CN102414218A - 具有蛋白酶识别序列的标签肽及其应用 - Google Patents

具有蛋白酶识别序列的标签肽及其应用 Download PDF

Info

Publication number
CN102414218A
CN102414218A CN2010800180432A CN201080018043A CN102414218A CN 102414218 A CN102414218 A CN 102414218A CN 2010800180432 A CN2010800180432 A CN 2010800180432A CN 201080018043 A CN201080018043 A CN 201080018043A CN 102414218 A CN102414218 A CN 102414218A
Authority
CN
China
Prior art keywords
antibody
labelled peptide
peptide
recognition sequence
protease recognition
Prior art date
Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
Pending
Application number
CN2010800180432A
Other languages
English (en)
Inventor
高木淳一
Current Assignee (The listed assignees may be inaccurate. Google has not performed a legal analysis and makes no representation or warranty as to the accuracy of the list.)
Osaka University NUC
Original Assignee
Osaka University NUC
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by Osaka University NUC filed Critical Osaka University NUC
Publication of CN102414218A publication Critical patent/CN102414218A/zh
Pending legal-status Critical Current

Links

Images

Classifications

    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K16/00—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies
    • C07K16/08—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from viruses
    • C07K16/10—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from viruses from RNA viruses
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K47/00—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient
    • A61K47/50—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates
    • A61K47/51—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates the non-active ingredient being a modifying agent
    • A61K47/62—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates the non-active ingredient being a modifying agent the modifying agent being a protein, peptide or polyamino acid
    • A61K47/65—Peptidic linkers, binders or spacers, e.g. peptidic enzyme-labile linkers
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K1/00—General methods for the preparation of peptides, i.e. processes for the organic chemical preparation of peptides or proteins of any length
    • C07K1/14—Extraction; Separation; Purification
    • C07K1/16—Extraction; Separation; Purification by chromatography
    • C07K1/22—Affinity chromatography or related techniques based upon selective absorption processes
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K7/00—Peptides having 5 to 20 amino acids in a fully defined sequence; Derivatives thereof
    • C07K7/04—Linear peptides containing only normal peptide links
    • C07K7/06—Linear peptides containing only normal peptide links having 5 to 11 amino acids
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12P—FERMENTATION OR ENZYME-USING PROCESSES TO SYNTHESISE A DESIRED CHEMICAL COMPOUND OR COMPOSITION OR TO SEPARATE OPTICAL ISOMERS FROM A RACEMIC MIXTURE
    • C12P21/00—Preparation of peptides or proteins
    • C12P21/06—Preparation of peptides or proteins produced by the hydrolysis of a peptide bond, e.g. hydrolysate products
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K2317/00—Immunoglobulins specific features
    • C07K2317/30—Immunoglobulins specific features characterized by aspects of specificity or valency
    • C07K2317/34—Identification of a linear epitope shorter than 20 amino acid residues or of a conformational epitope defined by amino acid residues
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K2317/00—Immunoglobulins specific features
    • C07K2317/90—Immunoglobulins specific features characterized by (pharmaco)kinetic aspects or by stability of the immunoglobulin
    • C07K2317/92—Affinity (KD), association rate (Ka), dissociation rate (Kd) or EC50 value
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K2319/00—Fusion polypeptide
    • C07K2319/40—Fusion polypeptide containing a tag for immunodetection, or an epitope for immunisation
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K2319/00—Fusion polypeptide
    • C07K2319/50—Fusion polypeptide containing protease site

Landscapes

  • Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
  • Organic Chemistry (AREA)
  • Health & Medical Sciences (AREA)
  • General Health & Medical Sciences (AREA)
  • Biochemistry (AREA)
  • Genetics & Genomics (AREA)
  • Medicinal Chemistry (AREA)
  • Molecular Biology (AREA)
  • Proteomics, Peptides & Aminoacids (AREA)
  • Biophysics (AREA)
  • Engineering & Computer Science (AREA)
  • Virology (AREA)
  • Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
  • Wood Science & Technology (AREA)
  • Zoology (AREA)
  • General Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Microbiology (AREA)
  • Chemical Kinetics & Catalysis (AREA)
  • General Engineering & Computer Science (AREA)
  • Biotechnology (AREA)
  • Immunology (AREA)
  • Pharmacology & Pharmacy (AREA)
  • Epidemiology (AREA)
  • Animal Behavior & Ethology (AREA)
  • Public Health (AREA)
  • Veterinary Medicine (AREA)
  • Analytical Chemistry (AREA)
  • Peptides Or Proteins (AREA)
  • Preparation Of Compounds By Using Micro-Organisms (AREA)
  • Micro-Organisms Or Cultivation Processes Thereof (AREA)

Abstract

本发明提供通过使蛋白酶识别序列与针对标签肽的抗体的表位重叠，可用于蛋白酶识别序列本身的检测和纯化的标签肽，并且提供利用该标签肽和针对该标签肽的抗体的重组蛋白的纯化方法。作为这样的标签肽，优选蛋白酶识别序列为烟草蚀纹病毒(TEV)蛋白酶识别序列，例如可举出具有氨基酸序列(1)RX1X2LYX3QGKDG(X1、X2和X3相同或不同，表示任意的氨基酸残基)的标签肽。

Description

具有蛋白酶识别序列的标签肽及其应用
技术领域
本发明涉及具有蛋白酶识别序列的标签肽及其应用，具体而言，涉及具有蛋白酶识别序列的标签肽、编码该标签肽的多核苷酸、含有该多核苷酸的重组载体、针对该标签肽的抗体、以及使用该抗体的蛋白纯化方法。
背景技术
生命科学领域中，在基础研究、应用研究及产品开发的所有领域中均广泛进行着利用基因重组技术的蛋白的生产。并且，为了检测和纯化利用大肠杆菌或动物细胞表达的重组蛋白，通常在目标蛋白的末端附加由数个残基的肽构成的标签。但是，认为该标签会对目标蛋白的生物活性、结晶结构等产生影响，因此最终必须将其切除。因此，需要预先在标签和目标蛋白之间插入特异性的蛋白酶识别序列。
例如，在非专利文献1中记载了将组氨酸标签和MBP(麦芽糖结合蛋白)标签组合、并且进一步附加有烟草蚀纹病毒(Tobacco etch virus，以下称为“TEV”)蛋白酶识别序列的复合标签。另外，在非专利文献2中记载了组合有蛋白A、钙调蛋白结合肽(CBP)和TEV蛋白酶识别序列的复合标签。但是，上述文献中记载的TEV蛋白酶识别序列，均只不过是为了将附加的标签切去而使用的，并非作为用于TEV蛋白酶识别序列自身的检测和纯化的标签而使用。如果蛋白酶识别序列本身能够作为检测和纯化用的标签使用，则能够飞跃性地简化构建体的设计。
现有技术文献
非专利文献
非专利文献1：David S.Waugh，Making the most of affinity tags.TRENDS in Biotechnology Vol.23No.6 June 316-320(2005)
非专利文献2：Oscar Puig，et al.，The Tandem Affinity Purification(TAP)Method：A General Procedure of Protein Complex Purification.METHODS 24，218-229(2001)
发明内容
本发明的目的在于提供能够用于蛋白酶识别序列本身的检测和纯化的标签肽，并且提供利用该标签肽和针对该标签肽的抗体的重组蛋白的纯化方法。此外，本发明的目的还在于提供由该标签肽和第二标签肽组合而成、能够同时结合两种抗体的标签肽。
为了解决上述课题，本发明包含以下的发明。
[1]一种标签肽，具有蛋白酶识别序列，其特征在于，该蛋白酶识别序列与针对该标签肽的抗体的表位重叠。
[2]一种标签肽，具有蛋白酶识别序列，其特征在于，该蛋白酶识别序列与针对该标签肽的抗体的表位重叠，该蛋白酶识别序列为烟草蚀纹病毒(TEV)蛋白酶识别序列。
[3]如上述[1]或[2]所述的标签肽，其特征在于，具有以下的氨基酸序列(1)：
(1)RX1X2LYX3QGKDG(序列号1)
(X1、X2和X3相同或不同，表示任意的氨基酸残基)。
[4]如上述[3]所述的标签肽，其中，氨基酸序列(1)为以下的氨基酸序列(2)：
(2)RENLYFQGKDG(序列号2)。
[5]一种标签肽，其特征在于，由上述[1]～[4]中任一项所述的标签肽和第二标签肽组合而成。
[6]如上述[5]所述的标签肽，其特征在于，能够同时结合针对上述[1]～[4]中任一项所述的标签肽的抗体和针对第二标签肽的抗体。
[7]一种多核苷酸，其特征在于，编码上述[1]～[6]中任一项所述的标签肽。
[8]一种重组载体，其特征在于，含有上述[7]所述的多核苷酸。
[9]针对上述[1]～[4]中任一项所述的标签肽的抗体。
[10]如上述[8]所述的抗体，其为由大鼠-小鼠杂交瘤2H5(FERMBP-11245)产生的单克隆抗体。
[11]大鼠-小鼠杂交瘤2H5(FERM BP-11245)。
[12]一种蛋白的纯化方法，其中，包括下述(i)～(iii)的步骤：
(i)使上述[9]或[10]所述的抗体与含有上述[1]～[4]中任一项所述的标签肽和目标蛋白的融合蛋白的试样作用而形成融合蛋白与抗体的结合物的步骤；
(ii)使洗脱物质与上述(i)的步骤中得到的结合物作用而使融合蛋白从抗体中游离的步骤；
(iii)从上述(ii)的步骤中得到的融合蛋白上切除标签肽的步骤。
[13]一种试剂盒，用于表达、纯化、检测或定量蛋白，其中，包含上述[8]所述的重组载体或者上述[9]或[10]所述的抗体。
发明效果
根据本发明，能够提供具有蛋白酶识别序列的标签肽和针对该标签肽的抗体。通过利用该标签肽和针对该标签肽的抗体，能够以容易的操作高纯度地纯化融合有该标签肽的目标蛋白，并且能够容易地标签将切去。
另外，根据本发明，提供由具有蛋白酶识别序列的标签肽和第二标签肽组合而成的标签肽。该标签肽能够同时结合针对该标签肽的两种抗体，因此即使在无法容易地获得针对目标蛋白的抗体的情况下，也能够利用夹心ELISA等，能够检测微量蛋白。因此，根据本发明，即使是不熟练者也能够容易地纯化或检测由克隆的基因所表达的不稳定且微量的重组蛋白。并且，能够高精度地比较多个试样中的目标蛋白的含量。
附图说明
图1(a)是表示标签肽、蛋白酶识别序列与目标蛋白的融合蛋白的示意图。
图1(b)是表示具有本发明的蛋白酶识别序列的标签肽与目标蛋白的融合蛋白的示意图。
图2(a)是表示利用了两种标签肽的夹心ELISA法的示意图。
图2(b)是表示利用了具有本发明的蛋白酶识别序列的标签肽与第二标签肽组合而成的标签肽的夹心ELISA法的示意图。
图3是表示在人纤连蛋白的第9-第10Fn3结构域部分的N末端附加有各种TEV序列的标签肽融合蛋白的图。
图4是表示对单克隆抗体2H5的表位进行分析的结果的图。
图5是表示对TEV蛋白酶的识别和切割所必需的氨基酸进行分析的结果的图。
图6是表示通过利用Biacore的表面等离子共振分析对2H5抗体对于eTEV肽的亲和性进行分析的结果的图。
图7是表示通过使用2H5抗体的蛋白免疫印迹法对eTEV标签融合蛋白进行检测的结果、和通过使用抗FLAG抗体M2的蛋白免疫印迹法对FLAG肽融合蛋白进行检测的结果的图。
图8是表示从表达eTEV-NP1的HEK293T细胞的培养上清中，使用固定有2H5抗体的琼脂糖凝胶纯化eTEV-NP1的结果的图。
图9是表示从表达eTEV-EGFP的HEK293T细胞的培养上清中，使用固定有2H5抗体的琼脂糖凝胶纯化eTEV-EGFP的结果的图。
图10是表示从表达hGH-eTEV-sema6C的HEK293T细胞的培养上清中，使用固定有2H5抗体的琼脂糖凝胶纯化hGH-eTEV-sema6C的结果的图。
图11是表示从表达sema3A-eTEV的HEK293T细胞的培养上清中，使用固定有2H5抗体的琼脂糖凝胶纯化sema3A-eTEV的结果的图。
图12是表示GFPUV的标签肽融合蛋白的氨基酸序列的图。
图13是表示通过SDS凝胶电泳对使用固定有2H5抗体的琼脂糖凝胶纯化的eTEV-GFPUV进行分析的结果的图。
图14是表示对固定有2H5抗体的琼脂糖凝胶上结合的eTEV-GFPUV的洗脱条件(竞争性的肽浓度)进行研究的结果的图。
图15是表示对固定有2H5抗体的琼脂糖凝胶上结合的eTEV-GFPUV的洗脱条件(缓冲液的种类)进行研究的结果的图。
图16是表示靶标签与eTEV标签结合的双标签的氨基酸序列的图。
图17是表示通过夹心ELISA对双标签融合蛋白进行测定的结果的图。
图18是表示双标签融合蛋白用表达载体pCD-NW3的结构的图。
图19(a)是表示自分泌运动因子(autotaxin)高表达株的一次筛选结果的图。
图19(b)是表示自分泌运动因子高表达株的二次筛选结果的图。
图20是表示CRISPa高表达株的筛选结果的图。
图21(a)是表示Semaphorin(神经元导向因子)3A高表达株的一次筛选结果的图。
图21(b)是表示Semaphorin3A高表达株的二次筛选结果的图。
具体实施方式
[标签肽]
本发明的标签肽，只要含有针对该标签肽的抗体的表位和蛋白酶识别序列、并且该表位与该蛋白酶识别序列相重叠即可。表位与蛋白酶识别序列重叠的状态是指，从标签肽中除去表位的范围时蛋白酶无法识别(切割)该肽的状态，或者，从标签肽中除去蛋白酶识别序列时针对该标签肽的抗体无法识别(特异性结合)该肽的状态。更优选为从标签肽中除去表位的范围时蛋白酶无法识别(切割)该肽、并且从标签肽中除去蛋白酶识别序列时针对该标签肽的抗体无法识别(切割)该肽的状态。
因此，通过用蛋白酶对附加有本发明的标签肽的目标蛋白进行切割，能够使针对该标签肽的抗体无法识别目标蛋白，从而能够使目标蛋白成为不与抗体固定化载体等结合的状态。另外，能够通过是否与抗体结合来确认经过蛋白酶处理后标签肽是否被切割。这在标签肽被切割而难以看出分子量变化的情况下特别有利。
本发明的标签肽中，针对该标签肽的抗体的表位和蛋白酶识别序列，只要对应于上述的状态，有至少1个以上的氨基酸重叠即可，特别优选在表位的范围内包含蛋白酶识别序列的形态、在蛋白酶识别序列内包含表位的范围的形态、或者表位的范围与蛋白酶识别序列一致的形态。
融合有标签肽的目标蛋白中，不能否定标签肽会对目标蛋白的生物活性、结晶结构等产生某种影响，因此在利用标签肽对目标蛋白进行纯化后，需要将标签肽切除。如图1(a)所示，以往需要插入与标签肽(图1(a)中的“标签”)不同的蛋白酶识别序列(图1(a)中的“TEV”)。但是，如图1(b)所示，本发明的标签肽(图1(b)中的“eTEV”)包含蛋白酶识别序列，因此不需要另外插入蛋白酶识别序列。由此，能够飞跃性地简化构建体的设计，能够大幅减少构建体制作的时间和成本。另外，具有减小因标签序列部分过长而对蛋白质的功能产生预料外的不利影响的可能性的效果。
作为标签肽的切割中使用的蛋白酶，只要是不会将融合有标签肽的目标蛋白非特异性地切断的蛋白酶则没有特别限定。即，优选本发明的标签肽为具有蛋白酶识别序列的标签肽，其特征在于，识别、切割该蛋白酶识别序列的蛋白酶不会将融合有该标签肽的目标蛋白非特异性地切断。具体地，例如可举出TEV蛋白酶、人轮状病毒(HRV)蛋白酶、肠激酶(EK)、凝血酶(Tb)、第Xa因子(Xa)等。根据使用的蛋白酶，决定蛋白酶识别序列。需要说明的是，即使是通常以非特异性切割为特征的蛋白酶(例如，胰蛋白酶等仅识别1个氨基酸的蛋白酶)，在目标蛋白内不具有该蛋白酶的识别序列、仅在标签肽内包含该蛋白酶的识别序列的情况下，也能够作为本发明的标签肽的蛋白酶识别序列使用。
本发明的标签肽，优选具有以下的氨基酸序列(1)。
氨基酸序列(1)：RX1X2LYX3QGKDG(序列号1)
(X1、X2和X3相同或不同，表示任意的氨基酸残基)
氨基酸序列(1)是包含作为后述的2H5抗体的表位所必需的1位的R、4位的L、5位的Y、8位的G、9位的K、10位的D、11位的G、且包含TEV蛋白酶的识别序列ENLYFQG(序列号3)中作为底物而言非常重要的L、Y、Q的序列。上述氨基酸序列(1)中，X1没有特别限定，例如优选谷氨酸(E)。X2没有特别限定，例如优选天冬酰胺(N)。X3没有特别限定，例如优选苯丙氨酸(F)。
作为本发明的标签肽，特别优选为具有以下的氨基酸序列(2)的标签肽。
氨基酸序列(2)：RENLYFQGKDG(序列号2)
氨基酸序列(2)是上述氨基酸序列(1)中X1选择谷氨酸(E)、X2选择天冬酰胺(N)、X3选择苯丙氨酸(F)的序列。以下，将氨基酸序列(2)称为“eTEV序列”、将eTEV序列构成的肽称为“eTEV肽”、将eTEV肽构成的标签肽称为“eTEV标签”。需要说明的是，“eTEV肽”和“eTEV标签”中包含在N末端附加有来源于起始密码子的蛋氨酸的、由12个氨基酸构成的肽(MRENLYFQGKDG(序列号4))。
作为本发明的标签肽的另一实施方式，可举出由具有上述蛋白酶识别序列的标签肽与第二标签肽组合而成的标签肽。第二标签肽没有特别限定，可以适当选择公知的标签肽来使用。优选为被特异性抗体识别的标签肽。具体地，例如可举出FLAG标签、MYC标签、HA标签、V5标签等。另外，也可以适当使用本发明人开发的、具有将YPGQ(序列号5)重复3～5次的氨基酸序列的标签肽等作为第二标签肽。具有蛋白酶识别序列的标签肽与第二标签肽组合而成的标签肽，具有以下方面的特征：含有两种抗体的表位，两种抗体能够同时与标签肽结合，且一种抗体表位与蛋白酶识别序列重叠。具有蛋白酶识别序列的标签肽与第二标签肽可以直接结合，或者也可以插入有任意的间隔序列。以下，将该标签肽称为“双标签”。
如图2(a)所示，通常如果要使用两种抗体通过夹心ELISA检测或定量目标蛋白，需要使用两种标签肽(图2(a)中的“标签A”和“标签B”)，制作在各标签肽中插入蛋白酶识别序列(图2(a)中的“TEV”和“EK”)、并结合在例如目标蛋白的N末端和C末端上的标签肽融合蛋白的构建体。但是，如果使用双标签，则利用1个标签肽就可以进行夹心ELISA和标签肽的切割、除去。因此，能够飞跃性地简化构建体的设计，能够大幅减少构建体制作的时间和成本。另外，即使在N末端或C末端存在功能上非常重要的结构、无法附加标签的情形下，也能够通过在任意一个末端附加双标签来达到目的。
本发明的标签肽，可以利用基因工程学方法使其与任意的蛋白结合而得到标签肽与任意蛋白的融合蛋白。该情况下，可以使标签肽与蛋白的N末端和C末端中的任一末端结合。这样的N末端和C末端结合有标签肽的标签肽融合蛋白，可以使用与本发明的标签肽特异性结合的抗体以一个阶段高纯度地进行纯化。并且，能够将标签肽从纯化后的标签肽融合蛋白上容易地切割、除去。另外，能够使用上述抗体对标签肽融合蛋白进行检测、定量等。
本发明的标签肽，能够与任意的物质发生化学结合。本发明的标签肽所化学结合的物质，可以使用与本发明的标签肽特异性结合的抗体简便且高纯度地纯化，并且可以检测、定量等。本发明的标签肽化学结合的对象物质没有限定，例如可举出蛋白、核酸、糖类、有机高分子、金属等。
本发明的标签肽与任意蛋白的融合蛋白的制造方法的概略如下所述。
首先，通过公知的方法合成编码本发明的标签肽的多核苷酸。作为多核苷酸，可举出DNA、RNA，优选DNA。多核苷酸为DNA的情况下，可以利用DNA合成仪合成DNA。另外，DNA可以分成若干个部分进行合成后，再将它们连接。标签肽的DNA序列，因基因密码子的简并可能有很多种类，但只要由DNA表达的肽具有本发明的标签肽的氨基酸序列，则没有特别限定。作为编码eTEV标签的多核苷酸，例如可举出序列号6所示的碱基序列构成的DNA。另外，作为编码双标签的多核苷酸，例如可举出序列号7所示的碱基序列构成的DNA。
将编码目标蛋白的DNA连接到编码合成的标签肽的DNA的3’末端或5’末端。或者，在通过PCR等方法得到目标蛋白的DNA时，如果使用编码标签肽的DNA作为DNA的3’末端或5’末端的引物，则可以得到编码标签肽的DNA与目标蛋白的基因连接而成的基因作为PCR产物。
将所得到的包含编码标签肽和蛋白质的DNA的DNA适当插入表达载体中。作为载体，可以适当使用公知的表达载体(细菌来源、酵母来源、病毒来源等)，没有特别限定。表达载体中所含的启动子，只要是与表达中使用的宿主对应的适当的启动子即可。可以使用除此之外还含有增强子、剪接信号、多聚A附加信号、选择标记、复制起始点等的表达载体。将这样得到的表达载体导入宿主细胞中。作为宿主细胞没有特别限定，可以使用大肠杆菌、酵母等微生物；动物细胞等。优选的宿主细胞为动物细胞。将表达载体导入宿主细胞的方法，根据宿主细胞的种类从公知的转化中适当选择使用即可。将所得的重组微生物或细胞用适当的培养基培养，使其表达结合有标签肽的融合蛋白。结合有标签肽的融合蛋白，可以使用后述的抗体从重组微生物或细胞中、或者培养液中以一个阶段进行纯化。
上述标签肽融合蛋白的制造方法中说明的、编码本发明的标签肽的多核苷酸和包含该多核苷酸的重组载体也包含在本发明中。需要说明的是，本发明的重组载体不限于可表达标签肽与目标蛋白的融合蛋白(标签肽融合蛋白)的重组载体，只要是包含编码本发明的标签肽的多核苷酸的重组载体即可。
[抗体]
本发明提供针对上述本发明的标签肽的抗体。本发明的抗体，只要是识别具有本发明的蛋白酶识别序列的标签肽并具有特异性相互作用的抗体则没有特别限定。本发明的抗体可以通过以本发明的标签肽(含有蛋白酶识别序列的肽片段)为抗原、根据公知的方法免疫小鼠、兔等哺乳动物而得到。作为本发明的抗体的具体例，可举出以包含TEV蛋白酶的识别序列的11个氨基酸构成的肽(RENLYFQGKDC(序列号8))为抗原、免疫小鼠、兔等哺乳动物而得到的抗体。另外，可举出由大鼠-小鼠杂交瘤2H5(已在独立行政法人产业技术综合研究所专利生物保藏中心(日本茨城县筑波市东1丁目1番地1号中央第6(邮政编码305-8566))以FERM BP-11245的保藏编号完成国际保藏。保藏日：2008年10月31日)产生的单克隆抗体。另外，也可以将该单克隆抗体的抗原识别区域用蛋白酶等切出，作为Fv、Fab、F(ab’)2使用。另外，也可以从杂交瘤中克隆出抗体基因，重组到适当的载体中，将其导入宿主，使用基因重组技术使其产生重组型的单克隆抗体。需要说明的是，产生本发明的抗体的大鼠-小鼠杂交瘤2H5(FERM BP-11245)也包含在本发明中。
[蛋白纯化方法]
本发明提供使用上述本发明的抗体的蛋白纯化方法。本发明的蛋白纯化方法，只要是包括以下的(i)～(iii)的步骤的方法即可。本发明的抗体可与具有本发明的蛋白酶识别序列的标签肽特异性相互作用，因此如果使用该抗体，则能够以一个阶段高纯度地纯化本发明的标签肽与任意蛋白的融合蛋白，并且能够容易地将标签切除。
(i)使本发明的抗体与含有本发明的标签肽和目标蛋白的融合蛋白的试样作用而形成融合蛋白与抗体的结合物的步骤；
(ii)使洗脱物质与所述(i)的步骤中得到的结合物作用而使融合蛋白从抗体中游离的步骤；
(iii)从所述(i)的步骤中得到的融合蛋白上切除标签肽的步骤。
(i)的步骤中，试样只要含有本发明的标签肽与目标蛋白的融合蛋白则没有特别限定。例如可举出表达该融合蛋白的转化细胞的培养上清、细胞裂解液等。在融合蛋白以包涵体等不溶性级分的形式而得到的情况下，可以适当进行蛋白的可溶化和折叠(复性)。试样优选通过离心分离等除去固体成分，根据需要优选将pH调节为中性(7～8)。另外，试样中的目标蛋白的浓度优选为0.2μg/mL以上。
在(i)的步骤中，优选使用将本发明的抗体固定到载体上而得到的固定化抗体。作为固定抗体的载体，只要能够发挥本发明的效果则没有特别限定，可以使用公知的载体。例如优选琼脂糖凝胶(GE healthcare公司)、Affi-Gel(BIO-RAD公司)等。将抗体固定到载体上的方法根据载体的种类等适当选择即可，没有特别限定。例如，使用琼脂糖凝胶的情况下，可以通过将抗体用偶联缓冲液透析、然后将CNBr活化的琼脂糖凝胶(GE healthcare)和抗体在室温下混合约1～2小时来制作琼脂糖凝胶固定化抗体。
本发明的蛋白纯化方法中，以下方法均可使用：将上述固定化抗体填充到柱中来使用的柱法、与试样混合以悬浊状态进行结合的批处理(バツチ)法。前者的情况下，将固定化抗体填充到柱中，向柱上注入试样以使本发明的抗体与标签肽作用。由此，标签肽与抗体结合，形成标签肽融合蛋白与抗体的结合物。后者的情况下，在每10mL试样溶液中加入约100μL的固定化抗体，轻轻混和，形成融合蛋白与抗体的结合物后填充到柱中。
然后，在(ii)的步骤中，使洗脱物质与所述(i)的步骤中得到的结合物作用，从而使标签肽融合蛋白从抗体上游离。即，通过使洗脱物质与结合物作用而使抗体与标签肽解离，从而使通过标签肽与固定化抗体结合的标签肽融合蛋白从抗体上游离出来。作为洗脱物质，只要是具有使本发明的标签肽与本发明的抗体的结合解离的作用的物质即可。作为这样的物质，可举出多元醇等亲水性有机溶剂、本发明的标签肽等。
作为使洗脱物质与标签肽融合蛋白和抗体的结合物作用的方法，优选将洗脱物质与水或适当的缓冲液混合制成洗脱液并将该洗脱液注入到柱上的方法。该情况下，借助洗脱液中的洗脱物质从抗体上游离的标签肽融合蛋白，与洗脱液一起从柱上洗脱下来。水或缓冲液根据蛋白的种类选择即可。
洗脱液中的洗脱物质的含量优选根据目标标签肽融合蛋白、洗脱物质的种类等适当变更。例如，使用亲水性有机溶剂作为洗脱物质的情况下，将水或缓冲液与亲水性有机溶剂的总体积设为100，则优选混合约30％(v/v)以上的亲水性有机溶剂，更优选混合约40％(v/v)以上的亲水性有机溶剂。水或缓冲液与亲水性有机溶剂的体积比(水或缓冲液∶亲水性有机溶剂)优选设定为约70∶30～30∶70。此时缓冲液中优选含有高浓度的盐、例如2M的NaCl。
以标签肽作为洗脱物质的情况下，优选以水或缓冲液中标签肽浓度为约0.01～2mg/mL的方式制备洗脱液。更优选为约0.03～1mg/mL。作为洗脱物质的标签肽，只要是本发明的标签肽则没有限定。本发明的标签肽可以通过公知的肽合成法来制造。
标签肽融合蛋白纯化后的固定化抗体，通过用含有洗脱物质的洗脱液充分清洗，可以重复使用。
然后，在(iii)的步骤中，从所述(ii)的步骤中得到的标签肽融合蛋白上切除标签肽。即，使识别本发明的标签肽中所含的蛋白酶识别序列的蛋白酶在适当的条件作用，由此能够得到未结合标签肽的目标蛋白。
在本发明的蛋白的纯化方法中，标签肽与抗体发生特异性相互作用，该相互作用通过标签肽、亲水性有机溶剂等洗脱物质可以容易地解离，因此能够以一个阶段高纯度地纯化标签肽融合蛋白。另外，由于使用亲水性有机溶剂等作为洗脱物质，因此能够在不使标签肽融合蛋白和抗体变性的情况下进行纯化。并且，能够将标签肽从标签肽融合蛋白上切割、除去。因此，根据本发明，可以期待能够简便地获得充分量的用于X射线结晶结构分析的高品质且已除去标签肽的重组蛋白。
[蛋白的检测或定量方法]
通过使用本发明的标签肽和本发明的抗体，能够进行目标蛋白的检测或定量。特别是通过使用双标签，即使在无法容易地得到针对目标蛋白的抗体的情况下，也能够实施夹心ELISA，从而能够检测极微量的目标蛋白。并且，能够高精度地比较多个试样中的目标蛋白的含量。使用夹心ELISA检测或定量双标签与目标蛋白的融合蛋白(以下，称为“双标签融合蛋白”)时，使用针对具有本发明的蛋白酶识别序列的标签肽的抗体(本发明的抗体)和针对第二标签肽的抗体两种抗体，可以使用任一种抗体作为捕获抗体，使用另一种抗体作为检测抗体。试样只要含有双标签融合蛋白则没有特别限定。例如可举出表达双标签融合蛋白的转化细胞的培养上清、细胞裂解液等。
使用夹心ELISA检测或定量双标签融合蛋白的步骤的概略如下所述。
1)预先通过某种手段对检测抗体进行修饰或标记。修饰或标记手段没有特别限定，例如可举出生物素化、过氧化物酶等酶标记、荧光素等荧光色素标记、125I等放射性同位素标记等。
2)将捕获抗体固相化于微孔板上。
3)在固相化的捕获抗体上注入含有双标签融合蛋白的试样，使双标签融合蛋白被捕获抗体捕获。
4)然后，使检测抗体与捕获的双标签融合蛋白作用，形成双标签融合蛋白与检测抗体的结合物。将检测抗体进行酶标记而使用的情况下，接着进行6)的操作。
5)将检测抗体进行生物素化而使用的情况下，使酶标记的链霉亲和素与所形成的结合物作用，使抗体中的生物素与链霉亲和素结合。
6)加入酶的发色或发光底物(例如，如果是过氧化物酶则为ABTS)。通过酶使底物分解可以得到发色反应产物，因此通过测定试样的吸光度可以检测双标签融合蛋白与检测抗体的结合物。另外，由于吸光度与试样中的双标签融合蛋白的质量定量相关，因此可以对双标签融合蛋白与抗体的结合物进行定量。另外，该情况下通过与发色底物一起并用底物增敏剂，可以提高检测灵敏度。
通过蛋白免疫印迹法可以检测目标蛋白。该情况下，标签肽可以是双标签，也可以是不具有第二标签肽的标签肽。以下，说明蛋白免疫印迹法的步骤的概略。
1)将包含本发明的标签肽与目标蛋白的融合蛋白的试样供于SDS电泳，分离标签肽融合蛋白，并转印到硝酸纤维素膜或PDVF膜上。
2)使本发明的抗体与膜上的融合蛋白作用，形成结合物。将本发明的抗体进行酶标记而使用的情况下，接着进行4)的操作。
3)在本发明的抗体未用酶标记的情况下，进一步使与2)中加入的抗体发生特异性反应的抗体(酶标记抗体：二次抗体)进行作用。
4)加入酶的底物(通常为发色或发光底物)，并检测酶反应的生成物。
本发明的标签肽和本发明的抗体，也可以应用于荧光抗体法、免疫沉淀法等、以及检测试剂的开发、细胞成像、传感器开发等。
[试剂盒]
本发明提供用于蛋白的表达、纯化、检测或定量的试剂盒。本发明的试剂盒，只要包含本发明的重组载体或本发明的抗体即可。通过使用本发明的试剂盒，可以简便地进行蛋白的表达、纯化、检测或定量。表达用试剂盒中必须包含本发明的重组载体，纯化、检测或定量用试剂盒中必须包含本发明的抗体。优选同时包含本发明的重组载体和本发明的抗体两者的试剂盒。
表达用试剂盒中所含的重组载体，优选以如下形态提供：试剂盒的使用者通过在其中重组入编码目标蛋白的DNA，能够制作本发明的标签肽与目标蛋白结合而成的标签肽融合蛋白的表达载体。使用者通过将制作的表达载体导入适当的宿主细胞并对宿主细胞进行培养，能够简便地表达所期望的标签肽融合蛋白。纯化用试剂盒中优选以固定化于适当的载体上的状态包含本发明的抗体。另外，优选包含用于切割标签肽的蛋白酶。更优选将表达用试剂盒与纯化用试剂盒组合，得到表达和纯化用试剂盒。
检测或定量用试剂盒中，优选包含本发明的抗体和针对构成双标签的第二标签肽的抗体。另外，本发明的抗体和针对第二标签肽的抗体中的任意一者优选以进行了适当的标记(酶标记、放射性标记、荧光标记等)或修饰(生物素化等)的状态含有。另外，试剂盒中还可以包含二次抗体、反应用缓冲液、底物、使用说明书等构成。
实施例
以下，通过实施例详细地说明本发明，但本发明不限于这些实施例。
[实施例1：单克隆抗体制作]
抗eTEV肽抗体通过常规方法如下制作。
(1-1)肽的合成、免疫
通过Fmoc固相法，合成含有TEV蛋白酶的识别序列(ENLYFQG(序列号3))、并且在其两侧进一步附加有带电氨基酸、由11个氨基酸构成的肽(RENLYFQGKDC(序列号8))。使利用反相HPLC纯化后的eTEV肽通过C末端的Cys残基与载体蛋白匙孔
Figure BDA0000101479780000161
血蓝蛋白(keyhole limpet hemocyanin，KLH)结合，将其作为免疫原。通过将该eTEV肽-KLH复合体与佐剂一起对大鼠(SD、雌性、8周龄)的两足底皮下给药(单足100μL、总计200μL/只)而进行免疫。免疫2周后，通过ELISA法测定抗体效价，结果得到高抗体效价。将自该大鼠取出的髂骨淋巴细胞用于融合。
(1-2)细胞融合、杂交瘤建立
将上述大鼠淋巴细胞与小鼠骨髓瘤细胞(SP2/0株)通过聚乙二醇法融合后，用HAT选择培养基培养。通过ELISA法筛选产生群落的孔的上清，并对强阳性的孔进行二次筛选。在二次筛选中，使用后述的融合蛋白质(TEV-Fn)作为抗原。其结果是，得到反应性高的一个克隆。将该克隆用有限稀释法进行克隆，最后建立了产生抗eTEV抗体的杂交瘤2H5(已在独立行政法人产业技术综合研究所专利生物保藏中心(日本茨城县筑波市东1丁目1番地1号中央第6(邮政编码305-8566))以FERM BP-11245的保藏编号完成国际保藏。保藏日：2008年10月31日)。
(1-3)抗体的纯化、琼脂糖凝胶固定化抗体的制备
(1)抗体的纯化
将1-2中建立的杂交瘤2H5在含有10％胎牛血清的RPMI1640培养基中培养。使用蛋白G琼脂糖凝胶从该培养上清中纯化2H5抗体。纯化抗体的同种型为IgG2a，轻链为κ。
(2)琼脂糖凝胶固定化抗体的制备
将纯化IgG(约20mg)于偶联缓冲液(0.1M NaHCO3、0.3M NaCl、pH8.3)中透析。然后，与用1mM盐酸清洗过的CNBr活化的琼脂糖凝胶4B(GE healthcare)在室温下混合1小时，由此制作琼脂糖凝胶固定化抗体。用0.1M Tris封闭未反应的活性基，利用pH 2.2、0.1M的Gly-HCl除去非特异性结合的抗体。由未结合的抗体的定量结果可知，每1mL琼脂糖凝胶树脂能够固定约2mg的2H5抗体。
[实施例2：标签序列融合蛋白的制作]
(2-1)利用大肠杆菌表达用构建体的标签序列融合蛋白的制作
使用表达人纤连蛋白的第9-第10Fn3结构域部分的185个残基的构建体，制作在其N末端附加有图3所示的各种TEV来源的序列(包含eTEV序列)的标签序列融合蛋白。通过延伸PCR(extension PCR)制作插入片段，并插入表达载体pET11c(Novagen)的NdeI-BamHI位点中。另外，使用QuickChange突变试剂盒(Stratagen)制作Ala突变体的构建体。将所得的构建体转化到大肠杆菌BL21(DE3)株中，按照常规方法进行诱导表达。融合蛋白从大肠杆菌可溶物中通过阴离子交换层析(TEV-Fn)或Ni-NTA琼脂糖层析(His-eTEV-Fn等)进行纯化。
(2-2)利用动物细胞表达用构建体的标签序列融合蛋白的制作
哺乳类细胞中的表达用载体使用pCDNA3.1(Invitrogen)或人生长因子(hGH)融合表达载体(pSGHV0、由D.Leahy教授提供)。通过延伸PCR将各种靶蛋白的DNA片段与编码eTEV序列的碱基序列融合，并插入到上述载体的克隆位点中。将制作的质粒转染到人成纤维细胞株HEK293T中，将所得到的培养上清用于沉降(pull down)实验等。
[实施例3：单克隆抗体2H5的性状分析]
(3-1)表位的分析
通过使用上述(2-1)中制作的各种eTEV-Fn融合蛋白的ELISA法，研究被单克隆抗体2H5(以下称为“2H5抗体”)识别所需的最小的肽序列。操作规程如下所述。
(1)将稀释为10μg/mL的His-eTEV-Fn融合蛋白(野生型或各Ala突变体)溶液50μL加入到96孔板中并静置(4℃、16小时)。
(2)用抽吸器抽吸，以200μL/孔加入5％脱脂奶粉的三羟甲基氨基甲烷缓冲盐溶液(TBS、20mM Tris-HCl、150mM NaCl pH7.5)，并在室温下静置1小时。
(3)加入50μL 0.01-30μg/mL的2H5抗体并在室温下静置1小时。
(4)用200μL/孔的TBS洗涤3次。
(5)加入50μL过氧化物酶标记的抗大鼠IgG(1/1000稀释)并在室温下静置30分钟。
(6)用200μL/孔的TBS洗涤4次。
(7)以100μL/孔加入过氧化物酶发色底物(ABTS)，在室温下静置5～10分钟后，测定各孔中的溶液的405nm的吸光度。
2H5抗体是针对11个残基的合成肽(RENLYFQGKDC(序列号8))而制作的(参照实施例1)，由于C末端的Cys残基用于与KLH的反应，因此对于抗原识别而言重要的残基原理上应该是除C末端的Cys残基以外的内部的10个残基。但是，由于与最初作成的筛选用融合蛋白TEV-Fn(在上述10个残基的两端存在Met和Gly、参照图3)的结合非常强，因此为进行确认，也制作了其两末端的氨基酸(Met0和Gly11)的Ala突变体，并进行了分析。结果示于图4。由图4可知，关于Ala突变体与2H5抗体的反应性分成3组。第一组的反应性与野生型的eTEV肽相比完全没有变化(M0、E2、N3、F6和Q7)。第二组虽然有反应性但与野生型相比降低100倍以上(R1和G11)。第3组几乎完全丧失反应性(L4、Y5、G8、K9和D10)。该结果表明，2H5抗体识别抗原肽的11个残基(RENLYFQGKDG(序列号2))这样极长的区域并进行结合。由此说明：通常，抗肽抗体识别的是几个残基，但2H5抗体作为抗肽抗体具有极特殊的抗原结合部位。
(3-2)2H5抗体的抗原识别部位与TEV蛋白酶的识别特异性的关系
eTEV肽可被TEV蛋白酶识别、切割。使用为确定2H5抗体的表位而制作的一系列的Ala突变体，鉴定被TEV蛋白酶识别所必需的氨基酸残基。具体而言，将His-eTEV-Fn融合蛋白(野生型或Ala突变体)以400μg/mL的浓度溶解于TBS，向其中添加1/10量的TEV蛋白酶，在20℃下反应16小时。加入SDS使反应停止，将全部反应液供于15％的SDS聚丙烯酰胺凝胶电泳，用考马斯亮蓝进行染色。切割前的底物蛋白显示分子量24kDa的迁移率，用TEV蛋白酶切割时会移动到20kDa的位置，基于此对切割进行评价。
结果示于图5。由图5可知，为了成为TEV蛋白酶的底物，第4、5和7位的氨基酸(即Leu、Tyr、Gln)是很重要的，其他残基即使是Ala也没有影响。该结果与已被Dougherty等人(EMBO J.，7，1281-1287，1988)报道的识别特异性基本一致，但可以得到如下的Dougherty等人的报道中没有的新发现：即使将第二位的Glu变为Ala对切割也没有大的变化；第4位的Leu残基不允许像Ala这样具有小的氨基酸侧链。重要的发现是：Gln7对于TEV蛋白酶的识别是重要的但对于2H5抗体的识别是不需要的，这表明通过改变第7位的残基能够改变肽的性质而使蛋白酶与抗体从双重识别模式变为单一识别模式。
(3-3)结合亲和性
为了研究2H5抗体对eTEV肽的结合亲和性，利用Biacore进行表面等离子共振分析。将2H5抗体固定化于CM5传感器芯片上，注入31、62、125、250、500、1000μM各浓度的eTEV-Fn融合蛋白并记录其传感图(参照图6)。利用BIAevaluation 3.0程序由图6所示的浓度依赖性测定亲和性，结果得到40nM的表观解离平衡常数，可知2H5抗体对eTEV肽的亲和性比较高。
(3-4)在蛋白免疫印迹法中的应用
将eTEV-Fn融合蛋白以0.63-10ng/泳道供于SDS电泳，转印到PDVF膜上后，与1μg/mL的2H5抗体反应，接着利用过氧化物酶标记的抗大鼠IgG和化学发光底物进行检测。为进行比较，将相同量的FLAG肽融合蛋白供于电泳，用抗FLAG抗体M2(Sigma-Aldrich公司)进行检测。结果示于图7。由图7可知，2H5抗体在蛋白免疫印迹法中能够检测约2ng(0.08pmol)以上的eTEV肽融合蛋白，其灵敏度与市售的FLAG/M2系统匹敌。
[实施例4：使用固定有2H5抗体的琼脂糖凝胶的标签序列融合蛋白的沉降]
为了将eTEV标签用于重组蛋白的纯化，必须能够将目标蛋白从表达细胞的培养上清或大肠杆菌的可溶物这样的混合物中特异性捕捉出来。为了用各种构建体对其进行研究，进行了沉降实验。
(实验方法)
将各种附加有eTEV标签的构建体在HEK293T细胞中瞬时表达，在其培养上清1mL中加入20μL的固定有2H5抗体的琼脂糖凝胶(以下称为“2H5琼脂糖凝胶”)或未固定2H5抗体的琼脂糖凝胶(对照)，并在4℃下反应1小时。通过离心使2H5琼脂糖凝胶沉降，用TBS洗涤2次后，用SDS上样缓冲液洗脱，并直接利用SDS凝胶电泳进行分析。其中，根据目标蛋白的分子量使用不同的丙烯酰胺浓度的凝胶。电泳后的凝胶通过考马斯亮蓝或银染色使蛋白可视化。使用的附加有eTEV标签的构建体如下所示。
(1)eTEV-NP1：由N末端具有eTEV标签的、小鼠的神经纤毛蛋白1的a1a2结构域(251个残基)构成的构建体
(2)eTEV-EGFP：由N末端具有eTEV标签的、增强GFP(241个残基)构成的构建体
(3)hGH-eTEV-sema6C：N末端具有人生长激素(hGH)、中央具有eTEV标签、C末端侧具有大鼠Semaphorin6C(sema6C)的构建体
(4)sema3A-eTEV：在小鼠Semaphorin3A(sema3A)的C末端侧具有eTEV标签的构建体
(1)eTEV-NP1的结果示于图8、(2)eTEV-EGFP的结果示于图9、(3)hGH-eTEV-sema6C的结果示于图10、(4)sema3A-eTEV的结果示于图11。图8～11中，M表示分子量标志物，2H5表示添加有2H5琼脂糖凝胶的试样，Cont.表示添加有对照的试样。箭头表示目标蛋白的条带。由图8～11可知，在所研究的所有构建体中，附加有标签的蛋白均与2H5琼脂糖凝胶特异性结合。值得注意的是，无论eTEV标签附加在目的基因的N末端(eTEV-NP1、eTEV-EGFP)、中央(hGH-eTEV-sema6C)、C末端(sema3A-eTEV)的任何位置，均不影响沉降。这表明：2H5识别eTEV序列时，基本不受其前后的结构的影响。
[实施例5：利用2H5琼脂糖凝胶的eTEV标签融合蛋白的纯化]
(5-1)纯化效率的研究
使用2H5琼脂糖凝胶，对绿色荧光蛋白的一种GFPUV的eTEV标签融合蛋白(以下也称为“eTEV-GFPUV”)进行一阶段纯化。GFPUV是为易于用UV灯等进行荧光观察而使激发波长偏移到短波长侧的GFP的突变体。将编码N末端具有P4×3标签、接着是eTEV序列、然后是238个氨基酸构成的GFPUV、进而附加有组氨酸标签的融合蛋白(参照图12、序列号9)的融合基因的构建体重组到大肠杆菌用表达载体pET11b中。
用上述表达载体转化大肠杆菌BL21(DE3)株，按照常规方法进行诱导表达。使其可溶性级分1mL在4℃下通过2H5琼脂糖凝胶(0.5mL柱床体积)，使其结合。将未结合的蛋白用TBS洗涤后，用含有100μg/mL的eTEV肽的TBS洗脱。每一级分的体积为0.5mL。将大肠杆菌破碎物的可溶性级分、以及洗涤和洗脱级分的各样品供于SDS凝胶电泳。
结果示于图13。图13中ori表示大肠杆菌破碎物的可溶性级分。泳道1～5表示洗涤级分的样品、6～10表示洗脱级分的样品。由图13可知，GFPUV在大肠杆菌破碎物的可溶性级分中作为30kDa附近的条带被确认(图13的箭头)。并且，通过利用2H5琼脂糖凝胶进行的亲和层析，能够以一个阶段完全地纯化GFPUV。通过测定各级分的荧光(Ex490nm/Em520nm)来计算收率，可知表达的GFPUV的约93％被回收至洗脱级分中。
(5-2)洗脱条件的研究
对从2H5琼脂糖凝胶上洗脱eTEV-GFPUV时的缓冲液的条件进行研究。首先，研究用于竞争性洗脱的肽的浓度条件。与上述(5-1)同样，使表达eTEV-GFPUV的大肠杆菌的可溶性级分通过2H5琼脂糖凝胶，用TBS洗涤未结合的蛋白后，用含有0～1000μg/mL各浓度的eTEV肽的TBS洗脱。
结果示于图14。图14中，M表示分子量标志物，ori表示大肠杆菌破碎物的可溶性级分。由图14可知，eTEV肽在30μg/mL的低浓度下就能够将eTEV-GFPUV从2H5琼脂糖凝胶上完全洗脱。通常，如果考虑到从抗肽抗体树脂上竞争性的洗脱时使用100～500μg/mL的肽溶液，则暗示使用2H5抗体的eTEV标签蛋白的纯化系统能够极廉价地进行构建。
接着，使用含有水溶性的有机溶剂、离液离子(カオトロピックイオン)的缓冲液，研究各自的洗脱能力。结果示于图15。使用的缓冲液如下所示。
泳道1：含有0.1mg/mL的eTEV肽的TBS
泳道2：40％丙二醇+2M NaCl
泳道3：40％丙二醇+2M NaI
泳道4：2M NaI
泳道5：0.1M Gly-HCl，pH3.0
由图15可知，在40％丙二醇+2M NaCl的条件下可以观察到eTEV-GFPUV从2H5琼脂糖凝胶上洗脱(泳道2)，其效率为用含有0.1mg/mL的eTEV肽的TBS洗脱(泳道1)的50％左右。用含有作为离液离子的碘化物离子的2M的碘化钠洗脱时则非常少(泳道4)。在pH3.0的酸性条件下可以观察到接近100％的洗脱(泳道5)，但在该条件下观察到抗体从2H5琼脂糖凝胶上解离(图15中的※标记所示的条带)，可知在抗体柱的重复使用方面存在问题。
由以上结果可知，纯化时为了从2H5琼脂糖凝胶上洗脱目标eTEV标签融合蛋白，使用30μg/mL以上的eTEV肽溶液即可，为了树脂的再生，使用含有40％丙二醇和2M NaCl的中性缓冲液即可。并且确认：完全的树脂再生可以通过注入约100倍柱量的上述缓冲液而得到。
[实施例5：与其他标签组合的双标签系统的构建]
通过将eTEV标签与其他肽标签连接而形成连续的“双标签”，可以使重组蛋白的纯化、夹心ELISA等简易化。于是，为了确认该结论，设计了图16所示的靶标签与eTEV标签结合而成的33个氨基酸的标签序列(序列号10、以下称为“W标签”)，对融合有该标签的蛋白进行表达。W标签与GFPUV或Fn的N末端融合，将它们在大肠杆菌中表达、纯化后，按照以下要领进行夹心ELISA。
即，将作为抗靶标签抗体的P20.1抗体(小鼠IgG)10μg/mL固相化于微孔板中，封闭后，将纯化的W标签融合GFPUV(W-GFPUV)或W标签融合Fn(W-Fn)稀释至0.003～3μg/mL的浓度加入孔中，在4℃捕获过夜。洗涤后，使生物素化2H5抗体(5μg/mL)在室温反应30分钟，洗涤3次后，加入过氧化物酶标记的链霉亲和素(Zymed)，再在室温静置15分钟，加入过氧化物酶底物(ABTS)，测定405nm的吸光度。
结果示于图17。由图17可知，附加有W标签的两种蛋白在使用两种抗体的夹心ELISA中，均提供良好的浓度依赖性信号，能够以1μg/mL以下的浓度对其进行定量。这表明，两种抗体能够同时与相邻的标签序列结合。但是，W-GFPUV与W-Fn的夹心ELISA的浓度依赖性存在3倍左右的差，由此暗示，作为融合伴侣的蛋白的性质、结构可能对P20.1抗体或2H5抗体与标签序列的结合产生影响。
可以确认，对于上述W标签融合蛋白，在利用P20.1抗体或2H5抗体进行亲和纯化和利用TEV蛋白酶进行切割方面，与单标签时同样地能够实现，结论是W标签能够如期地兼具两种作用。
[实施例7：使用W标签的稳定表达细胞的快速筛选]
构建W标签融合蛋白的表达载体，转染到HEK392T细胞或HEK293SGnT 1-细胞中，并进行目标蛋白高表达株的筛选。表达载体使用pCD-NW3(参照图18)。培养基使用添加有1mg/mL G418的含10％胎牛血清的DMEM培养基。筛选使用与实施例6同样的夹心ELISA进行。具体而言，将P20.1抗体10μg/mL固相化于微孔板中，封闭后，将培养上清加至孔中，在4℃温育过夜进行捕获。洗涤后，使生物素化2H5抗体(5μg/mL)在室温反应30分钟，洗涤3次后加入过氧化物酶标记的链霉亲和素(Zymed)，再在室温静置15分钟，加入过氧化物酶底物(ABTS)，测定405nm的吸光度。
(7-1)自分泌运动因子(Autotaxin、癌细胞转移促进因子)表达细胞
构建在自分泌运动因子的N末端融合有W标签的表达载体，并转染到HEK293SGnT1-细胞中。培养20天后选择G418耐性细胞，对所得到的克隆进行一次筛选。一次筛选的结果示于图19(a)。选择表达量高的3个克隆(5G3、5H11、3C11)，进行二次筛选。在二次筛选中，对于各克隆，以10倍稀释的培养上清、3倍稀释的培养上清和未稀释的培养上清作为试样。二次筛选的结果示于图19(b)。根据二次筛选的结果，选择克隆5G3作为自分泌运动因子高表达株。
(7-2)CRISPa(富半胱氨酸分泌蛋白A、来源于蛇毒的血管透过性促进因子)表达细胞
构建在CRISPa的N末端融合有W标签的表达载体，并转染到HEK392T细胞中。培养12天后选择G418耐性细胞，对所得到的克隆进行筛选。筛选的结果示于图20。根据筛选的结果，选择克隆#17作为CRISPa高表达株。
(7-3)Semaphorin3A(Semaphorin 3A、神经元导向因子)表达细胞
构建在Semaphorin3A的N末端融合有W标签的表达载体，并转染到HEK392T细胞中。培养14天后选择G418耐性细胞，对所得到的克隆进行一次筛选。一次筛选的结果示于图21(a)。选择表达量高的3个克隆(1A2、1B3、2F3)，进行二次筛选。在二次筛选中，对于各克隆，以10倍稀释的培养上清、3倍稀释的培养上清和未稀释的培养上清作为试样。二次筛选的结果示于图21(b)。根据二次筛选的结果，选择克隆2F3作为Semaphorin3A高表达株。
由以上可知，即使在无法容易地获得目标蛋白的抗体的情况下，通过使用W标签，也能够高精度地检测、比较目标蛋白的表达量，能够简便地选择目标蛋白的高表达株。
需要说明的是，本发明不限于上述的各实施方式和实施例，可以在权利要求书所示的范围内进行各种变更，将不同实施方式中分别公开的技术手段适当组合而得到的实施方式也包含在本发明的技术范围内。另外，本说明书中记载的全部学术文献和专利文献均作为参考引入本说明书中。
产业实用性
本发明可以用于能够通过容易的操作高纯度且廉价地纯化重组蛋白的系统，对于利用重组蛋白的产业、例如医药品产业、研究试剂产业、食品产业等有用。
保藏编号
杂交瘤2H5FERM BP-11245
Figure IDA0000101479900000011
Figure IDA0000101479900000021
Figure IDA0000101479900000031
Figure IDA0000101479900000041
Figure IDA0000101479900000051
Figure IDA0000101479900000061

Claims (13)

1.一种标签肽，具有蛋白酶识别序列，其特征在于，该蛋白酶识别序列与针对该标签肽的抗体的表位重叠。
2.一种标签肽，具有蛋白酶识别序列，其特征在于，该蛋白酶识别序列与针对该标签肽的抗体的表位重叠，该蛋白酶识别序列为烟草蚀纹病毒(TEV)蛋白酶识别序列。
3.如权利要求1或2所述的标签肽，其特征在于，具有以下的氨基酸序列(1)：
(1)RX1X2LYX3QGKDG(序列号1)
X1、X2和X3相同或不同，表示任意的氨基酸残基。
4.如权利要求3所述的标签肽，其中，氨基酸序列(1)为以下的氨基酸序列(2)：
(2)RENLYFQGKDG(序列号2)。
5.一种标签肽，其特征在于，由权利要求1～4中任一项所述的标签肽和第二标签肽组合而成。
6.如权利要求5所述的标签肽，其特征在于，能够同时结合针对权利要求1～4中任一项所述的标签肽的抗体和针对第二标签肽的抗体。
7.一种多核苷酸，其特征在于，编码权利要求1～6中任一项所述的标签肽。
8.一种重组载体，其特征在于，含有权利要求7所述的多核苷酸。
9.针对权利要求1～4中任一项所述的标签肽的抗体。
10.如权利要求8所述的抗体，其为由保藏编号为FERM BP-11245的大鼠-小鼠杂交瘤2H5产生的单克隆抗体。
11.大鼠-小鼠杂交瘤2H5，保藏编号为FERM BP-11245。
12.一种蛋白的纯化方法，其中，包括下述(i)～(iii)的步骤：
(i)使权利要求9或10所述的抗体与含有权利要求1～4中任一项所述的标签肽和目标蛋白的融合蛋白的试样作用而形成融合蛋白与抗体的结合物的步骤；
(ii)使洗脱物质与所述(i)的步骤中得到的结合物作用而使融合蛋白从抗体中游离的步骤；
(iii)从所述(ii)的步骤中得到的融合蛋白上切除标签肽的步骤。
13.一种试剂盒，用于表达、纯化、检测或定量蛋白，其中，包含权利要求8所述的重组载体或者权利要求9或10所述的抗体。
CN2010800180432A 2009-04-22 2010-04-21 具有蛋白酶识别序列的标签肽及其应用 Pending CN102414218A (zh)

Applications Claiming Priority (3)

Application Number Priority Date Filing Date Title
JP2009103925 2009-04-22
JP2009-103925 2009-04-22
PCT/JP2010/057028 WO2010123013A1 (ja) 2009-04-22 2010-04-21 プロテアーゼ認識配列を有するタグペプチドおよびその利用

Publications (1)

Publication Number Publication Date
CN102414218A true CN102414218A (zh) 2012-04-11

Family

ID=43011130

Family Applications (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
CN2010800180432A Pending CN102414218A (zh) 2009-04-22 2010-04-21 具有蛋白酶识别序列的标签肽及其应用

Country Status (5)

Country Link
US (1) US8481310B2 (zh)
EP (1) EP2423218B1 (zh)
JP (1) JPWO2010123013A1 (zh)
CN (1) CN102414218A (zh)
WO (1) WO2010123013A1 (zh)

Cited By (2)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN110950960A (zh) * 2019-11-26 2020-04-03 中国农业大学 基于高通量测序和杂合杂交瘤技术的小分子化合物抗体的制备方法
WO2022077551A1 (zh) * 2020-10-13 2022-04-21 南开大学 一种通过免疫沉淀分离和检测蛋白质的方法

Families Citing this family (2)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
JP2012140331A (ja) * 2010-12-28 2012-07-26 Tosoh Corp タグペプチド
US9270344B2 (en) * 2013-02-01 2016-02-23 Creating Revolutions, LLC Combination process interaction

Family Cites Families (7)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CA2263784A1 (en) 1998-03-23 1999-09-23 Megabios Corporation Dual-tagged proteins and their uses
WO2000009716A1 (en) 1998-08-17 2000-02-24 Europäisches Laboratorium für Molekularbiologie (EMBL) Method for purifying proteins and/or biomolecule or protein complexes
JP2002542261A (ja) * 1999-04-15 2002-12-10 メルク フロスト カナダ アンド カンパニー カスパーゼにより切断されたａｐｐを認識する抗体及びその使用法
US7592008B2 (en) 2000-11-20 2009-09-22 The Board Of Trustees Of The University Of Illinois, A Body Corporate And Politic Of The State Of Illinois Membrane scaffold proteins
EP1874798A1 (en) 2005-04-15 2008-01-09 Novo Nordisk A/S Basic protein purification tags from thermophilic bacteria
JP4891581B2 (ja) 2005-09-02 2012-03-07 ゼライス株式会社 ポリペプチドの製造方法およびキット
JP5257997B2 (ja) 2008-01-31 2013-08-07 国立大学法人大阪大学 タグペプチド及びその利用

Non-Patent Citations (3)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Title
A. EINHAUER 等: "The FLAGTM peptide, a versatile fusion tag for the purification of recombinant proteins", 《J. BIOCHEM. BIOPHYS. METHODS》 *
DAVID S. WAUGH: "Making the most of affinity tags", 《TRENDS IN BIOTECHNOLOGY》 *
OSCAR PUIG 等: "The Tandem Affinity Purification (TAP) Method:A General Procedure of Protein Complex Purification", 《METHODS》 *

Cited By (3)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN110950960A (zh) * 2019-11-26 2020-04-03 中国农业大学 基于高通量测序和杂合杂交瘤技术的小分子化合物抗体的制备方法
CN110950960B (zh) * 2019-11-26 2021-05-14 中国农业大学 基于高通量测序和杂合杂交瘤技术的小分子化合物抗体的制备方法
WO2022077551A1 (zh) * 2020-10-13 2022-04-21 南开大学 一种通过免疫沉淀分离和检测蛋白质的方法

Also Published As

Publication number Publication date
US20120052569A1 (en) 2012-03-01
EP2423218B1 (en) 2014-06-11
US8481310B2 (en) 2013-07-09
EP2423218A4 (en) 2013-05-15
WO2010123013A1 (ja) 2010-10-28
JPWO2010123013A1 (ja) 2012-10-25
EP2423218A1 (en) 2012-02-29

Similar Documents

Publication Publication Date Title
CN101704879B (zh) 具有改进的特异性的新型免疫球蛋白结合蛋白
CN102399288B (zh) 针对免疫球蛋白Fc段的单域重链抗体
CN102414218A (zh) 具有蛋白酶识别序列的标签肽及其应用
CN101970456B (zh) 标签肽及其应用
CN110669109B (zh) 一种酶联标签短肽及其应用
US20220064283A1 (en) Antibodies and use thereof
Tabata et al. A rapid screening method for cell lines producing singly-tagged recombinant proteins using the “TARGET tag” system
CN104862328A (zh) 重组阿达木单抗Fab片段在大肠杆菌中的制备方法
FI3857237T3 (fi) Disulfidisidosten luonnehtimismenetelmiä
CN107603996A (zh) 一种重组蛋白的编码序列、重组蛋白及其单克隆抗体的制备方法
CN112812190A (zh) 一种抗小鼠和家兔IgG的羊驼单重链纳米抗体及应用
US20210380719A1 (en) Rabbit antibodies to human immunoglobulins g
CN106928355B (zh) 一种CD105纳米抗体Nb184
KR102511816B1 (ko) c-Myc 펩타이드 특이적인 항체 및 이의 용도
WO2022121899A1 (zh) 一种特异性结合Strep-Tag II标签的抗体及其应用
CN106008715B (zh) 一种抗人血管性血友病因子裂解酶的抑制性单克隆抗体及其应用
JP2023178884A (ja) 膜タンパク質のＣ末端に付加したＨｉｓ－ｔａｇに対する高親和性モノクローナル抗体
EP4337679A2 (en) Mertk peptides and uses thereof
CN103974978B (zh) 用于检测snap/clip标记物的单克隆抗体
US10793619B2 (en) Preparation and selection of cells for producing bispecific antibodies
JP2023178881A (ja) ナノディスクに対する高親和性抗ｍｓｐモノクローナル抗体
CN117821396A (zh) 一种分泌抗鸽IgG单克隆抗体的杂交瘤细胞及应用
CN111925447A (zh) 一种人鼠卵透明带融合蛋白及其制备方法和应用
JP2011037775A (ja) 抗プロテインｓモノクローナル抗体
KR980009284A (ko) 항-맥아당 결합 단백질 단일클론항체, 이를 분비하는 하이브리도마 세포주 및 그의 제조방법

Legal Events

Date Code Title Description
C06 Publication
PB01 Publication
C10 Entry into substantive examination
SE01 Entry into force of request for substantive examination
C12 Rejection of a patent application after its publication
RJ01 Rejection of invention patent application after publication

Application publication date: 20120411