CN102421462B - 基于蛋白的人工视网膜 - Google Patents

基于蛋白的人工视网膜 Download PDF

Info

Publication number
CN102421462B
CN102421462B CN201080019805.0A CN201080019805A CN102421462B CN 102421462 B CN102421462 B CN 102421462B CN 201080019805 A CN201080019805 A CN 201080019805A CN 102421462 B CN102421462 B CN 102421462B
Authority
CN
China
Prior art keywords
mutant
bacterial
rgodopsin
layer
bacteriorhodopsin
Prior art date
Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
Active
Application number
CN201080019805.0A
Other languages
English (en)
Other versions
CN102421462A (zh
Inventor
R·R·伯格
M·诺伦伯格
M·拉纳罕
D·J·桑伯格
N·沃纳
Current Assignee (The listed assignees may be inaccurate. Google has not performed a legal analysis and makes no representation or warranty as to the accuracy of the list.)
University of Connecticut
Original Assignee
University of Connecticut
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by University of Connecticut filed Critical University of Connecticut
Publication of CN102421462A publication Critical patent/CN102421462A/zh
Application granted granted Critical
Publication of CN102421462B publication Critical patent/CN102421462B/zh
Active legal-status Critical Current
Anticipated expiration legal-status Critical

Links

Classifications

    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61L—METHODS OR APPARATUS FOR STERILISING MATERIALS OR OBJECTS IN GENERAL; DISINFECTION, STERILISATION OR DEODORISATION OF AIR; CHEMICAL ASPECTS OF BANDAGES, DRESSINGS, ABSORBENT PADS OR SURGICAL ARTICLES; MATERIALS FOR BANDAGES, DRESSINGS, ABSORBENT PADS OR SURGICAL ARTICLES
    • A61L27/00—Materials for grafts or prostheses or for coating grafts or prostheses
    • A61L27/14—Macromolecular materials
    • A61L27/22—Polypeptides or derivatives thereof, e.g. degradation products
    • A61L27/227—Other specific proteins or polypeptides not covered by A61L27/222, A61L27/225 or A61L27/24
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61L—METHODS OR APPARATUS FOR STERILISING MATERIALS OR OBJECTS IN GENERAL; DISINFECTION, STERILISATION OR DEODORISATION OF AIR; CHEMICAL ASPECTS OF BANDAGES, DRESSINGS, ABSORBENT PADS OR SURGICAL ARTICLES; MATERIALS FOR BANDAGES, DRESSINGS, ABSORBENT PADS OR SURGICAL ARTICLES
    • A61L27/00—Materials for grafts or prostheses or for coating grafts or prostheses
    • A61L27/28—Materials for coating prostheses
    • A61L27/34—Macromolecular materials
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61L—METHODS OR APPARATUS FOR STERILISING MATERIALS OR OBJECTS IN GENERAL; DISINFECTION, STERILISATION OR DEODORISATION OF AIR; CHEMICAL ASPECTS OF BANDAGES, DRESSINGS, ABSORBENT PADS OR SURGICAL ARTICLES; MATERIALS FOR BANDAGES, DRESSINGS, ABSORBENT PADS OR SURGICAL ARTICLES
    • A61L27/00—Materials for grafts or prostheses or for coating grafts or prostheses
    • A61L27/50—Materials characterised by their function or physical properties, e.g. injectable or lubricating compositions, shape-memory materials, surface modified materials
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P27/00—Drugs for disorders of the senses
    • A61P27/02—Ophthalmic agents
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61L—METHODS OR APPARATUS FOR STERILISING MATERIALS OR OBJECTS IN GENERAL; DISINFECTION, STERILISATION OR DEODORISATION OF AIR; CHEMICAL ASPECTS OF BANDAGES, DRESSINGS, ABSORBENT PADS OR SURGICAL ARTICLES; MATERIALS FOR BANDAGES, DRESSINGS, ABSORBENT PADS OR SURGICAL ARTICLES
    • A61L2430/00—Materials or treatment for tissue regeneration
    • A61L2430/16—Materials or treatment for tissue regeneration for reconstruction of eye parts, e.g. intraocular lens, cornea

Landscapes

  • Health & Medical Sciences (AREA)
  • Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
  • Veterinary Medicine (AREA)
  • Public Health (AREA)
  • Chemical & Material Sciences (AREA)
  • General Health & Medical Sciences (AREA)
  • Animal Behavior & Ethology (AREA)
  • Medicinal Chemistry (AREA)
  • Transplantation (AREA)
  • Dermatology (AREA)
  • Epidemiology (AREA)
  • Oral & Maxillofacial Surgery (AREA)
  • Engineering & Computer Science (AREA)
  • Chemical Kinetics & Catalysis (AREA)
  • Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
  • Organic Chemistry (AREA)
  • General Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Nuclear Medicine, Radiotherapy & Molecular Imaging (AREA)
  • Ophthalmology & Optometry (AREA)
  • Pharmacology & Pharmacy (AREA)
  • Prostheses (AREA)
  • Materials For Medical Uses (AREA)
  • Peptides Or Proteins (AREA)
  • Medicines That Contain Protein Lipid Enzymes And Other Medicines (AREA)

Abstract

提供了多层蛋白膜，其包含天然细菌紫膜质和/或特化的细菌紫膜质突变体作为光活性元件。还提供了携带所述细菌紫膜质膜的人工视网膜下和视网膜外植入物，以及制备和使用其的方法，例如，用于治疗视网膜疾病和病况。

Description

基于蛋白的人工视网膜
关于联邦支持研究的声明
引起本申请的研究部分地得到美国政府在国立卫生研究院(NIH)基金号GM-34548、国家自然科学基金会(NSF)基金号CCF-0432151、和国防部高级研究计划署(DARPA)基金号HR0011-05-1-0027下的支持。因此，美国政府可以享有本申请中的某些权益。
技术领域
本申请涉及人工视网膜植入物，其携带包含天然细菌紫膜质(bacteriorhodopsin)蛋白、一种或多种特化的细菌紫膜质突变体、或其组合的蛋白膜作为光活性元件；还涉及制备和使用所述人工视网膜植入物的方法，例如，用于治疗视网膜疾病。
背景技术
视网膜是多层的组织，其排列于眼睛后面的凹(内)表面。视网膜内的光感受器细胞被进入眼睛的光激活，并将光信号转化为电化学信号，所述电化学信号被传达至视网膜神经元。视网膜神经元继而通过视觉神经将信号传递至脑的视觉中枢，从而允许脑感知视觉图像。光感受器细胞广泛被分类为视杆细胞和视锥细胞(根据其形状命名)。视锥细胞含有颜色视觉所需的光色素，视杆细胞含有对光高度敏感的光色素：视紫质，因此允许在暗光条件下(例如黑夜)的视觉。视杆细胞的敏感性足以使其被光的单一光子激活，而视锥细胞的激活则需要数十至数百个光子。
视紫质是视杆细胞的感光色素，当被光的光子激活时，其发生构象变化。视紫质由被称作视蛋白的7次跨膜蛋白组成，所述视蛋白共价结合于被称作视黄醛的辅基，视黄醛是维生素A的衍生物。未激活的视黄醛以11-顺式形式存在，而光的刺激诱导构象变化为全反式形式。视黄醛的构象变化诱导共价结合的视蛋白多肽的相应的构象变化，从而激发光感受器细胞内的第二信使级联，其引起信号向适当的视网膜神经元的传播。这些信号沿着视觉神经传播至脑的视觉中枢，从而允许脑处理视觉输入并感知视觉图像。
破坏视网膜的光感受器细胞的多种疾病和病况引起部分或全部的视力丧失。视网膜的两种主要疾病是年龄相关性黄斑变性(AMD)和色素性视网膜炎(RP)。作为老年人中引起视力丧失和失明的主要诱因，AMD引起位于视网膜中心的黄斑区内的视杆和视锥光感受器细胞的恶化。此外，AMD影响视觉中枢，因此引起阅读、驾驶、和其它需要高对比度视觉的任务的困难。
后一种疾病RP是遗传性病况，其中视杆光感受器细胞退化，从而引起视力丧失和失明。视杆细胞的丧失破坏在暗光中看物体的能力，并逐渐降低外周视力，直至患者患上管状视，最终失明。
到目前为止，已经研究了多种人工视网膜原型以用于治疗此类视网膜疾病和病况，但是每种都具有明显缺点。比较有前景的一种设计，即来自Optobionics的视网膜下植入物，利用了硅二极管材料，以经光激活而产生电刺激。然而，硅二极管光感受器只有在使用强光作为刺激时才产生足够的电流，并且在最亮的环境下仅提供暗淡的景象。替代性的设计是由南加州大学的研究人员设计的视网膜外植入物，其利用了安置于一对镜片上的外部相机，通过连接线与微电极阵列相连。电极阵列直接向神经节细胞提供电刺激。在临床试验中，受试者能够在阵列的所有16个电极上感知到光、检测运动、并识别简单的形状。该设计具有以下明显缺点：其需要外部的硬件，例如镜片和通过手术植入的外部装置。
需要这样的改进的和手术侵入性较低的视网膜植入物：其能够使由于视网膜疾病或损伤而损失光感受器细胞所造成的丧失视力的患者至少部分地恢复视力。
发明内容
非常需要这样的改进的视网膜植入物：其能够改善由于视网膜疾病或损伤而损失光感受器细胞所造成的视力受损患者的视力。本文提供了此类视网膜植入物。所描述的植入物替代受损的光感受器细胞，因此可用于治疗任何尚未破坏两极或神经节网络的视网膜疾病或病况。
在一个方面，提供了细菌紫膜质膜，其包括细菌紫膜质蛋白的多个单层，其中细菌紫膜质蛋白的每个单层与阳离子聚合物的层交替，并且其中所述细菌紫膜质蛋白选自天然(野生型)细菌紫膜质蛋白、氯泵突变体、偶极突变体、光周期突变体、金结合性突变体、离子泵突变体、及其组合。
公开了另外的细菌紫膜质膜，其包括第一细菌紫膜质突变体的第一主层和天然细菌紫膜质蛋白、第二细菌紫膜质突变体、或其组合的第二主层。在一些实施方式中，所述第一细菌紫膜质突变体是金结合性突变体，并且所述第一主层包括金结合性突变体的大约2至大约5个单层，其中金结合性突变体的每个单层邻近阳离子聚合物的层，从而第一主层包括金结合性突变体与阳离子聚合物的交替的单层。在一些实施方式中，第二主层包括天然细菌紫膜质蛋白或选自氯泵突变体、偶极突变体、光周期突变体、离子泵突变体、及其组合的第二细菌紫膜质突变体，并且所述第二主层包含天然细菌紫膜质蛋白、第二细菌紫膜质突变体、或其组合的大约200至大约400个单层，其中天然细菌紫膜质蛋白、第二细菌紫膜质突变体、或其组合的每个单层邻近阳离子聚合物的层，从而第二主层包括天然细菌紫膜质蛋白、第二细菌紫膜质突变体、或其组合与阳离子聚合物的交替的单层。
在第二方面，提供了用于产生细菌紫膜质膜的方法。所述方法包括步骤：a)修饰基底以在所述基底上产生表面负电荷；b)将阳离子聚合物的层沉积于经修饰的基底上；c)将细菌紫膜质蛋白的单层沉积于阳离子聚合物的层上，其中所述细菌紫膜质蛋白是天然细菌紫膜质或选自氯泵突变体、偶极突变体、光周期突变体、离子泵突变体、及其组合的细菌紫膜质突变体；d)将阳离子聚合物的层沉积于细菌紫膜质蛋白的单层上；e)按照步骤(c)和(d)沉积细菌紫膜质蛋白与阳离子聚合物的额外的交替的层，直至沉积了细菌紫膜质蛋白的大约200至大约400个单层；从而产生细菌紫膜质膜。
在另一个实施方式中，用于产生细菌紫膜质膜的方法包括步骤：a)将金层沉积于基底层上；b)将第一细菌紫膜质突变体的单层沉积于金上，其中所述第一细菌紫膜质突变体是金结合性突变体；c)将阳离子聚合物的层沉积于细菌紫膜质的金结合性突变体的单层上；d)按照步骤(b)和(c)沉积细菌紫膜质的金结合性突变体与阳离子聚合物的额外的交替的层，直至沉积了细菌紫膜质蛋白的金结合性突变体的大约2至大约5个单层，以形成细菌紫膜质的金结合性突变体的主层；e)在细菌紫膜质的金结合性突变体的最后一个沉积层上沉积阳离子聚合物的层；f)在阳离子聚合物的层上沉积天然细菌紫膜质蛋白、第二细菌紫膜质突变体、或其组合的单层，其中所述第二细菌紫膜质突变体选自氯泵突变体、偶极突变体、光周期突变体、离子泵突变体、及其组合；g)按照步骤(e)和(f)，沉积天然细菌紫膜质蛋白、第二细菌紫膜质突变体、或其组合与阳离子聚合物的额外的交替的层，直至沉积了天然细菌紫膜质蛋白、第二细菌紫膜质突变体、或其组合的大约200至大约400个单层，以形成天然细菌紫膜质蛋白、第二细菌紫膜质突变体、或其组合的主层；从而产生细菌紫膜质膜。在一些实施方式中，所公开的方法中的基底可以选自聚对苯二甲酸乙二醇酯、甲基丙烯酸2-羟乙酯(HEMA)、甲基丙烯酸2-苯基乙酯(PEM)、聚乙二醇(PEG)、甲基丙烯酸甲酯(MMA)、聚二甲基硅氧烷(PDMS)大分子、聚乙烯醇(PVA)水凝胶。在其它实施方式中，所述基底是铂或钛针。在一些实施方式中，阳离子聚合物是聚(二烯丙基二甲基氯化铵)。
在第三方面，提供了通过所公开的方法中的任一项产生的细菌紫膜质膜。
在第四方面，提供了视网膜下和视网膜外植入物，其包括本文公开的任一种细菌紫膜质膜。在一些实施方式中，视网膜下或视网膜外植入物是柔软的。视网膜下或视网膜外植入物可以进一步包括沉积于细菌紫膜质膜的最外层上的第二基底层，其中所述第二基底层是离子通透性的。在一些实施方式中，所述第二基底层包括选自下列的基底：聚对苯二甲酸乙二醇酯、甲基丙烯酸2-羟乙酯(HEMA)、甲基丙烯酸2-苯基乙酯(PEM)、聚乙二醇(PEG)、甲基丙烯酸甲酯(MMA)、聚二甲基硅氧烷(PDMS)大分子、聚乙烯醇(PVA)水凝胶。在一些其它实施方式中，视网膜下或视网膜外植入物是刚性的。本文中描述了刚性视网膜植入物，其包括多个像素，其中每个像素包括与铂针可操作地连接的细菌紫膜质膜，并且其中多个铂针构造为：当植入患者的眼睛时，与患者的视网膜的神经节细胞层或两极细胞层相接合。在刚性视网膜植入物的一个实施方式中，细菌紫膜质膜沉积于金层上，所述金层沉积于铂或钛针的顶部。在刚性视网膜植入物的另一个实施方式中，细菌紫膜质膜沉积于金层上，所述金层沉积于垫上，其中每个像素包括与铂或钛针之一接触的金覆盖的垫。刚性视网膜下或视网膜外植入物还可以包括沉积于细菌紫膜质膜的最外层上的第二基底层，其中所述第二基底层是生物惰性材料。
在第五方面，提供了柔性视网膜植入物，其包括内基底层、粘合剂层、细菌紫膜质蛋白层的取向膜、和外基底层。
在第六方面，提供了细菌紫膜质突变体，其包括一种或多种本文描述的氨基酸置换，所述突变体是氯泵突变体、偶极突变体、光周期突变体、离子泵突变体、金结合性突变体、或其组合。
在第七方面，提供了通过向患者的眼睛内植入本文公开的任一种视网膜植入物而治疗具有由于视网膜光感受器细胞的损失而引起的视力丧失的患者的方法，从而治疗具有由于视网膜光感受器细胞的损失而引起的视力丧失的患者。在一些实施方式中，视网膜植入物通过将光转化为眼睛中的质子或氯离子梯度而刺激患者眼睛的两极细胞。
附图说明
图1A是显示天然视网膜内的细胞层的示意图。图1B是柔性的基于蛋白的人工视网膜植入物(“柔性视网膜植入物”)的一个实施方式的示意图，其显示了当该植入物用于视网膜下植入时，相对于患者的天然细胞层，在何处植入人工视网膜。柔性植入物也可用于视网膜外植入。在一些实施方式中，所述植入物使用天然细菌紫膜质或经遗传修饰的细菌紫膜质以将质子泵向两极细胞，并通过氢离子浓度的局部变化产生神经脉冲。在其它实施方式中，植入物使用经遗传修饰的细菌紫膜质，其将氯离子泵入两极区。NFL表示神经纤维层，RPE表示视网膜色素上皮。
图2是所公开的柔性的基于蛋白的人工视网膜的两个不同实施方式的示意图，其显示了内基底层、粘合剂层、细菌紫膜质层的取向蛋白膜、和外基底层的一般结构。两个实施方式都显示以DACRON作为内基底层，以离子通透性膜作为外基底层。Hi Q突变体是这样的突变体：其具有较高的光化学地进入无活性Q态的效率。Hi偶极突变体是这样的突变体：其在静止状态具有较大的偶极矩、并形成增强光化学地产生的离子梯度的致密包装的膜。LBL表示细菌紫膜质蛋白的层-层膜。图板A显示了这样的实施方式：其中包括金作为细菌紫膜质层的粘合剂；图板B显示了以聚(二烯丙基二甲基氯化铵)(PDAC)作为细菌紫膜质蛋白的粘合剂。图板C和D是用于测试目的的类似的人工视网膜的示意图。这些结构具有以氧化铟锡包被的玻片替代的外基底层，从而可以使用静电计测定离子转运。
图3显示了用于视网膜外植入的刚性人工视网膜(“刚性视网膜外植入物”)的两个实施方式的示意图。图板A和B的示意图显示了刚性视网膜外植入物的一个实施方式中的铂针和细菌紫膜质蛋白层的构型。该实施方式具有导电的塑料接地板，其包括四个孔用于将植入物通过手术方式附着至患者的眼睛。虽然该图中指明使用的是细菌紫膜质突变体蛋白，但是在该视网膜外植入物中也可使用天然细菌紫膜质。图板C的示意图显示了刚性视网膜外植入物的备选实施方式，其包括手术柄。图板D是刚性视网膜外植入物的一个实施方式的示意图，其显示了相对于患者的天然细胞层在何处植入人工视网膜。该植入物中显示了优化的探针长度以相接(intercept)紧接位于天然视网膜的神经纤维层下面的神经节细胞。
图4显示了用于视网膜下植入的刚性人工视网膜(“刚性视网膜下植入物”)的两个实施方式的示意图。图板A和B分别是刚性视网膜下植入物的一个实施方式的侧视和顶视的示意图。图板C的示意图显示了刚性视网膜下植入物的备选实施方式，其包括手术柄。图板D是插入至天然视网膜的视网膜色素上皮与光感受器细胞之间的刚性视网膜下植入物的一个实施方式的示意图。
图5显示了细菌紫膜质的示意图。图板A的示意图显示了细菌紫膜质的三维结构，其包括主要残基、螺旋区段、和相对于电泳方向的蛋白的质子泵向。图板B显示了细菌紫膜质的氨基酸序列(SEQ ID NO：1)和二级结构。
图6的示意图显示了细菌紫膜质的光周期。
图7的图显示了通过半随机诱变在着色区段中产生的大约800个细菌紫膜质突变体的光周期完成时间。多数短光周期突变体具有图5B所示的B-C环区中的突变。
图8的示意图显示了盐细菌紫膜质(halorhodopsin)和细菌紫膜质氯泵突变体的三维结构的一部分。图板A显示了在盐细菌紫膜质中在何处发生氯离子的最初摄取。图板B显示了在细菌紫膜质氯突变体中导入了突变的区域，所述突变允许细菌紫膜质担当氯泵。具体地，该突变体的85位处的天冬氨酸残基被置换为苏氨酸残基。此外，为了效率考虑，可以使用定点诱变将细胞外环区内的较大残基替换为较小的残基。
图9的图显示了刚性视网膜植入物的人工视网膜像素的差别响应性。
图10的示意图显示了在柔性人工视网膜植入物的一个实施方式中，细菌紫膜质与阳离子聚合物的层的排列(圆圈内的一行加号表示带正电的阳离子聚合物的层)。在该实施方式中，DACRON微纤维用作离子斑片(ionpatch)的内基底，金为粘合剂。层的这种排列也可用于刚性人工视网膜植入物，其中基底可以是铂或钛针。
图11的示意图显示了可用于在构建人工视网膜植入物的过程中产生细菌紫膜质的精确层的自动化浸蘸装置。
图12的图显示了人工视网膜植入物的吸收谱随着使用自动化浸蘸装置沉积的细菌紫膜质层数而变。横坐标是以纳米测定的波长，纵坐标是光密度或吸收度(OD)/1.25。
具体实施方式
本文描述了蛋白膜，柔性和刚性人工视网膜植入物，制备该植入物的方法，以及使用该植入物治疗引起由于视网膜光感受器细胞的退化而导致的视力丧失的视网膜疾病和病况的方法。柔性植入物含有蛋白膜，其吸收环境中的光并产生离子梯度以激活视网膜神经机构。刚性植入物含有相同的蛋白膜，但是在刚性植入物中，蛋白膜吸收环境中的光并产生光电信号以刺激神经机构。蛋白膜含有光合成的色素细菌紫膜质，一种发现于嗜盐古生菌中的紫色的膜中的光驱动的质子泵跨膜蛋白；或其特定的遗传工程化的突变体。当人工视网膜被植入眼睛中时，细菌紫膜质膜将进入眼睛的光转化为光电信号，该信号模拟光感受器的超极化。两极细胞提供视网膜光感受器细胞与视觉神经之间的界面，其将刺激携带至脑的视觉中枢，其处理视觉刺激。
为了辅助理解天然视网膜的结构和功能，在图1A中显示了天然视网膜的层的简化示意图。光的光子进入眼睛并分别通过神经纤维层(NFL；图的顶端)、神经节细胞、和两极细胞，然后被光感受器细胞(即视杆细胞和视锥细胞)吸收。任何未被光感受器截获的光被吸收至视网膜色素上皮(RPE)中，视网膜色素上皮附着至眼睛后面的脉络膜(脉管)层。
本文描述了两组主要的用于视网膜下或视网膜外植入的人工视网膜。第一个主要的组包括柔性植入物，其通过诱导局部介质中的离子梯度而刺激两极细胞。柔性植入物的一个实施方式利用天然细菌紫膜质蛋白或其经遗传工程化的突变体的层来产生质子梯度以激活两极细胞。柔性植入物的第二个实施方式使用细菌紫膜质蛋白的不同的遗传工程化突变体，其响应于光吸收而泵运氯离子。本文描述的柔性植入物设计为刺激两极细胞，所述两极细胞提供天然视网膜的光感受器与神经纤维之间的界面，如图1A所示。以下将更详细地描述柔性人工视网膜的两个实施方式及其组分。
所公开的柔性人工视网膜植入物一般包括内基底层、粘合剂层、蛋白层的取向膜、和外基底层(图1B)。在一些方面，内基底层包含合成的聚对苯二甲酸乙二醇酯(DACRON)微纤维。在本发明的一些方面，粘合剂层可以包含金或阳离子聚合物，例如聚(二烯丙基-二甲基氯化铵)(“PDAC”)。蛋白层的取向膜可以包含与阳离子聚合物的层交替的多层的天然细菌紫膜质和/或一种或多种突变体细菌紫膜质蛋白。在一些方面，外基底层包含稀松的编织物DACRON微纤维的离子通透性层或其它离子通透性膜。
第二个主要的植入物的组包括用于植入到视网膜上或视网膜下的刚性人工视网膜(分别是视网膜外和视网膜下植入物)。本文描述的刚性人工视网膜植入物一般包含带有铂针的基底。在视网膜外植入物中，每个针的顶部(即面向环境光的针尖端)被金包被。在刚性视网膜下植入物中，铂针的底部与金覆盖的垫相连。在两种刚性植入物中，金携带含有多层细菌紫膜质的蛋白膜。第一套层含有细菌紫膜质突变体，所述突变体经过遗传工程化以结合金。这些细菌紫膜质的金结合性突变体以取向方式共价连接至像素针上的金表面。第二套层是基于天然细菌紫膜质或就高偶极矩和有效Q-态形成而优化的细菌紫膜质突变体(高-Q细菌紫膜质)。Q-态代表蛋白的关闭状态。如果像素上的所有蛋白都转化为Q态，则像素不再对光应答(像素关闭)。如果50％的蛋白转化为Q态，则像素产生大小为标准像素一半的信号(像素下调)。以下描述了通过调节单个像素对光的响应而在植入患者的眼睛后校正刚性人工视网膜。刚性视网膜下或视网膜外植入物还可以包括沉积于细菌紫膜质膜的最外层上的第二基底层，其中所述第二基底层是生物惰性材料。
定义
除非明确且不含糊地限于指称一个，否则如本说明书中使用的单数形式“一个(a)”、“一个(an)”、和“该(the)”包括复数形式。
如本文使用的术语“膜(film)”是指多个单独的蛋白层。在一些实施方式中，膜包括阳离子聚合物与单独蛋白层的交替层。
如本文使用的术语“野生型细菌紫膜质”和“天然细菌紫膜质”二者均指天然存在的细菌紫膜质的形式。野生型或天然细菌紫膜质的一个实例是来自宿主生物嗜盐古生菌(Halobacterium salinarum)的细菌紫膜质。该生物还有数个别名，其中最常见的是盐生盐杆菌(Halobacteriumhalobium)和Halobacterium salanarium。
此外，如本文使用的术语“突变体细菌紫膜质”、“细菌紫膜质突变体”、“遗传工程化的细菌紫膜质”、“突变的细菌紫膜质”等是指这样的细菌紫膜质蛋白：其中野生型细菌紫膜质蛋白的至少一个氨基酸已被替换为未见于野生型细菌紫膜质内该氨基酸位置上的不同氨基酸。
如本文使用的术语“金结合性细菌紫膜质”、“金结合性突变体”等是指这样的细菌紫膜质分子：其经过遗传工程化(即一个或多个野生型氨基酸残基已被替换为半胱氨酸残基)，以使其相对于野生型细菌紫膜质分子更强烈地结合金。
如本文使用的术语“增强的偶极突变体细菌紫膜质”、“偶极突变体细菌紫膜质”、“偶极突变体”等是指这样的细菌紫膜质分子：其经过遗传工程化(即一个或多个野生型氨基酸残基已被替换为不同的残基)，以改变蛋白的总体电荷性，增加蛋白的内在偶极矩，从而突变体蛋白在薄膜内提供比野生型细菌紫膜质更大的光化学应答。
如本文使用的术语“快速光周期突变体细菌紫膜质”、“光周期突变体细菌紫膜质”、“快速光周期突变体”、“光周期突变体”等是指这样的细菌紫膜质分子：其经过遗传工程化(即一个或多个野生型氨基酸残基已被替换为不同的残基)，从而突变体蛋白相对于野生型细菌紫膜质更迅速地泵运离子。
如本文使用的术语“氯泵突变体细菌紫膜质”、“氯突变体”等是指这样的细菌紫膜质分子：其经过遗传工程化(即一个或多个野生型氨基酸残基已被替换为不同的残基)，从而突变体蛋白响应于光吸收而泵运氯离子而非质子。
如本文使用的术语“离子泵突变体细菌紫膜质”、“离子泵突变体”等是指这样的细菌紫膜质分子：其经过遗传工程化(即一个或多个野生型氨基酸残基已被替换为不同的残基)，从而突变体蛋白相对于野生型细菌紫膜质更迅速地泵运离子。
如本文使用的术语“主层”是指细菌紫膜质膜内的含有两层或更多层单一类型的细菌紫膜质蛋白的层。例如，在一些实施方式中，本发明的细菌紫膜质膜可以含有细菌紫膜质金结合性突变体的主层(包含金结合性突变体的2至5个单层)和天然细菌紫膜质、细菌紫膜质偶极突变体、光周期突变体、氯泵突变体、离子泵突变体、或其组合的主层(包含天然或突变体蛋白的大约200-400个单层)。在其它实施方式中，细菌紫膜质膜可以仅包含天然细菌紫膜质、细菌紫膜质偶极突变体、光周期突变体、氯泵突变体、离子泵突变体、或其组合(包含天然蛋白或突变体的大约200-400个单层)。
在本文中关于柔性视网膜植入物所使用的术语“内基底层”和“外基底层”是指用于所公开的视网膜植入物中的生物兼容性材料的层。在一些实施方式中，基底层是柔性的织物或编织物基底。在本文中关于刚性视网膜植入物所使用的术语“基底”是指铂或钛针或其它适合铺层细菌紫膜质膜的刚性结构。
如本文使用的术语“粘合剂”是指允许细菌紫膜质蛋白或突变体结合视网膜植入物的基底层的分子或物质。
除非另有指明，否则如本文使用的术语“视网膜植入物”用于指用于视网膜外和视网膜下植入的植入物。
如本文使用的术语“视网膜斑片”、“视网膜离子斑片”、“柔性视网膜植入物”等可以相互替换地用于指如本文公开的柔性的人工的基于蛋白的视网膜植入物。
如本文使用的术语，人工视网膜植入物的“像素”是指携带金膜的铂或钛针或其它适宜的刚性结构，在所述金膜上沉积了细菌紫膜质膜，所述细菌紫膜质膜含有金结合性细菌紫膜质的主层和天然或Q-突变体细菌紫膜质的主层。备选地，“像素”可以是与金覆盖的垫物理结合的铂或钛针或其它适宜的刚性结构，在所述垫上沉积了金结合性细菌紫膜质的主层和天然或Q突变体细菌紫膜质的主层。
如本文使用的术语“手术柄”是指这样的孔、环、圈、托架、或其它装置：本文描述的人工视网膜植入物可以通过它们而通过手术方式固定于(即植入)眼睛内。
离子梯度诱导型柔性的基于蛋白的人工视网膜
本文中描述了一种柔性的基于蛋白的人工视网膜植入物，其基于使用蛋白细菌紫膜质将光转化为离子梯度，所述离子梯度通过诱导局部介质中的离子梯度而激活视网膜两极细胞。细菌紫膜质(BR)是分离自盐沼地古生物嗜盐古生菌的光驱动的质子泵。分离自该生物的紫膜(purplemembrane)的光转导蛋白具有等同于视紫质(rhodopsin)的量子效率，视紫质是眼睛的杆状外部节段中的天然蛋白。然而，细菌紫膜质具有比视紫质高三个数量级的热稳定性和光化学稳定性。天然细菌紫膜质蛋白响应于光吸收而泵运质子，在视网膜斑片的一个实施方式中，质子梯度用于激活两极细胞。可以按照下文的进一步讨论来产生具有增加的内在偶极矩、更迅速地泵运离子、具有金结合特性、或具有这些性质的组合的该蛋白的突变体形式。此外，该蛋白还可以通过蛋白的遗传工程化被转化为氯离子泵。在柔性视网膜植入物中使用一种或多种这些野生型和/或遗传工程化的细菌紫膜质蛋白将在患者中产生视觉信号。
所公开的柔性视网膜植入物将不需要外部照相机设备，或者无需外部供电。此外，无需电线来连接外部硬件以刺激眼睛内的电极，因为所公开的视网膜植入物不含电极。相对于目前可获得的视网膜植入物，所公开的柔性视网膜植入物的引入具有更小的手术侵入性，并且降低了感染的机会。所提出的植入物的设计的另一项独特能力是，细菌紫膜质能够形成被称作Q态的无活性状态，如下文进一步讨论，这允许像素调节：植入物中多余的像素可以被调低或关闭。该特征具有显著优点，因为其提供了用于优化植入物与神经细胞的偶联的非侵入性方法。例如，患者将描述感知视野中的“热点”，这些将通过选择性过激活两极细胞的像素来表征。该位置是使用观察眼睛后面的显微镜布置鉴定的，并且能够以近衍射受限的性能聚焦在植入物上。该光学设计允许显微镜使用弱激光单个地激活像素，并使用两个红色激光脉冲(具有适合于将该区域内的细菌紫膜质转化为Q态的时间谱)的序列选择性脉动像素。完全转化是可能的，但是选择性转化将使像素暗淡。通过这种方式，可以调节单独像素的过量应答，如果必要的话，将其完全关闭。
所公开的柔性视网膜植入物相对于目前的主导技术具有很多另外的明显优点。它们是柔性的，并且是薄的，可以插入到视网膜下的空间并适应任何形状或大小的眼睛。可以通过使用如上所述的低功率红色激光关闭或调低单独的像素。如下文进一步讨论，有两种不同的离子激活机制可用于增强柔软性并操作多种患者状况。视网膜植入物的内和外表面上使用的材料(例如DACRON内层和DACRON离子通透性外层)提供了体内的长期稳定性，而不会激活患者内的免疫应答。在一些实施方式中，视网膜下植入物使用DACRON作为基础织物，其为生物惰性的、柔性的，并且能够被化学修饰以稳定化细菌紫膜质突变体的层。基于微纤维的织物还提供离子转运并保护细菌紫膜质蛋白。
所公开的柔性视网膜下植入物意在植入患者的视网膜的光感受器层与视网膜色素上皮(RPE)层之间(图1B)。图1B显示了植入到患者眼睛的天然细胞层中的本发明的柔性的基于蛋白的视网膜下植入物的一个实施方式的示意图。图2是所公开的柔性的基于蛋白的人工视网膜的两个不同实施方式的示意图，其显示了内基底层、粘合剂层、细菌紫膜质层的取向蛋白膜、和外基底层的一般结构。两个实施方式中都显示以DACRON作为内基底层，以离子通透性膜作为外基底层。图板A显示的实施方式包括溅射到已经被加热到高于玻璃转化温度的DACRON内基底层上的的金。该金层作为金结合性细菌紫膜质突变体的粘合剂。图板B显示了聚(二烯丙基二甲基氯化铵)(PDAC)作为细菌紫膜质蛋白的首层的粘合剂。在两个实施方式中，该首层之后均为额外的细菌紫膜质蛋白的层(例如，天然、偶极突变体、光周期突变体、氯泵突变体、离子泵突变体、或其组合)。图2的图板C和D是用于测试目的的类似的人工视网膜的示意图。这些结构具有被氧化铟锡包被的玻片替代的外基底层，从而可以使用静电计测定离子转运。所公开的柔性视网膜植入物也可针对视网膜外植入而设计。
所公开的柔性视网膜植入物的运作机理是简单的，虽然作用的生理学是非常复杂的。已知的是，改变两极或神经节细胞附近的pH或离子浓度能够激发神经脉冲。模拟表明：该过程的机理通常是由于天然信号载体的间接操作或与其竞争。所公开的视网膜植入物利用了该现象，使用天然或突变的基于蛋白的设计，以恢复患者的视力。在天然生物嗜盐古生菌中，细菌紫膜质(BR)担当光驱动的质子泵，其以0.65的量子效率运作，该效率等同于视觉色素视紫质的效率。嗜盐古生菌还在外膜中具有被称作盐细菌紫膜质的氯离子泵，其响应于光激发而泵运氯离子。基于质子泵和氯离子泵的视网膜植入物都是合意的，并且公开于本文中。然而，由于盐细菌紫膜质是相对脆性的，所以在视网膜植入物的一些实施方式中使用的是细菌紫膜质突变体，其将细菌紫膜质从质子泵转化为氯离子泵，以便实现植入物的长期稳定性。可获得的文献表明：质子梯度是更有效的，但是氯离子梯度对神经组织所造成的长期损害较低。
本文公开的柔性视网膜植入物相对于目前主导着现今的治疗方法的电刺激同类物而言，具有显著的改进。Luke S.K.Theogarajan博士的博士学位论文研究了基于离子的视网膜植入物的潜在可能，其中使用了复杂的计算机模拟(2007，Dept.of Electrical Engineering and Computer Science，MIT)。他通过模拟证明：质子(H+)、钾离子(K+)或氯离子(Cl-)梯度将激活视网膜神经构造并提出了一种基于细菌紫膜质的植入物。然而，他的模型植入物将不会工作，因为他仅使用了一层细菌紫膜质，不会产生足够的光捕获能力。Theogarajan不是第一个提出离子门化的人。长期以来，人们知道：改变两极或神经节细胞附近的pH或离子浓度能够激发神经脉冲(见，例如，Enz等人，1999，J.Neurosci.19：9841-47；Bringmann等人，1997，Glia 19：311-23；Verweij等人，1996，Vision Res.36：3943-53；Marc，1999，J.Compar.Neurol.407：65-76；Konnerth等人，1987，J.Physiol.386：603-33；和Ettaiche等人，2004，J.Neurosci.24：1005-12)。光敏感通道(channelrhodopsin)的研究提供了关于离子梯度植入物的可行性的另外的支持(见，例如，Bamann等人，2008，J.Mol.Biol.375：686-94；Berthold等人，2008，Plant Cell 20：1665-77；Douglass等人，2008，Current Biol.18：1133-37；Nagel等人，2002，Science 296：2395-98；Nagel等人，2003，PNAS 100：13940-45；和Petreanu等人，2007，NatureNeurosci.10：663-68)。
眼睛的两极细胞系统是非常复杂的，包括表征为给光中心的或撤光中心的两种类型的两极细胞(给光中心的两极细胞(on-bipolar cell)或撤光中心的两极细胞(off-bipolar cell))。两种类型均监视光感受器细胞并基于光感受器细胞是否被去极化(在黑暗中)或过极化(光照下)而选择性激活或抑制神经节活性。通过电脉冲激活撤光中心的两极细胞会抵消给光中心的两极细胞的附近激活，这一事实使得两极细胞的电刺激复杂化。本视网膜植入物相对于基于电刺激的植入物而言具有明显的优点，因为离子流通过模拟光感受器的过极化而自动区分。该特征避免了以上所述的激活错误细胞的问题，并且还使所需要的电流较低(即，较少的离子能够模拟电效应)。
视网膜外的刚性的基于蛋白的人工视网膜
本文描述的刚性视网膜外植入物植入到天然视网膜的顶部。刚性视网膜外植入物含有铂针以激活天然视网膜的神经节神经细胞，因为铂是高度导电性的，但对于身体是完全惰性的。当被植入时，刚性视网膜外植入物的铂针向下延伸通过患者的天然视网膜的神经纤维层进入神经节细胞。这些针的长度可以是大约0.2mm至大约1.5mm，并且由患者的视网膜疾病的性质以及通过该视网膜植入物提供神经节刺激还是两极刺激的决定来确定。每个铂针的顶端被下列物质包被(从下至上)：金层、金结合性细菌紫膜质分子的主层、和天然或突变体细菌紫膜质分子的主层。针的顶部固定于基板。具体地，每个针插入至它自己的孔，该孔比针的直径略大，并且完全穿过基板的厚度。基板由导电塑料的透明窗覆盖，以允许光穿过、到达细菌紫膜质层。刚性人工视网膜植入物内的携带其细菌紫膜质膜的单一的铂针在本文中被称作“像素”。可以使用不同数目的像素来制备本文描述的刚性人工视网膜植入物。使用较大数目的像素将允许人工视网膜植入物为患者提供更大水平的视觉分辨率。例如，可以按照大约400X300像素(大约为电视机的分辨率)、大约800X400像素(或更高)、或其中的任意值的阵列来制备人工视网膜植入物。
图3A是本发明的视网膜外植入物内的单一像素的示意图，其从铂针的顶部向上显示：大约10微米的金层，含有大约2至大约5个亚层的金结合性细菌紫膜质分子的金结合性细菌紫膜质的主层，以及含有大约200至大约400个亚层的天然或突变体细菌紫膜质分子的天然或突变体细菌紫膜质的主层。所述突变体细菌紫膜质可以是例如偶极突变体、光周期突变体、或其组合。可以使用Q突变体细菌紫膜质分子(其也具有增强的偶极矩)以产生细菌紫膜质膜和本文描述的刚性人工视网膜。虽然不希望被任何理论所限，但是具有增强的偶极矩的细菌紫膜质突变体能够通过允许细菌紫膜质分子的更一致的取向和/或细菌紫膜质分子在膜内的更致密的包装而增强细菌紫膜质膜和本文描述的刚性人工视网膜的效率。以下进一步描述了适宜的突变体。
图3B是单行像素的侧视图，其显示了非导电性的、非毒性的医学环氧化物外壳，其施用于基板的侧表面和下表面，以封闭并保护所有五个侧面上的细菌紫膜质层(除了植入物的顶上的侧面以外，顶上的侧面被导电塑料的透明窗覆盖)。适宜的环氧化物为可用于医学植入物的非毒性的、非导电性的、透明的环氧化物。可以使用很多环氧化物制剂，包括由EpoxyTechnology Corp制造的那些(例如，产品号301、320、和354，EpoxyTechnology，14 Fortune Drive，Billerica，MA 01821)。适宜的导电性塑料材料为生物惰性材料并且是本领域熟知的(关于适宜的材料，参见例如，美国专利号7,291,540，Xie等人，2002，Bioscience Rep 21，513-536；Xu等人，2005，Tissue Eng 11，1736-1748；Shi等人，2005，Eng Mat 6，485-490；Lloyd等人，2001，Biomaterials 22，769-785；Montezuma等人，2006，Invest Ophth Vis Sci47，3514-3522；Weiland等人，2005，Annu.Rev.Biomed.Eng.7，361-401；和Scholz，2007，J Bioact Compat Pol 22，539-568)。在一个实施方案中，透明塑料窗延伸出环氧化物密封，并且在植入物的两个相对面上各含有两个孔，总共有4个孔(例如，在植入物的大约每个角各一个)，以提供手术柄。手术柄可位于不使柄干扰光向像素的传播的任意位置。
图3C是本文描述的视网膜外植入物的透视图，其显示了使用环作为手术柄的备选设计。手术柄“环”无需是如图中所示的圆环，它们可以是允许外科医生安全地将刚性视网膜外植入物附着到患者的天然视网膜上的任意形状(例如，椭圆、锥体、三角形、矩形、正方形等)。手术柄可以由任何适合于手术植入的基底制成(例如钛)。图3C的刚性植入物的侧面显示为部分透明的，从而可以显示出下面的结构。光从顶部进入视网膜外植入物并且被透明的导电塑料(其将细菌紫膜质膜针对患者眼睛内的玻璃状液封闭)下面的细菌紫膜质层吸收。
图3D是植入到天然视网膜顶部的刚性视网膜外植入物的示意图。视网膜外植入物的铂针的长度被优化以相接紧接位于神经纤维层(NFL)下面的神经节细胞。显示了神经节细胞层下面的两极细胞层、光感受器细胞层、视网膜色素上皮(RPE)、和脉络膜(脉管)层。图3D中显示的视网膜外植入物的一个主要特征是铂针直接激活神经节细胞。该设计的优点在于植入物在光穿过眼睛的玻璃状液之后的光的直接光路上。
本文描述了刚性视网膜外植入物的两种基本形式。第一种是标准设计，其中铂针的长度仅延伸至相接天然视网膜内的神经节细胞。备选的设计应用较长的针的长度，其达到超出神经细胞层以相接、从而刺激两极细胞(即在天然视网膜中的神经细胞层下面的细胞层)。较长的针允许直接激活两极细胞，这允许更高的灵敏性和使用较小的像素，因此允许成像过程有更高的分辨率。这种备选的实施方案需要更深地透入视网膜组织，图3C中显示的备选的手术附着物(环形的附着物)提供了更安全的附着。
刚性的视网膜下的基于蛋白的人工视网膜
刚性视网膜下植入物植入到患者视网膜的光感受器层与视网膜色素上皮(RPE)层之间。图4包括本发明的基于蛋白的刚性视网膜下植入物的示意图。图4A是刚性视网膜下植入物的靠近的侧视图，从下至上显示了非导电性、非毒性塑料的基板；金覆盖的垫；细菌紫膜质膜；铂针，其中一个针与每个金覆盖的垫结合，针的一端布置为抵靠着垫；沉积于每个金覆盖的垫上的金结合性细菌紫膜质的主层、沉积于金结合性细菌紫膜质的主层上的天然或突变体细菌紫膜质的主层、透明的导电性塑料接地板，每个铂针经由稍大于针直径的孔而穿过该接地板；在金覆盖的垫的层与导电性透明窗之间。透明的、非毒性的、非导电性的环氧化物的层环绕每个铂针(即在针与穿过针的透明板上的孔之间，以封闭每个针)。
刚性视网膜下植入物的每个像素包含针、金覆盖的垫、和沉积于金覆盖的垫上的细菌紫膜质膜(含有金结合性细菌紫膜质的主层和天然或突变体细菌紫膜质的主层)。对于每个针使用单独的金覆盖的垫避免了像素之间的交叉干扰。进入眼睛的光的光子穿过透明的导电的塑料板并被细菌紫膜质蛋白膜吸收。由光子激活的细菌紫膜质产生的电流沿着铂针传导并通过针被转移至患者的天然视网膜的两极细胞。使用例如本文描述的逐层方法使细菌紫膜质取向，这提供了蛋白的层数的严格控制，从而提供了基于蛋白的像素的光密度的严格控制。
图4B的示意图显示了图4A中显示的刚性视网膜下植入物的金覆盖的垫和铂针的顶视图。图4C的示意图显示了刚性视网膜下植入物的侧视图，其显示了非导电性的、非毒性塑料的基板，铂针，和备选设计的手术柄(环柄)，如上文针对刚性视网膜外植入物所述。
图4D的示意图显示了插入到天然视网膜的视网膜色素上皮和光感受器细胞层之间的刚性视网膜下植入物的侧视图。铂针与两极细胞相接合并将信号传至两极细胞。在图4D中从上至下显示了神经纤维层、神经节细胞层、与铂针相接合的两极细胞层、光感受器细胞层(其中铂针穿过该层)、视网膜下植入物的基板和相关的结构、视网膜色素上皮、和脉络膜(脉管)层。
图4D中显示的植入物具有优化的探针长度以接合紧接位于天然视网膜中光感受器细胞上面的两极细胞。在该设计的一个实施方式中，探针被非导电性的生物惰性聚合物包被，但留出暴露的1微米的尖端(未包被)。包被物可以是聚异戊二烯，其为良好的绝缘体和生物惰性物。该过程为两步过程。在聚合之前，通过使尖端包埋于溶胶凝胶(solgel)中而保护尖端，然后允许发生聚合。然后使用气溶胶辅助化学气相沉积(AACVD)将聚异戊二烯导入植入物的未经保护的针和底部。然后通过小心地剥掉溶胶凝胶膜而使针的尖端暴露。该过程通过防止信号向周围组织的损失而增强了信号与神经细胞的偶联。只有当使用设计为相接两极细胞的较长的针时，该过程才是必要的。但是该过程总能增强信号偶联，并且是推荐的设计。
相对于视网膜外植入物，视网膜下植入物更难植入，因为植入需要外科医生将光感受器细胞层与视网膜色素上皮层分开，并将植入物插入到这两个层之间(见例如，Zrenner，E.(2002)The Subretinal Implant：CanMicrophotodiode Arrays Replace Degenerated Retinal Photoreceptors to RestoreVision？Ophthalmologica 216S1，8-20；Cohan，E.D.(2007)Prosthetic interfaceswith the visual system：biological issues.J.Neural Eng.4，R14-R31；和Zrenner，E.(2008)Will Retinal Implants Restore Vision？Science 295，1022-1025)。本发明的视网膜下植入物的植入可能破坏患者的天然视网膜的光感受器细胞。然而，该破坏的后果甚微，因为如果光感受器细胞功能正常的话，就不需要视网膜植入物了。有效的刚性视网膜下植入物替代光感受器或与其混合，铂针注入并刺激两极细胞。相对于刚性视网膜外植入物而言，刚性视网膜下植入物的优点在于，仅需要小的电流来刺激两极细胞。然而，光的光子必须首先穿过神经纤维层、神经节细胞、两极细胞、和任何其余的光感受器，然后光子才能激活刚性视网膜下植入物的蛋白膜。
基底层
在一些实施方式中，使用织物或修饰的合成DACRON微纤维(Goodfellow Cambridge Limited)的其它编织物组装柔性视网膜植入物的内基底层(或后表面)，DACRON是一种医用惰性(生物惰性)材料。DACRON是聚对苯二甲酸乙二醇酯的商品名，其是如下所示的聚合物分子：
该聚合物已经成功用于缝线和视网膜植入物。DACRON的优点是其提供用于直接在纤维表面上附着和取向蛋白的方便的方法。野生型和/或突变体细菌紫膜质蛋白可以通过直接与薄的金溅射层结合或者通过如下文所述的静电吸附法而附着至DACRON微纤维。
在一些实施方式中，外基底层是薄的稀松的编织的DACRON织物，其作为离子通透性膜，使用与用于将蛋白层附着至内基底层的较厚的DACRON基底织物相同的程序将所述外基底层附着至植入物的最外的蛋白层。
在一些实施方式中，内基底层是ES308704聚对苯二甲酸乙二醇酯(网孔标称孔径：21μm；单丝直径：41μm；线/cm：163；开幅：12％；类型：普通编织网)。在一些实施方式中，外基底层是离子通透性织物ES308710聚对苯二甲酸乙二醇酯(网孔标称孔径：100μm；单丝直径：70μm；线/cm：55；开幅：33％；类型：普通编织网)。
存在其它适合于内和/或外基底层的织物或其它编织物的合适的基底，其具有令人满意的生物兼容性，并且可以被化学修饰，从而可以使用所公开的逐层制造方法。合适的基底的实例包括、但不限于表1所示的基底。
表1
在刚性视网膜外或视网膜下植入物中，基底是合适的刚性结构，例如但不限于，由铂或钛制成的针。
基底层的制备
将细菌紫膜质附着至内基底层对于制备视网膜离子斑片是关键性的要求。有数种设计提供良好的粘附同时维持柔软性和离子运动。在一些实施方式中，使用DACRON微纤维。DACRON具有相对低的玻璃转变温度(GTT)：75℃，并且具有高熔融温度：260℃。这种组合允许金在高于GTT但远低于熔点的80℃溅射到样品的DACRON表面上。结果是金良好地粘合到表面上而不使织物变形或破坏其完整性。然后，金结合性细菌紫膜质突变体可以共价结合至金层，然后可以通过逐层(LBL)法添加后续的细菌紫膜质层(图2A)。
在备选的实施方式中，可以通过还原表面羰基官能团来修饰DACRON表面，以赋予表面负电荷(Phaneuf等人，1995，J.Applied Biomat.6：289-99)。在这些方法的一个实施方式中，在60℃在洗涤液(10g Na2CO3，10mLTWEEN 20，1L ddH[2]O)中洗涤织物30分钟。然后在60℃在ddH2O中洗涤纤维30分钟，然后在100℃以0.5％(w v-1)NaOH中温和水解30分钟。然后，在环境温度以ddH2O润洗纤维，然后其就绪可进行LBL添加(图2B)。该方法的优点是简单，以及通过织物的支持具有改进的离子转运。可能的小缺点是表面的反射率降低，但是使用致密编织的白色微纤维提供足够的反射率。
人工视网膜植入物的蛋白膜
天然细菌紫膜质
细菌紫膜质是存在于嗜盐细菌例如嗜盐古生菌的细胞膜中的跨膜蛋白，嗜盐古生菌是高盐环境下的天然古细菌。细菌紫膜质显示出独特的光物理特性，使蛋白能够用于光电子和生物光电子设备。当溶解氧浓度下降至低于足以进行呼吸氧化磷酸化的水平时，嗜盐古生菌表达细菌紫膜质以产生紫膜。紫膜包含细菌紫膜质三聚体的半结晶基质，其形成细菌紫膜质的四级结构，并允许生物有效地进行光合作用，作为限氧条件下的产能方式。紫膜显示出的大的表面积(通常超过总膜面积的50％)在细胞外和细胞内膜表面之间产生明显的pH梯度。因此，当进行蛋白的大分子操作时，在本文中使用“紫膜”；当进行单体结构的操作时，在本文中使用“细菌紫膜质”。
来自嗜盐古生菌的细菌紫膜质的野生型序列如下所示：
MLELLPTAVEGVSQAQITGRPEWIWLALGTALMGLGTLYFLVKGMGVSDPDAKKFYAITTLVPAIAFTMYLSMLLGYGLTMVPFGGEQNPIYWARYADWLFTTPLLLLDLALLVDADQGTILALVGADGIMIGTGLVGALTKVYSYRFVWWAISTAAMLYILYVLFFGFTSKAESMRPEVASTFKVLRNVTVVLWSAYPVVWLIGSEGAGIVPLNIETLLFMVLDVSAKVGFGLILLRSRAIFGEAEAPEPSAGDGAAATSD(SEQ ID NO：2).
细菌紫膜质的二级结构由取向于有机生色团周围的7个跨膜α螺旋组成(图5)。吸收光的生色团是全反式视黄醛(在图5A的中心，以浅灰色显示多烯碳原子)，其通过质子化的锡夫氏碱键合共价结合于螺旋VII中的Lys-216。在光激活的静止状态下(bR)，当光子被生色团吸收时，复杂的光化学周期被启动，持续大约15毫秒(图6)。该光周期将质子从细胞内转运到紫膜的细胞外一侧，产生上文所述的pH梯度，该梯度驱动ATP合酶以化学渗透地合成ATP。每次当光子被光化学稳定的视黄醛部分吸收时，都发生该过程。已经使用定点诱变来研究降低光周期的时间对于离子流量的影响。
光化学稳定性定量为：在37％(1/e)的照射的系综变性之前，光致变色材料在两种种类之间可被光转化的次数。该次数被称作周期值(cyclicity)，对于环境温度中的细菌紫膜质，其在106以上。鲜有有机的光致变色材料达到该数值，那些具有高周期值的材料通常具有低的光转化量子效率。细菌紫膜质的高周期值是由于完整的膜蛋白和半结晶的紫膜结构的保护性特征，其担当以下作用：从反应活性氧、单态氧、和游离基团物质分离生色团。这些光电子特性使细菌紫膜质成为应用于很多生物电子和生物光电子设备的良好候选物，所述设备包括：随机存取薄膜存储器，神经类型的逻辑门，光子计数器和光电转换器，可逆全息摄影介质，人工视网膜，皮秒光检测器，空间光线调节器，联想存储器，两光子容量存储器，模式识别系统，实时全息成像系统，和分支的光周期容量存储器。该应用的关键是该蛋白的良好的稳定性。自然界产生了细菌紫膜质，以在盐沼中经历的高温下发挥作用，并且在宽范围的pH和光流量下运行。因此，细菌紫膜质是作为用于人工视网膜的光活性成分的良好选择。
图5A和6显示的示意图分别代表质子泵运过程和细菌紫膜质的光周期。当细菌紫膜质吸收光时，该蛋白发生构象变化，该变化传递为光谱上不连续的光中间体状态，构成光周期。相对于天然细菌紫膜质的静止态，细菌紫膜质光周期中的M态的最大吸收值是显著偏蓝色的，而O态的最大吸收值是偏红色的。将O态暴露于红光导致产生分支的光周期。
野生型细菌紫膜质中的分支的光周期通过连续的双光子过程从O态作为分支关闭反应而发生(图6)。该交替途径表征为短期的P态和长期的Q态(在长达12年内是稳定的)(Gillespie等人，2002，J.Phys.Chem.B，106：133352-61)。细菌紫膜质的分支的光化学使得可以在植入之后通过使用红光的连续脉冲(以将蛋白的一部分转化为Q态)来调节人工视网膜的单独像素的强度。通过连续的双光子过程形成Q态使像素失活。波长小于450nm的蓝光使像素恢复至激活态。
紫膜斑片中细菌紫膜质的六角形排列为该蛋白提供了极高的热稳定性和光化学稳定性(虽然在高温下和恶劣化学环境中可能发生蛋白变性)。细菌紫膜质的高周期值(即，该分子可以被光激活的次数，高于108)和量子效率(0.65)远超过任何合成的非天然光致发光材料。量子效率代表吸收的光子产生光周期的概率。因此，每次该蛋白吸收光的光子，有65％的次数该过程产生完全的光周期(和产生的信号)。有趣的是，这几乎与视网膜蛋白“视紫质”的效率相同。细菌紫膜质的内在稳定性和灵敏性是本文描述的人工视网膜的优点。虽然不希望被任何估计所限，但据估计如本文描述的基于蛋白的人工视网膜可以在正常光条件下持续至少8年，虽然具有较短的寿命的人工视网膜也被认为是本发明的一部分。
应用细菌紫膜质作为光诱导的离子的来源要求该蛋白在整个多层体积上均匀地取向。细菌紫膜质薄膜的制造已有完善的记录，存在多种方法，既有优点也有缺点(见，例如Varo等人，1983，Biophys.J.43：47-51；Chen等人，1991，Appl.Opt.30：5188-96；He等人，1998，Langmuir 14：1674-79；和Koyama等人，1994，Science 265：762-65)。然而，很多这些方法导致用于视网膜植入应用的蛋白的取向不足。通过逐层(LBL)方式排列蛋白虽然费力，但是允许控制膜的厚度并产生最均匀取向的膜(He等人，1999，Adv.Mater.11：435-46)。以下描述了用于本发明的产生视网膜植入物的方法中的LBL装配的方法。
细菌紫膜质突变体
具有增强的偶极的细菌紫膜质突变体
术语“增强的偶极突变体”(或简称“偶极突变体”)是指涉及蛋白的总体电荷变化的任何突变置换，所述电荷变化增加细菌紫膜质的内在偶极矩。通过改善蛋白层的包装密度和取向，此类突变将在薄膜内提供更大的光化学应答。产生了总共8种单一的和6种多重的增强偶极突变体，其产生改进的效果。表2列出了3种最佳的单一突变体。
表2各种偶极突变体的光电效率
  λ(nm)   吸收值   信号(mV)   PV效率   校正的效率
  天然   570   1.2811   40   4.76   --
  E194K   560   2.0145   75   8.53   1.79
  E9Q   570   2.3145   100   11.13   2.34
  K159Q   565   1.3574   280   28.18   5.92
该表中列出的突变体描述为X-#-Y，其中X代表原始氨基酸(见图5B)，#代表氨基酸位置，Y代表存在于突变体中的氨基酸。报告的数值来自通过电场沉降(EFS)制备的薄膜，并根据天然细菌紫膜质信号进行校正，产生它们的总体光电效率。该数值将光电信号针对膜中的总蛋白和来自光照设备的光输出进行标准化。等式1给出了用于光电效率的等式：
其中ΔV是所测的膜的光电应答(V)，F是在入射光的波长下由样品吸收的光的部分，N是如等式2中定义的激光脉冲中的光子数(光子/脉冲)，
N＝5.03x1012·Epulse·λ    (2)
其中E是发射的光的能量输出(mJ/脉冲)，λ是发射的光的波长(nm)。K159Q突变体产生几乎为天然蛋白6倍的增强的光电效率。因此，将该突变体与其它突变进行了组合以进一步增强该蛋白的光电效率。离子泵运和光电效率按比例扩大，但是为了比较目的使用的是光电压度量，因为后者在实验室中更容易测定。细菌紫膜质偶极突变体的实例显示于表3和4。
表3
细菌紫膜质偶极/Q态突变体的实例
表4
细菌紫膜质增强的偶极突变体的实例
具有改变的Q态形成的细菌紫膜质突变体
在位置V49X、T90X、D115X、E204X、E194X、L206X、D85X/D96X、T90X/V49X/E204X具有氨基酸置换的细菌紫膜质的遗传工程化突变体(其中X可以是与被替代的氨基酸不同的任意氨基酸)也显示出增强的Q态形成。
这些Q态突变体的主要优点是：使用相对低的光激发，蛋白可以被转化为Q态的相对容易性。当通过连续的双光子过程将细菌紫膜质Q态突变体转化为无活性的Q态时，重要的是，短的光脉冲(小于1毫秒)被大约2毫秒间隔开，从而第一光子产生光周期并且第二光子启动O(640)-＞P(490)光化学转化(见图6)。P(490)态迅速分解以形成Q(380)，并且该蛋白不再有活性。Q的吸收谱具有延伸至可见光谱内的尾巴；然而，Q态的光化学活性不是非常高，在大约410nm在没有靶向蓝色脉冲的情况下不会被转化回活性的细菌紫膜质态。如果与单独像素相关的所有细菌紫膜质分子都被转化为Q态，则像素完全失活。本文描述的细菌紫膜质Q态突变体使细菌紫膜质向无活性Q态的转化的光化学效率相对于天然蛋白增强大约400倍。
细菌紫膜质的Q态突变体的实例显示于表5。显示出增强的Q态形成的细菌紫膜质突变体可以与增强的偶极突变体组合，并且可以包含表3、4、和5所示的一个或多个突变氨基酸位置。这些多重突变体也可用于本文描述的细菌紫膜质膜和人工视网膜。
表5
Q态形成性细菌紫膜质突变体的实例
a细菌紫膜质突变体可以通过单光子过程和/或双光子过程进入分支的光周期，以形成永久的Q态。其余的突变体通过双光子过程(连续的一光子反应)形成Q态。
快速光周期细菌紫膜质突变体
为了增强细菌紫膜质蛋白层的动态范围，使用定点诱变组合高偶极突变和快速光周期突变。后者的突变体相对于天然蛋白而言更快的泵运离子，因此可以在较高的光强度下线性地运行。图5B和7中描述了最佳的突变体，表6中列出了具体的突变。
表6
细菌紫膜质快速光周期突变体
细菌紫膜质具有相对高效的光周期，其在环境温度下具有大约15毫秒的总的光周期时间，这表示再生63％的bR静止态所需的总的时间。使用遗传工程化缩短光周期允许产生具有比基于天然蛋白的视网膜植入物更高的应答线性和带宽的视网膜植入物。该观察得自以下事实：如果在恢复至静止态之前蛋白对光作出应答所需的时间长2-3倍，则植入物上的亮点将使蛋白系综的饱和更加迅速。
当与高偶极矩突变体组合时，最快的光周期突变体(其涉及5个突变的组合)不工作。当与K159Q(最佳的增强的偶极突变体)组合时，接下来的5个均等同地良好地工作(数据未显示)。
金结合性细菌紫膜质突变体
在一些实施方式中，人工视网膜使用包括金的粘合剂层，其允许细菌紫膜质蛋白层与内基底结合。在此实施方式中，金结合性细菌紫膜质突变体用于结合金粘合剂层。金结合性突变体作为蛋白薄膜的基本构架并指导随后的蛋白层的取向。天然细菌紫膜质不含任何半胱氨酸残基，因此在策略上将半胱氨酸残基导入这些突变体中蛋白的环区内。这种布置允许蛋白的特定取向和光化学极性的控制。半胱氨酸巯基与金原子反应以将蛋白共价结合至基底表面。表7中显示了24种半胱氨酸突变体的库。半胱氨酸残基被导入蛋白环区内的位点，所述位点使用该蛋白的公开的3-D晶体结构(即，来自Protein Data Base的1C3W结构)来鉴定。对于金的结合，每个蛋白仅需要1个半胱氨酸原子，但是也产生并测试了具有两个或三个半胱氨酸残基替换的细菌紫膜质突变体。
表7
靶向的金结合性细菌紫膜质突变体
  突变体   区域  位置*   突变体   区域  位置*
  T5C   N末端  Ex   S132C   DE环  Ex
  G6C   N末端  Ex   K159C   EF环  Int
  R7C   N末端  Ex   E161C   EF环  Int
  E9C   N末端  Ex   S162C   EF环  Int
  G33C   AB环  Int   R164C   EF环  Int
  V34C   AB环  Int   E166C   EF环  Int
  S35C   AB环  Int   G195C   FG环  Ex
  D36C   AB环  Int   A196C   FG环  Ex
  A39C   AB环  Int   G197C   FG环  Ex
  K40C   AB环  Int   1198C   FG环  Ex
  G72C   BC环  Ex   P200C   FG环  Ex
  G73C   BC环  Ex   N202C   FG环  Ex
  E74C   BC环  Ex   E204C   FG环  Ex
  Q75C   BC环  Ex   R227C   C末端  Int
  A103C   CD环  Int   G231C   C末端  Int
  Q105C   CD环  Int   A233C   C末端  Int
  K129C   DE环  Ex   A240C   C末端  Int
  V130C   DE环  Ex   A241C   C末端  Int
  Y131C   DE环  Ex   A242C   C末端  Int
*Ex表示细胞外表面结合金，Int表示细胞内表面结合金。
通常而言，首先将大约2至大约5层的金结合性细菌紫膜质突变体沉积于金层上，然后是天然细菌紫膜质、增强的偶极突变体、快速光周期突变体、氯泵突变体、离子泵突变体、或其组合，它们的表面电荷经改变以适应如下文所述的用于产生细菌紫膜质膜的静电逐层技术的使用。在一些实施方式中，首先将大约3层的金结合性细菌紫膜质突变体沉积于金层上，然后是天然细菌紫膜质、增强的偶极突变体、快速光周期突变体、氯泵突变体、离子泵突变体、或其组合。
氯泵突变体
可以使用盐细菌紫膜质设计人工视网膜，然而，该蛋白的稳定性不足以使其长期用于视网膜植入物中。通过遗传工程化细菌紫膜质以泵运氯离子(Cl-)同时维持细菌紫膜质的半结晶晶格(其为细菌紫膜质的稳定性的主要来源)而解决了该稳定性问题。
将细菌紫膜质转化为Cl-泵的主要突变是D85T，其向该蛋白中导入羟基官能团(Sasaki等人，1995，Science 269：73-75；Paula等人，2001，Biophys.J.80：2386-95)。推测该官能团临时结合Cl-，启动离子的摄取步骤(Essen，2002，Curr.Opin.Struct.Biol.12：516-22)。为了增大效率，可以使用定点诱变将细胞外环区内的较大的残基(例如Asn、Phe、和Tyr)替换为较小的残基(例如Ala、Val、和Gly)。
在Cl-的光转导过程中，D85T突变体形成中间体，其中Cl-诱导细菌紫膜质突变体的位置204处的谷氨酸残基的暂时脱质子化。图8显示了盐细菌紫膜质和细菌紫膜质的三维结构，显示了氯离子在何处与蛋白结合。盐细菌紫膜质不进行任何此类的同源残基的脱质子化，所述同源残基为中性的苏氨酸离子(Essen，2002，Curr.Opin.Struct.Biol.12：516-22)。质子化状态的改变可能有助于D85T突变体的光周期，在细菌紫膜质突变体的位置204处突变为谷氨酸残基可以抑制或阻止所有离子的光转导。然而，E204T突变体增加细菌紫膜质与盐细菌紫膜质的同源性，并提供改进的通量。
细菌紫膜质膜的差别化信号
视觉神经必须将大量的信息转移至脑。为了改进该过程的效率，通过两极和神经节网络介导经吸收光由光感受器产生的信号，从而沿着视觉神经传递的信号被边缘加强和差别化。本文描述的刚性人工视网膜植入物的薄的细菌紫膜质膜可以提供差别化响应性(Chen，Z.和Birge，R.R.(1993)，″Protein based artificial retinas，″Trends Biotech.11，292-300)。差别化信号的基本要素是：(1)光被细菌紫膜质吸收后的最初信号，然后是(2)无信号的一段时间，最后是(3)当光被关闭时的负向信号。
图9的图显示了刚性人工视网膜像素的差别化响应性。通过改变层间聚合物的通透性，可以在最初光电峰值(0毫秒时显示)的5％至95％调节差别化的(反转电压)光关闭信号(在时间＝150毫秒时)的大小。相对于在光刺激的整个持续过程中开着的恒定信号，差别化的信号具有更高的激发天然视网膜的两极或神经节细胞的可能性。非常短的脉冲将不会产生差别化信号，因为差别化信号的来源是像素上的电荷的建立，经回洗，产生相反的(差别化)信号。可以使用如下所述的静电逐层方法通过用于制备细菌紫膜质膜的聚合物的性质控制差别化信号的存在和强度。
细菌紫膜质膜的产生
制备本文描述的人工视网膜的关键方面是提供具有合适的离子梯度或光电性质的取向的蛋白膜。为了提供对于膜的性质的最佳控制，可以使用静电逐层方法来产生本文描述的细菌紫膜质膜。该方法使用每个蛋白层之间的带正电的聚合物。
图10的图显示了蛋白和阳离子聚合物聚(二烯丙基二甲基氯化铵)(PDAC)的排列。其它阳离子聚合物可以替代PDAC以调节差别化信号的大小。可用于组装细菌紫膜质层的阳离子聚合物的实例包括、但不限于，表8中所示的那些。薄膜嵌入剂的实例包括、但不限于下文表9中显示的那些(见例如，Bromley等人(2007)Adv.Mater.19：2433)。
表8
用于逐层组装细菌紫膜质层的阳离子聚合物
表9
薄膜嵌入剂
嵌入剂与阳离子聚合物按照20％-50％的重量比混合以通过阳离子聚合物层提供离子的增强的导电性。
虽然图10仅显示了一层细菌紫膜质金结合性突变体，但是使用至少约2至约5个单层的细菌紫膜质金结合性突变体分子在添加关键的天然细菌紫膜质蛋白、偶极突变体、快速光周期突变体、氯泵突变体、离子泵突变体、或其组合的层之前提供了更高质量的金结合性主层。细菌紫膜质金结合性突变体主层的单层沉积于薄的金层上，所述薄的金层沉积于视网膜下植入物的内基底层上，例如，使用本文描述的自动化装置。
植入后的刚性人工视网膜的校正
植入之后，每个像素具有活性，当与该像素相联的蛋白吸收光时，其在插入了针的神经中产生神经脉冲。一些针完全接触不到神经细胞，为此它们被有效地关闭。其它的针相接产生假信号的神经细胞，这是由于神经细胞与具有相对于该神经细胞的空间位置突变的光感受器相联，或者是由于插入过程涉及产生冲突信号的多个神经。最终结果是一些像素需要被关闭以使患者具有空间相干视力。关闭假的像素将降低人工视网膜的分辨率，但是增强视觉感知的质量。该设计使之变得可能的这一事实代表了本文描述的刚性人工视网膜植入物相对于现有的人工视网膜的主要的比较上的一个优势。
用于构建本文描述的细菌紫膜质膜的Q态突变体允许将细菌紫膜质从质子泵实体转化为在可见区内不再吸收光的稳定实体。被转化为Q态的细菌紫膜质蛋白多层将在～380nm处具有最大吸收值，其在正常的可见范围之外。
可以修改成像系统(例如由Laser Diagnostic Technologies Inc.或ZeissMeditec生产的系统)以使用弱黄光(590nm)的脉冲激发人工视网膜的单独像素。接受刚性人工视网膜的患者被要求确定所激发的像素相对于视网膜后的倒置图像的位置。该过程可以鉴定假的像素。通过使用与用于使人工视网膜成像的相同光学构架定位，可以使用3mJ的红光脉冲关闭假的像素。
实施例
实施例1
用于视网膜植入物的基于细菌紫膜质的膜的产生
应用细菌紫膜质作为光诱导的离子的来源要求该蛋白在整个多层体积上均匀地取向。细菌紫膜质薄膜的制造已有完善的记录，存在多种方法，既有优点也有缺点(见，例如Varo等人，1983，Biophys.J.43：47-51；Chen等人，1991，Appl.Opt.30：5188-96；He等人，1998，Langmuir 14：1674-79；和Koyama等人，1994，Science 265：762-65)。然而，很多这些方法导致用于视网膜植入应用的蛋白的取向不足。通过逐层(LBL)方式排列蛋白虽然费力，但是允许控制膜的厚度并产生最均匀取向的膜(He等人，1999，Adv.Mater.11：435-46)。
为了增大LBL方法的效率，构建了自动化浸蘸系统以通过多阶段过程移动薄膜基底(图11)。该过程的自动化消除了人的误差并允许该过程在洁净室或层流通风橱中进行以使污染最小化。自动化还允许形成具有需要数天的连续浸蘸的厚度的膜，如果通过人工进行则为非常令人畏缩的任务。自动化浸蘸器构建自Thompson Industries线性滑臂和步进电机。电机由RMV电子控制板ST-400NT控制，该控制板中配有以C++书写的动态库。该库的子程序和功能包裹在延伸的基本插头内，编撰的RealBasic程序用于使功能的必要组合执行产生薄膜所需的浸蘸。此外，本发明的膜证实了He等人描述的膜吸收与蛋白层数之间的直接关系(1998，J.Phys.Chem.B.102：7067-72)。
图11是用于产生人工视网膜上的精确蛋白层的自动化浸蘸器的示意图。人工视网膜的金膜表面连续浸蘸入一系列烧杯(或50ml的圆锥形管或其它容器)，每个烧杯含有阳离子聚合物(例如PDAC)、细菌紫膜质、或洗涤缓冲液。浸蘸步骤的每个完整循环在基底表面(例如DACRON)上产生单独的细菌紫膜质层。通过完成多轮浸蘸循环而产生多个层。例如，在图11中，烧杯A含有带正电的聚合物PDAC，烧杯C含有带负电的细菌紫膜质，其余的烧杯含有一系列洗涤缓冲液。使用烧杯C中的金结合性突变体产生前几个细菌紫膜质层，然后，通过连接于浸蘸器的计算机通知自动化浸蘸器的操作器以将含有金结合性突变体的烧杯C替换为含有高-Q突变体的烧杯C。
这些方法提供了得到的蛋白膜的匀质性和光学特性的精确控制。在一个实施方式中，使用聚(二烯丙基二甲基氯化铵)或PDAC作为有机阳离子以使蛋白层彼此结合(图10)。在碱溶液(50mM甘氨酸，pH9.5)中制备细菌紫膜质以增强用于吸附的分子的净负电荷。每次浸蘸之后进行一系列水洗以防止任何结合得疏松的分子污染随后的溶液。观察到：400层的取向细菌紫膜质产生0.88单位光密度的一次过吸收性。当使用金作为粘合层时，使用的最佳构造是大约400层，因为金层反射大多数的在第一次通过时未被吸收的光。该实施方式允许400个蛋白层吸收大约98％的到达蛋白膜的所有的光。由ITO板上的200个蛋白层组成的天然细菌紫膜质的LBL膜显示出光电信号为800mV。激活兔子的视网膜，以及此类推，足够的离子差别，需要大约2倍于此的电压。
一般地，大约200-400层的突变体细菌紫膜质提供最佳的光密度(0.88)，因为溅射到基底表面上的金薄膜反射在第一次通过时最终穿过蛋白膜的大多数光(图10)。得到的蛋白膜吸收98％或更多的光。层数太多会降低信号的强度。层数太少也会通过不吸收光的足够高的部分而降低信号的强度。
图12是人工视网膜的吸收光谱随着使用图11所示的自动化装置沉积的蛋白层数而变的图。注意纵坐标是吸收性(OD)/1.25。本文描述的细菌紫膜质蛋白膜在570nm处具有最大吸收值，比人类视杆光感受器的吸收波长(λmax＝500nm)更接近人类杆锥(rod cone)。虽然可以对细菌紫膜质进行遗传修饰以提供可见光谱内的多个波长，但是蛋白的标称最大吸收值是在570nm，并且该波长是最容易达到的。但是，蛋白在420-630nm有效地吸收，这提供了用于人工视网膜的足够的波长范围。
如上所述，DACRON是用于一些提议的柔性人工视网膜设计的固体基底。已经证明该材料与类似的LBL方法兼容(见，例如，Liu等人，2005，Coll.Surf.B：Biointerfaces 46：117-26；Wyers等人，1999，Cardiovasc.Pathol.8：153-59；和Liu等人，2007，J.Biomed.Mat.Res.81A：692-704)。DACRON纤维的制备由两种方案的一种完成。第一种方案将金溅射到纤维表面上以产生导电材料，金结合性细菌紫膜质突变体可以共价结合到该材料上。一旦蛋白共价结合到金表面，以Milli-Q蒸馏的水润洗板，使金板经历2个循环的LBL浸蘸：在烧杯C中含有相同的金结合性细菌紫膜质突变体。在随后的浸蘸循环数中，含有天然细菌紫膜质、增强的偶极突变体、快速光周期突变体、氯泵突变体、离子泵突变体、或其组合的新的烧杯替代烧杯C。在备选的方案中，纤维的制备需要表面羰基官能团的温和还原以赋予表面负电荷(Phaneuf等人，1995，J.Applied Biomat.6：289-99)。在该方案中，不使用金和金结合性突变体，相反，在烧杯C中的是天然细菌紫膜质、增强的偶极突变体、快速光周期突变体、氯泵突变体、离子泵突变体、或其组合。此外，也考虑到使用其它设备(自动化的和人工的)用于逐层方法。
实施例2
视网膜植入物的效应
具有由于色素性视网膜炎导致的视力丧失的55岁的老年患者显示出受损的或丧失的光感受器细胞，但仍然具有活性的神经节或两极神经网络。将如本文公开的视网膜植入物植入到该患者的眼睛中，替代受损的或丧失的光感受器细胞。该视网膜植入物通过诱导局部介质中的离子梯度或通过诱导光电信号而刺激神经细胞，使得该患者的视力增加。
在另一个实施方式中，具有黄斑变性的72岁老年患者具有受损的光感受器细胞，但是具有活性的神经节或两极神经网络。将如本文公开的视网膜植入物植入到该患者的眼睛中，替代受损的光感受器细胞。该视网膜植入物通过诱导局部介质中的离子梯度或通过诱导光电信号而刺激神经细胞，使得该患者的视力增加。
通过引用并入和其它实施方式
在本申请中，引用了多篇出版物、专利、和/或专利申请以更完善地描述本组合物和方法所涉及的领域的现状。这些出版物、专利、和/或专利申请的公开内容通过引用方式全文并入本文，达到如果每篇独立的出版物、专利、和/或专利申请均特别和单独被指明通过引用方式并入的程度。
适宜地，可以在不存在未在本文中特别公开的任意要素或限制的情况下实施如本文示例性描述的本发明。因此，例如，在本文的每种情况下，术语“包含(comprising)”、“基本上由......组成(consisting essentiallyof)”、和“由......组成(consisting of)”的任一个可以替换为其它两个术语。所使用的术语和表述用作描述性而非限制性术语，在使用此类术语和表述中不是意在排除所显示的和描述的特征或其部分的任何等同物，但是认识到，在所要求保护的本发明的范围内的可能有多种修饰。
对本领域技术人员容易地显而易见的是，可以不脱离本发明的精神和范围对本文描述的本发明作出不同的替换和修饰。例如，本文未列出的来自嗜盐菌属的细菌紫膜质落在本发明的范围内，本文中未特别列出的细菌紫膜质突变体也是如此。因此，此类另外的实施方式在本发明和以下权利要求的范围内。

Claims (19)

1.一种细菌紫膜质膜，其包含天然细菌紫膜质或细菌紫膜质突变体的多个单层，其中所述天然细菌紫膜质或细菌紫膜质突变体的每个单层与阳离子聚合物的层交替，并且其中所述细菌紫膜质突变体选自氯泵突变体、偶极突变体、光周期突变体、金结合性突变体、离子泵突变体、及其组合，其中所述多个单层包括：包含第一细菌紫膜质突变体的第一主层和包含天然细菌紫膜质、第二细菌紫膜质突变体、或其组合的第二主层，
其中所述第一细菌紫膜质突变体是金结合性突变体，并且所述第二细菌紫膜质突变体选自氯泵突变体、偶极突变体、光周期突变体、离子泵突变体、及其组合；
其中所述第一主层包含金结合性突变体的2至5个单层，其中所述金结合性突变体的每个单层邻近阳离子聚合物的层，从而所述第一主层含有所述金结合性突变体与所述阳离子聚合物的交替的单层；并且
其中所述第二主层包括所述天然细菌紫膜质、所述第二细菌紫膜质突变体、或其组合的200至400个单层，其中所述天然细菌紫膜质、所述第二细菌紫膜质突变体、或其组合的每个单层邻近所述阳离子聚合物的层，从而所述第二主层含有所述天然细菌紫膜质、所述第二细菌紫膜质突变体、或其组合与所述阳离子聚合物的交替的单层。
2.权利要求1的细菌紫膜质膜，其中所述第二细菌紫膜质突变体具有选自下列的一个或多个氨基酸置换：E9N、G33D、G33E、V34D、V34E、A39E、A39D、K40Q、K40N、L66I、M68L、M68T、P70V、P70A、G72S、G72K、G72R、G73K、G73R、E74N、E74V、Q75R、Q75L、Q75H、N76K、A103D、A103E、Q105E、Q105D、K159Q、K159N、R164N、E194K、G195K、G195R、A196K、A196R、G197K、G197R、A233E、A233D、A240E、A240D、D241A、D241V、G242K、G242R、A243E、A243D、A244E、A244D、A245E、和A245D。
3.权利要求1的细菌紫膜质膜，其中所述第一细菌紫膜质突变体具有选自下列的一个或多个氨基酸置换：G6C、R7C、E9C、V34C、D36C、A39C、K40C、G73C、Q105C、S132C、K159C、G195C、A196C、G197C、R227C、A233C、A240C、A241C、和A242C。
4.一种用于刺激视网膜两极或神经节细胞的生物兼容性视网膜植入物，其包含基底层和权利要求1所述的细菌紫膜质膜或包含天然细菌紫膜质或细菌紫膜质突变体的多个单层的细菌紫膜质膜，其中所述天然细菌紫膜质或细菌紫膜质突变体的每个单层与阳离子聚合物的层交替，并且其中所述细菌紫膜质突变体选自氯泵突变体、偶极突变体、光周期突变体、金结合性突变体、离子泵突变体、及其组合。
5.如权利要求4所述的视网膜植入物，其中所述视网膜植入物是柔性的。
6.一种用于产生细菌紫膜质膜的方法，所述方法包括：
a.将金层沉积于基底上；
b.将第一细菌紫膜质突变体的单层沉积于所述金上，其中所述第一细菌紫膜质突变体是金结合性突变体；
c.将阳离子聚合物的层沉积于细菌紫膜质的金结合性突变体的所述单层上；
d.按照步骤(b)和(c)沉积所述细菌紫膜质的金结合性突变体与所述阳离子聚合物的额外的交替的层，直至沉积了所述细菌紫膜质的金结合性突变体的2至5个单层，以形成所述细菌紫膜质的金结合性突变体的主层；
e.在所述细菌紫膜质的金结合性突变体的最后一个沉积层上沉积所述阳离子聚合物的层；
f.在所述阳离子聚合物的层上沉积天然细菌紫膜质或第二细菌紫膜质突变体的单层，其中所述第二细菌紫膜质突变体选自氯泵突变体、偶极突变体、光周期突变体、离子泵突变体、及其组合；
g.按照步骤(e)和(f)沉积所述天然细菌紫膜质或第二细菌紫膜质突变体与所述阳离子聚合物的额外的交替的层，直至沉积了所述天然细菌紫膜质或第二细菌紫膜质突变体的200至400个单层，以形成所述天然细菌紫膜质或第二细菌紫膜质突变体的主层，
从而产生所述细菌紫膜质膜。
7.如权利要求6所述的方法，其中所述基底选自聚对苯二甲酸乙二醇酯(PET)、甲基丙烯酸2-羟乙酯(HEMA)、甲基丙烯酸2-苯基乙酯(PEM)、聚乙二醇(PEG)、甲基丙烯酸甲酯(MMA)、聚二甲基硅氧烷(PDMS)大分子、聚乙烯醇(PVA)水凝胶、铂、和钛。
8.如权利要求7所述的方法，其中所述阳离子聚合物是聚(二烯丙基二甲基氯化铵)或3-(1-吡啶鎓)-1-丙磺酸盐。
9.一种细菌紫膜质膜，其通过如权利要求6所述的方法产生。
10.一种视网膜植入物，其包含如权利要求9所述的细菌紫膜质膜，其中所述细菌紫膜质膜还包含沉积于所述细菌紫膜质膜的最外层上的第二基底层，其中所述第二基底层是离子通透性的。
11.如权利要求10所述的视网膜植入物，其中所述第二基底层包括选自下列的基底：聚对苯二甲酸乙二醇酯(PET)、甲基丙烯酸2-羟乙酯(HEMA)、甲基丙烯酸2-苯基乙酯(PEM)、聚乙二醇(PEG)、甲基丙烯酸甲酯(MMA)、聚二甲基硅氧烷(PDMS)大分子、和聚乙烯醇(PVA)水凝胶。
12.如权利要求4所述的视网膜植入物，其中所述视网膜植入物是刚性的。
13.一种柔性视网膜植入物，其包含内基底层、粘合剂层、细菌紫膜质蛋白层的取向膜、和外基底层，其中，所述细菌紫膜质蛋白层的取向膜包含细菌紫膜质与阳离子聚合物的多个交替的层。
14.一种刚性视网膜植入物，其包含多个像素，其中每个像素包含与铂或钛针可操作地连接的细菌紫膜质膜，并且其中所述多个像素构造为：当所述视网膜植入物植入患者的视网膜时，使所述铂或钛针与所述患者的视网膜的神经节细胞层或两极细胞层相接合，其中，所述细菌紫膜质膜包含细菌紫膜质与阳离子聚合物的交替的层。
15.如权利要求14所述的视网膜植入物，其中所述细菌紫膜质膜沉积于金层上，所述金层沉积于所述铂或钛针的顶部。
16.如权利要求14所述的视网膜植入物，其中所述细菌紫膜质膜沉积于金层上，所述金层沉积于与所述铂或钛针结合的垫上，其中每个像素包含与所述铂或钛针之一接触的金覆盖的垫。
17.如权利要求4、5和10-16中的任一项所述的视网膜植入物在制造药物中的用途，所述药物用于治疗具有由于视网膜光感受器细胞的损失而引起的视力丧失的患者。
18.如权利要求17所述的用途，其中所述视网膜植入物将光转化为所述患者眼睛内的离子梯度。
19.如权利要求17所述的用途，其中所述视网膜植入物将光转化为所述患者眼睛内的光电信号。
CN201080019805.0A 2009-03-05 2010-03-05 基于蛋白的人工视网膜 Active CN102421462B (zh)

Applications Claiming Priority (4)

Application Number Priority Date Filing Date Title
US20928409P 2009-03-05 2009-03-05
US61/209,284 2009-03-05
US61/209284 2009-03-05
PCT/US2010/026362 WO2010102205A2 (en) 2009-03-05 2010-03-05 Protein-based artificial retinas

Publications (2)

Publication Number Publication Date
CN102421462A CN102421462A (zh) 2012-04-18
CN102421462B true CN102421462B (zh) 2014-11-26

Family

ID=42235901

Family Applications (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
CN201080019805.0A Active CN102421462B (zh) 2009-03-05 2010-03-05 基于蛋白的人工视网膜

Country Status (6)

Country Link
US (1) US8563026B2 (zh)
EP (1) EP2403549B1 (zh)
CN (1) CN102421462B (zh)
AU (1) AU2010221216B2 (zh)
CA (1) CA2789943A1 (zh)
WO (1) WO2010102205A2 (zh)

Families Citing this family (6)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US8883719B2 (en) 2008-01-16 2014-11-11 University Of Connecticut Bacteriorhodopsin protein variants and methods of use for long term data storage
US9023989B2 (en) 2008-02-19 2015-05-05 University Of Connecticut Protein-based photovoltaics and methods of use
US8563026B2 (en) 2009-03-05 2013-10-22 University Of Connecticut Protein-based artificial retinas
EP3618763A4 (en) 2017-05-08 2021-02-17 Lambdavision Incorporated A method for stimulating retinal cells and treating vision loss
CN111670020A (zh) * 2018-01-31 2020-09-15 克拉梅德有限公司 用于眼科植入物的抗微生物聚合物
WO2023146058A1 (ko) * 2022-01-26 2023-08-03 서강대학교 산학협력단 외부 광 자극 센싱 기능의 바이오 인공 눈 및 이의 제조 방법

Citations (1)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
WO2008141271A1 (en) * 2007-05-10 2008-11-20 Newcyte, Inc. Artificial retinal implant

Family Cites Families (14)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US5268862A (en) 1989-04-25 1993-12-07 The Regents Of The Unversity Of California Three-dimensional optical memory
US5253198A (en) 1991-12-20 1993-10-12 Syracuse University Three-dimensional optical memory
US5559732A (en) 1994-12-27 1996-09-24 Syracuse University Branched photocycle optical memory device
US6800155B2 (en) 2000-02-24 2004-10-05 The United States Of America As Represented By The Secretary Of The Army Conductive (electrical, ionic and photoelectric) membrane articlers, and method for producing same
EP1307474B1 (de) 2000-07-27 2010-03-03 MIB - Munich Innovative Biomaterials GmbH Protonen-translozierende retinalproteine mit konstantem all-trans-retinal-gehalt und verlangsamten photozyklus
US7146221B2 (en) * 2001-11-16 2006-12-05 The Regents Of The University Of California Flexible electrode array for artifical vision
JP3991937B2 (ja) 2002-08-26 2007-10-17 富士電機デバイステクノロジー株式会社 積層型有機電子写真感光体
US7190051B2 (en) 2003-01-17 2007-03-13 Second Sight Medical Products, Inc. Chip level hermetic and biocompatible electronics package using SOI wafers
WO2006076008A2 (en) * 2004-04-26 2006-07-20 Massachusetts Institute Of Technology Neural stimulation device employing renewable chemical stimulation
US20060187795A1 (en) 2004-10-14 2006-08-24 Steve Redfield Branch photocycle technique for holographic recording in bacteriorhodopsin
US7573024B2 (en) * 2006-12-12 2009-08-11 The University Of Western Ontario Flexible bioelectronic photodetector and imaging arrays based on bacteriorhodopsin (BR) thin films
US8883719B2 (en) 2008-01-16 2014-11-11 University Of Connecticut Bacteriorhodopsin protein variants and methods of use for long term data storage
US9023989B2 (en) 2008-02-19 2015-05-05 University Of Connecticut Protein-based photovoltaics and methods of use
US8563026B2 (en) 2009-03-05 2013-10-22 University Of Connecticut Protein-based artificial retinas

Patent Citations (1)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
WO2008141271A1 (en) * 2007-05-10 2008-11-20 Newcyte, Inc. Artificial retinal implant

Non-Patent Citations (6)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Title
jin-an he et al.oriented bacteriorhodopsin/polycation multilayers by electrostatic layer-by-layer assembly.《langmuir》.1998,第14卷(第7期),第1674-1679页. *
optical and electrical characterization of bacteriorhodopsin films;T.DYUKOVA et al;《biosystems》;19971231;第41卷(第2期);第91页左栏第1段-98页左栏倒数第2段 *
oriented bacteriorhodopsin/polycation multilayers by electrostatic layer-by-layer assembly;jin-an he et al;《langmuir》;19980213;第14卷(第7期);第1675页左栏倒数第1段-1676页左栏第1段 *
peralvarez a a et al.Thr90 is a key residue of the bacteriorhodopsin proton mechanism.《febs letters》.2001,第508卷(第3期),第399-402页. *
T.DYUKOVA et al.optical and electrical characterization of bacteriorhodopsin films.《biosystems》.1997,第41卷(第2期),第91-98页. *
Thr90 is a key residue of the bacteriorhodopsin proton mechanism;peralvarez a a et al;《febs letters》;20011123;第508卷(第3期);第399页左栏第1段-402页左栏最后1段 *

Also Published As

Publication number Publication date
CN102421462A (zh) 2012-04-18
CA2789943A1 (en) 2010-09-10
AU2010221216B2 (en) 2015-07-09
EP2403549A2 (en) 2012-01-11
WO2010102205A2 (en) 2010-09-10
EP2403549B1 (en) 2017-07-05
WO2010102205A3 (en) 2011-02-03
US20100226957A1 (en) 2010-09-09
AU2010221216A1 (en) 2011-10-27
US8563026B2 (en) 2013-10-22

Similar Documents

Publication Publication Date Title
CN102421462B (zh) 基于蛋白的人工视网膜
Tong et al. Improved visual acuity using a retinal implant and an optimized stimulation strategy
US20100152849A1 (en) Retinal prosthetic devices
EP2509551B1 (fr) Retine artificielle comprenant une couche en materiau photovoltaique comprenant un semiconducteur a base de dioxyde de titane
Frick et al. Biofunctionalized peptide-based hydrogels provide permissive scaffolds to attract neurite outgrowth from spiral ganglion neurons
US11998443B2 (en) Method for stimulating retinal cells and treating vision loss
Hetling et al. Neural prostheses for vision: designing a functional interface with retinal neurons
Yu et al. Folate-modified photoelectric responsive polymer microarray as bionic artificial retina to restore visual function
JP2020519379A5 (zh)
Greco et al. Activation of retinal ganglion cells using a biomimetic artificial retina
Ghaffari et al. Nanobiomaterials for bionic eye: vision of the future
Matsuo et al. Safety, efficacy, and quality control of a photoelectric dye-based retinal prosthesis (Okayama University-type retinal prosthesis) as a medical device
Zhou et al. Microelectronic visual prostheses
Greco et al. Pixel characterization of a protein-based retinal implant using a microfabricated sensor array
Weitz et al. Visual prostheses
Yang et al. Vision restoration in photoreceptor-degenerated mice and macaque monkeys using nanowires
Chenais et al. 11 RETINAL PROSTHESES
CN116585534B (zh) 光活性可注射水凝胶及其制法和在人工视网膜方面的应用
Greco et al. Mehdi Azadmehr*, Philipp Häfligers, Erik A. Johannessen* and Robert R. Birge†,||* Department of Chemistry
Haick Mimicking Human Vision by Photo-stimulation of Blind Retinas based on NR-CNT sensor
Mahadiuzzaman et al. Visual Neuroprostheses for Impaired Human Nervous System: State‐of‐the‐Art and Future Outlook
Antognazza et al. 10. EMERGING TECHNOLOGIES IN RETINAL PROSTHETICS
Chang Manipulation of RGCs Response Using Different Stimulation Strategies for Retinal Prosthesis
Grossman et al. A Non-Invasive Approach to the Bionic Eye
ABDEL AZIZ The role of reactive oxygen species in smart bio-organic interfaces

Legal Events

Date Code Title Description
C06 Publication
PB01 Publication
C10 Entry into substantive examination
SE01 Entry into force of request for substantive examination
C14 Grant of patent or utility model
GR01 Patent grant