CN102397268A

CN102397268A - 羟基酪醇在制备治疗前列腺癌疾病药物中的应用

Info

Publication number: CN102397268A
Application number: CN2011103277525A
Authority: CN
Inventors: 刘健康; 罗成
Original assignee: Xian Jiaotong University
Current assignee: Xian Jiaotong University
Priority date: 2011-10-25
Filing date: 2011-10-25
Publication date: 2012-04-04

Abstract

本发明内容为羟基酪醇在制备治疗前列腺癌疾病药物中的应用，涉及生物学和药学领域，其目的在于提供羟基酪醇在治疗前列腺癌疾病中的新用途，其技术特征主要在于，羟基酪醇抑制了雄性激素不依赖的前列腺癌细胞PC-3的增殖，诱导了PC-3细胞内的超氧自由基的产生，凋亡启动，线粒体功能紊乱，自噬缺陷，且该生长抑制作用并不依赖于MAPK的活化。

Description

羟基酪醇在制备治疗前列腺癌疾病药物中的应用

技术领域

本发明涉及生物学和药学领域，特别涉及羟基酪醇在制备治疗前列腺癌疾病药物中的应用。

背景技术

前列腺癌在东亚，欧洲和美国有着不同的发病趋势。根据美国2010年肿瘤协会的统计数据，前列腺癌占新发生肿瘤病例的28％，预期死亡人数的11％。Francesco等人通过统计分析得出地中海饮食有很好的改善健康状况的作用，特别是肿瘤的发病率和死亡率有显著的降低。Catherine等人认为传统的地中海饮食习惯可能是一种比较好的预防前列腺癌的方法。

地中海饮食主要包括大量的水果，蔬菜，纤维，鱼以及相对比较有特色的组份---橄榄油。橄榄油中主要成分是单不饱和脂肪酸(油酸)，其他一些成分为所谓的“次要化合物”---多酚类化合物如维生素E，羟基酪醇(hydroxytyrosol)，橄榄苦苷，酪醇等，都具有比较好的抗氧化活性。

羟基酪醇是一种植物化学物质，在橄榄油多酚类化合物中是主要成分，而且具有相对更强的抗氧化能力。同时，羟基酪醇在橄榄叶和橄榄中含量非常丰富。羟基酪醇的化学分子结构式为：

分子式为C₈H₁₀O₃，分子量为154.16克/摩尔。羟基酪醇易溶于水和二甲基亚砜，其中在水中的浓度可以达到5克/毫升。人体摄入橄榄油后，羟基酪醇剂量依赖的被人体吸收，并以葡糖苷酸结合物的形式从尿液中排出。摄入的橄榄油多酚类物质在胃的酸性环境中能够进行部分修饰，但小肠是最主要的吸收部位。当人体摄入288.89毫克橄榄油/千克体重时，体内含量最大值出现在60分钟左右，而摄入961.17毫克橄榄油/千克体重时，最大峰值出现在120分钟左右，且羟基酪醇在血浆中含量显著增加。在大鼠中的实验表明，每千克体重摄入2克羟基酪醇没有表现出毒性效应，且在摄入后5小时在尿液中发现多达90％的羟基酪醇代谢物，而只有5％左右存在于胃肠道和粪便中，其中儿茶酚-O-甲基转移酶，乙醇脱氢酶，醛脱氢酶以及酚磺基转移酶可能参与了其中的代谢过程。

目前已有的研究表明，除了清除微生物外，羟基酪醇的强抗氧化作用对于心血管疾病，衰老相关退行性疾病(如肿瘤，2型糖尿病，老年性视网膜黄斑病变)等有很好的预防效果。早期研究发现羟基酪醇对乳腺癌，结肠癌，人早幼粒白血病细胞具有良好的增殖抑制效果，主要通过对细胞周期的阻断，NF-κB途径的抑制，Erk1/2途径的活化等等。

每天摄入2毫克羟基酪醇将在血浆中达到约1～4微摩尔的浓度，由于人体的吸收和转化效率差别比较大，我们建议每日羟基酪醇的摄入量应该在200毫克以上为宜，才能达到应有的血浆和细胞内浓度。

发明内容

本发明的目的在于提供羟基酪醇在治疗前列腺癌疾病中的新用途，羟基酪醇具有对人雄激素不依赖型PC-3细胞的增殖抑制，凋亡促进的作用，但是对正常前列腺上皮细胞基本无毒性。

本发明的技术方案是这样实现的：

羟基酪醇在制备治疗前列腺癌疾病药物中的应用，其特征在于，羟基酪醇在制备抑制雄性激素不依赖的前列腺癌细胞PC-3增殖药物中应用。

羟基酪醇还用于引起了PC-3细胞内的超氧自由基的产生。

羟基酪醇还用于诱导了PC-3细胞的凋亡以及线粒体功能的紊乱。

羟基酪醇还用于诱导了PC-3细胞内自噬缺陷。

羟基酪醇还用于诱导的PC-3细胞生长抑制不依赖于MAPK的活化。

本发明的主要优点在于：

(1)首次研发出羟基酪醇在治疗前列腺癌方面的新的用途。

(2)阐述了细胞内重要的细胞器线粒体在其中所发生的重要变化以及对羟基酪醇作用的调控。

(3)揭示了自噬功能异常在肿瘤预防中的作用。

(4)羟基酪醇是来源于地中海地区的食用橄榄油中的多酚类化合物，其副作用比较低。

附图说明

图1为羟基酪醇(hydroxytyrosol)的处理导致了前列腺癌细胞存活率降低的柱状示意图；其中：图1a是PC-3和RWPE-1细胞用0，40，60，80，100μmol/L羟基酪醇处理24小时后的前列腺癌细胞存活率降低的柱状示意图；图1b是PC-3细胞用80μmol/L羟基酪醇处理0，6，12，24，48小时后的前列腺癌细胞存活率降低的柱状示意图；细胞存活率通过MTT的方法检测；数据来源于至少3个独立重复实验，以平均值±标准误的形式表示；**P＜0.01vs.正常对照组。

图2为氧化应激在PC-3细胞的生长抑制中起重要作用的示意图；其中：图2a为抗氧化剂NAC有效阻止了羟基酪醇诱导的PC-3细胞的生长抑制的柱状示意图；图2b为羟基酪醇处理的PC-3细胞内超氧自由基显著增加的荧光染色示意图。PC-3细胞用5mmol/L NAC预处理2小时，随后与80μmol/L羟基酪醇共处理24小时(生长抑制检测)或8小时(超氧自由基产生的检测)。数据来源于至少3个独立重复实验，以平均值±标准误的形式表示。**P＜0.01vs.正常对照组，##P＜0.01vs.羟基酪醇处理组。

图3为羟基酪醇诱导了前列腺癌细胞发生凋亡性细胞死亡以及线粒体功能紊乱的示意图；其中：图3a为羟基酪醇处理的PC-3细胞内染色质固缩的荧光染色示意图；图3b为羟基酪醇处理的PC-3细胞内Bcl-2家族蛋白变化的蛋白免疫印迹示意图；图3c为羟基酪醇处理的PC-3细胞内线粒体通透性转位孔的结构组成蛋白的免疫印迹示意图；图3d为羟基酪醇处理的PC-3细胞内线粒体的整体功能变化的柱状示意图；图3e为羟基酪醇处理的PC-3细胞内线粒体相关酶的活性变化的柱状示意图，其中图3e1为线粒体呼吸链复合体活性的柱状示意图，图3e2为线粒体三羧酸循环相关酶活性的柱状示意图。PC-3细胞用80μmol/L羟基酪醇分别处理0，4，8，12小时后检测染色质固缩的变化。PC-3细胞用5mmol/L NAC预处理2小时，随后与80μmol/L羟基酪醇共处理24小时，收集蛋白用于免疫印迹分析。PC-3细胞用80μmol/L羟基酪醇共处理24小时，抽提线粒体用于线粒体功能的检测。数据来源于至少3个独立重复实验，以平均值±标准误的形式表示。*P＜0.05，**P＜0.01vs.正常对照组。

图4为羟基酪醇诱导的PC-3细胞内自噬缺陷的示意图；其中：图4a为羟基酪醇诱导的PC-3细胞内自噬相关蛋白含量变化的蛋白免疫印迹示意图；其中：图4b为羟基酪醇诱导的PC-3细胞内自噬泡活性变化的免疫荧光染色示意图。PC-3细胞用5mmol/L NAC预处理2小时，随后与80μmol/L羟基酪醇共处理24小时，收集蛋白用于免疫印迹分析。PC-3细胞用5mmol/L NAC预处理2小时，随后与80μmol/L羟基酪醇共处理12小时，然后通过Lysotracker Red和MDC染色的方法鉴定自噬泡的变化。

图5为羟基酪醇诱导的PC-3细胞生长抑制非依赖于MAPK活化的示意图；其中：图5a为羟基酪醇诱导了MAPK活化(Erk1/2，JNK和p38的磷酸化)，且NAC能够有效地抑制这些激酶的磷酸化的蛋白免疫印迹示意图。图5b为MAPK的抑制剂(U0126，SP600125，SB203580)无法保护PC-3细胞免受羟基酪醇诱导的生长抑制作用的柱状示意图。PC-3细胞用5mmol/L NAC预处理2小时，随后与80μmol/L羟基酪醇共处理6小时，收集蛋白用于免疫印迹分析。PC-3细胞分别用10μmol/L U0126，10μmol/L SP600125，10μmol/L SB203580预处理2小时，随后与80μmol/L羟基酪醇共处理24小时，用MTT方法检测细胞存活率的变化。数据来源于至少3个独立重复实验，以平均值±标准误的形式表示。**P＜0.01vs.正常对照组。

具体实施方式

下面结合附图及具体实施方式对本发明做详细阐述。

I、材料与方法

1、材料

羟基酪醇(hydroxytyrosol)，叠氮钠(NaN₃)，U0126，SP 600125，SB 203580，N-乙酰半胱氨酸(NAC)，辅酶Q1(CoQ1)，癸泛醌(decylubiquinone)，细胞色素C(Cytochrome C)，2，6-Dichlorobenzenone-indophenol(DCIP)，3-(4，5-二甲基-2-噻唑基)-2，5-二苯基四氮唑溴(3-(4，5-Dimethyl-2-thiazolyl)-2，5-diphenyltetrazolium bromide，MTT)，2-(P-碘苯基)-3(P-硝基苯基)-5-苯基四氮唑氯(2-(p-iodophenyl)-3(p-nitrophenyl)-5-phenyl tetrazoliumchloride，INT)，己糖激酶(hexokinase)，葡萄糖-6-磷酸脱氢酶(glucose-6-phosphate dehydrogenase)，硫辛酰胺脱氢酶(lipoamide dehydrogenase)，辅酶A(CoASH)，焦磷酸硫胺素(thiamine pyrophosphate)，monodansylcadaverine(MDC)以及吩嗪甲基硫酸盐(phenazine methosulphate，PMS)购自西格玛奥德里奇公司(Sigma，St Louis，MO)。RPMI-1640培养基，青霉素(penicillin)，链霉素(streptomycin)，线粒体示踪绿色荧光探针(

Green FM)，溶酶体示踪红色荧光探针(Lysotracker Red DND-99)，二氢乙啶(dihydroethidium)，2，7-二氯二氢荧光素二乙酸酯(2′，7′-dichlorodihydrofluoresceindiacetate，H₂DCFDA)，胰蛋白酶(trypsin)以及5，5’，6，6’-四氯-1，1’，3，3’-四乙基苯并咪唑基-羰化青碘化物(5，5′，6，6′-tetrachloro-1，1′，3，3′-tetraethylbenzimidazolylcarbocyanine iodide，JC-1)，针对线粒体复合体(anti-OxPhos Complex Isubunit NDUFS3，anti-OxPhos Complex II 30kDa subunit，anti-OxPhos Complex III subunit core 1，anti-OxPhos Complex IVsubunit I，anti-OxPhos Complex V subunit α)的一抗来源于Invitrogen公司。针对Bax，Bak，Bad，Bcl-xL，Bcl-2，Phospho-p44/42 MAPK(Erk1/2)(Thr202/Tyr204)，LC3，Beclin1，Atg7以及Atg12的一抗来源于细胞信号有限公司(Cell Signaling Technology，Inc.)；针对SQSTM 1/p62，亲环素D(Cyclophilin D)，腺苷酸转移酶(Adenine nucleotidetranslocase)，VDAC1，Phospho-JNK(Thr183/Tyr185)，Phospho-p38(thr180/thr182)，JNK，Erk2，以及p38α/β的一抗来自于santa cruz biotechnology，inc.；辣根过氧化物酶偶联的针对鼠/兔/山羊的二抗购自杰克逊免疫研究实验室(JacksonImmunoResearch Laboratories，Inc)；胎牛血清购自PAALaboratories GmbH(Linz，Austria)；Hoechst 33342和细胞裂解液购自江苏海门碧云天生物技术公司。

2、实验方法

细胞培养

前列腺癌细胞PC-3购自美国ATCC公司，是一株来源于62岁白人的骨转移的4级前列腺癌的对雄性激素不敏感的细胞，生长在含10％胎牛血清，100单位/毫升青霉素和100微克/毫升链霉素的RPMI1640培养基中，并被置于恒温(37℃)恒湿的5％二氧化碳培养箱中，大约2天传代。永生化的人前列腺上皮细胞株RWPE-1，作为正常细胞对照，被培养在无血清，附加有0.05毫克/毫升牛垂体提取物和5纳克/毫升人重组内皮生长因子的角质细胞培养基中，并被置于恒温(37℃)恒湿的5％二氧化碳培养箱中，大约3天传代。

细胞存活率检测

按15,000/孔的比例，将PC-3以及RWPE-1细胞种在96孔培养板内，静置待细胞贴壁恢复正常生长状态。第二天使用浓度梯度为0，20，40，60，80，100μmol/L的羟基酪醇处理细胞24小时，此外对于PC-3细胞，用80μmol/L羟基酪醇时间梯度处理0，6，12，24小时，摒弃培养基，用PBS清洗一遍，然后加入0.5毫克/毫升的MTT(溶解在PBS中)于37℃的培养箱中孵育1小时，接着去除MTT溶液，加入二甲基亚砜将所产生的紫色结晶溶解，在550nm处测定吸光值的变化。

细胞内氧化应激的测定

按400,000/孔的比例，将PC-3细胞种在6孔培养板内，静置待细胞贴壁恢复正常生长状态，第二天使用80μmol/L羟基酪醇处理细胞8小时，摒弃培养基，用PBS清洗一遍，然后加入溶解在无血清的1640培养基中的DHE于37℃的培养箱中孵育0.5小时，接着去除DHE溶液，用PBS清洗一遍，然后在荧光显微镜下观察红色荧光的变化并拍照记录。

染色质固缩的检测

经羟基酪醇处理后的PC-3细胞，摒弃培养基，用PBS清洗一遍，用4％多聚甲醛室温固定1小时，然后用Hoechst 33342染色20分钟，接着去除Hoechst 33342溶液，用PBS清洗一遍，然后在荧光显微镜下观察蓝色荧光的变化并拍照记录。

线粒体整体功能(线粒体DNA，线粒体数量，线粒体膜电位，呼吸耗氧以及胞内ATP含量)的测定

线粒体DNA含量测定

通过基因组DNA小量抽提试剂盒提取总DNA，然后通过PCR方法检测线粒体DNA含量的变化(以18S rRNA为内参基因，线粒体D-loop作为目的基因)。定量PCR反应的体系为：5μL SYBR PremixEx TaqTM，0.5μL引物对(10pmol/L)以及2.5ng模板DNA(阴性对照不加)，最后加无RNase的水至总体积10μL。反应条件为：起始95℃5分钟变性，随后进行40个循环的反应(95℃，30秒；55℃，30秒以及72℃，20秒)。在PCR过程中所用到的引物如下：线粒体D-loop，F-5′-AAGTGGCTGTGCAGACATTC-3′，R-5′-TCTGTCTTTGATTCCTGCCT-3′：18S rRNA，F-5′-TCTCCTACTTGGATA ACTGTGG-3′，R-5′-GGCGACTACCATCGAAAGTTG-3′。通过线粒体D-loop与18SrRNA的数量比值来说明线粒体DNA含量的差异。

线粒体数量的测定

经羟基酪醇处理后的PC-3细胞，摒弃培养基，用PBS清洗一遍，用溶解在无血清的1640培养基中的Mitotracker green FM染色30分钟，接着去除Mitotracker green FM溶液，用PBS清洗一遍，然后利用流式细胞仪检测荧光(激发光485nm，散射光538nm)的变化来表示线粒体数量的变化。

线粒体膜电位变化的测定

经羟基酪醇处理后的PC-3细胞，摒弃培养基，用PBS清洗一遍，用溶解在无血清的1640培养基中的JC-1染色30分钟，接着去除JC-1溶液，用PBS清洗一遍，用荧光酶标仪检测荧光(绿光，激发光485nm，散射光538nm；红光，激发光485nm，散射光585nm)的变化，通过红/绿荧光的比值来表示线粒体膜电位的变化。

细胞呼吸耗氧的测定

经羟基酪醇处理后的PC-3细胞，胰酶消化，收集，用300μL无血清的1640培养基重悬。将100μL重悬好的细胞悬液转入BD耗氧板内，记录1小时内荧光(激发光485nm，散射光630nm)的变化情况，同时计算细胞的数量，通过荧光变化值/细胞数量来表示单个细胞呼吸的能力。

细胞内ATP含量的测定

经羟基酪醇处理后的PC-3细胞，用PBS清洗一遍，然后加入含0.5％Triton X-100的100mmol/L甘氨酸缓冲液(pH 7.4)裂解细胞，收集上清，转移至96孔板内，加入混合好的ATP检测液，用化学发光仪测定光亮度的变化，同时定量蛋白浓度，通过光亮度值/蛋白量来表示细胞内ATP的含量。

线粒体呼吸链复合体酶以及柠檬酸脱氢酶活性的检测

线粒体抽提。收集经羟基酪醇处理过后的PC-3细胞沉淀，用预冷的低渗缓冲液(10mmol/L氯化钠(NaCl)，1.5mmol/L氯化镁(MgCl₂)，10mmol/L Tris-HCl，pH 7.5)重悬，于冰上静置5分钟后调节溶液为等渗(210mmol/L甘露醇(mannitol)，70mmol/L蔗糖(sucrose)，5mmol/L Tris-HCl，1mmol/L乙二胺四乙酸(EDTA)，pH 7.5)，然后转入2-mL Dounce匀浆器中，上下研磨15～20次，将破碎的细胞匀浆于1300g离心5分钟，重复一次。收集得到的上清再于17,000g离心15分钟。线粒体沉淀用等渗缓冲液重悬，并进行蛋白定量。以上所有操作都在4℃进行。所得到的线粒体保存于-80℃直至酶活检测。

NADH-CoQ氧化还原酶(complex I)

反应体系为：50mmol/L Tris-HCl pH 8.1，0.05mmol/L DCIP，0.35％牛血清白蛋白(BSA)，1μmol/L抗霉素A(antimycin A)，0.2mmol/L叠氮钠(NaN₃)，0.05mmol/L辅酶Q1(coenzyme Q1)，通过200μmol/L还原态的烟酰胺腺嘌呤二核苷酸(NADH)启动反应，然后在30℃条件下读取600nm处吸光值的变化2分钟。

Succinate-CoQ氧化还原酶(complex II)

反应体系为：50mmol/L磷酸钾缓冲液pH 7.8，0.05mmol/LDCIP，2mmol/L乙二胺四乙酸(EDTA)，0.1％牛血清白蛋白(BSA)，3μmol/L鱼藤酮(rotenone)，1μmol/L抗霉素A(antimycinA)，0.2mmol/L叠氮钠(NaN₃)，0.2mmol/L三磷酸腺苷(ATP)，0.05mmol/L辅酶Q1(CoQ1)，通过10mmol/L琥珀酸(succinate)启动反应，然后在30℃条件下读取600nm处吸光值的变化2分钟。

CoQ-cytochrome c还原酶(complex III)

反应体系为：50mmol/L Tris-HCl pH 7.8，0.2mmol/L叠氮钠(NaN₃)，0.05％吐温-20(Tween-20)，0.01％牛血清白蛋白(BSA)，0.05mmol/L细胞色素C(Cytochrome C)，通过0.05mmol/Ldecylubiquinol启动反应，然后在30℃条件下读取550nm处吸光值的变化2分钟。

Cytochrome c氧化酶(complex IV)

反应体系为：50mmol/L磷酸钾缓冲液pH 7.0，0.1％牛血清白蛋白(BSA)，0.2％吐温-20(tween-20)，通过0.05mmol/L还原态的细胞色素C(reduced cytochrome C)启动反应，然后在30℃条件下读取550nm处吸光值的变化2分钟。

F₁F₀ATP合成酶(Complex V)

反应体系为：10mmol/L HEPES pH 8.0，20mmol/L葡萄糖(glucose)，3mmol/L氯化镁(MgCl₂)，0.75mmol/L烟酰胺腺嘌呤二核苷酸磷酸(NADP⁺)，20mmol/L琥珀酸(succinate)，10mmol/L磷酸氢二钾(K₂HPO₄)，5units/mL己糖激酶(hexokinase)，2.5units/mL葡萄糖-6-磷酸脱氢酶(glucose-6-phosphate dehydrogenase)，通过1mmol/L二磷酸腺苷(ADP)启动反应，然后在30℃条件下读取340nm处吸光值的变化2分钟。

丙酮酸脱氢酶复合体(PDH)

反应体系为：0.2mmol/L焦磷酸硫胺素(thiaminepyrophosphate)，0.6mmol/L 2-(p-iodophenyl)-3(p-nitrophenyl)-5-phenyltetrazolium chloride(INT)，2.5mmol/L烟酰胺腺嘌呤二核苷酸(NAD⁺)，1mmol/L氯化镁(MgCl₂)，3μmol/L鱼藤酮(rotenone)，50mmol/L Tris-HCl pH 7.8，0.1％牛血清白蛋白(BSA)，1mg/mL硫辛酰胺脱氢酶(Lipoamide dehydrogenase)，0.1mmol/L辅酶A(CoASH)，通过(3mmol/L二硫苏糖醇(DTT)+5mmol/L丙酮酸(pyruvate))启动反应，然后在30℃条件下读取500nm处吸光值的变化2分钟。

a-同戊二酸脱氢酶复合体(a-KGDH)

反应体系为：35mmol/L磷酸钾缓冲液(potassium phosphatebuffer pH 7.25)，2mmol/L叠氮钠(NaN₃)，0.5mmol/L乙二胺四乙酸(EDTA)，2.5μmol/L鱼藤酮(rotenone)，5mmol/L氯化镁(MgCl₂)，0.5mmol/L烟酰胺腺嘌呤二核苷酸(NAD⁺)，0.2mmol/L焦磷酸硫胺素(thiamine pyrophosphate)，2mmol/L a-酮戊二酸(a-Ketoglutarate)，通过0.04mmol/L辅酶A(CoASH)启动反应，然后在30℃条件下读取340nm处吸光值的变化2分钟。

苹果酸脱氢酶(MDH)

反应体系为：50mmol/L磷酸钾缓冲液pH 9，3μmol/L鱼藤酮(rotenone)，0.1％牛血清白蛋白(BSA)，0.5mmol/L烟酰胺腺嘌呤二核苷酸(NAD⁺)，0.6mmol/L INT，0.2mmol/L吩嗪甲基硫酸盐(PMS)，通过15mmol/L苹果酸(malate)启动反应，然后在30℃条件下读取500nm处吸光值的变化2分钟。

蛋白免疫印迹分析

收集经羟基酪醇处理过后的PC-3细胞沉淀，加入细胞裂解液于冰上孵育30分钟。将裂解液于17,000g离心15分钟，收集上清，蛋白定量，并将上清保存于-20℃。取约20μg蛋白通过SDS聚丙烯酰胺凝胶电泳分离并转至硝酸纤维素膜(NC膜)上，NC膜用5％脱脂牛奶(溶解于TBST)封闭1小时，然后一抗孵育1小时，TBST漂洗3次15分钟，接着二抗孵育1小时，TBST漂洗3次15分钟，最后通过化学发光底物HR反应，记录光亮度的变化。

自噬泡(自噬小体和自噬溶酶体)的观察

经羟基酪醇处理后的PC-3细胞，摒弃培养基，用PBS清洗一遍，用溶解在无血清的1640培养基中的MDC或者Lysotracker Red染色30分钟，接着去除MDC或者Lysotracker Red溶液，用PBS清洗一遍，然后在荧光显微镜下观察荧光的变化并拍照记录。

统计分析

实验数据从至少3次独立重复实验中得出的平均值±标准误表示。使用SPSS统计软件的单向方差分析方法(ANOVA)中的Fisher′s LSD方法进行结果的差异显著性分析。差异显著性按如下说明：*p＜0.05；**p＜0.01。

实施例1、羟基酪醇对人雄性激素非依赖型前列腺癌细胞PC-3的抑制效果

人雄激素非依赖性前列腺癌PC-3细胞和正常人前列腺上皮RWPE-1细胞用0，40，60，80，100μmol/L羟基酪醇处理24小时，然后用MTT方法检测细胞存活率的变化。从图1a中可以看出，羟基酪醇对PC-3细胞存在一个浓度依赖性的抑制效果，然而对RWPE-1细胞却没有多大影响。同时可以看到当用80μmol/L羟基酪醇处理PC-3细胞时，羟基酪醇存在一个时间依赖性的抑制趋势，结果见图1b。

实施例2、羟基酪醇的处理引起了PC-3细胞内的超氧自由基的产生

超氧自由基是活性氧中的一种，主要由于线粒体氧化磷酸化过程中电子渗漏造成的。羟基酪醇显著地诱导了PC-3细胞内超氧自由基的产生，N-乙酰-半胱氨酸(NAC)是一种普通的活性氧清除剂，能够防止PC-3免受羟基酪醇造成的生长抑制以及超氧自由基的产生，结果见图2。

实施例3、羟基酪醇诱导了PC-3细胞的凋亡以及线粒体功能的紊乱

我们认为羟基酪醇诱导的PC-3细胞的生长抑制可能是由于凋亡的诱导所促进的。用Hoechst 33342染色的方法检测染色质固缩这样一个凋亡的标志，发现在80μmol/L羟基酪醇处理PC-3细胞12小时后，细胞核表现出很明显的核固缩现象，结果见图3a。Bcl-2家族蛋白常常参与了线粒体凋亡途径。在抗凋亡蛋白中，Bcl-2蛋白表现出显著的下调，而Bcl-xL蛋白变化不明显，相对而言促凋亡蛋白中，Bax和Bak都显著地增加了蛋白的表达，结果见图3b。同时可以看到，线粒体通透性孔结构组成也发生了变化。亲环素D蛋白有轻微的下降，然而ANT和VDAC1含量显著的上升，结果见图3c。

在羟基酪醇处理后，PC-3细胞表现出明显的线粒体功能紊乱。线粒体的整体功能，包括线粒体膜电位，线粒体数量，线粒体DNA，细胞耗氧速率和细胞内的腺苷5′-三磷酸(ATP)含量都有显著的降低，结果见图3d。线粒体呼吸链复合体酶(I，II，III，IV)活性都有所下降，但是复合体V(ATP合成酶)活性却有所升高，结果见图3e1。柠檬酸循环相关酶(丙酮酸脱氢酶复合体，a-同戊二酸脱氢酶复合体，苹果酸脱氢酶)活性显著下降，结果见图3e2。

实施例4、羟基酪醇诱导了PC-3细胞内自噬缺陷

如图4a，PC-3细胞经羟基酪醇处理后，在功能性自噬小体形成中起重要作用的Atg12-Atg5共轭偶联复合体和泛素化E1类似酶Atg7蛋白水平有所下降。然而，一个经典的自噬流标志物LC3-II蛋白水平显著增加，另外一个重要的自噬相关蛋白SQSTM1/p62发生了累积。MDC和lysotracker red常常被用于自噬途径通畅的检测。从图4b中可以看到，PC-3经80μmol/L羟基酪醇处理12小时后，荧光强度变弱，意味着自噬泡缺乏正常功能的酸性环境。

实施例5、羟基酪醇诱导的PC-3细胞生长抑制不依赖于MAPK的活化

许多氧化应激条件能够诱导MAPK(p44/42 MAPK(Erk1/2)，JNK，p38)的活化。羟基酪醇能够显著诱导PC-3细胞内p44/42 MAPK(Erk1/2)，JNK和p38的活化。同时，NAC的预处理能够有效的防止这些磷酸化进程的发生，结果见图5a。然而MAPK的抑制剂(U0126，SB203580和SP600125)并不能有效的保护PC-3细胞免于羟基酪醇诱导的生长抑制，结果见图5b。

由上述结果可见，相对于正常的永生化的前列腺上皮细胞，羟基酪醇有效的诱导了雄性激素不敏感的前列腺癌细胞PC-3凋亡，并且超氧以及自噬缺陷在其中起了非常重要的作用。此次发现对于有效的理解橄榄油，特别是羟基酪醇在癌症预防上的作用机制有非常好的提示作用。

Claims

1.羟基酪醇在制备治疗前列腺癌疾病药物中的应用，其特征在于，羟基酪醇在制备抑制雄性激素不依赖的前列腺癌细胞PC-3增殖药物中应用。

2.根据权利要求1所述的羟基酪醇在制备治疗前列腺癌疾病药物中的应用，其特征在于，羟基酪醇还用于引起了PC-3细胞内的超氧自由基的产生。

3.根据权利要求1所述的羟基酪醇在制备治疗前列腺癌疾病药物中的应用，其特征在于，羟基酪醇还用于诱导了PC-3细胞的凋亡以及线粒体功能的紊乱。

4.根据权利要求1所述的羟基酪醇在制备治疗前列腺癌疾病药物中的应用，其特征在于，羟基酪醇还用于诱导了PC-3细胞内自噬缺陷。

5.根据权利要求1所述的羟基酪醇在制备治疗前列腺癌疾病药物中的应用，其特征在于，羟基酪醇还用于诱导的PC-3细胞生长抑制不依赖于MAPK的活化。