CN102449142A - 合成移植物 - Google Patents
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Abstract
本发明涉及塑性-压缩的胶原凝胶作为用于角膜细胞，尤其是角膜缘上皮干细胞的生长的基底的应用。在这样的基底上生长的细胞可以被培养以产生可以在眼毒性试验中使用或用于移植的人造眼上皮细胞。
Description
技术领域
本发明涉及塑性-压缩的胶原凝胶(塑性-压实的胶原凝胶，plastically-compacted collagen gel)作为用于角膜细胞，尤其是角膜缘上皮干细胞(缘角膜上皮干细胞，limbal corneal epithelial stem cell)生长的基底的应用。在这样的基底上生长的细胞可以被培养以产生人造眼上皮或人造角膜组织，其可以在眼毒性试验中使用或用于移植。
背景技术
在商品化前，新的药物和化妆品必须在眼毒性试验如Draize兔眼刺激试验中被测试，以便确定那些新的药物/化妆品的毒性可能性。在这点上，眼被使用，因为它代表对我们的日常环境的最通常暴露的和化学-敏感极限。在这样的试验中，每年使用数千只兔子，这个在兔眼上测试药物和化妆品的方法在过去的50年间几乎没有改变。然而，Draize兔眼试验已经不仅在伦理方面，而且在科学方面(因为兔眼和人眼的较大差异)受到批评。然而，目前没有非动物实验作为Draize试验的替代物被接受；欧洲立法方面即将到来的改变可能增加对这样的替代的需求。
动物模型的体外可替代方式的应用先前已经利用器官培养、人类细胞系和人类供体组织被研究，但是这些模型的有效性已经被遗传不稳定性、二维组织培养限制(没有模拟上皮屏障功能)、缺乏正常生长和分化、种间遗传变异和有限的可用性妨碍。因为这些原因，最近对三维(3D)角膜模型的需求已经导致作为眼刺激试验的体外可替代方式的两个商业上皮模型(SkinEthic Laboratories和EpiOcular，MatTek Corp)的开发。SkinEthic模型使用永生的人类角膜上皮细胞(Doucet，O.et al.Toxicol In Vitro，2006.20(4)：p.499-512)，而MatTek模型使用正常角质形成细胞(Van Goethem，F.et al.Toxicol.In Vitro，2006.20(1)：p.1-17)。虽然这些模型均展现出角膜样上皮结构，但是它们既没有使用生理基底，也没有模拟角膜干细胞在维持角膜上皮的功能中所起的重要作用。
已经尝试提供用于角膜细胞生长的基底，其模拟由体内角膜提供的生理基底。已经尝试了范围广泛的基底，包括羊膜、温度敏感的水凝胶、血浆聚合物涂覆的基底和胶原、血纤蛋白、和纤连蛋白/血纤蛋白凝胶。在作为用于收获的角膜干细胞的载体的羊膜、胶原凝胶和胶原罩之间的比较中，羊膜被发现为较好的载体(Schwab，I.R.Trans.Am.Opthalmol.Soc.1999，97：p.891-986)。自从那时，羊膜已经被用作标准角膜细胞基底，因为它促进在其上生长的细胞的增殖、粘附和分化。它还已显示为用于眼表面移植的角膜干细胞的临床扩展的优异基底(例如Koizumi N et al.，Invest.Ophthalmol.Vis.Sci.2000；41：2506-2513)。
然而，羊膜在结构和化学组成方面显示出显著的样品间和样品内的变化(Hopkinson，A.et al.Invest.Ophthalmol.Vis.Sci.，2006.47(10)：p.4316-4322)，并且在临床应用前没有常规地被表征。最重要的，作为基底的羊膜缺乏工程化的聚合物构造的可量测性。
因此，已经在除了羊膜以外的基底上制作来自扩展的缘干细胞(角膜缘干细胞，limbal stem cell)的离体角膜上皮移植构造方面进行了尝试。适用于利用角膜干细胞的体外眼毒性试验的基底需要具有下列基本要求：(i)支持干细胞扩展，以及(ii)为细胞分层提供固体载体。因此，本发明的一个目的是提供新型基底，所述基底提供与羊膜类似的组织工程能力，但是更易得到比并且更容易标准化。
发明内容
在一个方面，本发明提供了塑性-压缩的胶原凝胶作为用于角膜细胞生长的基底的应用。
未压缩的胶原凝胶包含在隙间液体(间质液体，interstitial liquid)周围形成连续支架的胶原原纤维的基质。例如，溶解的胶原可以通过添加稀释的碱而被诱导聚合/聚集，以形成交联的胶原原纤维的凝胶网络。所述原纤维的凝胶网络支持溶解的胶原纤维的初始体积，保留隙间液体。用于产生这样的胶原凝胶的一般方法是本领域熟知的(例如，WO2006/003442、WO2007/060459和WO2009/004351)。
如这里所用的，术语“塑性-压缩的胶原凝胶”指的是这样的胶原凝胶，其初始体积已经通过外部压缩/脱水处理被减小，其中初始隙间液体的一部分或大部分已经从所述凝胶中被去除，并且其中所述胶原凝胶在去除外部处理后保持其新的(减小)的体积。所述塑性-压缩的胶原凝胶也可以被称为脱水的。
与现有技术的胶原凝胶如商标Gelfoam
下的生产的那些胶原凝胶(其据说能够在血液中吸收45倍它们的重量)相比，本发明的塑性-压缩的胶原凝胶被永久地压缩并基本上不能吸收。在这个上下文中，术语“塑性压缩的”意味着压缩导致所述凝胶的结构的永久压缩/变形。
这里涉及的塑性-压缩的凝胶未被玻璃化(即，它们没有被干燥到产生刚性、玻璃状物质的程度)；它们不是玻璃状的；它们不是刚性的；它们是柔性的。这里使用的胶原凝胶能够具有捕获在它们的结构中的活细胞如成纤维细胞和/或角膜细胞。
在所述胶原凝胶中使用的胶原可以为任何原纤维-形成胶原。原纤维-形成胶原的实例为I、II、III、V、VI、IX和XI型。所述凝胶可以包含全然相同类型的胶原或不同类型的胶原的混合物。优选地，所述凝胶包含I型胶原或由I型胶原组成。在本发明的一些实施方式中，所述凝胶排他地或基本上由胶原原纤维形成，即，胶原原纤维是所述凝胶中仅有的或基本上仅有的聚合物。
在本发明的其他实施方式中，所述胶原凝胶可以另外包含其他天然存在的聚合物，例如丝、纤连蛋白、弹性蛋白、壳多糖和/或纤维素。一般来说，非胶原的天然存在的聚合物的量将少于凝胶的5％，优选少于凝胶的4％、3％、2％或1％(wt/wt)。类似量的非天然聚合物也可以在凝胶中存在，如，聚内酯、聚交酯、聚甘油栓(聚糖苷配糖基，polyglycone)、聚己内酯(polycapryolactone)和/或磷酸盐玻璃。
所述隙间液体可以为其中胶原原纤维可以被溶解和其中胶原原纤维可以凝胶化的任何液体。通常，它会是水成液，例如含水缓冲剂或细胞培养基。
在本发明的一些实施方式中，所述胶原凝胶的一个或多个表面被涂覆有层粘连蛋白(laminin)、或一个或多个层粘连蛋白域，以便提高角膜细胞的粘附。层粘连蛋白，一种细胞外基质(ECM)多域三聚糖蛋白，为支持粘附、增殖和分化的基板(基底层)的主要非成胶成分。它最初从小鼠Engelbreth-Holm-Swarm(EHS)肿瘤(层粘连蛋白-1)中分离。层粘连蛋白蛋白质是动物组织中结构性支架的组成分。层粘连蛋白经由巢蛋白(entactin)和基底膜聚糖(基底膜蛋白多糖，perlecan)与IV型胶原联合并通过整联蛋白受体、营养不良聚糖糖蛋白复合体和卢塞兰血型糖蛋白结合到细胞膜。
如这里所用的，术语“层粘连蛋白域”包括，尤其是α-链的RGD和IKVAV序列、β1-链的YIGSR、和γ-链的RNIAEIIKDI。
优选地，所述层粘连蛋白来自Engelbreth-Holm-Swarm鼠肉瘤基膜。
层粘连蛋白或层粘连蛋白域可以，例如，以1-2μg/cm2的浓度被使用。层粘连蛋白或层粘连蛋白域可以在压缩之前或压缩之后被应用于胶原凝胶。优选地，仅角膜细胞被放置其上的表面被涂覆。这可以，例如，为胶原凝胶的上表面(使用时)。
在一些实施方式中，所述未压缩的胶原凝胶可以在凝胶内不包含细胞。在还有的其他实施方式中，所述未压缩的胶原凝胶可以包含一种或多种类型的细胞。这样的接种的细胞的实例包括间质祖细胞如分化或未分化形式的角膜成纤维细胞(角膜细胞)。优选地，这些角膜成纤维细胞从外周缘(外周角膜缘，peripheral limbus)或从缘环(limbal ring)获得，其在约37℃下与约0.02％胶原酶过夜孵育。
这样的细胞，如果存在，通常在压缩(即，脱水)前被接种到胶原凝胶中，例如，通过在聚合/聚集前将它们与胶原溶液混合。
凝胶压缩(凝胶中有或没有细胞)的合适的方法的实例包括以下：
(i)到凝胶的一个或多个表面或边缘(edge)的压缩力的应用；
(ii)到凝胶的一个或多个表面或边缘的脱水力的应用；
(iii)凝胶在一个或两个平面(例如长度和/或宽度)中的拉伸；或
(iv)(i)-(iii)中的一个或多个的组合。
上述方法的每个可以与隙间液体-吸收物质到凝胶的一个或多个表面或边缘的直接施加(即接触)结合。
在一些实施方式中，所述胶原凝胶的压缩可以通过将压缩力施加到凝胶的一个或多个表面或边缘而产生。优选地，所述凝胶在压缩力的施加期间被限制。优选地，所述压缩力被施加至凝胶的上表面。例如，重力可以被施加至凝胶的上表面，可选地连同将隙间液体-吸收物质施加至凝胶。重力的量和压缩的持续时间将取决于希望的压缩水平而变化。在一些实施方式中，重力将为20-100g，优选40-60g，最优选约50g。在一些实施方式中，压缩的持续时间将为10-600秒，优选20-400秒，最优选约5分钟。
在其他实施方式中，胶原凝胶的压缩可以通过将脱水力施加于凝胶的一个或多个表面或边缘产生。例如，隙间液体-吸收物质可以被施加于凝胶的上表面和/或下表面。这样的液体-吸收物质的实例包括一个或多个组织薄片或吸墨纸。隙间液体-吸收物质的施加持续时间将取决于希望的压缩水平而变化。
在还有的其他实施方式中，胶原凝胶的压缩可以通过在一个或两个平面(例如长度和/或宽度)中拉伸所述凝胶而产生。这样的拉伸作用可以挤出部分隙间液体。例如，所述凝胶可以从第一边缘被悬吊，负荷被施加于第二(如相对)边缘。所述负荷将为能够拉伸凝胶而不打断凝胶的量。不同的负荷可以穿过凝胶的不同轴被施加。负荷的施加持续时间和负荷的量将取决于希望的压缩水平而变化。在优选的实施方式中，隙间液体-抽出力或脱水力可以沿着与负荷相同的轴施加，例如通过隙间液体-吸收物质被放置于负荷被施加的凝胶的一个边缘或两个边缘。
在凝胶的压缩之前或之后，所述凝胶可以经受(a)施加单轴拉伸负荷和(b)去除所述负荷的一个或多个重复循环。相信这样的加载和卸载的重复循环以定向方式增加了压缩的凝胶中胶原原纤维的融合(参见，例如，WO2007/060459)。
用于生产压缩的凝胶胶原的另外的方法在本领域是已知的(例如，WO2006/003442、WO2007/060459和WO2009/004351)。
在外部压缩/脱水处理下，隙间液体从压缩的凝胶中被永久去除。与初始(未压缩的)凝胶相比，得到的凝胶具有永久-减小的体积、增加的密度和增加的强度。
所述胶原凝胶的体积可以，例如，被减小至少50％、60％、70％、80％、90％、95％、99％或99.9％。优选地，所述凝胶的体积为初始体积的0.1-2.0％。
实现压缩所需的时间可以取决于施加的外部处理而变化。例如，压缩可以在少于24小时、少于12小时、少于6小时、少于3小时或少于1小时内实现。在其他实施方式中，压缩可以在少于30、20、10、5或2分钟内实现。
与初始凝胶相比，从凝胶中失去的隙间液体的量可以为至少50％、60％、70％、80％、90％、95％、96％、97％、98％或99％。
为了产生用于移植或用于眼毒性试验或这里披露的任何其他应用的人造眼上皮细胞，所述塑性-压缩的胶原凝胶将优选为1-60mm长，更优选20-40mm长。它还可以为0.5-60mm宽，优选20-40mm宽。
在本发明的一些实施方式中，所述塑性-压缩的胶原凝胶将为作为5-10000μm厚，优选10-1000μm，更优选20-100μm厚，最优选约50μm厚的片的形式。
所述塑性-压缩的胶原凝胶的组成通常为3-4％胶原(优选3.3-3.5％，更优选约3.4％的胶原)，剩余物为水和来自缓冲剂的盐/糖。在这个剩余物中，水将通常构成＞99％。
所述压缩的胶原凝胶中胶原原纤维的直径优选为10-100nm。所述压缩的胶原凝胶中胶原原纤维的间距优选为1-200nm。这些参数可以通过以下方法测量：胶原凝胶可以在室温下在PBS中的2.5％戊二醛中固定1小时，接着在室温下在1％四氧化锇中固定1小时，随后在增加的乙醇浓度(直到100％)中脱水，接着在环氧丙烷中充气，随后埋置在琼脂100树脂中在60℃下聚合24小时。70nm部分可以被切下，在电子透射电子显微镜(TEM)检查前通过柠檬酸铅和乙酸双氧铀复染色，此时胶原原纤维直径和间距可以被量化。胶原原纤维的定向也可以通过这个方法被定性评估，如高(或低)程度的定向。
在另一个方面，本发明提供了塑性-压缩的胶原凝胶作为基底的应用，在所述基底上生长角膜细胞。
本发明还提供了用于生产人造眼上皮的方法，包括在塑性-压缩的胶原凝胶基底上培养角膜干细胞或包含角膜干细胞的组合物，其中所述细胞或所述组合物在这样的条件下培养以便提供在基底上产生人造眼上皮的角膜上皮细胞群。
本发明中使用的塑性压缩的凝胶提供了角膜细胞在其上生长的基底，这个基底形态上与裸露的角膜基质(角膜间质)相似。所述细胞在这个基底的表面上生长，没有或基本上没有这样的细胞生长到基底中。所述塑性-压缩的胶原凝胶的压缩水平是使得其防止了施加的上皮细胞向内生长到压缩的凝胶中。
在一些实施方式中，所述人造眼上皮随后与所述基底分离。
在本发明的其他实施方式中，所述人造眼上皮被保持在所述塑性-压缩的胶原凝胶基底上，后者被用作人造角膜基质。如这里所用的，术语“人造角膜基质”优选涉及这里定义的塑性压缩的胶原凝胶，其可以可选地包含捕获在其中的角膜成纤维细胞和/或角质形成细胞，和/或其可以可选地是交联的(优选利用核黄素/UV)。
在一些实施方式中，所述人造眼上皮随后被储存在适于人类组织的储存和保存的介质中，具有或没有基底，优选地为基于软骨素-硫酸盐的储存介质，例如Optisol(Bausch&Lomb)，可选地连同作为人造眼上皮使用的说明书。
优选地，所述塑性-压缩的胶原凝胶基底通过这里描述的方法获得或可以获得。
本发明还提供了通过上述方法获得或可获得的人造眼上皮。
本发明还提供了优选通过这里定义的方法获得或可获得的人造眼上皮，包含表达CK3(细胞角蛋白3)分化标记物和CK14(细胞角蛋白14)未分化标记物的3-7个细胞层的连续复层上皮，在基细胞内和基细胞下具有基膜成分(例如，层粘连蛋白、整联蛋白、半桥粒)。
所述人造眼上皮优选在450nm处具有0.00-0.50的光密度(OD)。优选地，具有埋置的角质形成细胞和人造眼上皮的层粘连蛋白-涂覆的塑性-压缩胶原凝胶具有0.01-0.10，优选约0.073的OD(450nm)。
桥粒和半桥粒(分别是细胞-细胞和细胞-基底粘附复合体)在人造眼上皮中的存在可以用于量化组织完整性和对下面的基质的粘附。尤其是，本发明涉及这样的人造眼上皮，其中半桥粒在一些或所有基细胞中存在和/或一些或所有邻近上皮细胞经由桥粒结构被相互连接。
包含角膜干细胞的组合物优选包含缘上皮细胞(角膜缘上皮细胞，limbal epithelial cell)，即干细胞和分化细胞的非均匀混合物，其可以从角膜边缘处的缘(角膜缘，limbus)获得。换言之，包含角膜干细胞的组合物可以包含角膜干细胞和还没有完全定向(commit)于角膜上皮表型的细胞的混合物。
如这里所用的，术语“角膜细胞”涉及从动物(优选哺乳动物)角膜获得的细胞。优选地，所述细胞从角膜的缘环获得，即，排除结膜、虹膜和中心角膜的角膜的外缘。所述细胞可以包含上皮细胞或由上皮细胞组成。所述细胞可以包含角膜干细胞或由角膜干细胞组成，优选角膜缘上皮干细胞。优选地，所述角膜干细胞为人类角膜干细胞。
所述压缩的胶原凝胶的胶原可以在压缩之前或之后被交联以便提高所述凝胶的机械性能。优选地，所述交联利用核黄素和UV(优选UVA，最优选在约365nm处)进行。例如，所述交联可以通过在室温下在核黄素溶液(优选在15-25％葡聚糖溶液中0.05-0.2％的核黄素)中孵育压缩的凝胶达20-40分钟进行。随后任何不用的核黄素可以例如利用PBS被从凝胶中洗掉。以这个方式处理的胶原凝胶与未处理的凝胶相比能够经受住增加的负荷，并且在移植到眼表面时被缝线较好地维持在原位。
在本发明的一些实施方式中，所述交联不是利用1-乙基-3-(3-二甲基氨基丙基)碳二亚胺(EDC)或N-羟基琥珀酰亚胺(NHS)或任何其他基于碳二亚胺或琥珀酰亚胺的交联剂进行的。
在本发明的一个优选的实施方式中，交联的塑性压缩的胶原凝胶被使用(优选利用核黄素/UV交联)，其中所述压缩的凝胶不包含捕获的细胞。
本发明还提供了塑性-压缩的胶原凝胶，其中所述胶原纤维已经利用核黄素(优选利用UV光)被交联；这样的凝胶作为人造眼上皮可以在其上生长的基底的应用；以及所述胶原凝胶在这里披露的其他用途中的应用。优选地，所述塑性-压缩的胶原凝胶是通过这里披露的方法生产的凝胶。
所述组合物或干细胞在这样的条件下被培养，以便提供在基底的表面上产生人造眼上皮的角膜上皮细胞群。这样的条件在本领域是众所周知的(例如Ebato B.，et al.Invest.Opthalmol.Vis.Sci.1988；29：1533-1537；dePaiva C.S.et al.Stem Cells 2005；23：63-73)。
本发明进一步提供了包含本发明的人造眼上皮和塑性-压缩的胶原凝胶基底的人造眼组织，通过本发明的方法获得或可获得，优选地，其中所述人造眼上皮正在或已经在所述塑性-压缩的胶原凝胶基底的表面上生长。
本发明进一步提供了评估试验化合物对人造眼上皮或人造眼组织的作用的方法，包含以下步骤：
(a)提供通过本发明的方法获得或可获得的人造眼上皮或组织；
(b)将所述人造眼上皮或组织与一定量的试验化合物接触；以及
(c)评估所述化合物对人造眼上皮或组织的作用。
所述化合物的作用可以，例如通过任何分析、生物化学、光学、显微镜或其他方式评估。
在一些实施方式中，要评估的作用为所述人造眼上皮或组织的光学特性的改变，或者人造眼上皮或组织的通透性的改变。所述改变可以，例如，在测试化合物应用之前和之后测量，或者所述改变可以与对照进行比较。
在其他实施方式中，所述化合物的作用可以通过人造眼上皮或组织的组织学检查，或者通过测量任何促炎介质的产生来评估。
本发明还提供了通过本发明的方法获得或可获得的人造眼上皮或组织在提供测试化合物对哺乳动物角膜的毒性指征中的应用。
在其他实施方式中，本发明提供了通过本发明的方法获得或可获得的眼上皮或组织在提供模型来研究角膜上皮的基础/基本生物学(例如，增殖、分化、粘附和分层的分子控制)中的应用。
本发明还提供了通过本发明的方法获得或可获得的人造眼上皮或组织作为人造角膜的应用。
本发明还提供了通过本发明的方法获得或可获得的人造眼上皮或组织作为用于将细胞递送到需要其的组织的试剂应用。
本发明进一步提供了处理眼外伤的方法，包括：
(a)提供通过本发明的方法获得或可获得的人造眼上皮或组织；
(b)将眼外伤与所述人造眼上皮或组织接触；以及可选地
(c)将所述人造眼上皮或组织固定在眼外伤的部位。
可以被处理的眼外伤包括那些涉及不足的间质微环境以支持干细胞功能的外伤，如无虹膜、角膜炎、神经营养性角膜病变(neurotrophickeratopathy)和慢性limbitis；或者涉及破坏缘干细胞的外在因素的那些外伤，如化学或热伤、史蒂文斯-约翰逊综合征、眼瘢痕类天疱疮、接触镜佩戴并发症(contact lens wear)、或广泛的微生物感染。
本发明进一步提供了用于治疗方法、优选处理眼外伤如上面定义的那些的方法中的通过上述方法获得或可获得的人造眼上皮或组织。
本发明还提供了通过上述方法获得或可获得的人造眼上皮或组织在制造用于治疗方法、优选处理眼外伤如上面定义的那些的方法的组合物中的应用。
本发明还提供了在哺乳动物受试者中替换角膜的方法，包括：
(a)提供通过本发明的方法获得或可获得的人造眼上皮或组织；
(b)用所述人造眼上皮或组织替换哺乳动物受试者的角膜。
本发明还提供了用于手术方法中的通过上述方法获得或可获得的人造眼上皮或组织，优选地，其中哺乳动物受试者的角膜被所述人造眼上皮或组织替换。
本发明还提供了通过上述方法获得或可获得的人造眼上皮或组织在制造用于手术的方法的组合物中的应用，优选地，其中哺乳动物受试者的角膜被所述人造眼上皮或组织替换。
附图说明
图1.通过来自牛角膜基质的缘的角膜细胞的初始球形成。代表性的球分别培养5(A)、7(B)和9(C)天。(D)：来自初始球的分化的后代。比例尺＝50μm。
图2.埋置的角膜细胞的活/死染色。A：培养7天后压缩的胶原凝胶内埋置的角膜细胞。B：通过它们的绿色染色表明角膜细胞是活的。C：显示红色染色的死的角膜细胞没有被检测到。
图3A-B.人类角膜(图3A)和羊膜(图3B)的透射电子显微镜检查(TEM)。
图4A-B.羊膜的X-射线衍射(图4A)显示穿过X-射线衍射图样的横切面(图4B)。
图5.不同支架的扫描电子显微照片。A：压缩的胶原凝胶；B：裸露的羊膜。
图6.角膜上皮片和正常牛角膜上皮的透射电子显微镜图像。A：基细胞显示经由半桥粒附着充分粘附到压缩的胶原支架(箭头)；B：正常牛角膜上皮中的半桥粒附着(箭头)；C：邻近的细胞清楚地显示压缩凝胶上的桥粒连接(箭头)；D：正常角膜上皮中的桥粒连接(箭头)。比例尺：800nm。
图7.透明度的评估。A：第1行(“胶原”)具有埋置的角膜细胞的层粘连蛋白涂覆的压缩的胶原凝胶；第2行(“AM”)裸露的羊膜；第3行(“胶原+”)在压缩的胶原凝胶上扩展的LEC的组合；第4行(“AM+”)在裸露的羊膜上扩展的LEC的组合。组织置于96孔板中。B：得到的OD测量值。条形图代表平均值和标准差。
图8A-C.羊膜上分离的缘细胞(角膜缘细胞)的分层。扩展的细胞来自在基础培养基中孵育11天后的缘片(角膜缘片)(A)和在14天后悬浮的细胞(B)。脱水的胶原片上扩展的细胞显示细胞密度和分层的可比较水平(C)。染色显示细胞核。
图9A-B.K3(红色)和K14(绿色)的20x显微照片，在培养11天后角膜缘细胞的DAPI(蓝色)双标记。悬浮培养的细胞(A)和外植体培养的细胞(B)。比例尺：100μm。
图10.扩展的缘上皮细胞的免疫荧光染色。A：埋置有角膜细胞的层粘连蛋白涂覆的压缩的胶原凝胶上LEC(红色)的CK3染色(绿色)。B：裸露的羊膜上LEC(蓝色)的CK3染色(红色)。C：埋置有角膜细胞的层粘连蛋白涂覆的压缩的胶原凝胶上LEC(红色)的CK14(绿色)染色。D：裸露的羊膜上LEC(蓝色)的CK14(绿色)染色。比例尺＝50μm。
图11.在埋置有角膜细胞的层粘连蛋白涂覆的压缩的胶原凝胶(胶原)上和裸露的羊膜(AM)上培养的LEC的CK3(A-“K3”)和CK14(B-“K4”)表达的蛋白质印迹和免疫印迹。
图12.在埋置有角膜细胞的层粘连蛋白涂覆的压缩的胶原凝胶(胶原)上和裸露的羊膜(AM)上培养的LEC中的CK12 mRNA表达。
图13.胶原凝胶的塑性压缩。A：稳定的未压缩的胶原凝胶；B：示出用于稳定的胶原凝胶的PC的方法的图；C：压缩的胶原凝胶。
图14.缘上皮长出物。A：未压缩的胶原凝胶上的外植体长出物；B：压缩的胶原凝胶上的外植体长出物；C：示出胶原支架上的外植体长出物的面积(区域)的图。比例尺＝50μm。
图15.不同的支架的扫描电子显微照片。A：未压缩的胶原凝胶；B：压缩的胶原凝胶；C：裸露的牛角膜基质。
图16.胶原凝胶和正常角膜上的LEC的扫描电子显微镜(图像)。A：未压缩的胶原凝胶上的细胞；B：压缩的胶原凝胶上的细胞；C：正常的牛角膜上皮。
图17.胶原纤维、角膜上皮细胞片和正常牛角膜上皮的透射电子显微镜图像。A-C来自不同支架的胶原纤维：未压缩的胶原凝胶(A)，压缩的胶原凝胶(B)和正常牛角膜基质(C)；D：基细胞没有非常良好地粘附于未压缩的胶原凝胶；E：基细胞显示经由半桥粒附着(箭头)良好地粘附于压缩的胶原支架；F：正常牛角膜上皮中的半桥粒附着(箭头)；G：细胞层之间的大的间隙在未压缩的凝胶上是可见的(箭头)；H：邻近细胞清楚地显示出压缩的凝胶上的桥粒连接(箭头)；I：正常角膜上皮中的桥粒连接(箭头)。比例尺：(A-C)10μm；(D-I)1μm。
图18.在胶原凝胶和正常牛角膜上皮上生长的细胞的免疫染色。碘化丙啶(红色)和CK 3(绿色)。A：在未压缩的胶原凝胶上生长的细胞；B：在压缩的胶原凝胶上生长的细胞；C：正常牛角膜上皮。比例尺＝50μm。
图19.未处理(左)和核黄素/UV处理的(右)的压缩的胶原凝胶。
图20.用于分析压缩的胶原凝胶的断裂应变的装置。
图21.对于未处理的(图21A)和核黄素/UV处理的(图21B)压缩的胶原凝胶，针对时间增加负荷的实施例。
图22.在核黄素/UV处理的胶原凝胶上生长的细胞的免疫染色。碘化丙啶(红色)和CK 3(绿色)。角膜缘细胞可以穿过核黄素处理的压缩的胶原凝胶生长。
图23.移植到兔子的眼表面的压缩的胶原凝胶(薄片状移植物)。A：移植后的压缩的胶原凝胶不能有效地支持缝线；B：用核黄素处理的压缩的胶原凝胶能够改进移植，因为它可以更好地被缝合并保持在原位。
具体实施方式
实施例
本发明在下面的实施例中被进一步定义，除非另外说明，其中份数和百分比为按重量计，度数为摄氏度。应当理解这些实施例，虽然表明本发明的优选实施方式，但仅以示例的方式给出。根据上面的讨论和这些实施例，本领域技术人员可以确定本发明的基本特征，而不偏离其精神和范围，可以进行本发明的多种变化和改变以使其适应多种应用和条件。因此，除了本文中那些显示和描述的，根据前面的说明，本发明的多种改变对本领域技术人员将是显而易见的。这样的改变也将旨在落入所附权利要求的范围。这里陈述的每个参考文献披露的内容以其整体通过引用方式并入本文中。
实施例1：利用初始球形成试验分离角膜细胞
正常牛眼在死亡后2小时内从当地屠宰场(Chity批发屠宰场，Guildford，UK)获得，在4℃被运输到实验室并立即使用。利用标准眼库技术切开角膜巩膜扣(corneoscleral button)。简单地，用杜伯科氏最小必需培养基(DMEM，GIBCO)漂洗角膜巩膜组织三次。在仔细去除中心角膜、过量巩膜、虹膜、角膜内皮、结膜和眼球囊后，剩余的缘边(角膜缘边，limbal rim)被切成约25mm2的小片。缘间质角膜细胞和上皮细胞随后从这些片被分离。为了缘间质角膜细胞分离，将缘边的片用0.02％胶原酶(GIBCO)在37℃下过夜孵育。其余的缘间质片随后被收集并用0.2％EDTA(Sigma，UK)在37℃下处理5分钟，随后通过21规格针抽吸以分离为单独的细胞。在离心后，所述细胞被重新悬浮在包含DMEM和Ham’s F12培养基(DMEM/F12，1∶1)，补充有B27(Invitrogen，UK)，20ng/ml表皮生长因子(EGF，Sigma，UK)，40ng/ml基础成纤维细胞生长因子Mary Ann Liebert，Inc.，140 Huguenot Street，New Rochelle，NY 10801(bFGF，Sigma，UK)，100U/ml青霉素，100μg/ml链霉素，和250ng/ml两性霉素B的基础培养基中。采用球形成试验以利用包含甲基纤维素凝胶基质(0.8％，Sigma-Aldrich)的基础培养基培养这些分离的缘角膜细胞。平板接种在60mm培养皿27中以十个可存活细胞/μl的密度进行。
实施例2：球集落的分化
初始球由悬浮的缘角膜细胞形成并在培养7天后被转移到涂有50μg/ml聚-L-赖氨酸(Sigma，UK)和10μg/ml纤连蛋白(Sigma，UK)的玻璃盖玻片用于显微镜研究。为了促进缘角膜细胞的分化，将1％胎牛血清加入到基础培养基中，培养被持续7天。得到的分化的角膜细胞在0.25％胰蛋白酶和0.02％EDTA(Sigma，UK)中被消化并以2.0×105个细胞的密度被重新悬浮在基础介质中。
当缘间质被解聚为单独的细胞并培养9天时，在此期间存活细胞球生长。在5、7、9天培养的代表性球的照片分别在图1A、1B和1C中示出。来自每个初始球的分化的后代显示出典型的成纤维细胞样形态(图1D)。
实施例3：无细胞胶原凝胶的形成
如先前描述的(Brown et al.，Adv.Funct.Mater.，2005，15：1762-1770)，通过用0.5mL 1mol氢氧化钠(Merck，Leicestershire，UK)中和在1mL 10X浓度Eagle最小必需培养基(Gibco，Paisley，UK)中的4mL无菌鼠尾I型胶原(First Link Ltd.West Midlands，UK)来制备无细胞胶原凝胶。凝胶被流延成矩形模型(33mm×13mm×4mm)并在37℃0.5％CO2孵育箱中被凝固/稳定30分钟。在凝固和孵育后，利用尼龙网层和纸片(没有使用由Brown等人使用的另外的金属丝网)，通过压缩和吸收的组合来压缩凝胶。为了实现凝胶的压缩，尼龙网的层(50μm筛目大小)被放置在双层吸收纸上，胶原凝胶被放置在尼龙网上并覆盖有第二尼龙网，在室温下加50g重量的负荷达5分钟，导致在双尼龙网之间保护的平坦胶原片(20-40μm厚)的形成。
实施例4：载有成纤维细胞的胶原凝胶的形成
将从新鲜角膜组织或成纤维细胞细胞系提取的间质成纤维细胞的小粒悬浮在1mL 10X浓度Eagle最小必需培养基(Gibco，Paisley，UK)中的4mL无菌鼠尾I型胶原(First Link Ltd.West Midlands，UK)中，并用0.5mL 1mol氢氧化钠(Merck，Leicestershire，UK)中和。包含细胞的凝胶被流延成矩形模型(33mm×13mm×4mm)并在37℃0.5％CO2孵育箱中被凝固/稳定30分钟。在凝固和孵育以后，利用尼龙网层和滤纸片，通过压缩和吸收的组合来压缩凝胶。为了实现凝胶的压缩，将尼龙网的层(50μm筛目大小)放置在双层吸收纸上，将胶原凝胶放置在尼龙网上并用第二尼龙网覆盖，在室温下加50g重量的负荷达5分钟，导致在双尼龙网之间保护的平坦胶原片(20-40μm厚)的形成。
实施例5：胶原凝胶的层粘连蛋白涂覆
在一些情况中，埋置有角膜细胞的得到的压缩的胶原凝胶，随后被转移到6孔板(透孔(transwells)，costar)，每个凝胶用层粘连蛋白溶液(50μg/ml，Sigma，UK)涂覆，在37℃下孵育2小时，用磷酸盐缓冲盐水(PBS)冲洗3次，在这个点胶原支架准备好用于LEC扩展。
实施例6：角膜细胞存活试验
在补充有10％FBS(Sigma，UK)、0.5％DMSO(Sigma，UK)、10ng/mlEGF(Sigma，UK)、5mg/ml胰岛素(Sigma，UK)、100IU/ml青霉素以及100mg/ml链霉素的DMEM和Ham’s F12(DMEM/F12)培养基中培养7天后，利用活/死双重染色试剂盒(Calbiochem，German)检查埋置在压缩的凝胶内的角膜细胞的存活。所述试剂盒利用细胞-染料，一种细胞-可透过的绿色荧光染料以对活细胞染色，同时死细胞被碘化丙啶(PI)染色，PI是一种非透过性红色荧光染料，其仅在导致透化作用的膜损坏时可以进入细胞。共焦显微镜(LEICADMIRE2，德国)被用于检测活与死角膜细胞的比率。
埋置的角膜细胞被培养7天，其间胶原凝胶直径没有显著变化。凝胶内的细胞被处理为活/死双重染色并通过共焦显微镜检查(图2A)。通过聚焦在通过凝胶的多个深度，我们检测到细胞保持存活(图2B)，没有死细胞被看到(图2C)，表明在此期间胶原凝胶内角膜细胞的封装和随后的压缩没有影响细胞存活性。
实施例7：角膜、羊膜和胶原凝胶的结构细节
人类角膜和羊膜的透射电子显微镜检查(TEM)显示胶原纤维直径、间距和定向方面的结构类似性(图3A和图3B)。羊膜的X-射线衍射显示43nm的原纤维直径，46nm的原纤维间距并示出原纤维组织(图4)。
实施例8：来自缘细胞(角膜缘细胞)的细胞悬液的制备
位于角膜的外缘的缘环从结膜、虹膜和中心角膜被切开，维持缘环结构用于缘上皮细胞分离。缘环被切成约1cm长的几个片，其在37℃下在湿润的5％二氧化碳和95％空气的气氛中，用包含DMEM，FM12(1∶1)介质(Fisher Sci，U.K.)、50μg/ml抗生素、5％FBS、0.5％二甲亚砜、2ng/ml人类表皮生长因子、5μg/ml胰岛素、B27补充培养基(Fisher Sci，U.K.)的基础培养基中的0.02％IA型胶原酶(Sigma-Aldrich)在37℃孵育12小时。
上皮片通过精细钳从酶孵育的缘片被剥下，随后被转移到包含0.05％胰蛋白酶/EDTA的15ml管中用于在37℃下孵育10到15分钟，最后通过21规格针经由搅拌被分离为单独的细胞。通过加入具有FBS的基础培养基，接着通过在室温下几轮离心1000rpm 5分钟来去除胰蛋白酶/EDTA。细胞被重新悬浮在基础培养基中并被接种到胶原凝胶或羊膜上。
实施例9：包含缘干细胞的外植体的制备
缘环结构被均等地切成8-10个片，这些片中的每一个测量为5mm×5mm正方形，最后下面的缘间质(约为间质厚度的三分之二)也被仔细去除。缘片用无菌PBS冲洗3次，接着在青霉素/链霉素抗生素溶液(Gibco)中漂洗3分钟。缘角膜缘片被放置在培养皿上，上皮侧朝上，用基础培养基浸没。将缘片在湿润的5％二氧化碳和95％空气的气氛中，在37℃下孵育2-3天。一旦在培养皿上缘上皮细胞可以被看到迁移到缘外植体的边缘(通过倒置光学显微镜)，它们被认为“健康”并适于进一步培养。这样的缘片从塑料皿被仔细去除，并通过覆盖的6孔板内的培养插入物被轻轻地转移到基底(胶原凝胶或羊膜)。
实施例10：缘上皮细胞在压缩的胶原凝胶和裸露的羊膜上的扩展
羊膜(AM)被无菌PBS缓冲剂冲洗三次，随后用0.25％胰蛋白酶在37℃下处理30分钟。在孵育后，用刮刀去除膜上的上皮细胞。无细胞AM随后被转移到6透孔中，基膜表面向上。分离的LSC以106个细胞/ml被接种到具有埋置的角膜细胞的层粘连蛋白涂覆的压缩的胶原凝胶和裸露的AM上。在14天以后，通过降低培养基水平达另外的7天，扩展的LEC被暴露于空气。3周孵育后，具有多层细胞的角膜上皮膜准备好用于进一步检查。
实施例11：电子显微镜检查
通过扫描电子显微镜(SEM)检查压缩的胶原凝胶和裸露的AM的表面。通过透射电子显微镜(TEM)检查在压缩的胶原凝胶上扩展的LEC。所有的样品被固定在2.5％(v/v)戊二醛中，在PBS中冲洗三次达10分钟，并在1％含水四氧化锇中后固定2小时。随后样品在通过分级的乙醇系列(50％、70％、90％和100％)之前在PBS中被再冲洗三次。为了SEM，样品被转移到六甲基二硅氮烷20分钟并被允许风干。这些样品随后被安放在铝桩(柱，stubs)上并在利用SEM(FEI Quanta FEG 600，UK)检查前喷涂金。为了TEM，脱水的样品被埋置在环氧树脂(琼脂100；AgarScientific，Ltd.，Stansted，UK)中。超薄(70nm)切片在铜载网上被收集并用乙酸铀酰和1％磷钨酸(phosphotungstic acid)染色1小时，随后在利用透射电子显微镜(Philips CM20，Holland)检查前用Reynold(雷诺)柠檬酸铅染色20分钟。
压缩的凝胶内胶原纤维的SEM分析(图5A)显示密集而均匀的，形态和结构类似裸露的AM(图5B)。
TEM分析显示LEC一旦在压缩的凝胶上扩展，就产生定义的基膜层，在基细胞中有半桥粒形成的迹象(图6A)，类似于由正常角膜上皮显示的(图6B)。此外，邻近细胞经由桥粒结构被粘附(图6C)，也类似于在正常角膜上皮中看到的(图6D)。
实施例12：透明度的评估
为了评估压缩的胶原凝胶和裸露的AM的透明度，在LEC扩展之前和之后，得到的角膜构造利用环锯被切成3.5-mm直径的片并被单独地放置入96-孔培养板的孔内。Bio-Tek仪器(Elx800UV，UK)被用于测量组织光密度(OD)。
采取光密度(450nm处的OD)测量以促进在压缩的胶原凝胶和裸露的AM上生长的LEC之间的透明度的比较(图7A)。来自埋置有角膜细胞的层粘连蛋白涂覆的压缩的胶原凝胶(0.003±0.001)和裸露的AM(0.003±0.001)的OD值非常低，它们之间没有显著的差别(P＞0.05)。从埋置有角膜细胞的层粘连蛋白涂覆的压缩的胶原凝胶和裸露的AM采集的OD值，每个在加入扩展的LEC后，分别为0.073±0.003和0.072±0.003，它们之间没有显著的差别(P＞0.05)(图7B)。
实施例13：缘细胞在胶原凝胶或羊膜上的分层
核(DAPI)染色显示利用缘外植体(图8A)和缘悬浮介质(图8B)在培养10-14天后扩展的细胞之间角膜缘细胞的分层的程度。培养的缘细胞的分层在培养10-14后为3-6层。通过在脱水(塑性压缩的)胶原凝胶上生长的缘细胞看到分层到类似的水平(图8C)。
实施例14：免疫化学
将得到的角膜构造在压缩的胶原凝胶和裸露的AM上LEC扩展后，通过免疫荧光显微镜检查。角膜构造被埋置在OCT(TissueTek)中，在液氮中被冷冻，随后被低温切片。在免疫细胞化学前，利用包含0.4％TritonX-100的50mM Tris-缓冲盐水(TBS；pH 7.2)中的5％牛血清白蛋白(BSA)在室温下封闭每个切片(10μm厚)达60分钟。随后，切片用针对细胞角蛋白(CK)3(1∶50；Chemicon，UK)和CK14(1∶100，Chemicon，UK)的一抗在4℃过夜孵育，在包含0.4％Triton X-100的TBS中的1％BSA中稀释。FITC-标记的二抗(1∶50，Sigma，UK)在室温下使用1小时。切片与碘化丙啶(Sigma，UK)共染色并通过荧光显微镜(Carl Zeiss Meditec，德国)观察。
实施例15：培养的缘细胞内的K14和K3表达
悬浮的缘上皮细胞显示在基层细胞内的强K14表达(未分化细胞的标记物)，其在空运之前对CK3(分化细胞的标记物(图9A)是阴性的。三到四层厚基细胞显示充满的细胞空间排列，具有极小的细胞间隙。细胞核显示高核/胞质比。上基层细胞更可能变平，具有清楚的细胞界限，这些细胞是CK14阴性的，也是CK3阴性的。
相同条件下缘外植体培养的细胞也显示出对CK14(图9B)的正染色，在外植体培养的细胞内CK3也是阴性或非常弱的染色。与悬浮培养的细胞不同，CK14阳性细胞被看到穿过所有的细胞层(3-4层)和甚至最上的上基层上的一些单独的细胞。这些细胞全部显示核/胞质的大比率和非常紧密的堆积。
CK3，也用作角膜上皮细胞的特异性标记物，在压缩的胶原凝胶(图10A)和裸露的AM(图10B)两者上生长的LEC的表面细胞层中强表达。另外的角膜上皮标记物，CK14(推定的祖细胞标记物)，被发现在压缩的胶原凝胶(图10C)和裸露的AM(图10D)两者上生长的LEC的全部细胞层中表达。
实施例16：蛋白质印迹
来自在具有埋置的角膜细胞的压缩的胶原支架和裸露的AM(对于每个条件4μg总蛋白质；利用改良的劳里试验评估)上生长的LEC的蛋白质通过一维十二烷基硫酸钠-聚丙烯酰胺凝胶电泳(SDS-PAGE)，利用10％凝胶被分离。它们被转移到聚偏二氟乙烯(PVDF)膜，与膜的非特异性结合通过用溶解在1X Tris-缓冲盐水-吐温(TBS-T)(20mM Tris-碱，0.14M NaCl，0.1％吐温
-20；pH 7.6)中的5％(w/v)牛奶孵育被阻断。膜用在2％(w/v)牛奶(溶解在1X TBS-T中)中稀释的抗-CK3一抗(1μgml-1)和抗-CK14一抗(1μgml-1)在4℃过夜孵育。在用小鼠-结合的二抗(1∶6000稀释)在室温下孵育2小时之前，印记在1X TBS-T中冲洗45分钟。利用增强的化学发光系统在X-射线胶片上检测蛋白质。
在两个支架(压缩的胶原和裸露的AM)上培养的LEC中观察CK3蛋白质表达，与在裸露的AM上培养的LEC相比，CK3在压缩的胶原基底上培养的LEC中更强地表达。CK14蛋白质也在两个支架上培养的LEC中观察到，两个支架之间的表达水平没有可辨别的差异(图11)。
实施例17：实时定量的PCR
根据生产商的规约，利用TRI试剂(Sigma，Poole，UK)，从具有埋置的角膜细胞的层粘连蛋白涂覆的压缩的胶原支架和裸露的AM两者上培养的LEC中分离总的RNA。总的RNA被分光光度计测量(GE医疗保健，UK)量化，遵循生产商的规约，利用RevertAid H Minus First StrandcDNA合成试剂盒(Fermentas，UK)反转录1ng RNA。定制的PerfectProbe试验(PrimerDesign，UK)被用于量化角蛋白12(登录号：XM_001255461)基因表达。每个反应用包含10μl 2X qPCR Mastermix(Primerdesign，UK)、1μl重组完美探针(reconsitituted perfectprobe)引物/探针混合物(Primerdesign，UK)、4μl PCR-级水(Primerdesign，UK)和5μl cDNA(1∶10的初始浓度)的20μl的最终反应体积进行3次。非模板对照也被进行。实时反应在ABI PRISM 7700序列检测仪(Applied Biosystem，UK)中的96孔板(Fisher，UK)上进行。
利用微软Excel进行Student t检验(未配对的)，以分析OD和实时PCR数据。结果以3个单独的实验的平均值与平均值的标准误差提供，P值≤0.05被认为显著。
CK12(像其对应物CK3)为分化的角膜上皮细胞的标记物。利用持家基因，GAPDH作为对照，实时PCR结果显示在埋置有角膜细胞的层粘连蛋白涂覆的压缩的胶原凝胶上扩展的LEC中的CK12 mRNA表达水平(1.18±0.09)稍高于在裸露的AM上扩展的LEC(1.00±0.07)。该差异发现是不显著的(P＞0.05)(图12)。
实施例18：胶原凝胶上的缘上皮长出物
无细胞胶原凝胶如上所述进行制备。在孵育器中凝固30分钟后，胶原凝胶被充分形成(图13A)，通过压缩和吸收的组合，利用尼龙网的层和纸片，与压缩的凝胶一起，液体被排出(图13B)。压缩的胶原凝胶是密集的，机械上强的，具有高程度的透明度(图13C)。
胶原凝胶上的缘上皮长出物
角膜上皮细胞由缘外植体生长。来自先前的分离步骤的残余的完整的缘边被切成几片(约2×2mm)，它们的上皮侧向上的两个片被直接置于压缩和未压缩的胶原凝胶的表面上，在所述的细胞培养基中培养。长出物的面积(区域)在组织培养板的顶部被标记，同时用倒置显微镜观察细胞。长出物的总面积(区域)在第3、6、和9天被精确地标记，测量并经受定量分析。
进行Student t-检验(未配对的)以利用微软Excel来比较未压缩的和压缩的胶原凝胶上LSC的长出物。结果以3个单独的实验的平均值与平均值的标准误差来提供，P值≤0.05被认为显著。
在3天以后，LEC从置于未压缩的(图14A)和压缩的(图14B)的胶原凝胶两者上的外植体长出，观察到长出物内的细胞是小和规则的。在未压缩的胶原凝胶(14.1±0.4；35.7±1.2；63.0±2.4；117.5±5.1mm2)和压缩的胶原凝胶(12.3±0.4；41.4±1.3；57.1±3.2；147.2±4.8mm2)上，第3、5、7和9天，分别标记和测量长出物面积(区域)。上皮长出物的面积(区域)的定量分析显示在两种凝胶类型上类似的指数生长(P＞0.05)(图14C)。
胶原凝胶上离体扩展LSC悬浮液
在无菌条件下，未压缩的和压缩的胶原凝胶被无菌PBS缓冲剂冲洗三次并随后安放在透孔插入物(transwell insert)(Corning，UK)的底部。100μl分离的LEC的悬浮液以106个细胞/ml被接种到每个凝胶上。细胞在如所述的培养基中被培养2周，随后通过降低培养基水平被暴露于空气达7天4。重要的是培养基水平被降低到恰好符合培养物的表面，允许培养基湿润表面，因此组织构造在其顶部表面保持湿润。在3周的孵育后，具有多层细胞的角膜上皮构造准备好用于检查。
电子显微镜
通过扫描电子显微镜(SEM)和透射电子显微镜(TEM)检查在LEC扩展之前和之后的压缩和未压缩的胶原凝胶和在胶原酶消化之后的缘环。样品被固定在2.5％(v/v)戊二醛中，在PBS中冲洗三次达10分钟，在1％含水四氧化锇中后固定2小时。样品随后在通过分级的乙醇系列(50％、70％、90％和100％)之前在PBS中被再冲洗三次。为了SEM，样品被转移到六甲基二硅氮烷20分钟并被允许风干。这些样品随后被安放在铝桩上并在利用SEM(FEI Quanta FEG 600，UK)检查前喷涂金。为了TEM，脱水的样品被埋置在环氧树脂(琼脂100；Agar Scientific，Ltd.，Stansted，UK)中。超薄(70nm)切片在铜载网上被收集并用乙酸铀酰和1％磷钨酸染色1小时，随后在利用透射电子显微镜(Philips CM20，Holland)检查前用Reynold柠檬酸铅染色20分钟。
胶原凝胶上的SEM分析显示在未压缩的凝胶内胶原纤维非常松散的排列(图15A)，而在压缩的凝胶内，胶原纤维显示密集和均匀的(图15B)，形态类似于裸露的角膜基质(图15C)。比较相对孔大小(胶原纤维之间的间隙)，压缩的凝胶类似于裸露的间质，具有比未压缩的凝胶更小的且更规则的孔大小。
不同支架上的LEC分布的扫描电子显微镜
观察到LEC在未压缩和压缩的胶原凝胶两者上增殖。未压缩的凝胶上的细胞的SEM图像显示细胞被不均匀分布且细胞的形状不规则(图16A)，而压缩的凝胶上的细胞的图像表明细胞更均匀的分布且在形状和大小方面均匀(图16B)，与正常牛角膜上的上皮显示的相同(图16C)。
不同支架上的LEC的结构的透射电子显微镜检查
在未压缩的胶原凝胶内的胶原纤维松散，直径多样(图17A)，而在压缩的凝胶内的纤维更密集，直径较少变化且更有序(图17B)。在压缩的凝胶内的胶原纤维比来自未压缩的支架的那些更接近地类似于来自牛角膜的正常间质纤维(图17C)。TEM分析显示接种到未压缩的胶原凝胶上的LEC既没有形成细胞基质粘附，也没有形成实质的基膜层(图17D)。然而，在压缩的凝胶上扩展的LEC产生定义的基膜层和在基细胞中半桥粒形成的证据(图17E)，类似于由正常角膜上皮显示的那样(图17F)。多细胞层形成在未压缩的胶原凝胶上，但是在这些细胞之间存在大的间隙，表明不良的细胞-细胞粘附(图17G)。在压缩的凝胶上，邻近细胞经由桥粒结构粘附(图17H)，再次类似于正常角膜上皮显示的那样(图17I)。
免疫组织化学
在胶原凝胶上的LEC扩展后，得到的角膜构造，通过免疫荧光被检查。低温切片(10μm厚)被包含0.4％Triton X-100的50mM Tris-缓冲盐水(TBS；pH 7.2)中的5％牛血清白蛋白(BSA)在室温处理60分钟。随后切片用在包含0.4％Triton X-100的TBS中的1％BSA中稀释的针对细胞角蛋白(CK)3(1∶50；Chemicon，UK)和CK14(1∶100，Chemicon，UK)的一抗在4℃过夜孵育。使用FITC-标记的二抗(Sigma，UK)。切片与碘化丙啶(Sigma，UK)共染色并通过荧光显微镜(Carl Zeiss Meditec，德国)观察。
LEC成功地在两种形式的胶原支架上被扩展和分层，但是被看到在压缩的凝胶(图18B)上形成比在未压缩的凝胶(图18A)上的更多的细胞层，使得压缩的组更类似于正常角膜上皮(图18C)。碘化丙啶(红色)染色的组织切片清楚地显示在未压缩的组内的核间距离远大于压缩的组。在未压缩的、压缩的和正常牛间质上的每mm2细胞密度分别为0.41、0.72、0.81。CK3(绿色)，通常用作分化的角膜上皮细胞的特异性标记物，在未压缩的(图18A)和压缩的胶原凝胶(图18B)上扩展的表面上皮细胞中被发现，类似于正常角膜上皮(图18C)。
实施例19：毒性试验
利用充分表征的眼表面毒素和作用于上皮屏障功能、细胞存活性和形态的新型纳米颗粒评估人造眼上皮细胞精确测量眼毒性的能力。
选自ECETOC数据库的试验化学品(所述数据库排列化学品的眼刺激可能性(ECETOC，Eye Irritation：ECETOC Technical Report.1998，Reference Chemicals Data Bank，ECETOC，Brussels，Belgium.p.236))，被选择以代表一定范围的眼刺激(即，无、温和、中等、严重)。液体样品浓度使用去离子水用于按照历史上体内Draize试验记录稀释，0.3％TritonX-100用作阳性对照。实验物质被直接施加于上皮培养物(100μl液体/悬浮液或100mg固体/粉末)的表面上，达到不同的暴露时间(10、20、30和60分钟)。纳米颗粒毒性通过0.1、0.5和1nM浓度的10-20nm大小金纳米颗粒逐滴施加到角膜等同物的表面达24、48和72小时来评估。聚乙二醇化金纳米颗粒和已经被共轭到感温(thermoresponsive)嵌段共聚物、聚(N-异丙基丙烯酰胺)的金纳米颗粒(在每个金纳米颗粒周围形成角膜)也被评估细胞和组织毒性。诱导的细胞毒性(细胞增殖的改变)通过常规使用的比色MTT(3-(4，5-二甲基噻唑-2-基)-2，5-二苯基四唑溴化物)试验(Mosmann，T.J Immunol Methods，1983.65(1-2)：p.55-63)被量化，计算存活性百分比。毒性的定性测量通过评估细胞表面破坏的频率和程度和通过扫描电子显微镜(SEM)的细胞微皱襞(microplicae)和微绒毛的外观实现。先前开发的数字分级系统被用于辅助角膜上皮细胞的相对损坏的分类(Burstein，N.Invest.Ophthalmol.Vis.Sci.，1980.19(3)：p.308-313)。毒性的其他测量包括锥虫蓝(Trypan Blue)排除细胞存活性试验和针对应激、毒性和DNA损伤相关的基因的PCR阵列。X-射线微量分析(EDAX)也被包括用于纳米金颗粒定位和确认。
模型的预测力通过研究体外基于干细胞的试验的存活性与体内Modified Maximum Average Scores(修改的最大平均得分)(MMAS)的关系来评估，MMAS是一种得分系统，其量化对角膜的作用，如ECETOC数据库中报道的。除了ECETOC报道，另外的(因特网)体内数据的源(Toxnet，(http://toxnet.nlm.nih.gov)：毒理学、有害化学品和相关领域的数据库的集合)和在其他可替换实验模型中获得的结果(例如，牛角膜浑浊和通透性试验；Slug粘膜刺激试验；商业上皮模型)，被包括在角膜干细胞模型的最终有效性评估中。
上面的实施例中所用的羊膜经由Queen Mary’s Hospital(UK)和University of Nottingham(UK)从匿名女性捐赠者获得。许可从NottinghamUniversity获得。人类角膜经由Royal Berkshire Hospital(UK)从匿名人类捐赠者获得。Regional Ethical Committee批准被给予用于角膜细胞的使用。
实施例20：压缩的胶原凝胶的核黄素/UV交联
为了提高压缩的胶原凝胶的机械性能，这些凝胶中的胶原纤维利用核黄素和UV被交联。基本方法在Wollensak G.et al.(American Journal ofOphthalmology，Volume 135，Issue 5，May 2003，pages 620-627)中描述。基本上，压缩的胶原凝胶在室温下，在0.1％核黄素溶液(在10mL葡聚糖20％溶液中10mg核黄素)中被孵育30分钟。在胶原凝胶和365nm处的UVA灯之间的5cm距离处进行照射30分钟。随后凝胶在PBS中被冲洗以去除任何不用的核黄素。
在下面给出对8个压缩的凝胶的数据。另外的信息在图19-21中给出。
CK3，通常用作角膜上皮细胞的特异性标记物，在核黄素/UV处理的压缩的胶原凝胶上生长的LEC的表面细胞层中强表达(图22)，类似于由在压缩的胶原凝胶(图10A)和裸露的AM(图10B)上生长的LEC所显示的。
实施例21：压缩的胶原凝胶和核黄素/UV处理的压缩的胶原凝胶的移植的临床评估
为了评估压缩的胶原凝胶对于在角膜移植中使用的适合性，将压缩的胶原凝胶(图23A)和核黄素/UV处理的胶原凝胶(图23B)缝合到受伤的兔角膜上。兔角膜先前已经被手术去除眼表面，即，角膜上皮细胞层和部分下面的间质(胶原基质)。核黄素/UV处理的胶原凝胶，由于它们增加的机械强度(实施例20)，可以被更好地保持在原位，导致更成功的移植。
Claims (45)
1.一种人造眼组织，包含人造眼上皮和塑性-压缩的胶原凝胶基底，通过包括在塑性-压缩的胶原凝胶基底上培养角膜干细胞或包含角膜干细胞的组合物的方法而获得或可获得，其中，所述细胞或所述组合物在这样的条件下培养以便提供在所述塑性-压缩的胶原凝胶基底上产生人造眼上皮的角膜上皮细胞群。
2.一种用于生产人造眼上皮的方法，包括在塑性-压缩的胶原凝胶基底上培养角膜干细胞或包含角膜干细胞的组合物，其中，所述细胞或所述组合物在这样的条件下培养以便提供在基底上产生人造眼上皮的角膜上皮细胞群。
3.根据权利要求2所述的方法，其中，随后将所述人造眼上皮与所述基底分离。
4.根据权利要求2所述的方法，其中，随后将所述人造眼上皮储存在适于人类组织的储存和保存的介质中，其中，将所述眼上皮在具有或没有所述塑性-压缩的胶原凝胶基底的情况下储存。
5.根据权利要求2至4中任一项所述的方法，其中，所述角膜干细胞为角膜缘上皮干细胞，优选为人类角膜缘上皮干细胞。
6.根据权利要求2至5中任一项所述的方法，其中，所述塑性-压缩的胶原凝胶基底通过提供在隙间液体中包含胶原原纤维的基质的胶原凝胶并随后通过下述对所述凝胶进行塑性-压缩：
(i)将压缩力施加到所述凝胶的一个或多个表面或边缘；
(ii)将脱水力施加到所述凝胶的一个或多个表面或边缘；
(iii)在一个或两个平面中拉伸所述凝胶；或
(iv)(i)-(iii)中的一个或多个的组合，
以及可选地使所述压缩的凝胶经受下述中的一个或多个重复循环的方法来产生：
(a)沿着所述凝胶的轴施加单轴负荷，以及
(b)去除所述负荷。
7.根据权利要求6所述的方法，其中，将(i)-(iv)中的一个或多个与将隙间-液体吸收物质施加到所述凝胶中的一个或多个表面或边缘进行组合。
8.根据权利要求2至7中任一项所述的方法，其中，所述塑性-压缩的胶原凝胶基底为1-60mm长，优选20-40mm长，和/或0.5-60mm宽，优选20-40mm宽。
9.根据权利要求2至8中任一项所述的方法，其中，所述塑性-压缩的胶原凝胶基底为10-1000μm厚，优选20-100μm厚。
10.根据权利要求2至9中任一项所述的方法，其中，所述塑性-压缩的胶原凝胶基底中的所述胶原原纤维的直径为10-100nm，和/或所述原纤维的间距为1-200nm。
11.根据权利要求2至10中任一项所述的方法，其中，所述塑性-压缩的胶原凝胶基底的胶原含量为3-4％。
12.根据权利要求2至11中任一项所述的方法，其中，所述压缩的胶原凝胶的至少一个表面用层粘连蛋白或一个或多个层粘连蛋白域涂覆，并且所述角膜干细胞或组合物在所述层粘连蛋白/层粘连蛋白域表面上培养。
13.根据权利要求2至12中任一项所述的方法，其中，所述压缩的胶原凝胶包含捕获在所述凝胶内的间质祖细胞，优选角膜成纤维细胞。
14.根据权利要求2至13中任一项所述的方法，其中，使所述压缩的胶原凝胶中的所述胶原已进行交联，优选利用核黄素和暴露于UV进行交联。
15.根据权利要求2至14中任一项所述的方法，其中，将所述塑性-压缩的胶原凝胶压缩到防止所述角膜干细胞向内生长到所述凝胶中的程度。
16.根据权利要求2至15中任一项所述的方法，其中，所述塑性-压缩的胶原凝胶为柔性和非刚性的。
17.根据权利要求2或4至16中任一项所述的方法，其中，随后将所述人造眼上皮保留在所述基底上，由此形成人造眼组织。
18.通过根据权利要求2至16中任一项所述的方法获得或可获得的人造眼上皮。
19.一种人造眼上皮，包含表达CK3分化标记物和CK14未分化标记物两者的3-7个细胞层的连续复层上皮，其中基膜成分位于基细胞内和基细胞下，所述人造眼上皮优选通过根据权利要求2至16中任一项所述的方法获得或可获得。
20.根据权利要求18或权利要求19所述的人造眼上皮，其中，半桥粒存在于一些或所有基细胞中和/或一些或所有邻近上皮细胞经由桥粒结构相互连接。
21.通过根据权利要求17所述的方法获得或可获得的人造眼组织。
22.一种人造眼组织，包含：
(i)根据权利要求18至20中任一项所述的人造眼上皮；以及
(ii)根据权利要求2至16中任一项所定义的塑性-压缩的胶原凝胶基底。
23.一种评估试验化合物对人造眼上皮或人造眼组织的作用的方法，包含以下步骤：
(a)提供根据权利要求18至20中任一项所述的人造眼上皮或根据权利要求21或权利要求22所述的人造眼组织；
(b)将所述人造眼上皮或人造眼组织与一定量的所述试验化合物接触；以及
(c)评估所述化合物对所述人造眼上皮或人造眼组织的作用。
24.根据权利要求18至20中任一项所述的人造眼上皮或根据权利要求21或权利要求22所述的人造眼组织在提供试验化合物对哺乳动物角膜的毒性的指征中的应用。
25.根据权利要求18至20中任一项所述的人造眼上皮或根据权利要求21或权利要求22所述的人造眼组织作为人造角膜的应用。
26.根据权利要求18至20中任一项所述的人造眼上皮或根据权利要求21或权利要求22所述的人造眼组织作为用于将细胞递送到需要其的组织的试剂的应用。
27.一种处理眼外伤的方法，包括：
(a)提供根据权利要求18至20中任一项所述的人造眼上皮或根据权利要求21或权利要求22所述的人造眼组织；
(b)将所述眼外伤与所述人造眼上皮或人造眼组织接触；以及可选地
(c)将所述人造眼上皮或人造眼组织固定在所述眼外伤的部位。
28.根据权利要求18至20中任一项所述的人造眼上皮或根据权利要求21或权利要求22所述的人造眼组织，用于治疗方法中，优选用于处理眼外伤的方法中。
29.根据权利要求18至20中任一项所述的人造眼上皮或根据权利要求21或权利要求22所述的人造眼组织在制造用于治疗方法，优选用于处理眼外伤的方法的组合物中的应用。
30.根据权利要求27所述的方法，根据权利要求28所述的人造眼上皮或组织或根据权利要求29所述的应用，其中，所述眼外伤为涉及不足的间质微环境以支持干细胞功能的眼外伤，如无虹膜、角膜炎、神经营养性角膜病变和慢性limbitis；或者涉及破坏缘干细胞的外在因素的眼外伤，如化学或热伤、史蒂文斯-约翰逊综合征、眼瘢痕类天疱疮、接触镜佩戴并发症、或广泛的微生物感染。
31.一种替换哺乳动物受试者中的角膜的方法，包括：
(a)提供根据权利要求18至20中任一项所述的人造眼上皮或根据权利要求21或权利要求22所述的人造眼组织；
(b)用所述人造眼上皮或组织替换所述哺乳动物受试者的角膜。
32.根据权利要求18至20中任一项所述的人造眼上皮或根据权利要求21或权利要求22所述的人造眼组织，用于手术方法中，优选其中哺乳动物受试者的所述角膜被所述人造眼上皮或组织替换。
33.根据权利要求18至20中任一项所述的人造眼上皮或根据权利要求21或权利要求22所述的人造眼组织在制造用于手术方法的组合物中的应用，优选其中哺乳动物受试者的所述角膜被所述人造眼上皮或组织替换。
34.塑性-压缩的胶原凝胶作为用于角膜细胞生长的基底的应用。
35.根据权利要求34所述的应用，其中，所述塑性-压缩的胶原凝胶基底通过提供在隙间液体中包含胶原原纤维的基质的胶原凝胶并随后通过下述对所述凝胶进行塑性-压缩：
(i)将压缩力施加到所述凝胶的一个或多个表面或边缘；
(ii)将脱水力施加到所述凝胶的一个或多个表面或边缘；
(iii)在一个或两个平面中拉伸所述凝胶；或
(iv)(i)-(iii)中的一个或多个的组合，
以及可选地使所述压缩的凝胶经受下述中的一个或多个重复循环的方法来产生：
(a)沿着所述凝胶的轴施加单轴负荷，以及
(b)去除所述负荷。
36.根据权利要求35所述的应用，其中，将(i)-(iv)中的一个或多个与将隙间-液体吸收物质施加到所述凝胶的一个或多个表面或边缘进行组合。
37.根据权利要求34至36中任一项所述的应用，其中，所述塑性-压缩的胶原凝胶基底为1-60mm长，优选20-40mm长，和/或0.5-60mm宽，优选20-40mm宽。
38.根据权利要求34至37中任一项所述的应用，其中，所述塑性-压缩的胶原凝胶基底为10-1000μm厚，优选20-100μm厚。
39.根据权利要求34至38中任一项所述的应用，其中，所述塑性-压缩的胶原凝胶基底中的所述胶原原纤维的直径为10-100nm，和/或所述原纤维的间距为1-200nm。
40.根据权利要求34至39中任一项所述的应用，其中，所述塑性-压缩的胶原凝胶基底的胶原含量为3-4％。
41.根据权利要求34至40中任一项所述的应用，其中，所述胶原凝胶的至少一个表面用层粘连蛋白涂覆。
42.根据权利要求34至41中任一项所述的应用，其中，所述胶原凝胶是交联的，优选利用核黄素/UV交联。
43.一种塑性-压缩的胶原凝胶，其中，所述胶原纤维通过用核黄素处理，优选利用UV光而已被交联。
44.根据权利要求43所述的塑性-压缩的胶原凝胶，其中，所述凝胶是根据权利要求2至14中任一项所定义的。
45.根据权利要求43或权利要求44所述的塑性-压缩的胶原凝胶作为用于生长人造眼上皮的基底的应用。
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