CN102388135A - 用于创伤调理和皮肤护理的新型蛋白酶 - Google Patents
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Abstract
发明人已通过分子克隆鉴定出源自丝光绿蝇幼虫的蛋白酶,并且由于该蛋白酶具有可用于对创伤进行清创的活性而将其命名为清创酶。本发明描述了一种编码具有纤维蛋白和酪蛋白切割能力的丝氨酸蛋白酶的核酸分子,所述核酸分子是:(a)编码包含氨基酸序列SEQ ID NO:4或由氨基酸序列SEQ ID NO:4组成的丝氨酸蛋白酶的核酸分子;(b)包含核苷酸序列SEQ ID NO:3或由核苷酸序列SEQ ID NO:3组成的核酸分子;(c)编码氨基酸序列与(a)中所述的氨基酸序列具有至少80%同一性、优选至少85%同一性、更优选至少90%同一性且最优选至少95%同一性的丝氨酸蛋白酶的核酸分子;(d)由与(b)中所述的核苷酸序列具有至少80%同一性、优选至少85%同一性、更优选至少90%同一性且最优选至少95%同一性的核苷酸序列组成或包含该核苷酸序列的核酸分子;(e)与(d)所述的核酸分子简并的核酸分子;或(f)与(a)~(d)中任一项的核酸分子对应的其中T被U置换的核酸分子。
Description
本发明涉及一种含有蛋白酶的用于创伤调理和皮肤护理的药物组合物和化妆品组合物以及医药产品,所述蛋白酶来自丝光绿蝇(Lucilia sericata),并被称为清创酶(debrilase)。清创酶是通过使用幼虫转录物组(即,mRNA制备物)并将其转变为cDNA而鉴定出的,并且通过使用重组技术和随后在适合的宿主细胞中表达而制得。本发明的蛋白酶具有纤维蛋白水解活性、酪蛋白水解活性和PAR-2(蛋白酶激活受体2)激活活性。在一个实施方式中,提供了含有清创酶的组合物,用来清洁由坏死细胞、组织和纤维蛋白围袖(fibrin cuff)引起的缓慢愈合或不愈合的创伤,这一过程被称为清创。在另一个实施方式中,提出了清创酶在皮肤护理和皮肤光滑化领域中的化妆品用途。
本发明还涉及编码具有切割纤维蛋白和酪蛋白能力的丝氨酸蛋白酶的核酸分子,所述核酸分子是编码包含氨基酸序列SEQ ID NO:4或由氨基酸序列SEQ ID NO:4组成的丝氨酸蛋白酶的核酸分子,本发明还涉及编码上述丝氨酸蛋白酶的前体或片段的核酸分子。此外,本发明涉及包含核苷酸序列SEQ ID NO:3或由核苷酸序列SEQ IDNO:3组成的核酸分子,和与核苷酸序列SEQ ID NO:3的同一性为至少77%、更优选为至少80%、进一步优选为至少85%且最优选为至少90%的编码丝氨酸蛋白酶的核酸分子。在其中T被U置换了的任何上述核酸也在本发明的范围中。
在本说明书中,引用了包括专利申请和制造商的手册在内的多个文献。不认为这些文献的公开内容与本发明的专利性有关,并通过引用将其完整地并入本文中。更具体而言,将所参考的所有文献通过引用并入本文中,其程度相当于特定地且单独地指明将每个单独的文献都通过引用并入本文中。
创伤愈合有三个不同阶段:(1)炎症;(2)细胞迁移和增殖;和(3)重塑。在炎症阶段,免疫系统的细胞会释放蛋白酶。嗜中性粒细胞和巨噬细胞会分泌出对创伤愈合的下一阶段进行调节的各种淋巴因子。第二阶段称为增殖阶段,该阶段包括成纤维细胞迁移、增殖和新的细胞外基质分子的合成。这些事件看似是以确定的顺序出现,在此情况下包括纤维连接蛋白、胶原和蛋白聚糖在内的细胞外基质分子被分泌至肉芽床(granulation bed)中。炎症阶段在3天时达到峰值。创伤愈合的第二阶段通常在受伤后约1到2周达到峰值,随后是更加长久的第三阶段,即组织重塑,该阶段在几周内开始并可能持续数月。在重塑阶段,当已破坏的胶原纤维被更厚更有序排列的胶原分子置换时,结缔组织基质变成熟。这种组织重塑最终增加了创伤的抗张强度,且有时伴有瘢痕形成。
皮肤损伤基本上总会涉及对血管的伤害。因此,创伤愈合还包括凝血过程,凝血过程是血液形成凝块的复杂过程。该过程为止血的重要环节,通过该过程,含有血小板和纤维蛋白的凝块会覆盖受损的血管壁,从而使流血停止并开始修复受损血管。凝血紊乱会使出血和/或形成血栓的风险升高。在血管所受的伤害已经对内皮造成损伤后,几乎会立即引发凝血。血小板会在受伤部位立刻形成止血栓(初期止血)。在血浆中的凝血因子以复杂的级联反应做出响应从而形成强化血小板栓的纤维蛋白股的同时,发生二期止血。二期止血的凝血级联反应有两种途径,即接触活化途径(旧称内源性途径)和组织因子途径(旧称外源性途径),这两种途径均导致纤维蛋白的形成。现已知,血液凝固启动的主要途径是组织因子途径。这些途径为一系列反应,其中丝氨酸蛋白酶的酶原(无活性的酶前体)及其糖蛋白辅助因子经活化而变成具有活性的组分,该组分随后催化级联中的下一个反应,并最终形成交联的纤维蛋白。除了FVIII和FV是糖蛋白并且因子XIII是转谷氨酰胺酶之外,凝血因子通常为丝氨酸蛋白酶。通常凝血级联划分为三个途径。组织因子途径和接触活化途径均会激活因子X、凝血酶和纤维蛋白的“最终共同途径”。
纤维蛋白是参与血液凝块形成的蛋白。其为纤维状蛋白,其经聚合而与血小板一起在创伤部位上形成止血栓或凝块。纤维蛋白是从其酶原纤维蛋白原转变而来,纤维蛋白原是由肝脏合成的可溶的血浆糖蛋白。在凝血级联反应中,酶原凝血酶原(prothrombin)经活化而成为丝氨酸蛋白酶凝血酶,凝血酶负责将纤维蛋白原转变为纤维蛋白。随后纤维蛋白通过因子XIII而发生交联,从而形成凝块。
纤溶酶以蛋白水解方式将纤维蛋白切割成纤维蛋白降解产物,纤维蛋白降解产物抑制过多的纤维蛋白形成。纤溶酶是通过对纤溶酶原进行蛋白水解式切割而产生的,纤溶酶原是在肝脏中合成的血浆蛋白。内皮合成并分泌的组织纤溶酶原激活剂(t-PA)催化上述切割。纤溶酶原在凝块形成过程中被捕集,并在创伤已停止流血且凝块分解时被缓慢激活。
创伤愈合过程中的凝块瓦解是使上述基质形成和重塑得以实现的重要步骤。缓慢愈合或慢性创伤的一个潜在原因据认为是缺乏纤维蛋白溶解作用。所谓的“纤维蛋白围袖”,由纤维蛋白、层粘连蛋白、纤维连接蛋白、腱生蛋白、胶原和白细胞组成,会妨碍营养、生长因子和气体的交换,并导致缺氧、溃疡形成,且阻碍血管生成。这些“纤维蛋白围袖”的蛋白水解式溶解支持新血管形成、白细胞侵袭、成纤维细胞迁移、新上皮的形成,并且诱导细胞增殖和迁移。此外,脓液、组织碎屑、细菌和渗出液的存在会延迟创伤的愈合,其可以通过清创试剂来除去。
清创的定义为将非生命组织从创伤处除去。在慢性创伤中,清创是指消除坏死物以及将创伤敷料、异物和其他非生命物质清除掉。充分的清创是无延迟创伤愈合过程的一个基本前提。除了对延迟性创伤愈合的起因进行处理外,清创还应当是为慢性创伤进行的充分的阶段适应性创面床准备中的第一步。对慢性创伤的不同清创方法已有描述,例如外科手术、蛆疗法、激光、超声、水疗法、湿-干(wet-to-dry)法、自体溶解、蛋白水解酶、渗透压清创或化学清创。
清创试剂在不伤害活细胞的情况下快速消化坏死组织,从而加速了愈合过程。在寻找此类清创试剂的过程中已采用了大量不同的植物和动物材料,例如蛆或丽蝇(blowfly)的幼虫,但也采用了酶,如来源于植物的木瓜蛋白酶、菠萝蛋白酶(bromelain)及罗汉果蛋白酶(ananain)(例如US 6548556、EP 0194647B1、US 5106621)、来源于微生物的蛋白酶(例如来自弧菌属的蛋白酶,US 5145881;来自杆菌属的嗜热菌蛋白酶,WO 03/088993A1、US 2003/0198632A1)和来自动物的蛋白酶(例如,来自鱼的胰蛋白酶和胰凝乳蛋白酶,US 6846485)。一些清创性酶作为凝血级联反应中的蛋白酶抑制剂(凝血酶抑制性微管连接蛋白-1(PN-1),US 5112608)或急性期反应中的蛋白酶抑制剂(α1-抗胰蛋白酶,US 6262020)起作用。清创性酶的主要目的是清洁创伤的所有不同坏死组织要素,并减少粘性渗出性分泌。恰当应用的蛋白水解酶会净化受感染表面的炎性渗出液,且不伤害活组织。这些酶促使分布有含脓、含血和含纤维蛋白的累积物的区域的排出,促进藏匿细菌的释放以使其可接触免疫防御系统。
清创性酶的酶促作用可用于非愈合性创伤(例如Lobmann等,Proteases and thediabetic foot syndrome:Mechanisms and therapeutic Implications.Diabetes Care 28(2005),461-471),但是其也能够有益于治疗炎性皮肤疾病(例如银屑病和湿疹等)和严重程度较低的皮肤病症(例如皱纹、痤疮和干性皮肤),如在例如美国专利第4,524,136、5,439,935、5,441,740、5,554,366、5,853,705和6,780,444号中所公开的。包含此类酶的商品也是可以获得的,例如(木瓜蛋白酶)和(胰蛋白酶),其应用限于对创伤的清创。
为找到更佳的创伤清创用酶而进行的努力一直在持续。高度优选的创伤清创用酶的一些标准是下述标准中的至少一个、且优选多个(例如全部):其应当能够快速消化纤维蛋白、变性胶原、弹性蛋白和渗出液;其应当不伤害正常出现的人皮肤组织;其应当对创伤无毒性且无刺激性;其应当容易制备、稳定且易于使用。例如,WO2007/074454A2中描述了适于在环境条件下储存且同时保持酶活性的稳定的浓缩酶组合物以及包含酶组合物的试剂盒。
处理慢性创伤的若干方法包括使用使创伤保持湿润的敷料,从而支持浸润创伤的免疫系统细胞的活力。
对于创伤处理,提出了使用蛋白酶(即,肽链外切酶和肽链内切酶)和使用蛋白酶抑制剂。
Bott等(A silicone-based controlled-release device for accelerated proteolyticdebridement of wounds,Wound Repair Regen.(2007)15:227-35)描述了一种基于硅酮的器件,用来对创伤的蛋白水解式清创所用的酶进行控制型释放,该器件使用了枯草杆菌蛋白酶家族的蛋白酶。类似的是,US 7368128描述了一种用于持续释放清创性酶的敷料,该敷料由吸收材料层和可降解的聚合物材料组成。
几个世纪以来,已知蛆对创伤具有有益效果。在20世纪30年代到20世纪40年代早期的美国,采纳并常规地使用了蛆清创疗法(MDT)方法,但是青霉素和现代外科手术程序的出现MDT(Child FS,Roberts EF.The treatment of chronic osteomyelitiswith live maggots.New York State J Med 1931;31:937-43;Teich S,Myers RAM.Maggottherapy for severe skin infections.South Med J 1986;79:1153-5;Church JCT.Larvaetherapy in modern wound care:A review.Primary Intention 1999;May:63-8;ShermanRA,Hall MJR,Thomas S.Medicinal maggots:An ancient remedy for some contemporaryafflictions.Ann Rev Entomol 45(2000):55-81,Courtenay,M.等,Larva therapy in woundmanagement,J.R.Soc.Med.93(2000):72-74)。
对创伤应用蛆常常使患者感到不愉快甚至疼痛。但是,不同昆虫物种的幼虫却被用于常规情况下无法治疗的创伤的清洁和愈合。某些蝇物种的蛆以坏死组织为食,并且通过这种清创活性帮助愈合慢性软组织创伤,例如压力性溃疡和静脉淤滞溃疡、糖尿病足感染和手术后创伤,这些创伤对外科手术或抗生素干预有抗性(Sherman RA.1998,Maggot debridement in modern medicine.Infect Med 15:651-6,Sherman RA,HallMJR,Thomas S.,2000,Medicinal maggots:An ancient remedy for some contemporaryafflictions.Ann Rev Entomol 45:55-81)。
医学用蛆发挥三个主要作用:1)其通过溶解死(坏死)的受感染组织而对创伤进行清创(清洁);2)其通过杀死细菌而对创伤进行杀菌;和3)其刺激创伤愈合。
Horobin等(2006)描述了使用了应用至慢性创伤的丝光绿蝇的幼虫或绿蝇(greenbottle fly)的蛆的MDT,从而通过触发成纤维细胞迁移和基质重塑来帮助愈合(Horobin等,Promotion of human dermal fibroblast migration,matrix remodelling and modificationof fibroblast morphology within a novel 3D model by Lucilia sericata larval secretions,JInvest Dermatol.126:1410-1418)。此前,他们对存在于蛆的排泄物/分泌物(ES)中的某种酶活性进行了表征(Horobin等,2003,Maggots and wound healing:an investigation ofthe effects of secretions from Lucilia sericata larvae upon interactions between humandermal fibroblasts and extracellular matrix components,Br.J.Dermatol.148:923-933)。
通过使用3龄幼虫,示出了来自丝光绿蝇蛆的分泌物对诸如藤黄色微球菌(Micrococcus luteus)和金黄色葡萄球菌(Staphylococcus aureus)等常见的创伤菌落具有杀菌活性(Daeschlein,G.等,2007,In vitro antibacterial activity of Lucilia sericata maggotsecretions,Skin Pharmacol.Physiol.20:112-115)。
成纤维细胞和周围的细胞外基质间的相互作用在组织形成中起到关键作用,影响成纤维细胞的增殖、迁移和组织重塑。蛆增强创伤内组织形成的假定机制可能是通过促进成纤维细胞的移动性、加速细胞外基质的重塑和协调细胞响应,从而使具有活力的成纤维细胞更广泛分布。据显示,丝光绿蝇的ES产物在被覆纤维连接蛋白的表面上促进成纤维细胞的迁移,并且这与蛆排泄物/分泌物中的丝氨酸蛋白酶所导致的纤维连接蛋白的降解有关(Chambers等,2000,Degradation of extracellular matrixcomponents by defined proteinases from the greenbottle larva Lucilia sericata used for theclinical debridement of non-healing wounds,Brit J Dermatol.148:14-23)。
在羊丽蝇(即铜绿蝇(Lucilia cuprina))的1龄幼虫cDNA中鉴定出了很多各种各样的丝氨酸蛋白酶基因(Elvin等,1994,An estimate of the number of serine protease genesexpressed in sheep blowfly larvae(Lucilia cuprina)”Insect Molecular Biol 3:105-115)。从铜绿蝇的1龄幼虫的ES产物中纯化出了两种胰凝乳蛋白酶样蛋白酶(Casu等,1994,Excretory/secretory chymotrypsin from Lucilia cuprina:purification,enzymatic specificityand amino acid sequence deduced from mRNA,Insect Molecular Biol 3:201-211)。使用对胰蛋白酶样和胰凝乳蛋白酶样丝氨酸蛋白酶有活性的多种蛋白酶抑制剂通过体外喂食测定来表征了来自铜绿蝇的消化道蛋白酶(Casu等,1994,Isolation of a trypsin-likeserine protease gene family from the sheep blowfly Lucilia cuprina,Insect Molecular Biol3:159-170)。在用胰蛋白酶抑制剂尤其是大豆胰蛋白酶抑制剂对1龄幼虫进行喂食时,观察到了明显的幼虫生长阻滞。喂食胰凝乳蛋白酶抑素(chymostatin)(一种胰凝乳蛋白酶抑制剂)不会导致明显的生长阻滞。这一信息表示胰蛋白酶样丝氨酸蛋白酶很可能是主要的消化道消化酶。
Chambers等(2003,Degradation of extracellular matrix components by definedproteinases from greenbottle larva Lucilia sericata used for the clinical debridement ofnon-healing wounds,British J.Dermatol 148:14-23)描述了对绿蝇丝光绿蝇的1~3龄幼虫的纤维蛋白和细胞外基质组分有活性的蛋白酶。他们在早幼虫期(1龄和2龄)的排泄物中发现了最高的比活性。包含在幼虫排泄/分泌(ES)产物中的具有胰凝乳蛋白酶和胰蛋白酶样活性的蛋白酶据认为可通过除去坏死组织而有助于对创伤的清创。使用带异硫氰酸荧光素标签的酪蛋白作为模型底物,在分泌物中检测到了三类蛋白水解酶:两个不同亚类(胰蛋白酶样和胰凝乳蛋白酶样)的丝氨酸蛋白酶(最适pH为8~9)、天冬氨酸蛋白酶(最适pH为5)和具有肽链外切酶特性的金属蛋白酶(最适pH为9)。使用皮肤相关的ECM组分作为底物,丝光绿蝇的ES产物使纤维蛋白凝块溶解并且降解了纤维连接蛋白、层粘连蛋白和酸化可溶的I型和III型胶原。
尽管存在这些结果,但科学家和医生们至今仍在寻找幼虫中大量的具有蛋白水解活性的蛋白中的有效要素。已知幼虫分泌物能够降解细胞外基质(ECM)/创伤组分、纤维连接蛋白、层粘连蛋白以及胶原I、III、IV和V。这些大分子见于慢性创伤的腐肉(slough)中,而且还形成主要存在于慢性溃疡中的“纤维蛋白围袖”。幼虫分泌物对层粘连蛋白和纤维连接蛋白的降解作用受到PMSF的抑制,但不会受到APMSF或金属蛋白酶抑制剂1,10-二氮杂菲的明显抑制。幼虫分泌物活性的最适pH为8.0~8.5(Chambers等,2000,Degradation of extracellular matrix components by definedproteinases from the greenbottle larva Lucilia sericata used for the clinical debridement ofnon-healing wounds,Brit J Dermatol.148:14-23),该pH值与慢性创伤中从酸性到碱性的较宽pH范围并不一致。因此,需要这样清创性酶:在宽得多的pH范围内其还具有如所述的幼虫分泌物的活性那样的活性。
据US 7144721B1中推测,幼虫分泌物中的主要蛋白水解活性是丝氨酸蛋白酶活性,并且存在两种类型的丝氨酸蛋白酶活性;一种源自胰凝乳蛋白酶,另一种源自胰蛋白酶。US 2008/0108551A1提供证据证明,细胞外基质的降解是丝光绿蝇进行的蛋白酶介导的创伤愈合中的重要步骤。在上述申请中,提出了从丝光绿蝇的排泄/分泌产物中分离出的丝氨酸蛋白酶和金属蛋白酶,其分别降解细胞外基质组分纤维连接蛋白或提高细胞迁移。显而易见,所得到的具生物活性的纤维连接蛋白降解产物会促进创伤愈合。WO 2007/138361A3公开了一种用于治疗创伤的来自丝光绿蝇幼虫的胰凝乳蛋白酶。在丝光绿蝇幼虫的分泌产物中,鉴定出了明显参与创伤愈合的其他蛋白,例如核酸酶(WO 2007/122424A2)和toll样受体的配体(US 2005/0053597A1)。
虽然近年来在清创组合物的开发中取得了进展,但仍然需要提供明确确定的清创化合物或含有确定成分的组合物,其性质与上文讨论的现有技术的材料相比如果没有改进,则至少应当相似。例如通过鉴定使蛆提供的创伤愈合得到提高的有效要素,可以实现这一目标。此类化合物还可用于化妆品应用中。
因此,在第一实施方式中,本发明涉及一种核酸分子,所述核酸分子是
(i)编码具有纤维蛋白和酪蛋白切割能力的丝氨酸蛋白酶的下述核酸分子(a)~(f):(a)编码包含氨基酸序列SEQ ID NO:4或由氨基酸序列SEQ ID NO:4组成的丝氨酸蛋白酶的核酸分子;(b)包含核苷酸序列SEQ ID NO:3或由核苷酸序列SEQ ID NO:3组成的核酸分子;(c)编码氨基酸序列与(a)中所述的氨基酸序列具有至少80%同一性、优选至少85%同一性、更优选至少90%同一性且最优选至少95%同一性的丝氨酸蛋白酶的核酸分子;(d)包含与(b)中所述的核苷酸序列具有至少80%同一性、优选至少85%同一性、更优选至少90%同一性且最优选至少95%同一性的核苷酸序列或由该核苷酸序列组成的核酸分子;(e)与(d)所述的核酸分子简并的核酸分子;或(f)与(a)~(d)中任一个的核酸分子对应的其中T被U置换的核酸分子;
(ii)编码(i)中所述的丝氨酸蛋白酶的片段的核酸分子,所述片段与(i)中所述的丝氨酸蛋白酶活性相同;
(iii)编码(i)中所述的丝氨酸蛋白酶的前肽(propeptide)的核酸分子,所述前肽被切割为其活性形式,且优选在治疗创伤前即刻切割或在治疗创伤过程中切割,其中,所述前肽由选自下述核酸分子(a)~(f)的核酸分子编码:(a)编码包含氨基酸序列SEQ IDNO:6或由氨基酸序列SEQ ID NO:6组成的丝氨酸蛋白酶前肽的核酸分子;(b)包含核苷酸序列SEQ ID NO:5或由核苷酸序列SEQ ID NO:5组成的核酸分子;(c)编码氨基酸序列与(a)中所述的氨基酸序列具有至少80%同一性、优选至少85%同一性、更优选至少90%同一性且最优选至少95%同一性的丝氨酸蛋白酶前肽的核酸分子;(d)包含与(b)中所述的核苷酸序列具有至少80%同一性、优选至少85%同一性、更优选至少90%同一性且最优选至少95%同一性的核苷酸序列或由所述核苷酸序列组成的核酸分子;(e)与(d)所述的核酸分子简并的核酸分子;或(f)与(a)~(d)中任一个的核酸分子对应的其中T被U置换的核酸分子;或者
(iv)编码(i)中所述的丝氨酸蛋白酶的前肽原(pre-propeptide)的核酸分子,其中,所述前肽原由选自下述核酸分子(a)~(f)的核酸分子编码:(a)编码包含氨基酸序列SEQID NO:2或由氨基酸序列SEQ ID NO:2组成的丝氨酸蛋白酶前肽原的核酸分子;(b)包含核苷酸序列SEQ ID NO:1或由核苷酸序列SEQ ID NO:1组成的核酸分子;(c)编码氨基酸序列与(a)中所述的氨基酸序列具有至少80%同一性、优选至少85%同一性、更优选至少90%同一性且最优选至少95%同一性的丝氨酸蛋白酶前肽原的核酸分子;(d)包含与(b)中所述的核苷酸序列具有至少80%同一性、优选至少85%同一性、更优选至少90%同一性且最优选至少95%同一性的核苷酸序列或由所述核苷酸序列组成的核酸分子;(e)与(d)所述的核酸分子简并的核酸分子;或(f)与(a)~(d)中任一个的核酸分子对应的其中T被U置换的核酸分子。
本发明中的术语“核酸分子”包括DNA(例如cDNA或基因组DNA)和RNA。还包括本领中已知的核酸模拟分子,例如DNA或RNA的合成或半合成的衍生物,以及混合聚合物。本发明的这种核酸模拟分子或核酸衍生物包括硫代磷酸核酸(phosphorothioate nucleic acid)、氨基磷酸核酸(phosphoramidate nucleic acid)、2′-O-甲氧基乙基核糖核酸、吗啉代核酸、己糖醇核酸(HNA)、肽核酸(PNA)和锁核酸(LNA)(参见Braasch和Corey,Chem Biol 2001,8:1)。LNA是其中核糖环受到2′氧和4′碳间的亚甲基键限制的RNA衍生物。
术语“丝氨酸蛋白酶”是指属于一个亚类的具有蛋白水解活性的蛋白,其特征为该亚类的成员在其活性中心含有丝氨酸,该丝氨酸与组氨酸和天冬酰胺一起构成多数丝氨酸蛋白酶所共有的催化三联体(Rawlings,N.D.,Barrett,A.J.(1994).Families of serinepeptidases.Meth.Enzymol.244:19-61)。丝氨酸蛋白酶的类别为水解酶,并且属于EC编号分类体系中的亚类3.4.21。本发明的核酸分子所编码的蛋白本身可以显示出丝氨酸蛋白酶的蛋白水解活性(例如SEQ ID NO:4)或者可以在进一步成熟或活化(例如,通过蛋白水解加工)后显示出上述活性(例如SEQ ID NO:2或SEQ ID NO:6);另外参见下文对本发明的前肽的讨论。蛋白水解加工可以包括信号肽从前肽原(例如具有SEQ ID NO:2的前肽原)的切除以及通过蛋白水解式切割对前肽(例如具有SEQ IDNO:6的前肽)进行的进一步蛋白水解加工。
本文所用的术语“信号肽”的定义为引导蛋白转运至特定细胞区室且优选转运至内质网的短氨基酸序列(优选3~60个氨基酸长)。
本文所用的术语“前肽”描述了线状的氨基酸分子链,其为蛋白的前体并且在该蛋白成熟或活化的过程中被切割(例如,氨基酸序列SEQ ID NO:6或由核苷酸序列SEQID NO:5编码的氨基酸序列)。本文所用的术语“前肽原”是前肽的前体,其进一步含有信号肽(例如,氨基酸序列SEQ ID NO:2或由核苷酸序列SEQ ID NO:1编码的氨基酸序列)。其为最初的翻译产物。同样地,如果将所述前肽原应用至创伤中,其被切割为其活性形式,且优选是在治疗所述创伤前即刻切割或在治疗所述创伤的过程中切割。
术语“具有纤维蛋白和酪蛋白切割能力”优选仅指成熟蛋白的活性,但也可以包括作为成熟蛋白前体的前肽原和前肽的即将具有的活性(该活性通过上述切割来实现)。
本文所用的术语“蛋白”可与术语“多肽”或“肽”互换,其描述了线状的氨基酸分子链,包括单链蛋白或其片段,且优选包含超过30个氨基酸。通常仅将具有30个氨基酸以下的氨基酸段称为肽而不是多肽。根据场合,本文中的术语“蛋白”或“多肽”可以表示成熟蛋白(例如氨基酸序列SEQ ID NO:4或由核苷酸序列SEQ ID NO:3编码的氨基酸序列)、前肽(例如氨基酸序列SEQ ID NO:6或由核苷酸序列SEQ ID NO:5编码的氨基酸序列)或前肽原(例如氨基酸序列SEQ ID NO:2或由核苷酸序列SEQ IDNO:1编码的氨基酸序列)。多肽可以进一步形成由至少两个相同或不同的分子组成的寡聚体。相应地,将此类多聚体的相应更高级结构称为同源或异源二聚体、同源或异源三聚体等。此外,本发明还涵盖此类蛋白/多肽的肽模拟物,其中氨基酸和/或肽键已被功能性类似物置换。这种功能性类似物包括除20种基因编码的氨基酸外所有已知的氨基酸,例如硒代半胱氨酸。术语“多肽”、“蛋白”和“肽”还指经天然修饰的多肽/蛋白和肽,其中所述修饰通过例如糖基化、乙酰化、磷酸化及本领域公知的类似修饰来实现。
关于本发明的片段,术语“相同的活性”是指本文所列举的存在于本发明的丝氨酸蛋白酶清创酶的片段中的生物活性。本发明此实施方式的片段视其长度可以是多肽或具有30个以下氨基酸的肽。
根据本发明,术语“百分比(%)序列同一性”描述了相对于构成模板核酸或氨基酸序列总长度的核苷酸或氨基酸残基数量,比对中的两个以上核酸或氨基酸序列中相一致的核苷酸/氨基酸的匹配(“命中”)数。换言之,通过使用比对,对于两个以上的序列或子序列,在对这些(子)序列进行比较和比对以在比较视窗或指定区域上获得用本领域已知的序列比较算法测得的最大对应时,或者在进行人工比对和目视检查时,可以确定其相同的氨基酸残基或核苷酸的百分比(例如,80%、85%、90%或95%的同一性)。此定义同样适用于测试序列的互补序列。
本发明的氨基酸序列分析和比对是通过使用NCBI BLAST算法进行的(Stephen F.Altschul,Thomas L.Madden,Alejandro A.Jinghui Zhang,Zheng Zhang,WebbMiller和David J.Lipman(1997),″Gapped BLAST and PSI-BLAST:a new generation ofprotein database search programs″,Nucleic Acids Res.25:3389-3402)。技术人员还知晓用来对核酸序列进行比对的适合程序。
与SEQ ID NO:2、SEQ ID NO:4或SEQ ID NO:6相比,本发明的丝氨酸蛋白酶的氨基酸序列中的替换优选为保守性替换。即,替换优选发生在同一类别的氨基酸内。例如,优选将带正电荷的氨基酸突变为另一带正电荷的氨基酸。这同样适用于碱性氨基酸类、芳香氨基酸类或脂肪族氨基酸类。
本发明中的术语“简并”是指遗传密码的简并。简并的产生是因为三联体密码指定了20种氨基酸和终止密码子。由于存在四种用来编码遗传信息的碱基,因此需要三联体密码子来产生至少21种不同的密码。碱基三联体可以有43种可能性,从而产生64种可能的密码子,这意味着必须存在某种简并。因此,一些氨基酸由多于一个三联体编码,即由最多6个三联体编码。简并主要产生于三联体中第三个位置的变更。这意味着序列与上述序列不同但仍编码同一多肽的核酸分子也在本发明的范围内。
当创伤未在适当的时间内愈合时,经常面临的问题是除去“纤维蛋白围袖”和坏死组织以使成纤维细胞能够浸润并因此使创伤愈合过程能够开始。令人惊奇的是,本发明人已发现,本发明的核酸所编码的丝氨酸蛋白酶具有溶解这些纤维蛋白围袖从而使创伤可以进行自然愈合的极佳性质。据信具有丝光绿蝇创伤愈合活性的主要有效要素是一种具有生物活性的丝氨酸蛋白酶。在本文中该酶亦称“清创酶”,意指其对创伤进行清创的提出用途。
丝光绿蝇的幼虫通常以活体应用于临床实践中,用来治疗对常规治疗有抗性的创伤。由于许多患者对蛆疗法感到很不愉快,并且该昆虫分泌物也远非确定的药物组合物,所以本发明人通过分子方法而着手鉴定了至少一种创伤清创的有效要素。
从以血琼脂为食的2龄幼虫的mRNA(转录物组)生成cDNA文库,从而鉴定出了编码高丰度表达的胰蛋白酶样蛋白酶及相应氨基酸序列的核酸,该蛋白酶及相应氨基酸序列可能是参与丝光绿蝇幼虫对创伤进行清创的主要蛋白酶。在从分离自5日龄幼虫(3龄)的mRNA得到的cDNA文库中未发现此酶。这与幼虫龄期越晚清创活性越低这一现象相符(Chambers等,2003)。
在用血基底诱导的2龄幼虫的转录物组中,通过对所述文库进行酪蛋白蛋白水解活性筛选而得到了编码蛋白酶的若干cDNA序列。对诱导的2龄幼虫的文库中的cDNA序列进行分析,从而鉴定出了仅存在于2龄幼虫所产生的cDNA文库中但不在更晚期(3龄)幼虫的转录物组中的蛋白酶。在所发现的这些蛋白酶中,有一些分别与含磷胰凝乳蛋白酶(phosphochymotrypsin)、胰蛋白酶或胰凝乳蛋白酶具有核酸序列相似性。未发现金属型、苏氨酸型、半胱氨酸型、天冬氨酸型或谷氨酸型蛋白酶。
在脱脂乳上进行的第一琼脂平板筛选中,发现了若干cDNA克隆分泌出具有酪蛋白水解活性的酶,但仅有一种酶还在含纤维蛋白的基底上显示出活性。通过重组表达和在不同测定中对该酶的生化性质进行的评估,对该酶进行了表征。
核酸序列分析显示出在诱导的幼虫的mRNA中高丰度的三种丝氨酸型蛋白酶和两种胰蛋白酶型蛋白酶。所述胰蛋白酶型蛋白酶显示出纤维蛋白水解活性和酪蛋白水解活性。使用NCBI BLAST算法(Stephen F.Altschul,Thomas L.Madden,Alejandro A.Jinghui Zhang,Zheng Zhang,Webb Miller和David J.Lipman(1997),″GappedBLAST and PSI-BLAST:a new generation of protein database search programs″,NucleicAcids Res.25:3389-3402)对纤维蛋白水解蛋白酶中的一种(其与由氨基酸序列SEQ IDNO:4表示的且由核酸序列SEQ ID NO:2编码的清创酶对应)进行的氨基酸序列分析显示出,其与来自麻蝇属(Sarcophaga sp.)的胰蛋白酶样蛋白酶的蛋白序列同一性为76.1%,为与已知酶最接近的相似性。已发现清创酶以高丰度表达,因此其可能是参与丝光绿蝇幼虫对创伤进行清创的主要蛋白酶。在经表达和翻译后,清创酶是包含信号肽和前肽氨基酸的前肽原(图5A)。通过切掉信号肽并通过对前肽进行进一步切割而实现对酶活性的激活,从而产生清创酶的成熟蛋白(SEQ ID NO:4),其中所述前肽明显通过自体蛋白水解而得到切割。优选的是,上述成熟蛋白由SEQ ID NO:3组成的核酸分子编码。成熟清创酶具有纤维蛋白和酪蛋白切割能力。PMSF (苯甲基磺酰氟)和APMSF(4-脒苯基甲磺酰氟)可以完全抑制其活性。使用针对金属型、苏氨酸型、半胱氨酸型或天冬氨酸型蛋白酶的抑制剂时未检测出抑制作用。这表明该蛋白是丝氨酸蛋白酶并且具有胰蛋白酶样活性。
已知恶化中的创伤病况涵盖了较宽的pH范围(Greener B等,2005.Proteases andpH in chronic wounds.J Wound Care;14(2))。在另一详细研究中,在12个月中对患有不同来源的慢性创伤的39个患者的247个pH值进行了分析,检测到的值为5.45~8.65(Dissemond,J.等,2003,pH-Wert des Milieus chronischer Wunden,Untersuchungenim Rahmen einer modernen Wundtherapie,Der Hautarzt 54,No.12,959-965)。清创酶高度稳定,并且在5~10的pH范围内具有活性,从而使之适合应用于慢性创伤并在上述具有较宽pH范围发挥作用。
此外,在细胞受体活化测定中,发现清创酶具有使蛋白酶激活受体2(PAR2)活化的能力。PAR2是与鸟苷酸结合蛋白偶联的7次跨膜受体大家族的成员。PAR2还是蛋白酶激活受体家族的成员。其由胰蛋白酶而不是凝血酶来激活。胰蛋白酶实现了对受体的细胞外氨基末端的蛋白水解式切割,新氨基末端发挥系锁配体(tethered ligand)的功能并且将该受体激活。PAR2在炎症和疼痛中、在成纤维细胞增殖中(Asano-Kato等,Tryptase increases proliferative activity of human conjunctival fibroblasts throughprotease-activated receptor-2,Invest Ophthalmol Vis Sci.,2005 46(12):4622-6)和在有助于创伤愈合的结缔组织形成中(Borensztajn K.等,2008,Factor Xa stimulatesproinflammatory and profibrotic responses in fibroblasts via protease-activated receptor-2activation,1:Am J Pathol.172(2):309-20)起重要作用。因此,本发明的胰蛋白酶样酶通过切割系锁配体而激活受体,随后该受体触发参与促进创伤愈合的生化过程。例如,可以有利地使用清创酶来溶解在非愈合性创伤上经常观察到的“纤维蛋白围袖”、除去坏死组织并触发由受体介导的免疫和细胞响应的反应。
本文在重组表达后首次在分子水平上描述和表征了来自丝光绿蝇的具有纤维蛋白水解活性、酪蛋白水解活性、PAR2激活活性和较宽的酶活性pH范围的蛋白酶。清创酶及其具有清创酶活性的片段具有如下能力:通过对创伤进行清创,即除去死组织并溶解纤维蛋白围袖,对缓慢愈合的创伤或慢性创伤进行处理或预处理从而使之易于经历自然愈合过程和/或接受常规医学治疗。此外,所用的涉及皮肤处理的化妆品可改善皮肤的外表或肌理。向创伤应用前肽会使该前肽通过酶促切割而转变为成熟蛋白。
本发明还涉及包含本发明的核酸分子(即,编码本说明书中所述的成熟蛋白、前肽或前肽原的核酸分子)的载体。此外,该载体可以包含编码上述片段的核酸分子。
本发明的载体能够引导本发明的核酸分子的复制和/或表达,或者/并且引导由所述核酸分子编码的多肽的表达。
优选的是,该载体为质粒、粘粒、病毒、噬菌体或在例如遗传工程中常规使用的其他载体。
例如在Studier等中(Studier,W.F.;Rosenberg A.H.;Dunn J.J.;Dubendroff J.W.,1990,Use of the T7 RNA polymerase to direct expression of cloned genes,Methods Enzymol.185,61-89)或在由Novagen、Promega、New England Biolabs、Clontech和Gibco BRL等公司提供的宣传册中,列有示例性的质粒和载体。其他优选的质粒和载体可见于:Glover,D.M.,1985,DNA cloning:a practical approach,第I-III卷,IRL Press Ltd.,Oxford;Rodriguez,R.L.和Denhardt,D.T.(编),1988,Vectors:a survey of molecularcloning vectors and their uses,179-204,Butterworth,Stoneham;Goedeel,D.V.,1990,Systems for heterologous gene expression,Methods Enzymol.185,3-7;Sambrook,J.;Russell,D.W.,2001,Molecular cloning:a laboratory manual,第三版,Cold SpringHarbor Laboratory Press,New York。
适合的载体的非限制性实例包括原核生物质粒载体,例如pUC系列、pBluescript(Stratagene)、pET系列表达载体(Novagen)或pCRTOPO(Invitrogen)、λgt11、pJOE、pBBR1-MCS系列、pJB861、pBSMuL、pBC2、pUCPKS、pTACT1,以及与在哺乳动物细胞中的表达相容的载体,如pREP(Invitrogen)、pCEP4(Invitrogen)、pMC1neo(Stratagene)、pXT1(Stratagene)、pSG5(Stratagene)、EBO-pSV2neo、pBPV-1、pdBPVMMTneo、pRSVgpt、pRSVneo、pSV2-dhfr、pIZD35、Okayama-Berg cDNA表达载体pcDV1(Pharmacia)、pRc/CMV、pcDNA1、pcDNA3(Invitrogene)、pSPORT1(GIBCO BRL)、pGEMHE(Promega)、pLXIN、pSIR(Clontech)、pIRES-EGFP(Clontech)、pEAK-10(Edge Biosystems)pTriEx-Hygro(Novagen)和pCINeo(Promega)。适合于毕赤酵母(Pichia pastoris)的质粒载体的实例包括例如质粒pAO815、pPIC9K和pPIC3.5K(全部来自Invitrogen)。
还可以将上文提及的本发明的核酸分子插入载体中从而产生与另一个核酸分子的翻译融合物。将由此产生的产物称作融合蛋白并且下文将对其进一步描述。所述另一个核酸分子可以编码例如可以使本发明的核酸分子所编码的蛋白溶解度提高和/或易于纯化的蛋白。非限制性实例包括pET32、pET41、pET43。载体还可以包含额外的可表达的核酸,所述核酸编码一种或多种用来促使蛋白正确折叠的分子伴侣。适合的细菌表达宿主包括例如源自BL21(如BL21(DE3)、BL21(DE3)PlysS、BL21(DE3)RIL、BL21(DE3)PRARE)或的菌株。
可以用来将编码本发明的丝氨酸蛋白酶的核酸导入宿主细胞的特别优选的质粒是:pUC 18/19(Roche Biochemicals)、pKK-177-3H(Roche Biochemicals)、pBTac2(RocheBiochemicals)、pKK223-3(Amersham Pharmacia Biotech)、pKK-233-3(Stratagene)和pET(Novagen)。在PCT/EP03/07148中列有其他适合的质粒。极特别优选的是以属于pET系列的质粒为基础的表达系统。
关于载体修饰技术,参见Sambrook和Russel,2001。通常,载体可以包含用于克隆或表达的一个或多个复制起点(ori)和遗传系统、用于在宿主中进行选择的一个或多个标记基因(例如,抗生素抗性)和一个或多个表达盒。适合的复制起点包括例如Col E1复制起点、SV40病毒复制起点和M 13复制起点。
插入载体中的编码序列可以例如用标准方法合成或从天然来源分离。通过使用成熟的方法,可以将编码序列连接至转录调控元件和/或其他氨基酸编码序列。确保在原核细胞或真核细胞中实现表达的转录调控元件(属于表达盒的一部分)为本领域技术人员所公知。这些元件包括确保转录开始的调控序列(例如,翻译起始密码子、启动子、增强子和/或绝缘子)、内部核糖体进入位点(IRES)(Owens等,2001)和可选的确保转录终止和转录物稳定的poly-A信号。额外的调控元件可以包括:转录及翻译增强子,和/或天然相关的或异源的启动子区域。优选的是,使本发明的核酸分子可操作地连接至使得可以在原核细胞或真核细胞中实现表达的此类表达控制序列。载体还可以包含编码分泌信号的核苷酸序列作为另外的调控元件。这些序列为本领域技术人员所公知。此外,根据所用的表达系统,可以在本发明的核酸分子的编码序列上添加能够将已表达的多肽引导至细胞区室的前导序列。这些前导序列在本领域中是公知的。经特别设计的载体使得DNA可以在不同宿主(例如细菌-真菌细胞,或细菌-动物细胞)间穿梭。
上文所述的本发明的核酸分子经设计可以直接导入细胞或通过脂质体、噬菌体载体或病毒载体(例如,腺病毒、逆转录病毒)导入细胞。此外,杆状病毒系统或基于牛痘病毒或塞姆利基森林病毒的系统可以作为载体用于本发明核酸分子的真核表达系统中。源自诸如逆转录病毒、牛痘病毒、腺相关病毒、疱疹病毒或牛乳头状瘤病毒等病毒的表达载体可以用来将核酸或载体递送至靶向细胞群中。可以使用本领域技术人员所公知的方法来构建重组病毒载体;参见例如Sambrook,2001和Ausubel,2001中描述的技术。
可使用的特别是用于大肠杆菌中的对实施本发明而言特别有利的启动子是技术人员已知的(Sambrook,J.;Fritsch,E.F.和Maniatis,T.(1989),Molecular cloning:alaboratory manual,第二版,Cold Spring Harbor Laboratory Press,New York)。其他适合的启动子是选自T7、lac、tac、trp、ara或可被鼠李糖诱导的启动子的那些。另外的启动子在下述文献中有所提及:Cantrell,SA(2003)Vectors for the expression ofrecombinant proteins in E.coli.Methods in Molecular biology 235:257-275;Sawers,G;Jarsch,M(1996)Alternative principles for the production of recombinant proteins inEscherichia coli.Applied Microbiology and Biotechnology 46(1):1-9。极特别优选的是在本发明的载体中使用T7启动子(Studier,W.F.;Rosenberg A.H.;Dunn J.J.;DubendroffJ.W.;(1990),Use of the T7 RNA polymerase to direct expression of cloned genes,Methods Enzymol.185,61-89;或由Novagen或Promega等公司提供的宣传册)。
允许在真核生物宿主细胞中表达的调控元件的实例有:酵母中的AOX1或GAL1启动子,或者哺乳动物及其他动物细胞中的CMV(巨细胞病毒)启动子、SV40启动子、RSV(劳氏肉瘤病毒)启动子、鸡β-肌动蛋白启动子、CAG启动子(鸡β-肌动蛋白启动子和巨细胞病毒立即早期增强子的组合)、gai10启动子、人类延长因子1α启动子、CMV增强子、CaM-激酶启动子、苜蓿尺蠖蛾(Autographa californica)核型多角体病毒(AcMNPV)多面启动子(polyhedral promoter)或球蛋白内含子。除了负责启动转录的元件外,此类调控元件还可以在所述核酸下游包含转录终止信号,例如SV40-poly-A位点或tk-poly-A位点或SV40、lacZ和AcMNPV多面多腺苷酸化信号。
与用于在大肠杆菌和其他细菌中进行培养的选择性标记基因(例如卡那霉素和氨苄青霉素抗性基因)的共转染使得能够鉴定并分离出已转染的细胞。
用于哺乳动物细胞培养的选择性标记基因是dhfr、gpt、新霉素、潮霉素抗性基因。还可以使转染的核酸扩增,从而表达大量的所编码的(多)肽。DHFR(二氢叶酸还原酶)标记物可用来建立携带兴趣基因的几百或甚至几千个拷贝的细胞系。其他有用的选择标记物是谷氨酰胺合成酶(GS)(Murphy等,1991;Bebbington等,1992)。
通过使用这些标记物,使细胞在选择性培养基中生长,从而选择出具有最高抗性的细胞。
在另一个实施方式中,本发明涉及用本发明的载体转化、转导或转染了的宿主细胞。
使用可以将包含本发明的核酸分子的载体克隆至其中的宿主细胞来复制和分离充足量的重组酶。用于此目的的方法为技术人员所公知(Sambrook,J.;Fritsch,E.F.和Maniatis,T.(1989),Molecular cloning:a laboratory manual,第二版,Cold Spring HarborLaboratory Press,New York)。
适合的原核生物宿主细胞包括例如埃希氏菌属的细菌,例如源自大肠杆菌BL21(例如BL21(DE3)、BL21(DE3)PlysS、BL21(DE3)RIL、BL21(DE3)PRARE、BL21codonplus、BL21(DE3)codon plus)、XL1Blue、NM522、JM101、JM109、JM105、RR1、DH5α、TOP 10、HB101或MM294的菌株。其他适合的细菌宿主细胞是链霉菌、沙门氏菌或芽胞杆菌,例如枯草芽胞杆菌。大肠杆菌菌株是本发明中优选的原核生物宿主细胞。
适合的真核生物宿主细胞是例如酵母(例如酿酒酵母(Saccharomyces cerevisiae)、多形汉森酵母(Hansenulapolymorpha)或毕赤酵母属(Pichia sp.),如巴斯德毕赤酵母(Ppastoris))、昆虫细胞(例如果蝇S2或甜菜夜蛾(Spodoptera)Sf9细胞)或植物细胞。
极特别优选的是存在于原核生物宿主大肠杆菌BL21和真核生物宿主巴斯德毕赤酵母中的表达系统。
可以使用的哺乳动物宿主细胞包括:人Hela、HEK293、H9和Jurkat细胞,小鼠NIH3T3和C127细胞,COS 1、COS 7和CV1,鹑QC1-3细胞,小鼠L细胞,Bowes黑色素瘤细胞,以及中华仓鼠卵巢(CHO)细胞。
本发明还涉及制造上述丝氨酸蛋白酶、其片段、前肽或前肽原的方法,所述方法包括培养本发明的宿主细胞并分离所产生的丝氨酸蛋白酶、片段、前肽或前肽原。
培养原核生物或真核生物宿主的适合条件为本领域技术人员所公知。例如,培养细菌的适合条件是,在通气条件下使细菌在Luria Bertani(LB)培养基中生长。为了提高产量和表达产物的溶解度,可以对培养基进行缓冲或向其补充已知会增强或促进产量和溶解度的适合的添加剂。大肠杆菌可以在4℃~约37℃下培养,确切的温度或温度顺序取决于待过表达的分子。通常,技术人员还知道这些条件可能必须经改良以适应宿主的需要和所表达的多肽的要求。在可诱导的启动子控制存在于宿主细胞中的载体中的本发明的核酸的情况下,可以通过添加适合的诱导剂来诱导多肽的表达。适合的表达操作规程和策略对技术人员来说是已知的。
根据细胞类型和其具体要求,可以在例如含有10%(v/v)FCS、2mM L-谷氨酰胺和100U/ml青霉素/链霉素的RPMI或DMEM培养基中进行哺乳动物细胞培养。可以将细胞保持在37℃的含5%CO2的水饱和的气氛中。
用于昆虫细胞培养的适合培养基是例如TNM+10%FCS或SF900培养基。昆虫细胞通常作为黏附培养物或悬液培养物在27℃生长。
用于真核细胞的适合的表达操作规程为技术人员所公知,并且可以从例如Sambrook,2001获得。
对所产生的多肽进行分离的方法在本领域中是公知的,其包括但不限于诸如离子交换色谱、凝胶过滤色谱(尺寸排阻色谱)、亲和色谱、高压液相色谱(HPLC)、反相HPLC、圆盘凝胶电泳或免疫沉淀等方法步骤,参见例如Sambrook,2001。
本发明还涉及由本发明的核酸分子编码的或通过本发明的方法产生的丝氨酸蛋白酶、其片段、前肽或前肽原。如已提到的,该丝氨酸蛋白酶亦称“清创酶”。
如上所述,本发明的丝氨酸蛋白酶的特征在于:(i)其源自丝光绿蝇,(ii)其显示出针对纤维蛋白、酪蛋白和Tosyl-Gly-Pro-Arg-AMC的蛋白水解活性,但对Suc-Ala-Ala-Phe-AMC无此活性,(iii)本发明的丝氨酸蛋白酶的针对酪蛋白和纤维蛋白的蛋白水解活性受到丝氨酸蛋白酶抑制剂PMSF和APMSF的抑制,和(iv)清创酶优选激活蛋白酶激活受体PAR-2。可以令人惊奇地展示出,其在pH5~10的较宽pH范围内具有活性(见图3B)。
如已提到的,本发明还涉及本发明的丝氨酸蛋白酶的前肽,其经切割而产生其活性形式,且优选是在治疗创伤前即刻切割或在治疗创伤的过程中切割。该前肽优选具有氨基酸序列SEQ ID NO:6,并且还优选由核酸序列SEQ ID NO:5编码。
在另一实施方式中,本发明涉及包含本发明的丝氨酸蛋白酶、本发明的丝氨酸蛋白酶的片段、本发明的前肽或本发明的前肽原的融合蛋白。
除了本发明的丝氨酸蛋白酶(清创酶)、其片段、前肽或前肽原的氨基酸序列外,本发明的融合蛋白包含至少一种额外的异种氨基酸序列。通常但不必定的是,这些额外序列将位于多肽的N端末尾或C端末尾。举例而言,可以方便地先将多肽作为融合蛋白表达,且可以例如利用能够特异性地修整本发明的多肽的蛋白酶来将额外的氨基酸残基从该融合蛋白中除去。
清创酶的示例性融合蛋白、其片段或清创酶的前肽(原)进一步包含能够发挥如下功能的肽或蛋白:介导融合蛋白黏附到创伤敷料中所含的基质上,从而使清创酶可以稳定地混入本发明的医药产品中。融合蛋白可以选自由表面活性蛋白或抗体及其片段组成的组。对抗体及其片段的性质将在下文结合本发明的抗体进行进一步的描述。
本发明还涉及包含本发明的丝氨酸蛋白酶、本发明的丝氨酸蛋白酶的或其片段的片段、本发明的前肽、本发明的前肽原、本发明的融合蛋白、本发明的核酸、本发明的载体、本发明的宿主细胞或其组合的组合物。
在优选实施方式中,该组合物是药物组合物。
根据本发明,术语“药物组合物”是指用于向患者施用、优选向人类患者施用的组合物。该药物组合物优选用于辅助治疗场合,即用于通过除去坏死组织和溶解纤维蛋白围袖(清创)而使缓慢愈合的创伤易于经历自然愈合过程或接受常规医学治疗。本发明的药物组合物包含单独的或以组合形式存在的上述化合物。该组合物可以是固体或液体形式,并且可以尤其是粉末形式、溶液或气溶胶形式、乳膏形式、软膏形式或凝胶形式。本发明的药物组合物可以可选地额外包含制药可接受的载剂。“制药可接受的载剂”意为任何类型的非毒性的固体、半固体或液体填充剂、稀释剂、包封材料或配制辅助剂。适合的药物载剂的实例在本领域中是公知的。可以通过公知的常规方法来配制包含此类载剂的组合物。该药物组合物可以进行局部施用。对应于适合的施用剂量的剂量方案将由主治医师和临床因素来决定,其可以尤其取决于创伤尺寸、创伤病况的阶段或严重程度。在用于局部应用的组合物中,上述化合物的浓度可以是0.001%~1%(w/w)、优选0.01%~0.1%(w/w)。对创伤的局部应用优选以每日应用一次或多于一次的方式重复进行。
上述化合物可以作为活性成分用在药物组合物中,所述药物组合物用于通过溶解纤维蛋白围袖而对慢性或缓慢愈合的创伤进行清创。本发明的药物组合物优选用于辅助治疗场合,即,用于通过除去坏死组织和溶解纤维蛋白围袖(清创)而使缓慢愈合的创伤易于经历自然愈合过程或接受常规医学治疗。
本发明的药物组合物可以与诸如敷料、创可贴或绷带等(固体)载剂或基质一起组合应用。化合物可以以共价方式或非共价方式与所述载剂或基质结合。可以将其应用到创伤上来促进伤口愈合。
例如,可以将化合物混入将在创伤上应用的敷料中。此类敷料的实例包括可选地覆盖有常规敷料的分阶段或分层的敷料,所述分段或分层的敷料含有包含创伤愈合材料的缓慢释放的水胶体颗粒或包含创伤愈合材料的海绵。将固定在创伤敷料基质中的药物组合物溶液的浓度通常为在0.001%~1%(w/v)、优选为0.01%~0.1%(w/v)。此外,可以将上述化合物混入能够以缓慢释放或控制型释放的方式将酶递送至创伤的适合材料中。
应当以适合的间隔(例如24小时)重复进行对创伤敷料的更新,直至完全除去纤维蛋白围袖和坏死组织。该敷料适用于包含坏死组织的任何创伤,包括下肢溃疡、褥疮、糖尿病足溃疡和烧伤。优选的是,该敷料包含一层吸收材料,例如水胶体、泡沫(例如聚氨酯泡沫)、海藻酸盐、壳聚糖,因此可以将其用在渗液创伤上并保护周围皮肤不被浸泡。创伤接触层可以涂覆有赋形剂(例如矿脂)从而防止敷料粘到创伤上。可以将本发明的化合物混入聚合材料(例如纤维素、聚乳酸酯、聚乙烯、丙烯酸共聚物)中并以不同方式整合至敷料中。在一个实施方式中,所述聚合材料以膜形式存在于敷料面向创伤的表面上。在与创伤床接触的敷料表面上需要高浓度的化合物,从而通过酶的高起始释放量而实现更有效的清创。该膜可以为层的形式,或者可以涂布在网上。
特别是对于三级烧伤的情况,可以在创伤清创疗法中使用含有清创酶(作为清创性酶)的创可贴。
在含有上述化合物(该化合物可选地包含在无菌载剂中)的制剂中,可以将液体形式的本发明的药物组合物喷洒到创伤区域上,或者将固体或液体形式的本发明的药物组合物混入待应用至创伤的载剂中。
在优选实施方式中,本发明的丝氨酸蛋白酶以其非活性形式包含在固体载剂(例如创伤敷料或绷带)中,并且在例如与创伤渗出液接触时可以通过以不同方式对上述前肽(原)进行切割而激活该丝氨酸蛋白酶。优选的是,根据渗出液的量,酶活性在敷料的推荐佩戴时间内持续。
本发明的药物组合物的凝胶制剂还包含至少一种在药物凝胶配制中常用的凝胶形成剂。凝胶形成剂的实例有:纤维素衍生物,例如甲基纤维素、羟乙基纤维素和羧甲基纤维素;乙烯聚合物,例如聚乙烯醇、聚乙烯吡咯烷酮;以及羧聚乙烯衍生物,例如卡波姆。可用于本发明的其他凝胶剂为果胶、树胶、海藻酸盐、琼脂和明胶。此外,凝胶或乳胶(emugel)制剂可以包含常用于此类制剂中的辅助剂,例如防腐剂、抗氧化剂、稳定剂、着色剂和香料。
在另一优选实施方式中,所述组合物是化妆品组合物。
本发明的化妆品组合物用于非治疗性应用。
通过其设计用途,还可以将化妆品组合物限定为设计用来擦抹、倾倒、喷洒、喷雾或以其它方式应用至人体的组合物,从而实现清洁、美化、增加吸引力或改变外表。
对本发明的化妆品组合物的具体制剂并无限制。所设想的制剂包括清洗液、乳剂、乳膏、乳液、凝胶(如水凝胶)、软膏、悬浮剂、分散体、粉末、固体涂棒、泡沫、喷雾或洗剂。为此目的,本发明的化妆品组合物还可以包含化妆品可接受的稀释剂和/或载剂。根据所需的制剂来选择适合的载剂和稀释剂属于技术人员的技能。适合的化妆品可接受的稀释剂和载剂为本领域所公知,并且包含Bushell等(WO 2006/053613)提到的试剂。所述化妆品组合物的优选制剂是清洗液和乳膏。
本发明的组合物在化妆品中的应用旨在以酶促方式处理皮肤以使皮肤剥蜕并使皮肤光滑,并且/或者干预瘢痕的形成。本发明的化合物在化妆品用途中的适合浓度为0.0001%~1%(w/v)、优选为0.0001%~0.1%(w/v)、更优选为0.001%~0.1%(w/v)。
本发明的化妆品组合物在单次应用中的优选应用量为0.1g~10g、更优选为0.1g~1g、最优选为0.5g。应用量还取决于待治疗的区域的尺寸,并且必须适应于该尺寸。
在另一方面,本发明涉及用于制备化妆品组合物的本发明的丝氨酸蛋白酶、本发明的丝氨酸蛋白酶的片段、本发明的前肽、本发明的前肽原、本发明的融合蛋白、本发明的核酸、本发明的载体或本发明的宿主细胞,所述化妆品组合物用于使皮肤剥蜕、使皮肤光滑或干预瘢痕的形成,且最优选为辅助疗法的形式。
本发明还涉及用于治疗创伤的本发明的丝氨酸蛋白酶、本发明的丝氨酸蛋白酶的片段、本发明的前肽、本发明的前肽原、本发明的融合蛋白、本发明的核酸、本发明的载体或本发明的宿主细胞。
对于将在上述化妆品应用和治疗应用中使用的包含本发明的化合物的组合物,其细节已在上文有所描述。
在优选实施方式中,创伤是慢性创伤或缓慢愈合的创伤。
在另一方面,本发明涉及治疗人类或非人类哺乳动物的创伤以促进其愈合的方法,所述方法包括向创伤应用治疗有效量的含有本发明的丝氨酸蛋白酶、其片段、前肽、前肽原、融合蛋白、核酸、载体或宿主细胞作为活性成分的无菌组合物。本发明亦涉及上述的本发明的化合物在制备或制造用于对创伤进行清创并溶解纤维蛋白围袖的医药产品(例如创可贴、敷料或绷带)中的应用。
本发明还涉及用于治疗伴有皮肤损伤和/或创伤愈合受影响的皮肤疾病的本发明的丝氨酸蛋白酶、本发明的丝氨酸蛋白酶的片段、本发明的前肽、本发明的前肽原、本发明的融合蛋白、本发明的核酸、本发明的载体或本发明的宿主细胞。此类皮肤损伤和/或受损的愈合的实例为银屑病、异位性皮炎、接触性皮炎以及湿疹和荨麻疹。
在优选实施方式中,本发明的组合物额外包含选自由另外的蛋白酶、核酸酶、赋形剂、抗微生物剂和止痛剂组成的组的至少一种成分。
清创过程以及敷料更换可能使患者感到疼痛,因此可以优选的是,将止痛剂(例如镇痛化合物或麻醉化合物)混入本发明的敷料中。
本发明的敷料还可以包含除酶之外的其它清创性组合物,其可以具有加和的或协同的清创效果。这种化合物的实例是尿素。
本发明还涉及与本发明的丝氨酸蛋白酶或其片段或者与本发明的丝氨酸蛋白酶的前肽或前肽原特异性地结合的抗体或其片段或衍生物。
本发明的抗体与上文中详细描述的丝氨酸蛋白酶(清创酶)或其具有上述清创酶活性的片段或者与本发明的丝氨酸蛋白酶的前肽或前肽原特异性地结合。
本发明抗体可以是例如多克隆抗体或单克隆抗体。术语“抗体”还包括仍保留有结合特异性的其衍生物或片段。此类片段包括尤其是Fab片段、F(ab′)2、Fv片段或scFv衍生物。制造抗体及其片段的技术为本领域所公知,并且在例如Harlow和Lane的″Antibodies,A Laboratory Manual″,Cold Spring Harbor Laboratory Press,1988以及Harlow和Lane的“Using Antibodies:A Laboratory Manual”Cold Spring HarborLaboratory Press,1998中有所描述。可以将这些抗体用于例如对清创酶或其片段进行的免疫沉淀或亲和纯化中。
本发明的抗体还包括诸如嵌合抗体、单链抗体和人源化抗体等实施方式。各种程序在本领域中是已知的并且可以用于产生此类抗体和/或片段。此外,可以对用于产生单链抗体的已有技术进行改造而使之适合于产生对上述清创酶或其片段等有特异性的单链抗体。还可以使用转基因动物来表达对清创酶或其片段有特异性的人源化抗体。最优选的是,本发明的抗体是单克隆抗体。对于制备单克隆抗体而言,可以使用提供由连续细胞系培养物产生的抗体的任何技术。此类技术的实例包括杂交瘤技术(和Milstein Nature 256(1975),495-497)、三源杂交瘤(trioma)技术、人类B细胞杂交瘤技术(Kozbor,Immunology Today 4(1983),72)和EBV杂交瘤技术,用来产生人单克隆抗体(Cole等,Monoclonal Antibodies and Cancer Therapy,Alan R.Liss,Inc.(1985),77-96)。可以使用BIAcore系统所采用的表面等离子共振来提高与上述化合物的表位结合的噬菌体抗体的效率(Schier,Human Antibodies Hybridomas 7(1996),97-105;Malmborg,J.Immunol.Methods 183(1995),7-13)。本发明的范围还涵盖的是,术语“抗体”包括可以在细胞中表达的抗体构建体,例如可以通过尤其是病毒或质粒载体而转染和/或转导的抗体构建体。一旦获得了本发明的抗体,可以对该抗体本身或编码其的DNA进行测序,从而为以重组方式小规模或大规模地生产本发明的抗体提供信息。产生重组抗体的方法对本领域技术人员而言是已知的。
本发明中,术语“特异性地结合”可与“特异性地相互作用”互换使用,其意思是抗体不会或基本不会与具有相似结构的表位发生交叉反应。可以对研究中的抗体组的交叉反应性进行测试,例如,通过评估该抗体组在常规条件下与兴趣表位的结合以及与(在结构上和/或功能上)或多或少紧密相关的多种表位的结合。仅将下述抗体认为是对兴趣表位有特异性并因此认为其为本发明的抗体:所述抗体与在其相关环境中的兴趣表位(例如,蛋白结构中的特定基序)结合,但不与或基本不与任何其他表位结合。相应的方法在例如上文所引用的Harlow和Lane,1988和1999中有所描述。
出于对本发明的优选实施方式进行说明性描述的目的,本文仅通过实例并参照附图对本发明进行描述。
所述附图显示了:
图1:在含有酪蛋白的琼脂上进行的扩散测定,显示了在分泌清创酶的大肠杆菌克隆周围的清亮区。
图2:在含有纤维蛋白的琼脂中进行的活性测定,显示了在清创酶活性样品A)生长于含纤维蛋白的基底上的清创酶阳性克隆周围的清亮区,B)用来自清创酶阳性重组大肠杆菌克隆的粗提取物进行的琼脂扩散测定;(a)未稀释的粗提取物,b)以1∶10稀释在PBS中,c)以1∶50稀释在PBS中。
图3:A)通过使用已知的丝氨酸蛋白酶抑制剂(PMSF)和胰蛋白酶样丝氨酸蛋白酶抑制剂(APMSF)而进行的用于鉴定重组清创酶活性特征的酶测定;B)pH值不同的缓冲液中的清创酶的活性测定,用来鉴定重组清创酶的pH特征。
图4:在基于细胞的受体测定中的PAR2的激活,所述测定使用HEK232细胞,并以Ca2+流作为读出。
图5:使用NCBI BLAST算法完成的对清创酶的前肽原氨基酸序列(A)及cDNA核苷酸序列(B)与最接近的邻近序列的比对,所述最接近的邻近序列为来自水泡麻蝇(Sarcophaga bullata)的胰蛋白酶样蛋白,该比对显示出76%的核苷酸序列同一性和蛋白序列同一性。(A)清创酶的信号肽由氨基酸1~16组成(该信号肽以粗体示出),前肽由氨基酸17~254组成(前肽氨基酸17~26以下划线标出),并且蛋白水解加工后的清创酶成熟多肽由氨基酸27~254组成。
图6:(A)培养物上清液的SDS-PAGE:1)离心后;2)预过滤(0.45μm);3)无菌过滤(0.22μm),前肽的分子量为25.7kDa;(B)活化的成熟清创酶的可视图像:5)在透析及随后的pH变化(从5.5到8)之后;6)亲和色谱柱流穿液(未结合的蛋白);7)洗柱液流穿液,8)~12)分别为分级的洗脱液1~5,(成熟蛋白的分子量为24.6kDa)。
以下实施例阐明了本发明。
实施例
一般方法和材料
从丝光绿蝇中分离出不同幼虫期的mRNA
2日龄的绿蝇(丝光绿蝇)蛆购自BioMonde(BioMonde,22885 Barsbüttel,德国)。在血琼脂(含10%牛血的1.5%(w/v)的琼脂)上进行24小时(2龄期)的喂食以提高蛋白酶产量,而后分离总RNA,并且在3天后当在3龄期中的酶产量显著降低时分离总RNA(Chambers等,2000,Degradation of extracellular matrix components by definedproteinases from the greenbottle larva Lucilia sericata used for the clinical debridement ofnon-healing wounds,Brit J Dermatol.148:14-23)。为了分离总RNA,用液氮对3只幼虫(约30mg)进行速冻并进行机械粉碎。使用试剂盒“总RNA分离,NucleoSpin RNAII”(购自Macherey-Nagel,52313 Düren,德国)分离RNA,产生了47μg总RNA。
从分离自丝光绿蝇幼虫的总RNA生成大肠杆菌cDNA文库
依照“SMART cDNA文库构建试剂盒用户手册”(CLONTECH Laboratories,Inc.)从所述丝光绿蝇RNA生成了cDNA文库。对最终连接反应物的体外包装及随后对大肠杆菌XL-1Blue的转化产生了1.5×10E6个原代空斑形成单位。
收集原代噬菌体并将其储存在-80℃的包含7%DMSO的噬菌体稳定缓冲液中,以用于在大肠杆菌中进行后续的感染和质量切除(mass excision)。
依照“SMART cDNA文库构建试剂盒用户手册”(CLONTECH Laboratories,Inc.),通过“Cre”重组酶介导的对嵌有噬菌体的质粒的质量切除,将λ噬菌体文库转化为相应的质粒文库。
通过限制性切割分析测试了该文库的异源性和品质。
在丝光绿蝇cDNA文库中鉴定蛋白酶
在选择性条件下在含有2%脱脂乳的琼脂培养基上对经上述质量切除而产生的菌落形成单位进行了筛选。异种蛋白酶的表达由包含可诱导的Plac启动子的载体驱动。根据在浑浊脱脂乳培养基中菌落周围的清亮区的形成,检测出了表达异种蛋白酶的菌落。
从大肠杆菌培养表达培养物中分离并纯化清创酶蛋白
为了获得具有表征酶的足够酶活性的清创酶的酶样品,使用了表达相应蛋白酶的cDNA克隆或在常见表达载体(例如pET26b-载体(Novagen))中建立的更适合的表达构建体,并使用了适合的表达宿主(例如大肠杆菌Rosetta(DE3)(Novagen))。为了构建表达构建体,对相应的清创酶基因进行PCR扩增,从而在开放阅读框(ORF)的上游和下游引入独特的限制酶识别序列,其使得编码蛋白酶的基因以确定的方式连接到表达载体(例如pET26b)上。对限制酶识别序列,根据其不存在于清创酶基因的编码区中来进行选择,并且其可以是例如NdeI、HindIII、EcoRI、XhoI。通过对克隆后的扩增子进行测序,确认了不存在因聚合酶的错误扩增而产生的不需要的第二位点突变。
用cDNA克隆或表达构建体来进行接种,例如对1L的爱伦美氏瓶中的200ml补充有适当抗生素的培养基进行接种。使用了LB培养基和如下浓度的抗生素:100μg/ml的氨苄青霉素、25μg/ml的卡那霉素、12.5μg/ml的氯霉素。将起始光密度(OD580)调整至0.05,随后使细胞在旋转振荡器上于28℃生长。当光密度值达到约1时,通过添加浓度为20μM~500μM的IPTG来诱导从pTriplEx2(Clontech)的lac启动子进行的表达或从来自pET载体系列的载体(例如pET26)的T7启动子进行的表达。诱导4~20小时后,离心收集细胞。将细胞沉淀物重悬浮在pH为7.0的5ml 1×PBS中,通过超声来破碎细胞。
对于包含信号序列的完整蛋白,清创酶的分子量为27.4kDa,而假想前肽的分子量为25.7kDa,成熟蛋白的分子量为24.6kDa。
针对纤维蛋白水解活性的固相活性测定
为了鉴定降解酪蛋白的克隆的提取物中的纤维蛋白水解活性,使用了固体琼脂测定。为此,将含200mg琼脂糖、87mg NaCl和3mg CaCl2的溶液A添加到pH为7.4的10ml 0.1M Tris中并于50℃进行温育。将20μl纤溶酶原(2单位/毫克,Sigma P7397)添加到含10ml 0.9%NaCl和100mg纤维蛋白(Sigma F3879)的第二溶液B中,并于50℃进行预温育。将这两种溶液与12μl凝血酶(175~350NIH单位,Sigma T4265)合并,并使用微孔形成器件将其涂布在琼脂平板上。如果存在纤维蛋白水解活性,在含有提取物的孔洞周围的不透明培养基中会出现清亮区。
为了鉴定降解酪蛋白的克隆中的纤维蛋白水解活性,使用了固体琼脂测定。因此,于50℃温育由含有200mg琼脂糖、87mg NaCl和3mg CaCl2的10ml 2×Luria Bertani组成的培养基A。将20μl纤溶酶原(2单位/毫克,Sigma P7397)添加到含10ml 0.9%NaCl和100mg纤维蛋白(Sigma F3879)的溶液B中,并于50℃进行预温育。将这两种溶液与12μl凝血酶(175~350NIH单位,Sigma T4265)和用于进行选择的适当的抗生素合并,并在无菌条件下将其倾倒在琼脂平板上,从而形成不透明的琼脂培养基。如果存在由异种克隆表达的纤维蛋白水解活性,过夜温育后在菌落周围会出现清亮区。
液相活性测定和抑制性特征描述
通过在96孔板中进行的以BODIPY-FL-酪蛋白(Molecular Probes)为底物的荧光测定,对蛋白水解活性进行了定量。因此,在未消化的底物酪蛋白上,标签分子彼此紧密接触,从而通过淬灭机制而抑制了荧光。如果发生水解,这些分子会彼此分离,而且可以在485nm激发荧光并在520nm进行测量。
标准测定含有在100μl PBS缓冲液中的5μg/ml BODIPY-FL-酪蛋白和蛋白酶提取物的一系列稀释液。于37℃温育样品60分钟,随后使用分光光度计(NovoStar,BMGLABTECH,Offenburg,德国)来测量荧光,并使用以下参数:激发485nm,发射520nm,增益5,一个循环,10次闪光。使用了丝氨酸蛋白酶抑制剂APMSF (4-脒苯基甲磺酰氟)和PMSF(苯甲基磺酰氟)来测试分离出的蛋白酶的特异性。使用了以下测定浓度:
PMSF=丝氨酸蛋白酶抑制剂 5mmol/l
APMSF=胰蛋白酶样丝氨酸蛋白酶抑制剂 1mmol/l
以下实例是说明性的,但并不限制本发明的范围。在此可以进行合理的修改(例如本领域技术人员想到的那些)而不背离本发明的范围。
巴斯德毕赤酵母表达培养物
本发明的丝氨酸蛋白酶(即清创酶)的异源表达是在甲基营养酵母巴斯德毕赤酵母中进行的,食品和药物管理局将该酵母分类为GRAS生物体并因此确立用于药物生产过程。使用了整体载体系统来进行表达,该系统提供可被甲醇诱导的启动子。为了促进在毕赤酵母中的高效分泌,用载体编码的因子来自酿酒酵母的信号序列替换了清创酶的原生信号肽(″MFRFVALFAFVSCALA″)。
在第一批阶段,在以甘油为唯一碳源的矿质培养基中进行发酵。在消耗掉首批甘油后,启用分批补料模式(fed batch mode)。通过在基因表达过程中补充作为诱导物/碳源的甲醇和作为额外的非抑制性饲料的山梨醇,开始对异源表达进行诱导。
在导致达到约600的光密度的分批/分批补料(FB)阶段后,培养物达到了稳定生长期。通过添加MeOH来开始进行诱导。为了防止异种酶在此时以自动催化方式发生活化,使过程温度从30℃降到20℃。在该过程末期通过补料来支持清创酶的表达。在纯化程序中(见下文),通过将培养基的pH从5.5提升到6.8而实现了前肽的自动催化活化。
从巴斯德毕赤酵母培养表达培养物中提纯清创酶蛋白
通过使用与琼脂糖凝胶运载材料偶联的丝氨酸蛋白酶抑制剂苯酰胺(GEHealthcare)的亲和色谱来进行纯化。在除去未结合的纯化蛋白后,使用添加有游离苯酰胺的缓冲液进行竞争性洗脱,从而收集了纯化的本发明的丝氨酸蛋白酶。后续程序的SDS PAGE可见于图6中。在随后以柠檬酸盐储存缓冲液为背景进行透析后,将纯化的蛋白冻干,呈白色干粉。
对以重组方式表达的清创酶进行的N端测序
为进行Edman测序,将印迹放置在样品制备盒中。为确定氨基酸序列,使用了蛋白质测序仪Procise 492(Applied Biosystems)。根据制造商的建议使用了试剂和操作规程。使用适当的软件(Applied Biosystems)分析了得到的色谱图。在测试每个样品前,先测试标准样品和空白样品。
实施例1
在从丝光绿蝇生成的表达文库中筛选蛋白酶
对含有8×10E6个原代克隆的噬菌体文库进了了蛋白酶表达筛选。为此,依照“SMART cDNA文库构建试剂盒用户手册”(CLONTECH Laboratories,Inc.),与f1型辅助噬菌体一起对大肠杆菌进行共转染,将噬菌体文库转移到了质粒文库中。所得的克隆含有从噬菌体载体切下的原有质粒。
通过从代表性克隆中分离出40个质粒,对质粒文库的异源性进行了测试。实际上,每个质粒都含有插入序列,而且这些插入序列在尺寸上显示出完全多样性。在选择性条件下,在含有2%脱脂乳的固体培养基上对总共3×10E5个cfu进行了筛选。
通过对来自这些形成晕圈的菌落中16个菌落的质粒DNA进行分离和测序,鉴定出了与来自水泡麻蝇的胰蛋白酶样酶在氨基酸水平上的同一性为76%的蛋白酶的前肽原序列(SEQ ID NO:2)。
实施例2
对纤维蛋白水解蛋白酶的表征
在上述琼脂平板测定中进行了对纤维蛋白水解活性的鉴定。通过在含浑浊纤维蛋白底物的营养琼脂上将重组细胞划痕培养,鉴定出了表达纤维蛋白水解活性的菌落。在37℃下进行过夜温育后,带有鉴定出的蛋白酶的含有质粒的细胞在菌落周围显示出清亮区。
使用经缓冲的含纤维蛋白的琼脂培养基,确定了不含细胞的粗提取物中的纤维蛋白水解活性。平板具有容量最多为200μl的孔,这些孔是在琼脂培养基固体化过程中通过使用微孔板器件而形成的。对重组细胞进行超声并将所得的提取物离心,置于琼脂孔中并于37℃过夜温育。通过在含有蛋白酶基因SEQ ID NO:1的重组克隆所在的微孔的周围形成的清亮区,检测出了具有纤维蛋白水解活性的粗提取物。
实施例3
对纤维蛋白水解蛋白酶的特征描述
在96孔板中进行的液体测定中,使用不同类型蛋白酶的特异性抑制剂,鉴定了重组蛋白酶的类型。此处测量了胰蛋白酶的特异性抑制剂(4-脒苯基甲磺酰氟,APMSF)、丝氨酸蛋白酶的特异性抑制剂(苯甲基磺酰氟,PMSF)、天冬氨酸蛋白酶的特异性抑制剂(胃酶抑素A)和金属型蛋白酶的特异性抑制剂(1,10-二氮杂菲)。如图3A所示,对重组克隆的抑制剂特征描述提示了胰蛋白酶活性,这与SEQ ID NO:2与BLAST数据库间的比较性氨基酸序列比对数据对应,所述比对数据显示出与来自水泡麻蝇的酶具有最接近的同源性,即76%(图5)。
实施例4
不同pH值时的稳定性
在液体测定中,使用3~10的适当缓冲系统(0.1M~0.2M柠檬酸缓冲液,pH为3~7;0.05M Tris缓冲液,pH为8;0.1M碳酸盐缓冲液,pH为9~10)和荧光底物Z-Gly-Gly-Arg-AMC,测量了清创酶的活性。用BMC Novostar荧光计(λ激发=365nm;λ发射=440nm)测量了7-氨基-4-甲基香豆素(AMC)的释放。其结果示于图3B中。清创酶在5~10的pH范围内显示出酶活性,这与创伤环境的类似宽度的pH范围对应。
实施例5
PAR2的激活(钙成像)
在基于细胞的荧光测定中,通过使用内源性地表达人PAR2的野生型HEK293细胞系,监测了清创酶随时间的作为PAR2激动剂的活性。简言之,在执行测定的前1天,将表达人PAR2的HEK293细胞以每孔45,000个细胞的密度平板接种至96孔黑壁测定板上。使用96孔微孔板读取仪(Molecular Devices,Sunnyvale,CA),通过使用对钙敏感的荧光染料fluo-4(激发494nm,发射516nm),对细胞钙浓度的变化进行了监测。使用PAR2激动剂胰蛋白酶(8nM)作为阳性对照。在添加了补充有激动剂的50μl测定缓冲液(118mM NaCl;4.7mM KCl;1.2mM MgSO4;1.2mMKH2PO4;4.2mM NaHCO3;1.3mM CaCl2;10mM HEPES(pH:7.4))后,将平板中载有染料的细胞放置在荧光微孔板读取仪上以监测荧光(激发488nm,发射520nm)变化。将钙动员定量为相对于基准水平(F)的峰值荧光变化(ΔF)。数据以重复的独立样品的ΔF/F值(=RFU,相对荧光单位)的平均值S.E.表示。用软件进行分析。
实施例6
成熟清创酶的前10个氨基酸的序列
该实施例的目的是通过N-端Edman测序来确定前10个氨基酸的序列。从N端成功地进行了对样品(来自图6B中泳道5的蛋白)的测序。检测到了以下主序列:
IVNGVDTTIQ
该序列与对一级序列(图5A)的分析所提出的成熟蛋白对应。
实施例7
清创酶的分子性质和酶性质
表1:清创酶的分子性质和酶性质概览
*在使用Z-Gly-Gly-Arg-AMC为底物的荧光计量测定中测得
Claims (15)
1.一种核酸分子,所述核酸分子
(i)编码具有纤维蛋白和酪蛋白切割能力的丝氨酸蛋白酶,所述核酸分子为:
(a)编码包含氨基酸序列SEQ ID NO:4或由氨基酸序列SEQ ID NO:4组成的丝氨酸蛋白酶的核酸分子;
(b)包含核苷酸序列SEQ ID NO:3或由核苷酸序列SEQ ID NO:3组成的核酸分子;
(c)编码氨基酸序列与(a)中所述的氨基酸序列具有至少80%同一性、优选至少85%同一性、更优选至少90%同一性且最优选至少95%同一性的丝氨酸蛋白酶的核酸分子;
(d)由与(b)中所述的核苷酸序列具有至少80%同一性、优选至少85%同一性、更优选至少90%同一性且最优选至少95%同一性的核苷酸序列组成或包含该核苷酸序列的核酸分子;
(e)与(d)所述的核酸分子简并的核酸分子;或
(f)与(a)~(d)中任一项的核酸分子对应的其中T被U置换的核酸分子;
(ii)编码(i)中所述的丝氨酸蛋白酶的片段,所述片段与(i)中所述的丝氨酸蛋白酶活性相同;
(iii)编码(i)中所述的丝氨酸蛋白酶的前肽,所述前肽在治疗创伤前即刻或在治疗创伤过程中被切割为其活性形式,其中,所述前肽由选自下述核酸分子(a)~(f)的核酸分子编码:
(a)编码包含氨基酸序列SEQ ID NO:6或由氨基酸序列SEQ ID NO:6组成的丝氨酸蛋白酶前肽的核酸分子;
(b)包含核苷酸序列SEQ ID NO:5或由核苷酸序列SEQ ID NO:5组成的核酸分子;
(c)编码氨基酸序列与(a)中所述的氨基酸序列具有至少80%同一性、优选至少85%同一性、更优选至少90%同一性且最优选至少95%同一性的丝氨酸蛋白酶前肽的核酸分子;
(d)由与(b)中所述的核苷酸序列具有至少80%同一性、优选至少85%同一性、更优选至少90%同一性且最优选至少95%同一性的核苷酸序列组成或包含所述核苷酸序列的核酸分子;
(e)与(d)所述的核酸分子简并的核酸分子;或
(f)与(a)~(d)中任一项的核酸分子对应的其中T被U置换的核酸分子;或者
(iv)编码(i)中所述的丝氨酸蛋白酶的前肽原,其中,所述前肽原由选自下述核酸分子(a)~(f)的核酸分子编码:
(a)编码包含氨基酸序列SEQ ID NO:2或由氨基酸序列SEQ ID NO:2组成的丝氨酸蛋白酶前肽原的核酸分子;
(b)包含核苷酸序列SEQ ID NO:1或由核苷酸序列SEQ ID NO:1组成的核酸分子;
(c)编码氨基酸序列与(a)中所述的氨基酸序列具有至少80%同一性、优选至少85%同一性、更优选至少90%同一性且最优选至少95%同一性的丝氨酸蛋白酶前肽原的核酸分子;
(d)由与(b)中所述的核苷酸序列具有至少80%同一性、优选至少85%同一性、更优选至少90%同一性且最优选至少95%同一性的核苷酸序列组成或包含所述核苷酸序列的核酸分子;
(e)与(d)所述的核酸分子简并的核酸分子;或
(f)与(a)~(d)中任一项的核酸分子对应的其中T被U置换的核酸分子。
2.一种载体,所述载体编码权利要求1的核酸分子。
3.一种宿主细胞,所述宿主细胞转化、转导或转染有权利要求2的载体。
4.一种制备丝氨酸蛋白酶及其片段、前肽或前肽原的方法,所述方法包括培养权利要求3的宿主细胞并分离出所产生的所述丝氨酸蛋白酶、所述片段、所述前肽或所述前肽原。
5.一种由权利要求1的核酸分子编码或通过权利要求4的方法制备的丝氨酸蛋白酶、片段、前肽或前肽原。
6.一种融合蛋白,所述融合蛋白包含权利要求5的丝氨酸蛋白酶、片段、前肽或前肽原。
7.一种组合物,所述组合物包含:权利要求1的核酸,权利要求2的载体,权利要求3的宿主细胞,权利要求5的丝氨酸蛋白酶、片段、前肽或前肽原,或权利要求6的融合蛋白,或它们的组合。
8.如权利要求7所述的组合物,所述组合物是化妆品组合物。
9.如权利要求7所述的组合物,所述组合物是药物组合物。
10.用于制备化妆品组合物的权利要求1的核酸、权利要求2的载体、权利要求3的宿主细胞、权利要求5的丝氨酸蛋白酶、片段、前肽或前肽原或者权利要求6的融合蛋白,所述化妆品组合物用于使皮肤剥蜕、使皮肤光滑或干预瘢痕的形成。
11.用于治疗创伤的权利要求1的核酸、权利要求2的载体、权利要求3的宿主细胞、权利要求5的丝氨酸蛋白酶、片段、前肽或前肽原或者权利要求6的融合蛋白。
12.如权利要求11所述的核酸、载体、宿主细胞、丝氨酸蛋白酶、片段、前肽、前肽原或融合蛋白,其中,所述创伤是慢性创伤或缓慢愈合的创伤。
13.用于治疗伴有创伤愈合受影响的皮肤疾病的权利要求1的核酸、权利要求2的载体、权利要求3的宿主细胞、权利要求5的丝氨酸蛋白酶、片段、前肽或前肽原或者权利要求6的融合蛋白。
14.如权利要求10~12中任一项所述的组合物,所述组合物还包含选自由另外的蛋白酶、核酸酶、赋形剂、抗微生物剂和止痛剂组成的组的至少一种成分。
15.一种与权利要求5的丝氨酸蛋白酶、片段、前肽或前肽原特异性地结合的抗体或者其片段或衍生物。
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