CN102433328A - 扩增青虾gih-a和青虾gih-b的引物组及其扩增方法 - Google Patents
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Abstract
本发明涉及基因克隆领域，特别涉及扩增青虾性腺抑制激素(Gonad-inhibtinghormone，GIH)基因的引物组及克隆方法。利用本发明提供的引物组从青虾眼柄中克隆到了一种GIH-A和GIH-B基因，为青虾蜕皮、生殖、变态发育、血糖平衡以及体内渗透压的调控机制研究提供理论基础，为青虾良种繁育积累背景资料。
Description
技术领域
本发明涉及基因克隆领域，特别涉及扩增青虾GIH基因的引物组及扩增方法。
背景技术
青虾，学名日本沼虾(Macrobrachium nipponense)，隶属十足目（Decapoda），长臂虾科（Palaemonidae）、沼虾属（Macrobrachium），广泛分布于全国各地，是我国重要的淡水养殖虾类。近年来青虾出现了种质资源退化严重，规格小、性早熟等现象成为制约青虾养殖业可持续发展的关键问题。解决这些生产问题的关键在于对青虾的生长发育、繁殖、蜕皮等调控机理的掌握。
已有研究表明，性腺抑制激素(Gonad-inhibting hormone，GIH)作为甲壳动物眼柄中合成分泌的甲壳动物高血糖激素（crustacean hyperglycemic hormone，CHH）家族神经肽的重要成员之一,在调控甲壳运物的蜕皮、变态发育、生殖、血糖平衡以及体内的渗透压等方面起着重要的作用。GIH在雌性个体中又称为卵黄发生抑制激素(vitellogensis inhibiting bormone，VIH)，其主要作用是抑制雌性虾蟹的卵黄发生作用。目前有关青虾的研究主要集中在生物学特性、核型分析、养殖技术、病害防治和营养饲料以及群体遗传学等方面,而关于青虾眼柄神经激素的克隆研究还尚未报道。
在美洲鳌龙虾、欧洲鳌龙虾(Homarus gammarus)、挪威海螯虾、刀额新对虾、斑节对虾，罗氏沼虾、Rimicaris Karrei 和普通卷甲虫中已经克隆获得了GIH cDNA序列。研究表明，已获得的GIH cDNA序列所编码的GIH前体均由一个信号肽和一个成熟肽组成，信号肽的长度为31aa、23aa、17aa、32aa、34aa不等，成熟肽的长度为78aa、79aa、81aa不等.沼虾和龙虾的GIH氨基酸序列比较相似性为45-59%，对虾和龙虾的相似性为46%，而对虾和沼虾的相似性为30%，这表明GIH在物种间的保守性差，这也是CHH家族肽普遍存在的情况，可能是由于与脊椎动物相比低等生物在进化的过程中变异较大造成的。
因此，提供引物组用于扩增青虾GIH基因，对于研究青虾的蜕皮、变态发育、生殖、血糖平衡以及体内的渗透压调控机制等方面，具有重要意义。
发明内容
有鉴于此，本发明提供扩增青虾GIH基因的引物组及克隆方法。利用本发明提供的引物组从青虾眼柄中克隆到了一种GIH-A和GIH-B基因，对研究青虾蜕皮、变态发育、生殖、血糖平衡以及体内的渗透压调控机制提供参考，为青虾良种繁育积累背景资料。
为了实现上述发明目的，本发明提供以下技术方案：
本发明提供了扩增Gene Bank登录号为HQ724325.1的青虾GIH-A基因的引物组，其由如下引物组成：
引物组1：
正向引物FZ1的核苷酸序列如SEQ ID NO:1所示；
正向引物FZ2的核苷酸序列如SEQ ID NO:2所示；
反向引物RZ的核苷酸序列如SEQ ID NO:3所示；
引物组2：
正向外引物F3-1的核苷酸序列如SEQ ID NO:4所示；
正向内引物F3-2的核苷酸序列如SEQ ID NO:5所示；
反向外引物R5-1的核苷酸序列如SEQ ID NO:6所示；
反向内引物R5-2的核苷酸序列如SEQ ID NO:7所示。
本发明还提供了扩增Gene Bank登录号为HQ724326.1的青虾GIH-B基因的引物组，其由如下引物组成：
引物组1：
正向引物FZ1的核苷酸序列如SEQ ID NO:1所示；
正向引物FZ2的核苷酸序列如SEQ ID NO:2所示；
反向引物RZ的核苷酸序列如SEQ ID NO:3所示；
引物组2：
正向外引物F3-12的核苷酸序列如SEQ ID NO:8所示；
正向内引物F3-6的核苷酸序列如SEQ ID NO:9所示；
反向外引物R5-4的核苷酸序列如SEQ ID NO:10所示；
反向内引物R5-5的核苷酸序列如SEQ ID NO:11所示。
本发明还提供了一种扩增Gene Bank登录号为HQ724325.1的青虾GIH-A基因的方法，包括如下步骤：
步骤1：获得青虾眼柄总RNA；
步骤2：合成cDNA；
步骤3：用引物组1扩增获得青虾GIH-A基因片段；所述引物组1由乳腺癌引物组成：
正向引物FZ1的核苷酸序列如SEQ ID NO:1所示；
正向引物FZ2的核苷酸序列如SEQ ID NO:2所示；
反向引物RZ的核苷酸序列如SEQ ID NO:3所示；
步骤4：用引物组2扩增获得青虾GIH-A基因片段的3’端和5’端片段；所述引物组2由如下引物组成：
正向外引物F3-1的核苷酸序列如SEQ ID NO:4所示；
正向内引物F3-2的核苷酸序列如SEQ ID NO:5所示；
反向外引物R5-1的核苷酸序列如SEQ ID NO:6所示；
反向内引物R5-2的核苷酸序列如SEQ ID NO:7所示；
步骤5：将所述GIH-A因片段、所述GIH-A基因片段的3’端和5’端片段拼接，即得。
作为优选，步骤4所述扩增为套式两轮PCR。
本发明还提供了一种扩增Gene Bank登录号为HQ724326.1的青虾GIH-B基因的方法，包括如下步骤：
步骤1：获得青虾眼柄总RNA；
步骤2：合成cDNA；
步骤3：用引物组1扩增获得青虾GIH-B基因片段；所述引物组1由乳腺癌引物组成：
正向引物FZ1的核苷酸序列如SEQ ID NO:1所示；
正向引物FZ2的核苷酸序列如SEQ ID NO:2所示；
反向引物RZ的核苷酸序列如SEQ ID NO:3所示；
步骤4：用引物组2扩增获得青虾GIH-B基因片段的3’端和5’端片段；所述引物组3由如下引物组成：
正向外引物F3-12的核苷酸序列如SEQ ID NO:8所示；
正向内引物F3-6的核苷酸序列如SEQ ID NO:9所示；
反向外引物R5-4的核苷酸序列如SEQ ID NO:10所示；
反向内引物R5-5的核苷酸序列如SEQ ID NO:11所示:；
步骤5：将所述GIH-B基因片段、GIH-B基因片段的3’端和5’端片段拼接，即得。
作为优选，步骤4所述扩增为套式两轮PCR。
[0015] 本发明以青虾眼柄为材料，分离了青虾GIH的全长cDNA序列，利用逆转录聚合酶链式反应(RT-PCR)、嵌套聚合酶链反应(Nested-PCR)、3’端cDNA快速扩增(3’-RACE)以及5’端cDNA快速扩增(5’-RACE)的方法，对青虾GIH-A和GIH-B基因进行了研究，首次从青虾眼柄中克隆到了一种GIH-A和GIH-B基因，并对其所编码的神经肽的序列特征、同源性、进化地位进行了分析，为进一步研究青虾GIH基因的表达、调控奠定了基础，对研究青虾蜕皮、变态发育、生殖、血糖平衡以及体内的渗透压调控机制提供参考，为青虾良种繁育积累背景资料，同时也为甲壳动物整个CHH家族的功能和进化研究提供了新的材料。
附图说明
图1为青虾GIH-A和GIH-B的氨基酸序列与其它CHH家族神经肽的比对，其中“|”表示信号肽的切割位点；
“^”表示CHH前体相关肽的位置。
图2为甲壳动物CHH家族激素前体的NJ系统进化树。
具体实施方式
本发明公开了扩增青虾GIH基因的引物组及克隆方法。本领域技术人员可以借鉴本文内容，适当改进工艺参数实现。特别需要指出的是，所有类似的替换和改动对本领域技术人员来说是显而易见的，它们都被视为包括在本发明。本发明的方法及应用已经通过较佳实施例进行了描述，相关人员明显能在不脱离本发明内容、精神和范围内对本文所述的方法和应用进行改动或适当变更与组合，来实现和应用本发明技术。
本发明提供了扩增Gene Bank登录号为HQ724325.1的青虾GIH-A基因的引物组，其由如下引物组成：
引物组1：
正向引物FZ1的核苷酸序列如SEQ ID NO:1所示；
正向引物FZ2的核苷酸序列如SEQ ID NO:2所示；
反向引物RZ的核苷酸序列如SEQ ID NO:3所示；
引物组2：
正向外引物F3-1的核苷酸序列如SEQ ID NO:4所示；
正向内引物F3-2的核苷酸序列如SEQ ID NO:5所示；
反向外引物R5-1的核苷酸序列如SEQ ID NO:6所示；
反向内引物R5-2的核苷酸序列如SEQ ID NO:7所示。
本发明还提供了扩增Gene Bank登录号为HQ724326.1的青虾GIH-B基因的引物组，其由如下引物组成：
引物组1：
正向引物FZ1的核苷酸序列如SEQ ID NO:1所示；
正向引物FZ2的核苷酸序列如SEQ ID NO:2所示；
反向引物RZ的核苷酸序列如SEQ ID NO:3所示；
引物组2：
正向外引物F3-12的核苷酸序列如SEQ ID NO:8所示；
正向内引物F3-6的核苷酸序列如SEQ ID NO:9所示；
反向外引物R5-4的核苷酸序列如SEQ ID NO:10所示；
反向内引物R5-5的核苷酸序列如SEQ ID NO:11所示。
本发明还提供了一种扩增Gene Bank登录号为HQ724325.1的青虾GIH-A基因的方法，包括如下步骤：
步骤1：获得青虾眼柄总RNA；
步骤2：合成cDNA；
步骤3：用引物组1扩增获得青虾GIH-A基因片段；所述引物组1由乳腺癌引物组成：
正向引物FZ1的核苷酸序列如SEQ ID NO:1所示；
正向引物FZ2的核苷酸序列如SEQ ID NO:2所示；
反向引物RZ的核苷酸序列如SEQ ID NO:3所示；
步骤4：用引物组2扩增获得青虾GIH-A基因片段的3’端和5’端片段；所述引物组2由如下引物组成：
正向外引物F3-1的核苷酸序列如SEQ ID NO:4所示；
正向内引物F3-2的核苷酸序列如SEQ ID NO:5所示；
反向外引物R5-1的核苷酸序列如SEQ ID NO:6所示；
反向内引物R5-2的核苷酸序列如SEQ ID NO:7所示；
步骤5：将所述GIH-A因片段、所述GIH-A基因片段的3’端和5’端片段拼接，即得。
作为优选，步骤4所述扩增为套式两轮PCR。
本发明还提供了一种扩增Gene Bank登录号为HQ724326.1的青虾GIH-B基因的方法，包括如下步骤：
步骤1：获得青虾眼柄总RNA；
步骤2：合成cDNA；
步骤3：用引物组1扩增获得青虾GIH-B基因片段；所述引物组1由乳腺癌引物组成：
正向引物FZ1的核苷酸序列如SEQ ID NO:1所示；
正向引物FZ2的核苷酸序列如SEQ ID NO:2所示；
反向引物RZ的核苷酸序列如SEQ ID NO:3所示；
步骤4：用引物组2扩增获得青虾GIH-B基因片段的3’端和5’端片段；所述引物组3由如下引物组成：
正向外引物F3-12的核苷酸序列如SEQ ID NO:8所示；
正向内引物F3-6的核苷酸序列如SEQ ID NO:9所示；
反向外引物R5-4的核苷酸序列如SEQ ID NO:10所示；
反向内引物R5-5的核苷酸序列如SEQ ID NO:11所示:；
步骤5：将所述GIH-B基因片段、GIH-B基因片段的3’端和5’端片段拼接，即得。
作为优选，步骤4所述扩增为套式两轮PCR。
使用ClustalW1.83将GIH-A和GIH-B的cDNA序列全长以及所编码的氨基酸进行比对，青虾GIH-A和GIH-B的cDNA序列全长以及所编码的氨基酸长度等均不相同(见表1)。信号肽长度相差2个氨基酸，序列差异大，前体相似性为56％，成熟肽相似性为69％。使用ClustalW1.83将GIH-A和GIH-B氨基酸序列与已公布的部分虾蟹类CHH家族氨基酸序列进行了比对。前体的比对(不包括CHH的CPRP)结果如图1。结果显示，青虾GIH-A与罗氏沼虾SGP-A最相似(99％)，青虾GIH-B与罗氏沼虾的SGP-B最相似(94％)，都比青虾GIH-A和GIH-B之间相似性(69％)高，总体而言青虾GIH-A与其它物种II型肽(GIH、MIH、MOIH)的相似性要比青虾GIH-B与其它物种II型肽(GIH、MIH、MOIH)的相似性高一些。
通过对青虾中获得的该基因的序列与其它物种GIH序列利用DNAstar软件对GIH进行alignment分析和使用MEGA 4构建NJ系统发育树(如图2)，由系统发育树可见，甲壳动物CHH家族分为两组，分别是虾蟹类的CHH和虾蟹类的GIH、MIH、MOIH这两组，这与CHH家族结构的分型一致(I型和II型)。沼虾的II型肽与海螯虾的II型肽亲缘关系最近，其次与蟹的II型肽亲缘关系较近，与对虾II型肽亲缘关系较远，与鳌虾II型肽亲缘关系最远。
本发明中青虾由太湖无锡湖区渔民提供，试剂均可由市场够得，纯化及cDNA第一链合成试剂盒购自上海生工生物工程有限公司(Sangon)，3′及5′RACE试剂盒购自宝生物（大连）有限公司（Takara）。
下面结合实施例，进一步阐述本发明：
实施例1
总RNA提取：逐个取青虾眼柄，去色素后迅速放入盛有液氮的预冷研钵中，共取六个眼柄约30mg，解剖速度要快并且注意添加液氮；总RNA的提取使用上海博星生物公司的Unizol RNA提取试剂结合RNeasy Mini Kit法进行，提取方法参照使用说明书。
cDNA第一链合成：据上海生工生物工程有限公司(Sangon) cDNA合成试剂盒说明书进行。
青虾GIH cDNA 片段克隆：
根据已获得的GIH cDNA序列(美洲鳌龙虾Homarus americanus，X87192；欧洲鳌龙虾Homarus gammarus，DQ181793；挪威海螯虾Nephrops norvegicus，AF163771；Rimicaris kairei，FJ447500；罗氏沼虾Macrobrachium rosenbergii，AF432346)的编码区进行比对，依据比对结果，在保守区域设计引物，用于PCR扩增，得到青虾GIH-A和GIH-B基因片段；
正向引物：
FZ1：5′- GGBWTCTCTGYHCAGAGAGT -3′
FZ2：5′- CGAATGCCCHGGBGTVATGG -3′
反向引物：
RZ：5′- TAGACRCACCACAGGAARTC -3′
PCR扩增反应体系如下：
| RT液 | 2 μL |
| 10×PCR Buffer | 2.5 μL |
| MgCl2(25mM) | 2 μL |
| dNTP Mixture(25mM each) | 0.2 μL |
| Forward Primer(10μM) | 2.5 μL |
| Reverse Primer(10μM) | 2.5 μL |
| Taq DNA Polymerse(5U/μL) | 0.2 μL |
| dH2O | up to 25 μL。 |
PCR反应程序为：94℃预变性4min，然后进入下列循环：94℃ 30s，50℃ 30s，72℃ 1min，35个循环，最后72℃延伸10min，4℃保存。2%琼脂糖凝胶电泳检测。
反应产物纯化：利用上海生工生物工程有限公司(Sangon)产品，操作步骤按产品说明书进行。
基因片段的克隆：纯化的PCR产物与pMD18-T载体连接，转化大肠杆菌DH5α，进行蓝白斑筛选，挑取单克隆白斑扩增培养后，提取质粒，以FZ1、FZ2和RZ2为引物做PCR检测，确认插入片段大小后进行测序。
GIH（GIH-A和GIH-B）cDNA 3’端快速扩增（3’—RACE）：
根据3中得到的GIH-A和GIH-B基因片段序列，又设计特异性正向引物F3-1(即GSP1)和F3-2(即GSP2)及F3-6(即GSP2)和F3-12(即GSP1)；与正向引物GSP1和GSP2相配对反向引物是3′ RACE试剂盒中提供的3′ RACE Outer Primer和3′ RACE Inner Primer，进行cDNA 3’快速扩增，操作步骤按TaKaRa3’—RACE试剂盒说明书进行。正反引物序列如下：
F3-1：5′-GCAACAGGGACCTATACGAGAAG-3′
F3-2：5′-GTCAGGGTATGCGACGATTGTTC-3′
F3-12：5′-TGGCATCTCGTCTCAACAAAGC-3′
F3-6：5′-GTCAGGATATGCGACGACTGCGA-3′
3′ RACE Outer Primer：5′-TACCGTCGTTCCACTAGTGATTT-3′
3′ RACE Inner Primer：5′-CGCGGATCCTCCACTAGTGATTTCACTATAGG-3′
反转录：
按照3′ RACE试剂盒中的说明进行，获得3′ RT液。
| Total RNA | 5 μg |
| 3′ RACE Adaptor(5μΜ) | 2 μL |
| dNTP Mixture(10mM each) | 2 μL |
| 5×M-MLV Buffer | 4 μL |
| Rnase Inhibitor(40U/μL) | 0.5 μL |
| Reverse Transcriptase M-MLV(Rnase H－)(200U/μL) | 0.5 μL |
| Rnase Free dH2O | up to 20 μL。 |
反应条件为：42℃ 60 min；70℃ 15min；4℃ 2min。
第一轮PCR：
扩增反应体系如下：
| 3′ RT液 | 2 μL |
| 1×cDNA Dilution BufferⅡ | 3 μL |
| GSP1(10μM) | 1 μL |
| 3′ RACE Outer Primer (10μM) | 1 μL |
| 10×LA PCR BufferⅡ(Mg2+ Free) | 2 μL |
| MgCl2(25mM) | 1.5 μL |
| TaKaRa LA Taq(5U/μL) | 0.25 μL |
| dH2O | up to 25 μL。 |
第一轮PCR的反应条件为：94℃ 3min；94℃ 30s，55℃ 30s，72℃ 90s，30个循环；72℃ 10min；4℃保存。
第二轮PCR：
扩增反应体系如下：
| 第一轮PCR产物 | 2 μL |
| dNTP Mixture(2.5mM each) | 8 μL |
| 10×LA PCR BufferⅡ(Mg2+ Free) | 5 μL |
| MgCl2(25mM) | 5 μL |
| TaKaRa LA Taq(5U/μL) | 0.5 μL |
| GSP2(10μM) | 2 μL |
| 3′ RACE Inner Primer (10μM) | 2 μL |
| dH2O | up to 50 μL。 |
第二轮PCR的反应条件和第一轮一样。
将套式PCR产物在2.0%的琼脂糖胶上进行目的位置大小的检测，并进行随后的切胶、回收、转化、克隆及测序等（与3方法相同）。
GIH（GIH-A和GIH-B）cDNA 5’端快速扩增（5’—RACE）：
依据3中引物FZ1和RZ2扩增得到的部分cDNA序列(GIH-A的部分序列)设计用于扩增青虾GIH-A mRNA 5′ 端的反向特异引物R5-1(即GSP1)和R5-2(即GSP2)。
依据3中引物FZ2和RZ2扩增得到的部分cDNA序列(GIH-B的部分序列)设计用于扩增青虾GIH-B mRNA 5′ 端的反向特异引物R5-4(即GSP1)和R5-5(即GSP2)。
与反向引物GSP1和GSP2相配对正向引物是5′ RACE试剂盒中提供的5′ RACE Outer Primer和5′ RACE Inner Primer。正反引物序列如下：
R5-1：5′- GTTGGAACAATCGTCGCATACC -3′
R5-2：5′- TCGCATACCCTGACGACCTTCT -3′
R5-4：5′- CGTCGCATATCCTGACGACGTAT -3′
R5-5：5′- CGACGTATTCGTACAAGTCACGA -3′
5′ RACE Outer Primer：5′- CATGGCTACATGCTGACAGCCTA -3′
5′ RACE Inner Primer：5′-CGCGGATCCACAGCCTACTGATGATCAGTCGATG-3′
反转录：
按照5′ RACE试剂盒中的说明进行，使用Alkaline Phosphatase(CIAP)对Total RNA中裸露的5′磷酸基团进行去磷酸反应，然后使用Tobacco Acid Pyrophosphatase (TAP)去掉mRNA的5′ 帽子结构，保留一个磷酸基团，再连接5′RACE Adaptor，最后进行反转录反应，得到5′ RT液。
反转录反应：
① 首先在Microtube中配制下列溶液：
Ligated RNA 6 μL
Random 9 mers(50μM) 0.5 μL
② PCR仪上70℃ 10min，冰上放置2min，然后加入下列试剂：
5×M-MLV Buffer 2 μL
dNTP(10mM each) 1 μL
RNase Inhibitor(40U/μL) 0.25 μL
Reverse Transcriptase M-MLV(RNase H－)(200 U/μL) 0.25 μL
③ PCR仪上进行反转录，条件为：30℃ 10min；42℃ 60 min；70℃ 15min；4℃ 2min。
（2）第一轮PCR
以上述5′ RT液为模板，用设计的扩青虾GIH-A和GIH-B 5′ 端的GSP1(即R5-1和R5-4)与5′ RACE Outer Primer进行第一轮PCR扩增，扩增反应体系如下：
| 5′ RT液 | 1 μL |
| 1×cDNA Dilution BufferⅡ | 4 μL |
| GSP1(10μM) | 1 μL |
| 5′ RACE Outer Primer (10μM) | 1 μL |
| 10×LA PCR BufferⅡ(Mg2+ Free) | 2 μL |
| MgCl2(25mM) | 1.5 μL |
| TaKaRa LA Taq(5U/μL) | 0.25 μL |
| dH2O | up to 25 μL |
。第一轮PCR的反应条件为：94℃ 3min；94℃ 30s，55℃ 30s，72℃ 90s，20个循环；72℃ 10min；4℃保存。
以第一轮PCR产物为模板，用设计的扩增GIH-A和GIH-B5′ 端的GSP2(即R5-2和R5-5)与5′ RACE Inner Primer进行第二轮PCR扩增，扩增反应体系如下：
| 第一轮PCR产物 | 1 μL |
| dNTP Mixture(2.5mM each) | 8 μL |
| 10×LA PCR BufferⅡ(Mg2+ Free) | 5 μL |
| MgCl2(25mM) | 5 μL |
| TaKaRa LA Taq(5U/μL) | 0.5 μL |
| GSP2(10μM) | 2 μL |
| 3′ RACE Inner Primer (10μM) | 2 μL |
| dH2O | up to 50 μL。 |
第二轮PCR的反应条件为：94℃ 3min；94℃ 30s，55℃ 30s，72℃ 90s，30个循环；72℃ 10min；4℃保存。
将套式PCR产物在2.0%的琼脂糖胶上进行目的位置大小的检测，并进行随后的切胶、回收、转化、克隆及测序等（与上述方法相同）。
根据3’序列和5’序列的共有部分进行GHH cDNA 全长拼接。
比较青虾GIH-A和GIH-B的序列差异，结果见表1。
表1 青虾GIH-A和GIH-B的序列差异
以上所述仅是本发明的优选实施方式，应当指出，对于本技术领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明原理的前提下，还可以做出若干改进和润饰，这些改进和润饰也应视为本发明的保护范围。
<110> 中国水产科学研究院淡水渔业研究中心
<120> 扩增青虾GIH-A和青虾GIH-B的引物组及其扩增方法
<130>
<160> 11
<170> PatentIn version 3.3
<210> 1
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 1
ggbwtctctg yhcagagagt 20
<210> 2
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列
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<211> 20
<212> DNA
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<400> 3
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<212> DNA
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<211> 23
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<212> DNA
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<211> 22
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 8
tggcatctcg tctcaacaaa gc 22
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<211> 23
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 9
gtcaggatat gcgacgactg cga 23
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<212> DNA
<213> 人工序列
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cgtcgcatat cctgacgacg tat 23
<210> 11
<211> 23
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 11
cgacgtattc gtacaagtca cga 23
Claims (6)
1.扩增Gene Bank登录号为HQ724325.1的青虾GIH-A基因的引物组，其特征在于，其由如下引物组成：
引物组1：
正向引物FZ1的核苷酸序列如SEQ ID NO:1所示；
正向引物FZ2的核苷酸序列如SEQ ID NO:2所示；
反向引物RZ的核苷酸序列如SEQ ID NO:3所示；
引物组2：
正向外引物F3-1的核苷酸序列如SEQ ID NO:4所示；
正向内引物F3-2的核苷酸序列如SEQ ID NO:5所示；
反向外引物R5-1的核苷酸序列如SEQ ID NO:6所示；
反向内引物R5-2的核苷酸序列如SEQ ID NO:7所示。
2.扩增Gene Bank登录号为HQ724326.1的青虾GIH-B基因的引物组，其特征在于，其由如下引物组成：
引物组1：
正向引物FZ1的核苷酸序列如SEQ ID NO:1所示；
正向引物FZ2的核苷酸序列如SEQ ID NO:2所示；
反向引物RZ的核苷酸序列如SEQ ID NO:3所示；
引物组2：
正向外引物F3-12的核苷酸序列如SEQ ID NO:8所示；
正向内引物F3-6的核苷酸序列如SEQ ID NO:9所示；
反向外引物R5-4的核苷酸序列如SEQ ID NO:10所示；
反向内引物R5-5的核苷酸序列如SEQ ID NO:11所示。
3.一种扩增Gene Bank登录号为HQ724325.1的青虾GIH-A基因的方法，其特征在于，包括如下步骤：
步骤1：获得青虾眼柄总RNA；
步骤2：合成cDNA；
步骤3：用引物组1扩增获得青虾GIH-A基因片段；所述引物组1由乳腺癌引物组成：
正向引物FZ1的核苷酸序列如SEQ ID NO:1所示；
正向引物FZ2的核苷酸序列如SEQ ID NO:2所示；
反向引物RZ的核苷酸序列如SEQ ID NO:3所示；
步骤4：用引物组2扩增获得青虾GIH-A基因片段的3’端和5’端片段；所述引物组2由如下引物组成：
正向外引物F3-1的核苷酸序列如SEQ ID NO:4所示；
正向内引物F3-2的核苷酸序列如SEQ ID NO:5所示；
反向外引物R5-1的核苷酸序列如SEQ ID NO:6所示；
反向内引物R5-2的核苷酸序列如SEQ ID NO:7所示；
步骤5：将所述GIH-A因片段、所述GIH-A基因片段的3’端和5’端片段拼接，即得。
4.根据权利要求3所述的方法，其特征在于，步骤4所述扩增为套式两轮PCR。
5.一种扩增Gene Bank登录号为HQ724326.1的青虾GIH-B基因的方法，其特征在于，包括如下步骤：
步骤1：获得青虾眼柄总RNA；
步骤2：合成cDNA；
步骤3：用引物组1扩增获得青虾GIH-B基因片段；所述引物组1由乳腺癌引物组成：
正向引物FZ1的核苷酸序列如SEQ ID NO:1所示；
正向引物FZ2的核苷酸序列如SEQ ID NO:2所示；
反向引物RZ的核苷酸序列如SEQ ID NO:3所示；
步骤4：用引物组2扩增获得青虾GIH-B基因片段的3’端和5’端片段；所述引物组3由如下引物组成：
正向外引物F3-12的核苷酸序列如SEQ ID NO:8所示；
正向内引物F3-6的核苷酸序列如SEQ ID NO:9所示；
反向外引物R5-4的核苷酸序列如SEQ ID NO:10所示；
反向内引物R5-5的核苷酸序列如SEQ ID NO:11所示:；
步骤5：将所述GIH-B基因片段、GIH-B基因片段的3’端和5’端片段拼接，即得。
6.根据权利要求5所述的方法，其特征在于，步骤4所述扩增为套式两轮PCR。
Priority Applications (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| CN2011103037911A CN102433328A (zh) | 2012-02-06 | 2012-02-06 | 扩增青虾gih-a和青虾gih-b的引物组及其扩增方法 |
Applications Claiming Priority (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| CN2011103037911A CN102433328A (zh) | 2012-02-06 | 2012-02-06 | 扩增青虾gih-a和青虾gih-b的引物组及其扩增方法 |
Publications (1)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| CN102433328A true CN102433328A (zh) | 2012-05-02 |
Family
ID=45981674
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| CN2011103037911A Pending CN102433328A (zh) | 2012-02-06 | 2012-02-06 | 扩增青虾gih-a和青虾gih-b的引物组及其扩增方法 |
Country Status (1)
| Country | Link |
|---|---|
| CN (1) | CN102433328A (zh) |
Cited By (1)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| CN109251931A (zh) * | 2018-09-18 | 2019-01-22 | 中国水产科学研究院淡水渔业研究中心 | 青虾Rev3基因及其编码蛋白和应用 |
-
2012
- 2012-02-06 CN CN2011103037911A patent/CN102433328A/zh active Pending
Cited By (1)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| CN109251931A (zh) * | 2018-09-18 | 2019-01-22 | 中国水产科学研究院淡水渔业研究中心 | 青虾Rev3基因及其编码蛋白和应用 |
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