微米的多孔圆盘和圆盘片段；以及主长度为约3微米至约60微米的非对称片段)。此材料经XRD显示主要包含α-方石英。

通过下述方式表面处理硅藻土来制备包含各种不同表面改性剂(即，二氧化钛；与氧化铁组合的二氧化钛；氧化铁；铂；金；以及与氧化铁组合的金)的浓集剂：

金沉积

将约57-60g干燥的硅藻土或经金属氧化物改性的硅藻土载体介质(约300mL体积的粉末)在150℃的烘箱中进一步干燥24小时，以移除残余水。趁热将所得的干燥样品置于上述具体实施方式中描述的PVD设备中，其中PVD设备具有叶片间隙为2.7mm的粒子搅拌器。然后把设备的真空室抽吸至约5×10^-5托的背景压力，使包含氩溅射气的气体以约10毫托的压力进入真空室。

然后按照以下方法实施金属沉积过程：对设备的阴极供电预设的时间段，在以受控功率为0.02kW进行金属的DC磁控溅涂过程中，其粒子搅拌器轴和带孔叶片以4rpm旋转。溅涂持续时间为5小时。溅涂完成后，利用空气将真空室通风至环境条件，并且从PVD装置中取出所得的涂布金属的样品，通过25目(0.707mm)筛进行筛分，以分离该过程中产生的细小颗粒。通过对(沉积过程之前和之后)所使用的金属溅射靶进行称重来确定已沉积到样品上的金属的量。通常，约18％的靶的重量损失代表沉积到样品上的金属(基于电感耦合等离子体分析)。基于此信息，载体介质上的所得金量经计算为约0.9重量％。

铂沉积

基本上重复上述金沉积过程，不同的是使用7.62cm(3英寸)的铂靶来代替已用的7.62cm(3英寸)的金靶、功率设为0.03kW、并且沉积时间为1小时。载体介质上的所得铂量经计算为约0.25重量％。

二氧化钛的沉积

通过在搅拌下将20.0克的TiO(SO₄)·2H₂O(Noah TechnologiesCorporation(San Antonio，TX))溶于80.0克的去离子水中来制备20重量％的硫酸氧钛(IV)脱水溶液。将50.0克的此溶液与175mL的去离子水混合，以形成二氧化钛前体化合物溶液。通过在快速搅拌下将50.0克的硅藻土分散于大烧杯中的500mL的去离子水中来制备硅藻土的分散体。将硅藻土分散体加热到约80℃之后，经约1小时的时间段逐滴加入二氧化钛前体化合物溶液，同时快速搅拌。添加之后，将烧杯用表面皿盖住并将其内容物加热到沸腾20分钟。将氢氧化铵溶液添加到烧杯中，直到内容物的pH值为约9。通过沉降/滗析来洗涤所得产物，直到洗涤水的pH值为中性。通过过滤来分离产物并将其在100℃下干燥过夜。

将干燥产物的一部分放置到瓷坩埚内并且通过下述方式进行煅烧：以约3℃/分钟的加热速率从室温加热到350℃并且随后在350℃下保持1小时。

氧化铁的沉积

基本上使用上述二氧化钛沉积方法来将氧化铁沉积到硅藻土上，不同的是用20.0克的Fe(NO₃)₃·9H₂O(J.T.Baker，Inc.(Phillipsburg，N.J.))溶于175mL的去离子水中所得的溶液来替代硫酸氧钛溶液。将所得的经氧化铁改性的硅藻土的一部分按相似方法煅烧至350℃，以用于进一步的检测。

氧化铁和二氧化钛的沉积

基本上使用上述二氧化钛沉积的方法来将氧化铁和二氧化钛的混合物沉积到硅藻土上，不同的是用10.0克的Fe(NO₃)₃·9H₂O(J.T.Baker，Inc.(Phillipsburg，N.J.))和25.0克的TiO(SO₄)·2H₂O(Noah TechnologiesCorporation(San Antonio，TX))溶于175mL的去离子水中所得的溶液来替代硫酸氧钛溶液。将所得的经氧化铁和二氧化钛改性的硅藻土的一部分按相似方法煅烧至350℃，以用于进一步的检测。

浓集剂筛检：微生物浓集检测方法

将分离的微生物菌落接种于5mL的BBL^TM Trypticase^TM Soy Broth(BBL^TM Trypticase^TM大豆肉汤)(Becton Dickinson(Sparks，MD))中，并且在37℃下孵育18-20小时。将约10⁹个菌落形成单位/mL的该过夜培养物在pH值为7.2的吸附缓冲液(含5mM的KCl、1mM的CaCl₂、0.1mM的MgCl₂和1mM的K₂HPO₄)中稀释，以获得10³个微生物/mL的稀释液。将1.1mL体积的微生物稀释液添加至各经标记的含10mg浓集剂的无菌5mL聚丙烯管(BD Falcon^TM，Becton Dickinson(FranklinLakes，NJ))，将每一根管都封盖，并在Thermolyne Maximix Plus^TM涡旋混合器(Barnstead International(Iowa))上混合。在室温(25℃)下于Thermolyne Vari Mix^TM振荡器平台(Barnstead International(Iowa))上孵育每一根封盖的管15分钟。在孵育后，让每一根管都在试验台上静放10分钟，以沉降浓集剂。以相同方式处理含有1.1mL微生物稀释液但无浓集剂的对照样品管。然后将所得的沉降的浓集剂和/或上清液(以及对照样品)用于分析。

根据制造商的说明书，将沉降的浓集剂重悬浮于1mL的无菌Butterfield’s Buffer溶液(pH值为7.2±0.2；磷酸二氢钾缓冲溶液；VWR目录号83008-093，VWR(West Chester，PA))中并且铺板于3M^TMPetrifilm^TM Aerobic Count Plates培养基(干燥，可再水合的；3M公司(St.Paul.，MN))。使用3M^TM Petrifilm^TM Plate Reader(3M公司(St.Paul.，MN))对好氧性微生物计数进行量化。使用下式计算结果：

重悬浮的浓集剂中的CFU百分数/mL＝

(来自铺板的重悬浮的浓集剂的菌落数)/(来自铺板的未处理的对照样品的菌落数)×100

(其中，CFU＝菌落形成单位，其为活的或有活力的微生物的单位)。

然后使用下式以微生物被浓集剂捕集的百分数来记录结果：

捕集效率或捕集百分数＝重悬浮的浓集剂中的CFU百分数/mL浓集剂

出于比较目的，在至少一些情况中，移取1mL上清液，未经稀释进行铺板或在Butterfield’s Buffer溶液中1∶10稀释来铺板，并且铺板到3M^TM Petrifilm^TM Aerobic Count Plates培养基上。使用3M^TM Petrifilm^TMPlate Reader(3M公司(St.Paul.，MN))对好氧性微生物计数进行量化。使用下式计算结果：

上清液中的CFU百分数/mL＝

(来自铺板的上清液的菌落数)/(来自铺板的未处理的对照样品的菌落数)×100

当微生物菌落和浓集剂的颜色相似时(给酶标仪提供的对比度很小)，结果是基于上清液，因而使用下式以微生物被浓集剂捕集的百分数来记录结果：

捕集效率或捕集百分数＝100-上清液中的CFU百分数/mL

浓集剂筛检1-12和对比筛检1和2

利用上述微生物浓集检测方法，分别测定10mg各种不同表面处理的硅藻土或表面处理的煅烧硅藻土浓集剂(按上述方式制备)和10mg未经处理的硅藻土(以下简称DE)对靶微生物革兰氏阴性菌肠道沙门氏菌亚种鼠伤寒沙门氏菌(ATCC 35987)和革兰氏阳性菌金黄色葡萄球菌(ATCC 6538)的细菌浓集作用。结果示于下表1中。

表1.

筛检号	微生物	浓集剂	捕集百分数±标准偏差
				C-1	葡萄球菌	DE	54±13
1	葡萄球菌	TiO₂-DE	94±4
				2	葡萄球菌	Fe₂O₃-TiO₂-DE	96±1
3	葡萄球菌	煅烧的Fe₂O₃-TiO₂-DE	100±0
				4	葡萄球菌	Pt-煅烧的DE	99±0
5	葡萄球菌	Au-Fe₂O₃-DE	99±0
				6	葡萄球菌	Au-煅烧的DE	99±0
C-2	沙门氏菌	DE	45±1
				7	沙门氏菌	TiO₂-DE	86±3
8	沙门氏菌	Fe₂O₃-TiO₂-DE	88±1
				9	沙门氏菌	煅烧的Fe₂O₃-TiO₂-DE	89±5
10	沙门氏菌	Pt-煅烧的DE	72±1
				11	沙门氏菌	Au-Fe₂O₃-DE	91±6
12	沙门氏菌	Au-煅烧的DE	100±0
				13	沙门氏菌	Au-DE	89±2

浓集剂筛检14-19和对比筛检3

利用上述微生物浓集检测方法，分别测定10mg各种不同表面处理的硅藻土或表面处理的煅烧硅藻土浓集剂(按上述方式制备)和10mg未经处理的硅藻土(以下简称DE)对靶微生物酿酒酵母菌(10²CFU/mL；ATCC 201390)酵母菌浓集作用。根据制造商的说明书将所得的材料铺板于3M^TM Petrifilm^TM Yeast and Mold Count Plate培养基(干燥，可再水合的；3M公司(St.Paul，MN))，并孵育5天。对分离的酵母菌落进行手动计数，并如上所述计算出捕集百分数。结果示于下表2中(所有样品的标准偏差均为小于10％)。

表2.

筛检号	微生物	浓集剂	捕集百分数
				C-3	酵母菌属	DE	42
14	酵母菌属	TiO₂-DE	99
				15	酵母菌属	Fe₂O₃-TiO₂-DE	93
16	酵母菌属	煅烧的Fe₂O₃-TiO₂-DE	100
				17	酵母菌属	Pt-煅烧的DE	100
18	酵母菌属	Au-Fe₂O₃-DE	100
				19	酵母菌属	Au-煅烧的DE	99

浓集剂筛检20-22和对比筛检4-6

食品样品购自本地杂货店(Cub Foods(St.Paul))。将火腿切片、莴苣和苹果汁样品(11g)在无菌玻璃皿中称重并且添加到无菌Stomacher^TM聚乙烯过滤袋(Seward Corp(Norfolk，UK))中。利用肠道沙门氏菌亚种鼠伤寒沙门氏菌(ATCC 35987)的18-20小时过夜培养物(原液)以10²CFU/mL浓度将所述细菌培养物对食品样品进行接种。随后将99mL的Butterfield’s Buffer溶液添加至每一个接种样品。将所得的样品在Stomacher^TM400 Circulator实验室共混仪(Seward Corp(Norfolk，UK))中共混2分钟周期。将共混的样品收集在无菌的50mL的锥形聚丙烯离心管(BD Falcon^TM，Becton Dickinson(Franklin Lakes，NJ))中并且以2000转/分钟(rpm)离心(Eppendorf^TM Centrifuge 5804(Westbury，NY))5分钟，以移除大碎屑。将所得的上清液用作进一步检测的样品。

使用上述微生物浓集检测方法，分别将每一个1mL的按上述方式制备的检测样品添加至含有10mg表面处理的硅藻土的检测管和含有10mg未经处理的硅藻土的对照检测管并且检测对靶微生物肠道沙门氏菌亚种鼠伤寒沙门氏菌(ATCC 35987)的细菌浓集作用。对于莴苣的检测，将样品放置在无菌的100×20mm的组织培养皿(Sarstedt(Newton，NC))中并且在AlphaImager^TM MultiImage^TM光柜(Alpha InnotechCorporation(San Leandro，CA))中的紫外(UV)光下孵育1小时，以消除背景菌群。这种经UV处理的样品经确认存在原生菌群(通过铺板并且计数1mL样品，基本上按上文所述)并且随后被用于浓集实验。结果示于下表3中(所有样品的标准偏差均为小于10％)。

表3.

筛检号	微生物	浓集剂	样品	捕集百分数
					C-4	沙门氏菌	DE	苹果汁	43
20	沙门氏菌	Au-Fe₂O₃-DE	苹果汁	94
					C-5	沙门氏菌	DE	火腿	75
21	沙门氏菌	Au-Fe₂O₃-DE	火腿	94
					C-6	沙门氏菌	DE	莴苣	55
22	沙门氏菌	Au-Fe₂O₃-DE	莴苣	80

浓集剂筛检23-24和对比筛检7-8

按照实例20-22和比较例4-6中的程序，使用火鸡肉样品(使用25g切片的火鸡肉和225mL的Butterfield’s Buffer溶液)，分别基于大体积样品(300mg浓集剂/30mL样品体积)测定表面处理的硅藻土和未经处理的硅藻土对于靶微生物肠道沙门氏菌亚种鼠伤寒沙门氏菌(ATCC 35987)的浓集作用。另外测定得自饮水喷头的饮用水(100mL)，将其收集在无菌的250mL玻璃瓶(VWR(West Chester，PA))中并且利用10²CFU/mL的靶微生物肠道沙门氏菌亚种鼠伤寒沙门氏菌(ATCC35987)进行接种。将所得的接种水手动衔接混合5次并且在室温(25℃)下孵育15分钟。

将按照上述制备的30mL样品添加至含有300毫克浓集剂的无菌的50mL锥形聚丙烯离心管(BD Falcon^TM，Becton Dickinson(FranklinLakes，NJ))并且利用上述微生物浓集检测方法进行检测。将所得的沉降浓集剂重悬浮于30mL无菌的Butterfield’s Buffer溶液中并且铺板于3M^TM Petrifilm^TM Aerobic Count Plates培养基上。结果示于下表4中(所有样品的标准偏差均为小于10％)。

表4.

筛检号	微生物	浓集剂	样品	捕集百分数
					C-7	沙门氏菌	DE	饮用水	79
23	沙门氏菌	Au-Fe₂O₃-DE	饮用水	97
					C-8	沙门氏菌	DE	火鸡肉	52
24	沙门氏菌	Au-Fe₂O₃-DE	火鸡肉	88

浓集剂筛检25-34

分别测定各种不同表面处理的硅藻土浓集剂(按上述方式制备)的10mg样品对于靶细菌内生孢子萎缩芽孢杆菌(ATCC 9372)和枯草芽孢杆菌(ATCC 19659)的浓集作用。将上述微生物浓集检测方法以下述修改形式使用：过夜培养物分别具有1.4×10³CFU/mL的萎缩芽孢杆菌和6×10²CFU/mL的枯草芽孢杆菌；铺板未稀释的所得上清液；并且将具有结合的微生物的沉降浓集剂重悬浮于5mL无菌Butterfield’s Buffer溶液中并且铺板双份(各为1mL)。基于得自铺板上清液的计数来计算捕集效率，并且结果示于下表5中(所有样品的标准偏差均为小于10％)。

表5.

筛检号	微生物	浓集剂	捕集百分数
				25	萎缩芽孢杆菌	TiO₂-DE	79
26	萎缩芽孢杆菌	Fe₂O₃-DE	97
				27	萎缩芽孢杆菌	Pt-DE	100
28	萎缩芽孢杆菌	Au-DE	81
				29	萎缩芽孢杆菌	Au-Fe₂O₃-DE	100
30	枯草芽孢杆菌	TiO₂-DE	97
				31	枯草芽孢杆菌	Fe₂O₃-DE	97
32	枯草芽孢杆菌	Pt-DE	100
				33	枯草芽孢杆菌	Au-DE	99
34	枯草芽孢杆菌	Au-Fe₂O₃-DE	99

浓集剂筛检35-38

分别测定两种不同表面处理的硅藻土浓集剂(即，Pt-DE和Au-Fe₂O₃-DE)的10mg样品对靶无包膜细菌感染病毒大肠杆菌噬菌体MS2(ATCC 15597-B1；其通常用作各种人类感染性无包膜肠道病毒的替代物)的浓集作用。使用双层琼脂方法(下文所述)来测定对大肠杆菌噬菌体MS2(ATCC 15597-B1)(使用大肠杆菌细菌(ATCC 15597)作为宿主)的捕集。

在pH值为7.2的无菌1×吸附缓冲液(含有5mM的KCl、1mM的CaCl₂、0.1mM的MgCl₂和1mM的K₂HPO₄)中10倍系列稀释大肠杆菌噬菌体MS2原液，分别获得10³和10²噬斑形成单位/毫升(PFU/mL)的两种稀释液。将1.0mL体积的所得噬菌体稀释液添加至含有10mg浓集剂的标记的无菌5mL聚丙烯管(BD Falcon^TM，Becton Dickinson(Franklin Lakes，NJ))，并在Thermolyne Maximix Plus^TM涡旋混合器(Barnstead International(Iowa))上混合。在室温(25℃)下于ThermolyneVari Mix^TM振荡器平台(Barnstead International(Iowa))上孵育每一根封盖的管15分钟。孵育后，让管在试验台上静放10分钟，以沉降浓集剂。以相同方式处理含有1.0mL微生物稀释液但无浓集剂的对照样品管。然后将所得的沉降的浓集剂和/或上清液(以及对照样品)用于分析。

移取100微升上清液，使用下文所述的双层琼脂方法测定噬菌体。移取另外的800微升上清液并弃除。也对100微升沉降的浓集剂测定噬菌体。

双层琼脂方法：

将单菌落的大肠杆菌细菌(ATCC 15597)接种于25mL无菌的3重量％的胰蛋白酶大豆肉汤(Bacto^TM Tryptic Soy Broth，Becton Dickinsonand Company(Sparks，MD)；根据制造商的说明书制备)内，并在设为250转/分钟(rpm)的振荡培养箱(Innova^TM 44，New Brunswick ScientificCo.，Inc.(Edison，NJ))中在37℃过夜孵育。将750微升的该过夜培养物用于接种75mL无菌的3重量％的胰蛋白酶大豆肉汤。在设为250rpm的振荡培养箱中于37℃孵育所得培养物，以获得指数生长期的大肠杆菌细胞，指数生长期是通过用SpectraMax M5分光光度计(MolecularDevices(Sunnyvale，CA))于550nm处测得的吸光度(吸光度值为0.3-0.6)来测定。将细胞在冰上孵育直至用于测定。

将100微升的上述噬菌体检测样品与75微升冰孵育的大肠杆菌(宿主细菌)细胞一起混合，并在室温(25℃)下孵育5分钟。将所得样品与5mL无菌的熔化顶层琼脂(3重量％的胰蛋白酶大豆肉汤、1.5重量％的NaCl、0.6重量％的琼脂，当天制备，保持在48℃的水浴中)混合。然后将该混合物倾注到培养皿中的底层琼脂(3重量％的胰蛋白酶大豆肉汤、1.5重量％的NaCl、1.2重量％的琼脂)上。让混合物的熔化琼脂组分固化5分钟，倒置培养皿或培养板，在37℃下孵育。过夜孵育后，目测检查培养板，含有沉降浓集剂的那些培养板(以及对照培养板)显示存在噬菌体噬斑。基于来自铺板上清液的计数来计算捕集效率，并且该捕集效率对于Pt-DE(分别对于10³和10²PFU/mL的稀释液)经测定为96％和97％且对于Au-Fe₂O₃-DE(分别对于10³和10²PFU/mL的稀释液)经测定为94％和95％(标准偏差为小于10％)。

浓集剂筛检39-41

苹果汁购自本地杂货店(Cub Foods(St.Paul))。在无菌玻璃皿中称量苹果汁(11g)，将其添加至99mL无菌Butterfield’s Buffer中。将所得的组合涡旋混合1分钟，并使用肠道沙门氏菌亚种鼠伤寒沙门氏菌(ATCC 35987)和大肠杆菌(ATCC 51813)的18-20小时过夜培养物(细菌原液)，各以1CFU/mL浓度将这两种细菌培养物对所述组合进行接种。如上所述在1X吸附缓冲液中制备细菌原种的系列稀释液。

使用上述微生物浓集检测方法，将10mL体积的接种苹果汁样品添加至含有100mg表面处理的硅藻土浓集剂(即，Fe₂O₃-DE、TiO₂-DE或Au-Fe₂O₃-DE)的无菌的50mL锥形聚丙烯离心管(BD Falcon^TM，Becton Dickinson(Franklin Lakes，NJ))并且孵育15分钟以用于靶微生物沙门氏菌的细菌捕集/浓集(在存在大肠杆菌(对比组微生物)的情况下)。移取所得的上清液，并且将沉降的浓集剂转移至含有2mL无菌的3重量％胰蛋白酶大豆肉汤(Bacto^TM Tryptic Soy Broth，BectonDickinson and Company(Sparks，MD)；根据制造商的说明书制备)的另一个无菌的50mL管。将管松散地封盖，混合其内容物，并在37℃下孵育。在过夜孵育后，使用来自SDI(Strategic Diagnostics，Inc.(Newark，DE))的RapidChek^TM沙门氏菌侧流免疫测定测试条检测沙门氏菌在所得肉汤混合物中的存在。目测检查测试条显示其为沙门氏菌阳性。

还通过聚合酶链反应(PCR)对含有微生物的肉汤混合物进行核酸检测。使用来自Applied Biosystems(Foster City，CA))的TaqMan^TM ABI肠道沙门氏菌检测试剂盒，测定沙门氏菌在作为检测样品的1mL上述过夜孵育的含有浓集剂的肉汤中的存在。也对作为对照样品的1mL的肠道沙门氏菌亚种鼠伤寒沙门氏菌(ATCC 35987)的18-20小时过夜培养物(原液)进行了测定。通过使用下列每个循环的循环条件(45个循环)在Stratagene Mx3005P^TM QPCR(定量PCR)系统(StratageneCorporation(La Jolla，CA))中进行PCR检测：25℃持续30秒、95℃持续10分钟、95℃持续15秒以及60℃持续1分钟。对照样品获得的平均(n＝2)循环阈值(CT值)为17.71。从含有Fe₂O₃-DE、TiO₂-DE或Au-Fe₂O₃-DE的检测样品分别获得18.59、20.44和16.53的平均(n＝2)CT值，这指示出阳性PCR反应并证实了沙门氏菌的存在。

浓集装置的制备

两种不同的超高分子量聚乙烯(UHMWPE)粉末以PMX1(产品号GUR^TM2126，不规则形状的，粒度范围为50-100微米)和PMX2(产品号GUR^TM4150-3，球形的，中值粒度为约40微米)得自Ticona(Celanese的分部，总部位于德国的法兰克福)。以4∶1比率的PMX1∶PMX2来混合粉末。使用所得的组合物(以下简称UHMWPE混合物)来制备三种浓集装置。

对于A型浓集装置，将40重量％的含有氧化铁的浓集剂的混合物(基本上按上述方式制备；指定为Fe₂O₃-DE)与6O重量％的UHMWPE混合物进行混合。对于B型浓集装置，将40重量％的含有二氧化钛的浓集剂的混合物(基本上按上述方式制备；指定为TiO₂-DE)与60重量％的UHMWPE混合物进行混合。对于C型浓集装置(对照物)，使用未添加浓集剂的UHMWPE混合物。对于每一种浓集装置，都称出选定的组分并将其放入1升的圆柱形容器或广口瓶中。然后将广口瓶在低速(约10-15转/分钟(rpm))旋转的滚筒辗粉机上放置至少两个小时，以产生均匀的共混物或絮状物。

然后使用絮状物的一部分(约6g)来填充50mm直径的圆柱形模具，所述圆柱形模具具有5mm的深度并且还在其底部和封盖处设置有0.05mm(2密耳)厚的聚四氟乙烯浸渍的玻璃纤维圆盘，以避免絮状物发粘并且延迟透过模具面的热传递。将絮状物压缩到模具内，并且将模具的封盖按压到适当位置内以封闭模具。

将填充的模具在涡旋混合器(IKA^TM MS3 Digital Vortexer，得自VWR Scientific(West Chester，PA))放置10秒，以消除其内容物中的空隙或裂缝。然后将模具在设为180-185℃的通风对流烘箱(ThelcoPrecision Model 6555，得自Thermo Fisher Scientific，Inc.(Waltham，MA))中放置一个小时，以烧结絮状物。在冷却至室温(约23℃)之后，从模具中移出所得的烧结絮状物并且利用冲模整修成47mm直径，以用作浓集装置。

实例1-2和比较例C-1-C-4

食品样品(巴氏杀菌橙汁(不含果肉)、切片的火腿午餐肉和切片的鸡肉午餐肉)购自本地杂货店(Cub Foods(St.Paul，MN))。分别在无菌Stomacher^TM聚乙烯过滤袋(PE-LD Model 400，Seward Corp(Norfolk，UK))中称量25mL橙汁和25克每一种切片肉。将所得的样品利用每一种得自过夜胰蛋白酶大豆肉汤培养物(基本上按照上文基于标题“Concentration Agent Screening：Microorganism Concentration TestMethod(浓集剂筛检：微生物浓集检测方法)”中所述来制备，不同的是使用Bacto^TM Tryptic Soy Broth(Becton Dickinson(Sparks，MD)))的约1CFU/mL浓度的肠道沙门氏菌亚种鼠伤寒沙门氏菌(ATCC 35987)和大肠杆菌细菌(ATCC 51813)进行接种。

将接种样品在室温(约23℃)下孵育约10分钟之后，通过下述方式来制备检测样品：将225mL无菌Butterfield’s Buffer(pH值为7.2，VWR(West Chester，PA))添加至每一种接种样品，从而得到下表6中所示的近似总样品微生物浓度。将所得的基于橙汁的样品(各自具有约250mL的总体积)通过涡旋混合并且随后用于检测。将所得的基于午餐肉的样品(各自具有约250mL的总体积)在230转/分钟(rpm)的Stomacher^TM 400 Circulator实验室共混仪(Seward Corp(Norfolk，UK))中共混2分钟周期并且随后在检测之前通过无菌100微米筛网过滤器(Cell Strainer，BD(San Jose，CA))进行处理。

使用浓集装置的定制样品架(该架包括上部和下部流动分配板，其具有加工出的塑料管，以便为直径为47mm的浓集装置提供摩擦配合；O型环，其用于避免上游和下游侧的渗漏；贯穿螺栓，其提供封闭压力))、蠕动泵(Heidolph^TM Pump Drive 5201蠕动泵，得自VWRScientific(West Chester，PA))和内径为3.1mm的管材将样品以10mL/分钟的流速泵送穿过选定的浓集装置并持续25分钟。将数字压力传感器(SSI Technologies Model MGI-30-A-9V，Cole-Parmer(Vernon Hills，Illinois))设置在样品架的上游，以监测压降。

浓集装置包括具有A型(Fe₂O₃-DE)和C型(不含浓集剂)的那些(二者基本上都按上述方式制备)以及对比的商用绝对微米过滤器(得自Pall Corporation(East Hills，NY)的0.8微米聚醚砜和0.45微米尼龙过滤器)。将从未接种微生物(并且从未穿过浓集装置)的对应食品样品以未稀释方式铺板于3M^TM Petrifilm^TM Aerobic Count Plates(3M公司(St.Paul，MN))上。将铺板样品在37℃下孵育18-20小时并且第二天进行量化(根据制造商的说明书)作为对照物，且据发现不存在微生物。

泵送之后，使用无菌镊子将浓集装置从其架移出并且在含有25mL无菌Bacto^TM Tryptic S oy Broth(Becton Dickinson(Sparks，MD))的无菌Stomacher^TM聚乙烯过滤袋(PE-LD Model 400，Seward Corp(Norfolk，UK))中孵育过夜。将该袋用橡皮筋封闭并在75rpm下的37℃振荡培养箱(VWR Signature^TM Benchtop Shaking Incubator Model 1575R，VWRScientific(West Chester，PA))中孵育18-20小时。过夜孵育之后，利用商用的免疫测定仪(例如，得自3M公司(St.Paul，MN)的3M^TM TECRA^TM独特沙门氏菌免疫测定仪或得自Strategic Diagnostics，Inc.(SDI)(Newark，DE)的RapidChek^TM沙门氏菌侧流免疫测定测试条)来对所得培养物检测沙门氏菌的存在。结果示于下表6中。与商用的绝对微米过滤器相比，本发明的浓集装置通常在阻塞之前能够处理略微较大体积的含颗粒样品。

表6.

实例3

巴氏杀菌苹果汁购自本地杂货店(Cub Foods(St.Paul，MN))。将25mL苹果汁与225mL无菌Butterfield’s Buffer(pH值为7.2，VWR(WestChester，PA))混合并且利用浓度为约100CFU/mL的肠道沙门氏菌亚种鼠伤寒沙门氏菌(ATCC 35987)进行接种。将所得样品在室温(约23℃)下孵育10分钟并且随后以10mL/分钟的流速泵送(基本上如上文所述)穿过B型(TiO₂-DE)浓集装置(基本上按上述方式制备)并持续25分钟。在25分钟内每隔5分钟将流过样品级分(1mL)收集在标记的无菌5mL聚丙烯管(BD Falcon^TM，Becton Dickinson(Franklin Lakes，NJ))中并且根据制造商的说明书铺板于3M^TM Petrifilm^TM Aerobic Count Plates培养基(干燥，可再水合的；3M公司(St.Paul，MN))上。

在样品穿过浓集装置之后，将该装置设置在(基本上如上文所述使用无菌镊子)含有100mL无菌的3重量％的胰蛋白酶大豆肉汤(Bacto^TM Tryptic Soy Broth，Becton Dickinson and Company(Sparks，MD)；根据制造商的说明书制备)的无菌Stomacher^TM聚乙烯过滤袋(PE-LD Model 400，Seward Corp(Norfolk，UK))中。将该袋松散地系住并且在37℃下孵育18-20小时。孵育6小时之后，从袋中移取100微升并且未稀释地铺板于3M^TM Petrifilm^TM Aerobic Count Plates(3M公司(St.Paul.，MN))上，另外将该计数板在37℃下孵育18-20小时(以及流过样品板)并且第二天根据制造商的说明书进行量化。

基于从铺板的流过样品级分获得的计数使用下述公式来计算捕集效率(其中CFU＝菌落形成单位，其为活的或有活力的微生物的单位)：

级分中的CFU百分数＝(得自铺板级分的菌落数)/

(样品中的总菌落数)×100

捕集效率或捕集百分数＝100-级分中的CFU百分数

获得的捕集效率为大于99％。含有6小时时间点样品(得自孵育6小时的浓集装置)的板经分析并发现含有太多的菌落而不能计数，这表明所捕集的细菌为活的细菌。

将含有浓集装置的过夜培养肉汤在Butterfield’s Buffer中进行稀释并且铺板于3M^TM Petrifilm^TM Aerobic Count Plates(3M公司(St.Paul，MN))上，随后在37℃下孵育18-20小时并且在第二天进行量化。板计数表明，浓集装置中捕集的沙门氏菌数已增加至约2.7×10⁹CFU/mL的浓度。

实例4

将肠道沙门氏菌亚种鼠伤寒沙门氏菌(ATCC 35987)的分离细菌菌落接种于5mL的BBL^TM Trypticase^TM Soy Broth(BBL^TM Trypticase^TM大豆肉汤)(Becton Dickinson(Sparks，MD))中，并且在37℃下孵育18-20小时。将浓度为约1×10⁹CFU/mL的此过夜培养物在Butterfield’s Buffer(pH值为7.2±0.2；磷酸二氢钾缓冲溶液；VWR目录号83008-093，VWR(West Chester，PA))中稀释，以获得大约1×10³CFU/mL的种菌。

使用大约1×10³CFU/mL的种菌的1∶100稀释液对250mL体积的饮用水(得自饮水喷头)接种，产生浓度为约16CFU/mL的样品(在250mL的样品中含总计约4000CFU)。将样品以10mL/分钟的流速泵送(基本上如上文所述)穿过A型(Fe₂O₃-DE)浓集装置(基本上按上述方式制备)并持续25分钟。基本上按上文所述来收集和铺板流过样品级分(1mL)。

在样品穿过浓集装置之后，利用含有500微克/毫升的BSA(牛血清白蛋白，水中1mg/mL的原液，购自Sigma Chemicals(St Louis，Mo)的粉末)的过滤消毒的20mL的Butterfield’s Buffer来“冲洗”浓集装置以用于通过反向流动(5mL/分钟)来洗脱细菌。将所得的洗脱液收集在无菌的50mL聚丙烯管中并且基本上按照上文所述进行铺板。

将浓集装置移出、封袋、孵育过夜(以及铺板的流过样品级分和铺板的洗脱液)，并且在第二天基本上按上文所述来量化孵育板。在孵育4.5小时之后，从含有浓集装置的袋中移取100微升样品，将该样品在900微升的Butterfield’s Buffer中进行稀释，并且将所得的1mL总体积基本上按照上文所述进行铺板。

基于从铺板的流过样品级分获得的计数来计算捕集效率(基本上如上文所述)，并且获得的捕集效率为大于99％。洗脱(通过反向流动)释放了捕集种菌的大约17％(680/4000CFU)。含有4.5小时时间点样品(得自孵育4.5小时的浓集装置)的板经分析并发现含有约1300CFU/m的平均值，这表明所捕集的细菌为活的细菌。

使用来自SDI(Strategic Diagnostics，Inc.(Newark，DE))的SDIRapidChek

沙门氏菌侧流免疫测定测试条来检测沙门氏菌在含有浓集装置的过夜培养肉汤中的存在，并且获得了阳性结果。将含有浓集装置的过夜培养肉汤稀释、铺板，并且基本上按上文所述来过夜孵育板并在第二天进行量化。所得的板计数表明，浓集装置中捕集的沙门氏菌数已增加至约2.5×10⁹CFU/mL的浓度。

比较例C-5

基本上重复实例4的程序，其中使用C型(对照物)浓集装置(不含浓集剂)来代替A型(Fe₂O₃-DE)浓集装置，并且使用约13CFU/mL的接种饮用水样品(在大约250mL样品中总计约3300CFU)。获得的捕集效率为大于99％，并且洗脱(通过反向流动)释放了捕集种菌的大约2.4％(80/3300CFU)(比上述实例4中洗脱的百分数几乎低一个数量级)。此洗脱结果表明，本发明的浓集装置相比于对比装置可在捕集微生物的隔离或分隔方面提供优点，从而有利于进一步的分析。

实例5

将大肠杆菌(ATCC 51813)的分离细菌菌落接种于5mL的BBL^TMTrypticase^TM Soy Broth(BBL^TM Trypticase^TM大豆肉汤)(Becton Dickinson(Sparks，MD))中，并且在37℃下孵育18-20小时。将浓度为约1×10⁹CFU/mL的此过夜培养物在Butterfield’s Buffer(pH值为7.2±0.2；磷酸二氢钾缓冲溶液；VWR目录号83008-093，VWR(West Chester，PA))中稀释，以获得大约1×10⁴CFU/mL的种菌。

使用大约1×10⁴CFU/mL的种菌的1∶100稀释液对9.6升体积的去离子水(18兆欧姆，Milli-Q^TM Biocel水纯化系统，Millipore(MA))接种，产生浓度为约140CFU/mL的样品(样品中含总计约1.3×10⁶CFU)。将样品以20mL/分钟的流速泵送(基本上如上文所述)穿过A型(Fe₂O₃-DE)浓集装置(基本上按上述方式制备)并持续约8小时。

在第一小时内每隔15分钟，在接下来的7小时内每隔一小时来收集流过样品级分(1mL)，并且将其基本上按上文所述进行铺板。基于从铺板的流过样品级分获得的计数来计算捕集效率(基本上如上文所述)，并且获得的捕集效率为大于99％。

实例6

使用大约1×10⁴CFU/mL的种菌的1∶100稀释液对2.7升体积的去离子水(18兆欧姆，Milli-Q^TM Biocel水纯化系统，Millipore(MA))接种，产生浓度为约120CFU/mL的样品(样品中含总计约3.1×10⁵CFU)。将样品以15mL/分钟的流速泵送(基本上如上文所述)穿过B型(TiO₂-DE)浓集装置(基本上按上述方式制备)并持续约3小时。

每隔15分钟收集流过样品级分(1mL)，并且将其基本上按上文所述进行铺板。基于从铺板的流过样品级分获得的计数来计算捕集效率(基本上如上文所述)，并且获得的捕集效率为大于97％。

将本文所引述的专利、专利文献、出版物中包含的参考说明内容以引用的方式全文并入本文，就如同将每一个参考说明内容都单独引入本文一样。对于本领域的技术人员显而易见的是，在不脱离本发明的范围和精神的前提下，可对本发明作出各种无法预见的修改和更改。应当理解，无意使本发明不当地受限于本文所述的示例性实施例和实例，并且这些实例和实施例仅以举例的方式给出，本发明的范围旨在仅受下文所述权利要求书的限制。

Claims

1.一种方法，包括：(a)提供浓集装置，所述浓集装置包括烧结的多孔聚合物基质，所述烧结的多孔聚合物基质含有至少一种浓集剂，所述至少一种浓集剂包含硅藻土，所述硅藻土在其表面的至少一部分上载有表面处理剂，所述表面处理剂包括表面改性剂，所述表面改性剂包含氧化铁、二氧化钛、细纳米级金或铂、或它们的组合；(b)提供样品，所述样品包含至少一种微生物菌株；以及(c)使所述浓集装置与所述样品接触，使得所述至少一种微生物菌株的至少一部分被结合到所述浓集装置或被所述浓集装置捕集。

2.根据权利要求1所述的方法，其中所述方法还包括检测至少一种结合的微生物菌株的存在。

3.根据权利要求2所述的方法，其中所述检测通过选自以下方法来实施：基于培养的方法、显微镜法和其他成像方法、基因检测方法、免疫检测方法、基于发光的检测方法，以及它们的组合。

4.根据权利要求1所述的方法，其中所述方法还包括将所述浓集装置与所述样品分隔开和/或培养性地富集至少一种结合的微生物菌株和/或将至少一种结合的微生物菌株的至少一部分与所述浓集装置分隔开。

5.根据权利要求1所述的方法，其中所述烧结的多孔聚合物基质包含至少一种热塑性聚合物。

6.根据权利要求5所述的方法，其中所述热塑性聚合物选自烯烃均聚物、烯烃共聚物、烯烃与其他乙烯基单体的共聚物、以及它们的组合。

7.根据权利要求6所述的方法，其中所述热塑性聚合物选自烯烃均聚物以及它们的组合。

8.根据权利要求7所述的方法，其中所述烯烃均聚物为聚乙烯。

9.根据权利要求1所述的方法，其中所述浓集装置包括弯曲通道基质。

10.根据权利要求1所述的方法，其中所述表面改性剂选自细纳米级金、细纳米级铂、与至少一种金属氧化物组合的细纳米级金、二氧化钛、与至少一种其他金属氧化物组合的二氧化钛、氧化铁、与至少一种其他金属氧化物组合的氧化铁、以及它们的组合。

11.根据权利要求10所述的方法，其中所述金属氧化物选自氧化铁、二氧化钛、氧化锌、氧化铝，以及它们的组合。

12.根据权利要求10所述的方法，其中所述表面改性剂选自细纳米级金、细纳米级铂、与至少氧化铁或二氧化钛组合的细纳米级金、二氧化钛、与至少氧化铁组合的二氧化钛、氧化铁、以及它们的组合。

13.根据权利要求12所述的方法，其中所述表面改性剂选自细纳米级金、细纳米级铂、与氧化铁或二氧化钛组合的细纳米级金、二氧化钛、与氧化铁组合的二氧化钛、以及它们的组合。

14.根据权利要求13所述的方法，其中所述表面改性剂选自细纳米级金、与氧化铁或二氧化钛组合的细纳米级金、与氧化铁组合的二氧化钛、以及它们的组合。

15.根据权利要求14所述的方法，其中所述表面改性剂选自细纳米级金、与氧化铁或二氧化钛组合的细纳米级金、以及它们的组合。

16.根据权利要求1所述的方法，其中所述样品为流体形式。

17.根据权利要求1所述的方法，其中所述微生物菌株选自以下的株系：细菌、真菌、酵母菌、原生动物、病毒、细菌内生孢子、以及它们的组合。

18.根据权利要求17所述的方法，其中所述微生物菌株选自以下的菌株：细菌、酵母菌、病毒、细菌内生孢子、以及它们的组合。

19.根据权利要求1所述的方法，其中所述接触通过使所述样品穿过所述浓集装置来实施。

20.一种方法，包括：(a)提供浓集装置，所述浓集装置包括烧结的聚乙烯弯曲通道基质，所述烧结的聚乙烯弯曲通道基质含有至少一种浓集剂，所述至少一种浓集剂包含硅藻土，所述硅藻土在其表面的至少一部分上载有表面处理剂，所述表面处理剂包括表面改性剂，所述表面改性剂选自细纳米级金、细纳米级铂、与至少氧化铁或二氧化钛组合的细纳米级金、二氧化钛、与至少氧化铁组合的二氧化钛、氧化铁、以及它们的组合；(b)提供流体样品，所述流体样品包含至少一种微生物菌株，所述至少一种微生物菌株选自细菌、酵母菌、病毒、细菌内生孢子、以及它们的组合；以及(c)按照下述方式使所述流体样品穿过所述浓集装置，所述方式使得所述至少一种微生物菌株的至少一部分被结合到所述浓集装置或被所述浓集装置捕集。

21.根据权利要求20所述的方法，其中所述方法还包括检测至少一种结合的微生物菌株的存在。

22.一种浓集装置，包括烧结的多孔聚合物基质，所述烧结的多孔聚合物基质含有至少一种浓集剂，所述至少一种浓集剂包含硅藻土，所述硅藻土在其表面的至少一部分上载有表面处理剂，所述表面处理剂包括表面改性剂，所述表面改性剂包含氧化铁、二氧化钛、细纳米级金或铂、或它们的组合。

23.一种试剂盒，包括：(a)至少一种根据权利要求22所述的浓集装置；和(b)至少一种检测容器或检测试剂用于实施根据权利要求1所述的方法。

24.一种用于制备浓集装置的方法，包括：(a)提供混合物，所述混合物包含(1)至少一种颗粒状的可烧结的聚合物和(2)至少一种颗粒浓集剂，所述至少一种颗粒浓集剂包含硅藻土，所述硅藻土在其表面的至少一部分上载有表面处理剂，所述表面处理剂包括表面改性剂，所述表面改性剂包含氧化铁、二氧化钛、细纳米级金或铂、或它们的组合；以及(b)将所述混合物加热到足以烧结所述聚合物的温度，以便形成烧结的多孔聚合物基质，所述烧结的多孔聚合物基质包含所述颗粒浓集剂。