CN102417902A

CN102417902A - 磁珠-微孔板法提取核酸试剂盒及其提取核酸方法

Info

Publication number: CN102417902A
Application number: CN2011102756626A
Authority: CN
Inventors: 盘宝进; 温和心; 谢永平
Original assignee: BEIJING ENTRY-EXIT INSPECTION AND QUARANTINE BUREAU INSPECTION QUARANTINE TECHNOLOGY CENTER
Current assignee: BEIJING ENTRY-EXIT INSPECTION AND QUARANTINE BUREAU INSPECTION QUARANTINE TECHNOLOGY CENTER
Priority date: 2011-09-16
Filing date: 2011-09-16
Publication date: 2012-04-18

Abstract

本发明涉及一种磁珠-微孔板法提取核酸试剂盒及其提取核酸方法，试剂盒包括盒体和试剂，盒体由类似于酶标板的可拆卸微孔板（2）和磁力板（1）组成；试剂包括磁珠、裂解-结合液、洗涤液A、洗涤液B和洗脱液；可拆卸微孔板（2）由微孔（4）和孔架（3）两部分组成，微孔（4）的制作材料为聚苯乙烯、聚乙烯或聚丙烯，孔底为“U”形或“V”形，微孔（4）分单孔和多联孔两种形式；磁力板（1）的形状、尺寸与可拆卸微孔板（2）底部适配。本试剂盒可一次性大批量提取样品的核酸，而且操作简单、成本低、工作效率高。

Description

磁珠-微孔板法提取核酸试剂盒及其提取核酸方法

技术领域

本发明涉及一种用于提取核酸的试剂盒及其提取核酸方法，具体涉及了一种磁珠-微孔板法提取核酸试剂盒及其提取核酸方法。

背景技术

核酸是一类生物信息高分子化合物，自它首次被从细胞中分离出来，经历了一百多年的历史，直至上个世纪中期以后科学家对核酸结构和功能才取得了飞跃的发展。核酸分为脱氧核糖核酸和核糖核酸，核苷酸是核酸的基本单位。DNA和RNA在动植物种都有存在，但一种病毒只含有一种核酸，DNA或RNA。核酸在整个分子生物学中的所具有的无可替代的作用，自分子生物学创立以来，一直是分子生物学研究的主要对象。因此，核酸的提取和分离纯化也是分子生物学各类实验不可缺少的一个环节。在临床诊断中，常从人体组织，如血清或血浆、组织切片中分离纯化核酸，然后用于疾病的诊断和组织配型。

传统的酚-氯仿法等化学方法提取核酸，该方法虽然提取的核酸得率高，纯度好，但要使用到酚和氯仿等有毒有害物质，操作过程要反复开管加液、离心、弃液，频繁更换离心管和吸咀，工作步骤冗长繁杂，致使提取工作效率低下。

随着纳米技术的发展，利用SiO₂（二氧化硅）包裹的纳米磁珠在一定条件下特异吸附核酸的特性，开发出了磁珠提取纯化核酸技术，该技术得到了广泛的应用。操作基本过程是样品中的核酸与磁珠充分混合使核酸吸附到磁珠后，与磁珠一起在磁场的作用下与溶液分离，经过几次洗涤后，用洗脱液使核酸与磁珠分离，磁珠再由磁场中从液相中分离出来，液相即为纯化的核酸溶液。所以磁珠法提取核酸该技术利用磁珠的物理特性提取纯化核酸，不使用有毒有害化学试剂，操作过程简单，不用频繁更换离心管和吸咀，不用离心，磁吸瞬间可以完成，核酸得率和纯度优于酚～氯仿法等化学方法。磁珠法较传统的酚-氯仿法等化学方法是革命性的技术革新。如公开号CN101684138A公开一种应用纳米磁珠纯化核酸的试剂盒，该试剂盒由裂解液、磁珠缓冲液、洗涤缓冲液1、洗涤缓冲液2、洗涤缓冲液3、洗脱缓冲液和平衡液组成；该发明提取核酸速度快、灵敏度高，并且比传统核酸纯化方法具有自动化升级的潜力，使得核酸提取的大规模集成化，均一性成为可行。但是现有的磁珠法提取核酸也存在以下缺点：1.由于在离心管中进行提取，需要反复开盖加液、盖盖混匀，再开盖弃液过程，当检测量为几十上百份样时，反复开盖极不方便。2.分子生物学检测样品用量一般为1～5微升,而常规一次提取量为50～100微升,与磁珠昂贵的成本比较，无疑存在较大的浪费。

发明内容

本发明的目的在于针对现有技术的不足，提供了一种操作简单、节约成本的磁珠-微孔板法提取核酸试剂盒及其提取核酸方法。

为了实现上述目的，本发明采取以下技术解决法案：一种磁珠-微孔板法提取核酸试剂盒，包括盒体和试剂，盒体包括磁力板和可拆卸微孔板，可拆卸微孔板由孔架和微孔两部分组成；微孔分单孔或多联孔安置在孔架上；试剂包括磁珠、裂解-结合液、洗涤液A、洗涤液B和洗脱液。

所述微孔的制作材料为聚苯乙烯、聚乙烯或聚丙烯。

所述微孔的孔底为“U”形或“V”形，微孔的容积为400微升以上。

所述磁力板为长方形钕铁錋强磁片，形状、尺寸与可拆卸微孔板底部适配。

所述磁珠为SiO₂ 包裹的氧化铁纳米颗粒，所述裂解-结合液为异硫氰酸胍消化液，所述洗涤液A为75%无水乙醇水溶液，所述洗涤液B为无水乙醇，所述洗脱液为电导率≧18微西门子的纯水，即超纯水或双蒸水。

所述试剂盒提取核酸的样品为固体、液体或固-液混和物。

上述试剂盒中所有试剂均为工作液，可直接使用，磁珠液和裂解-结合液使用前充分摇匀；试剂盒在常温条件下储存和运输，磁珠液与磁板存放距离至少10cm以上，有效期一年；本发明试剂与器械配合使用，不建议与其它试剂或器械混用。

使用本发明试剂盒提取核酸的方法如下：

1.将样品与裂解-结合液放入离心管内充分作用后，在4000～10000转/分的转速下，离心5～15分钟；

2. 取上清液50～200微升/孔放入微孔板的微孔中，记录样品对应的孔号，并用8通道微量移液器向微孔加入磁珠5～10微升/孔；

3.将微孔板放在微量漩涡振荡器中充分混匀，静置5～10分钟，中间和最后各混匀1～2次，然后将微孔板板底扣入磁力板上，磁吸10～30秒后将磁力板和微孔板一起拿起，甩净孔内液体，管口向下在吸水纸上轻叩以吸干残留液体；

4.先分离微孔板和磁力板，然后用8通道微量移液器向微孔加入洗涤液A，50～200微升/孔，将微孔板放在微量漩涡振荡器中振荡使磁珠充分悬浮，再将微孔板板底扣入磁力板上，磁吸10～30秒后将磁力板和微孔板一起拿起，甩净孔内液体，然后管口向下在吸水纸上轻叩以吸干残留液体；重复操作此步骤3～5遍；

5.再次分离微孔板和磁力板，然后用8通道微量移液器向微孔加入洗涤液B，50～200微升/孔，将微孔板放在微量漩涡振荡器中振荡使磁珠充分悬浮，再将微孔板板底扣入磁力板上，磁吸10～30秒后将磁力板和微孔板一起拿起，甩净孔内液体，然后管口向下在吸水纸上轻叩以吸干残留液体；

6.将微孔板移入干燥箱中45～65℃干燥10～20分钟后，用8通道微量移液器向微孔加入洗脱液，30～200微升/孔，将微孔板放在微量漩涡振荡器中振荡使磁珠充分悬浮；

7. 将微孔板移入恒温箱中60～65℃作用10～20分钟，期间振荡混匀2～3次，最后将微孔板板底扣入磁力板上，磁吸10～30秒，上清液即为提取纯化的核酸。

本发明的优点：

1. 微孔固定于板架中，便于使用多道移液器加液、取液和弃液，克服了原技术逐管反复开盖加液和弃液等繁琐的操作，可一次性大批量提取样品的核酸，工作效率是原技术的10倍以上。本试剂盒在提供提取试剂的同时还提供一套核酸提取器械---盒体，由一块类似于酶标板的可拆卸微孔板和一块与微孔板适配的磁力板组成；磁珠与核酸吸附、洗涤、洗脱、磁吸等均在孔中进行，类似于ELISA操作过程，不需要逐管反复开盖加液、弃液等繁琐的操作，试剂用量较离心管方式节省一半以上。

2.耗材便宜经济，其核酸提取成本是机器用深孔板法的1/10。

3.试剂消耗少，磁珠加样量仅为5ul等试剂是传统方法和深孔板法用量的1/2。磁力板的作用是提供磁吸作用，在甩弃孔内液体时，磁力板与微孔板紧贴，吸住磁珠，防止磁珠随液体甩出。

附图说明

图1是本发明一实施例试剂盒的示意图。

图2是本发明的磁力板示意图。

图3是本发明的可拆卸8联孔微孔的示意图。

图4是本发明的微孔板孔架的示意图。

图5是本发明的8×12规格微孔板的示意图。

附图标记：磁力板1、微孔板2、孔架3、微孔4。

具体实施方式

下面结合附图对本发明进一步说明。

实施例1：

如附图所示，用聚苯乙烯制作容积为400微升、孔底呈U形的8联孔的微孔4，然后将微孔4放入相应的孔架3中，组成可拆卸微孔板2；将组装好的可拆卸微孔板2叩在形状、尺寸与可拆卸微孔板2底部适配的磁力板1上，使微孔4底部与磁力板1紧贴在一起，即可得到磁珠-微孔板法提取核酸试剂盒。

实施例2：

如附图所示，用聚丙烯制作容积为500微升、孔底呈U形的8联孔的微孔4，然后将微孔4放入相应的孔架3中，组成可拆卸微孔板2；将组装好的可拆卸微孔板2叩在形状、尺寸与可拆卸微孔板2底部适配的磁力板1上，使微孔4底部与磁力板1紧贴在一起，即可得到磁珠-微孔板法提取核酸试剂盒。

实施例3：

用聚乙烯制作容积为550微升、孔底为V形的单孔微孔4，然后将多个单孔微孔4放入相应数目的孔架3中，组成可拆卸微孔板2；将组装好的可拆卸微孔板2叩在形状、尺寸与可拆卸微孔板2底部适配的磁力板1上，使微孔4底部与磁力板1紧贴在一起，即可得到磁珠-微孔板法提取核酸试剂盒。

实施例4：

用上述实施例1的磁珠-微孔板法提取核酸试剂盒提取血清/全血样品中的DNA的步骤如下：

1. 在离心管内加入血清/全血和3～5倍量的异硫氰酸胍消化液（V/V），充分混匀作用后，在4000转/分的转速下离心5分钟；

2.取上清液50微升/孔放入微孔板2小孔中，记录样品对应的孔号，并用8通道微量移液器加入磁珠5微升/孔；

3.将微孔板2在微量漩涡振荡器中充分混匀，静置5分钟，中间和最后各混匀1次，然后将微孔板2板底扣入磁力板1上，磁吸10秒后将磁力板1和微孔板2一起拿起，甩净孔内液体，管口向下在吸水纸上轻叩以吸干残留液体；

4.先分离微孔板2和磁力板1，然后用8通道微量移液器向微孔板加入75%无水乙醇水溶液，50微升/孔，将微孔板2放在微量漩涡振荡器中振荡使磁珠充分悬浮，再将微孔板2板底扣入磁力板1上，磁吸10秒后将磁力板1和微孔板2一起拿起，甩净孔内液体，然后管口向下在吸水纸上轻叩以吸干残留液体；重复操作此步骤3遍；

5.再次分离微孔板2和磁力板1，然后用8通道微量移液器向微孔板2加入无水乙醇，50微升/孔，将微孔板2放在微量漩涡振荡器中振荡使磁珠充分悬浮，再将微孔板2板底扣入磁力板1上，磁吸10秒后将磁力板1和微孔板2一起拿起，甩净孔内液体，然后管口向下在吸水纸上轻叩以吸干残留液体；

6.将微孔板2移入干燥箱中45℃干燥10分钟后，用8通道微量移液器向微孔板2加入电导率≧18微西门子的超纯水，30微升/孔，将微孔板2放在微量漩涡振荡器中振荡使磁珠充分悬浮；

7.将微孔板2移入恒温箱中60℃作用10分钟，期间振荡混匀2次，最后将微孔板2板底扣入磁力板1上，磁吸10秒，上清液即为提取纯化的DNA酸。

实施例4的结果：获得DNA水溶液的纯度1.8＜OD260/ OD280＜2.0，体积≥30ul。

实施例5：

用上述实施例2的磁珠-微孔板法提取核酸试剂盒提取组织匀浆样品中的DNA的步骤如下：

1.在离心管内加入组织匀浆和3～5倍量的异硫氰酸胍消化液（V/V），充分混匀作用后，在7500转/分的转速下离心10分钟；

2.取上清液100微升/孔放入微孔板2小孔中，记录样品对应的孔号，并用8通道微量移液器加入磁珠8微升/孔；

3.将微孔板2在微量漩涡振荡器中充分混匀，静置7分钟，中间和最后各混匀2次，然后将微孔板2板底扣入磁力板1上，磁吸20秒后将磁力板1和微孔板2一起拿起，甩净孔内液体，管口向下在吸水纸上轻叩以吸干残留液体；

4.先分离微孔板2和磁力板1，然后用8通道微量移液器向微孔板2加入75%无水乙醇水溶液，120微升/孔，将微孔板2放在微量漩涡振荡器中振荡使磁珠充分悬浮，再将微孔板2板底扣入磁力板1上，磁吸20秒后将磁力板1和微孔板2一起拿起，甩净孔内液体，然后管口向下在吸水纸上轻叩以吸干残留液体；重复操作此步骤4遍；

5.再次分离微孔板2和磁力板1，然后用8通道微量移液器向微孔板2加入无水乙醇，150微升/孔，将微孔板2放在微量漩涡振荡器中振荡使磁珠充分悬浮，再将微孔板2板底扣入磁力板1上，磁吸20秒后将磁力板1和微孔板2一起拿起，甩净孔内液体，然后管口向下在吸水纸上轻叩以吸干残留液体；

6.将微孔板2移入干燥箱中55℃干燥15分钟后，用8通道微量移液器向微孔板2加入电导率≧18微西门子的双蒸水，100微升/孔，将微孔板放在微量漩涡振荡器中振荡使磁珠充分悬浮；

7.将微孔板2移入恒温箱中62℃作用15分钟，期间振荡混匀2次，最后将微孔板2板底扣入磁力板1上，磁吸20秒，上清液即为提取纯化的DNA。

实施例5的结果：获得DNA水溶液的纯度1.8＜OD260/ OD280＜2.0，体积≥30ul。

实施例6：

用上述实施例3的磁珠-微孔板法提取核酸试剂盒提取粪便样品中的DNA的步骤如下：

1. 在离心管内加入粪便样品和3～5倍量的异硫氰酸胍消化液（V/V），充分混匀作用后，在10000转/分的转速下离心15分钟；

2.取上清液200微升/孔放入微孔板2小孔中，记录样品对应的孔号，并用8通道微量移液器加入磁珠10微升/孔；

3.将微孔板2在微量漩涡振荡器中充分混匀，静置10分钟，中间和最后各混匀2次，然后将微孔板2板底扣入磁力板1上，磁吸30秒后将磁力板1和微孔板2一起拿起，甩净孔内液体，管口向下在吸水纸上轻叩以吸干残留液体；

4.先分离微孔板2和磁力板1，然后用8通道微量移液器向微孔板2加入75%无水乙醇水溶液， 200微升/孔，将微孔板2放在微量漩涡振荡器中振荡使磁珠充分悬浮，再将微孔板2板底扣入磁力板1上，磁吸30秒后将磁力板1和微孔板2一起拿起，甩净孔内液体，然后管口向下在吸水纸上轻叩以吸干残留液体；重复操作此步骤5遍；

5.再次分离微孔板2和磁力板1，然后用8通道微量移液器向微孔板2加入无水乙醇， 200微升/孔，将微孔板2放在微量漩涡振荡器中振荡使磁珠充分悬浮，再将微孔板2板底扣入磁力板1上，磁吸30秒后将磁力板1和微孔板2一起拿起，甩净孔内液体，然后管口向下在吸水纸上轻叩以吸干残留液体；

6.将微孔板2移入干燥箱中65℃干燥20分钟后，用8通道微量移液器向微孔板2加入电导率≧18微西门子的超纯水， 200微升/孔，将微孔板2放在微量漩涡振荡器中振荡使磁珠充分悬浮；

7.将微孔板2移入恒温箱中65℃作用20分钟，期间振荡混匀3次，最后将微孔板2板底扣入磁力板1上，磁吸30秒，上清液即为提取纯化的DNA。

实施例6的结果：获得DNA水溶液的纯度1.8＜OD260/ OD280＜2.0，体积≥30ul。

Claims

1.一种磁珠-微孔板法提取核酸试剂盒，包括盒体和试剂，其特征在于：盒体包括磁力板（1）和可拆卸微孔板（2），可拆卸微孔板（2）由孔架（3）和微孔（4）两部分组成；微孔（4）分单孔或多联孔安置在孔架（3）上，试剂包括磁珠、裂解-结合液、洗涤液A、洗涤液B和洗脱液。

2.根据权利要求1所述磁珠-微孔板法提取核酸试剂盒，其特征在于：所述微孔（4）的制作材料为聚苯乙烯、聚乙烯或聚丙烯。

3.根据权利要求2所述磁珠-微孔板法提取核酸试剂盒，其特征在于：所述微孔（4）的孔底为“U”形或“V”形，微孔（4）的容积为400微升以上。

4.根据权利要求1所述磁珠-微孔板法提取核酸试剂盒，其特征在于：所述磁力板（1）为长方形钕铁錋强磁片，形状、尺寸与可拆卸微孔板（2）底部适配。

5.根据权利要求1所述磁珠-微孔板法提取核酸试剂盒，其特征在于：所述磁珠为SiO₂包裹的氧化铁纳米颗粒，所述裂解-结合液为异硫氰酸胍消化液，所述洗涤液A为75%无水乙醇水溶液，所述洗涤液B为无水乙醇，所述洗脱液为电导率≧18微西门子的纯水。

6.一种使用磁珠-微孔板法提取核酸试剂盒提取核酸方法，其特征在于：包括以下步骤：

①将样品与裂解-结合液放入离心管内充分作用后，在4000～10000转/分的转速下，离心5～15分钟；

取上清液50～200微升/孔放入微孔板（1）的微孔（4）中，记录样品对应的孔号，并用8通道微量移液器向微孔（4）加入磁珠5～10微升/孔；

③将微孔板（2）放在微量漩涡振荡器中充分混匀，静置5～10分钟，中间和最后各混匀1～2次，然后将微孔板（2）板底扣入磁力板（1）上，磁吸10～30秒后将磁力板（1）和微孔板（2）一起拿起，甩净孔内液体，管口向下在吸水纸上轻叩以吸干残留液体；

④先分离微孔板（2）和磁力板（1），然后用8通道微量移液器向微孔（4）加入洗涤液A，50～200微升/孔，将微孔板（2）放在微量漩涡振荡器中振荡使磁珠充分悬浮，再将微孔板（2）板底扣入磁力板（1）上，磁吸10～30秒后将磁力板（1）和微孔板（2）一起拿起，甩净孔内液体，然后管口向下在吸水纸上轻叩以吸干残留液体；重复操作此步骤3～5遍；

⑤再次分离微孔板（2）和磁力板（1），然后用8通道微量移液器向微孔（4）加入洗涤液B，50～200微升/孔，将微孔板（2）放在微量漩涡振荡器中振荡使磁珠充分悬浮，再将微孔板（2）板底扣入磁力板（1）上，磁吸10～30秒后将磁力板（1）和微孔板（2）一起拿起，甩净孔内液体，然后管口向下在吸水纸上轻叩以吸干残留液体；

⑥将微孔板（2）移入干燥箱中45～65℃干燥10～20分钟后，用8通道微量移液器向微孔（4）加入洗脱液，30～200微升/孔，将微孔板（2）放在微量漩涡振荡器中振荡使磁珠充分悬浮；

⑦将微孔板（2）移入恒温箱中60～65℃作用10～20分钟，期间振荡混匀2～3次，最后将微孔板（2）板底扣入磁力板（1）上，磁吸10～30秒，上清液即为提取纯化的核酸。