CN102388066B - 具有对于人il-13的结合特异性的抗体分子 - Google Patents

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Abstract

本发明涉及具有对于人IL-13的抗原决定簇的特异性的抗体分子、所述抗体分子的治疗用途和用于产生所述抗体分子的方法。

Description

具有对于人IL-13的结合特异性的抗体分子
本发明涉及IL-13抗体和其片段例如其结合片段、包含所述抗体或其片段的组合物，并且特别地涉及它们在多种疾病包括哮喘、变态反应、COPD、纤维化和/或癌症的预防和/或治疗中的用途。
发明背景
IL-13是与IL-4共有25％序列同一性的短链细胞因子。其包含约132个氨基酸，形成覆盖残基10-21(A螺旋)、43-52(B螺旋)、61-69(C螺旋)和92-110(D螺旋)的4个螺旋以及覆盖残基33-36和87-90的2个β-链的二级结构。IL-13的溶液结构已被解析，其显示对于IL-4(Eisenmesser 2001)也观察到的预测的上-上-下-下(up-up-down-down)四螺旋束构象。
人IL-13是从活化的T细胞克隆的17-kDa糖蛋白(Zurawski和deVries 1994 Immunol Today 1519-26)，并且由Th2谱系的活化的T细胞产生，虽然Th0和Th1 CD4+T细胞、CD8+T细胞以及几种非T细胞群体例如肥大细胞也产生IL-13(Zurawski和de Vries 1994 Immunolloday 1319-26)。
IL-13的功能包括：
●在人B细胞中将免疫球蛋白同种型转换为IgE(Punnonen，Aversa等人1993 Proc Natl Acad Sci USA 903730-4)和
●在人和小鼠中抑制炎性细胞因子产生(de Waal Malefyt，Figdor等人1993 J Immunol 1516370-81；Doherty，Kastelein等人1993J Immunol 1517151-60)。
IL-13结合其细胞表面受体IL-13Rα1和IL-13Rα2。IL-13Rα1以低亲和力(KD-10nM)与IL-13相互作用，随后招募IL-4Ra形成高亲和力(KD约0.4nM)信号转导异二聚体受体复合物(Aman，Tayebi等人1996 J Biol Chem 271 29265-70；Hilton，Zhang等人1996 Proc NatlAcad Sci USA 93 497-501)。
IL-4R/IL-13Rα1复合物在许多细胞类型例如B细胞、单核细胞/巨噬细胞、树突细胞、嗜酸性粒细胞、嗜碱性粒细胞、成纤维细胞、内皮细胞、气道上皮细胞和气道平滑肌细胞上表达(Graber，Gretener等人1998 Eur J Immunol 28 4286-98；Murata，Husain等人1998 IntImmunol 10 1103-10；Akaiwa，Yu等人2001 Cytokine 1375-84)。
IL-13Rα1/IL-4R受体复合物的连接导致多种信号转导途径，包括信号转导子及转录激活物(ST AT6)和胰岛素受体底物-2(IRS-2)途径的活化(Wang，Michieli等人1995 Blood 864218-27；Takeda，Kamanaka等人1996 J Immunol 157 3220-2)。
单独的IL-13Rα2链对IL-13具有高亲和力(KD约0.25-0.4nM)，并且用作负调节IL-13结合的诱饵受体(Donaldson，Whitters等人1998 J Immunol 161 2317-24)和在巨噬细胞以及可能的其他细胞类型中通过AP-I途径诱导TGF-b合成和纤维化的信号转导受体(Fichtner-Feigl，Strober等人2006 Nat Med 12 99-106)。
在哮喘的临床前动物模型中进行的几个研究显示，IL-13在哮喘中起着重要作用。这些数据包括IL-13敲除小鼠对哮喘的抗性以及在多种小鼠模型中IL-13拮抗剂(可溶性IL-13受体、抗-IL-13mAb等)对哮喘表型的抑制(SeIa 1999 Harefuah 137 317-9；Wills-Karp和Chiaramonte 2003 Curr Opin PuIm Med 9 21-7；Wills-Karp 2004Immunol Rev 202 175-90)。多个研究已显示，重组IL-13至小鼠以及豚鼠的肺的药理施用诱导气道粘液过度分泌、嗜酸性粒细胞增多症和AHR(Grunig，Warnock等人1998 Science 282 2261-3；Wills-Karp，Luyimbazi等人1998 Science 282 2258-61；Kibe，Inoue等人2003AmJ Respir Crit Care Med 167 50-6；Vargaftig和Singer 2003 Am JPhysiol Lung Cell MoI Physiol 284 L260-9；Vargaftig和Singer 2003Am J Respir Cell MoI Biol 28 410-9)。
IL-13的这些作用在具有IL-13的组成型或诱导型表达的转基因小鼠中得到重现(Zhu，Homer等人1999 J Clin Invest 103 779-88；Zhu，Lee等人2001 Am J Respir Crit Care Med 164 S67-70；Lanone，Zheng等人2002 J Clin Invest 110463-74)。IL-13的慢性转基因过表达也诱导上皮下纤维化和肺气肿。在IL-13(和IL-4)信号转导分子STAT6中具有缺陷的小鼠不能发生变应原诱导的AHR和粘液过度产生(Kuperman，Huang等人2002 Nat Med 8 885-9)。利用可溶性IL-13受体融合蛋白(sDL-13Rα2Fc)的研究已证明该细胞因子在实验性变应原卵白蛋白(OVA)-诱导的气道疾病中的中枢作用(Grunig，Warnock等人1998 Science 282 2261-3；Wills-Karp，Luyimbazi等人1998Science 282 2258-61；Taube，Duez等人2002 J Immunol 169 6482-9)。
也在鼠类哮喘的慢性模型中证明了抗-IL-13治疗的功效。除了展示粘液过度分泌和AHR的特征外，该慢性哮喘模型还显示了在更急性的模型中不存在的人疾病的几个标志。此类标志包括位于上皮间间隙中的肺组织的嗜酸性粒细胞增多以及平滑肌纤维化，如通过胶原沉着的增加测量的。通过每周1次用OVA重复气雾剂攻击OVA-致敏的小鼠，进行总共4周来诱导慢性哮喘模型。在最后2周的OVA攻击中施用抗-IL-13抗体(从第36天开始，在研究的第53天评估功效)，显著抑制AHR、肺炎症、杯形细胞增生、粘液过度分泌和气道纤维化(Yang，Li等人2005J Pharmacol Exp Ther)。
也在灵长类动物哮喘模型中证明了IL-13拮抗剂抑制AHR的治疗效果(American Thoracic Society，San Diego 2005)。
IL-13牵涉人哮喘的发病机制，因为已在哮喘患者的肺中检测到与疾病的严重度相关的升高水平的IL-13mRNA和蛋白质(Huang，Xiao等人1995 J Immunol 155 2688-94)。此外，导致升高的IL-13水平的人IL-13遗传多态性已被鉴定并且与哮喘和特应性相关(Heinzmann，Mao等人2000 Hum MoI Genet 9 549-59；Hoerauf，Kruse等人2002Microbes Infect 4 37-42；Vercelli 2002 Curr Opin Allergy ClinImmunol 2 389-93；Heinzmann，Jerkic等人2003 J Allergy ClinImmunol 112 735-9；Chen，Ericksen等人2004 J Allergy Clin Immunol114 553-60；Vladich，Brazille等人2005 J Clin Invest)，并且已在哮喘患者的肺中检测到升高的IL-13水平(Huang，Xiao等人1995 JImmunol 155 2688-94；Arima，Umeshita-Suyama等人2002 J AllergyClin Immunol 109 980-7；Berry，Parker等人2004 J Allergy ClinImmunol 114 1106-9)。已证明了IL-13与哮喘之间的遗传连锁，因为在IL-13基因中具有引起更高的血浆IL-13水平的多态性的个体具有增加的发生特应性和哮喘的风险(Wills-Karp 2000 Respir Res 119-23)。
由于人IL-13在多种人病症中的作用，因此已设计治疗策略来抑制或抵消IL-13活性。特别地，已寻找结合及中和IL-13的抗体来作为抑制IL-13活性的手段。然而，本领域存在对能够结合IL-13特别是人IL-13的适当的和/或改进的抗体的需要。特别地，所述抗体能够中和人IL-13。本发明提供了能够以高亲和力结合人IL-13以及结合并且中和人IL-13的结合蛋白、CDR移植抗体、人源化抗体和其片段的新型家族。
发明概述
本发明涉及新型IL-13特异性抗体及其片段，例如IL-13结合片段，特别是中和抗体和片段。
附图概述
图1显示：
来自重链(CDR H)的CDR1、2、3和来自轻链(CDR L)的CDR1、2、3的每一个的氨基酸序列，
大鼠抗体轻链可变区的氨基酸序列，
大鼠抗体轻链可变区的DNA序列，和
具有信号序列的大鼠抗体轻链可变区的氨基酸序列。
图2显示：
具有信号序列的大鼠抗体轻链可变区的DNA序列，
大鼠抗体轻链可变区和恒定区的氨基酸序列，
大鼠抗体轻链可变区和恒定区的DNA序列，
具有信号序列的大鼠抗体轻链的氨基酸序列。
图3显示：
具有信号序列的大鼠抗体轻链的DNA序列，
大鼠抗体重链可变区的氨基酸序列，
大鼠抗体重链可变区的DNA序列，
具有信号序列的大鼠抗体重链可变区的氨基酸序列。
图4显示：
具有信号序列的大鼠抗体重链可变区的DNA序列，
大鼠抗体重链可变区和恒定区的氨基酸序列。
图5显示：
大鼠抗体重链可变区和恒定区的DNA序列，
具有信号序列的大鼠抗体重链可变区和恒定区的氨基酸序列。
图6显示：
具有信号序列的大鼠抗体重链可变区和恒定区的DNA序列。
图7显示：
人源化抗体轻链可变区的氨基酸序列，
人源化抗体轻链可变区的DNA序列，
具有信号序列的人源化抗体轻链可变区的氨基酸序列，
具有信号序列的人源化抗体轻链可变区的DNA序列，
人源化抗体轻链可变区和恒定区的氨基酸序列。
图8显示：
人源化抗体轻链可变区和恒定区的DNA序列，
具有信号序列的人源化抗体轻链可变区和恒定区的氨基酸序列，
具有信号序列的人源化抗体轻链可变区和恒定区的DNA序列。
图9显示：
人源化抗体重链可变区的氨基酸序列，
人源化抗体重链可变区的DNA序列，
具有信号序列的人源化抗体重链可变区的氨基酸序列，
具有信号序列的人源化抗体重链可变区的DNA序列，
人源化抗体重链可变区和恒定区的氨基酸序列。
图10显示：
人源化抗体重链可变区和恒定区的DNA序列，
具有信号序列的人源化抗体重链可变区和恒定区的氨基酸序列，
人源化抗体重链可变区和恒定区的DNA序列。
图11显示人VK 1 2-1-(1)02 JK4受体构架(acceptor framework)以及VH2 3-1 2-26 JH4受体构架的氨基酸和DNA序列。
图12显示大鼠的轻链、受体构架和人源化轻链的比对以及重链的比对。CDR以粗体和下划线标示。供体残基G49和R71以粗体、斜体和高亮突出显示。
图13.在变应原攻击后24小时测量的Ab652对BAL嗜酸细胞活化趋化因子-3的作用。数据表示为平均值±SEM，n＝4-8/组。
图14.在变应原攻击后24小时测量的Ab652对BAL嗜酸性粒细胞计数的作用。将数据针对在研究的筛选期测量的BAL嗜酸性粒细胞计数进行标准化。平均值±SEM，n＝4-8/组。
图15.在变应原攻击后测量直至15分钟的Ab652对峰值气道阻力的作用。将数据表示为平均值±SEM，n＝4-8/组。
图16.在变应原攻击后24小时测量的Ab652对气道阻力的作用。将数据针对在暴露于变应原之前测量的气道阻力进行标准化。平均值±SEM，n＝4-8/组。
根据由Kabat等人设计的系统常规地给抗体可变结构域中的残基编号。该系统示于Kabat等人，1987，Sequences of Proteins ofImmunological Interest，US Department of Health and HumanServices，NIH，USA(在下文中简写为“Kabat等人(同上)”)中。除非另外指出，否则本说明书中使用该编号系统。
Kabat残基名称并非总是直接与氨基酸残基的线性编号相对应。实际的线性氨基酸序列可包含比严格的Kabat编号中更少或更多的氨基酸，相应于结构元件(无论是基本可变结构域结构的构架区还是互补决定区(CDR))的缩短或至其中的插入。可通过将抗体序列中的同源残基与“标准的”Kabat编号的序列比对来确定给定抗体的残基的正确Kabat编号。
根据Kabat编号系统，重链可变结构域的CDR位于残基31-35(CDR-H1)、残基50-65(CDR-H2)和残基95-102(CDR-H3)上。然而，根据Chothia(Chothia，C.和Lesk，A.M.J.Mol.Biol.，196，901-917(1987))，等同于CDR-H1的环从残基26延伸至残基32。因此，‘CDR-H1’，如本文中所使用的，包含残基26至35，如由Kabat编号系统与Chothia的拓扑学环定义的组合所描述的。
根据Kabat编号系统，轻链可变结构域的CDR位于残基24-34(CDR-L1)、残基50-56(CDR-L2)和残基89-97(CDR-L3)上。
在一个实施方案中，抗体是拮抗性抗体。
如本文中所使用的，术语“拮抗性抗体”描述了能够例如通过阻断或显著减弱IL-13与IL-13受体的结合，从而抑制所述受体的激活来抑制和/或中和IL-13的生物学信号转导活性的抗体。
可使用本领域内已知的任何适当的方法获得用于本发明的抗体。可使用IL-13多肽，包括含有IL-13的融合多肽，或(重组地)表达所述多肽的细胞来产生特异性识别IL-13的抗体。IL-13多肽可以是‘成熟’多肽或其生物学活性片段或衍生物。IL-13多肽可利用本领域内公知的方法从包含表达系统的遗传工程宿主细胞制备或它们可回收自天然生物学来源。在本申请中，术语“多肽”包括肽、多肽和蛋白质。除非另外指出，否则这些术语可互换使用。IL-13多肽在一些情况下可以是更大的蛋白质例如融合蛋白(例如融合至亲和标签的融合蛋白)的一部分。
在必需免疫动物的情况下，针对IL-13多肽产生的抗体可以通过使用公知的和常规的方案(参见，例如Handbook of Experimental Immunology，D.M.Weir(ed.)，第4卷，Blackwell Scientific Publishers，Oxford，England，1986))给动物(优选非人动物)施用所述多肽来获得。可免疫许多温血动物例如兔、小鼠、大鼠、绵羊、牛、骆驼或猪。然而，小鼠、兔、猪和大鼠通常是最适合的。
用于本发明的抗体包括完整抗体和其功能活性片段或衍生物并且可以是，但不限于单克隆抗体、人源化抗体、完全人抗体或嵌合抗体。
单克隆抗体可利用本领域内已知的任何方法例如杂交瘤技术(Kohler & Milstein，1975，Nature，256：495-497)、三源杂交瘤技术、人B细胞杂交瘤技术(Kozbor等人，1983，Immunology Today，4：72)和EBV-杂交瘤技术(Cole等人，Monoclonal Antibodies and CancerTherapy，pp77-96，Alan R Liss，Inc.，1985)来制备。
用于本发明的抗体还可使用单淋巴细胞抗体法，通过克隆和表达从单个淋巴细胞产生的免疫球蛋白可变区cDNA来产生，所述单个淋巴细胞利用例如由Babcook，J.等人，1996，Proc.Natl.Acad.Sci.USA93(15)：7843-78481；WO92/02551；WO2004/051268和国际专利申请WO2004/106377描述的方法经选择用以产生特定抗体。
可使用测量与IL-13的结合的测定法和/或测量阻断IL-13与一种或多种其受体的结合的能力的测定法来筛选抗体。结合测定法的实例是ELISA，其例如使用被固定在平板上的IL-13的融合蛋白，并且利用缀合的第二抗体来检测结合至IL-13的抗-IL-13抗体。阻断测定法的实例是基于流式细胞术的测定法，其测量IL-13配体蛋白与IL-13R的结合的阻断。将荧光标记的第二抗体用于检测与IL-13R结合的IL-13配体蛋白的量。
人源化抗体(其包括CDR-移植抗体)是具有来自非人物种的一个或多个互补决定区(CDR)和来自人免疫球蛋白分子的构架区的抗体分子(参见，例如US 5,585,089；WO91/09967)。应当理解，可以只需转移CDR的决定特异性的残基而非整个CDR(参见例如，Kashmiri等人，2005，Methods，36，25-34)。人源化抗体可任选地还包括一个或多个来源于CDR所源自的非人物种的构架残基。
嵌合抗体包含来源于两个不同物种的元件，以便所述元件保持其所源自的物种的特征。通常嵌合抗体包含来自一个物种例如小鼠、大鼠、兔等的可变区和来自另一物种例如人的恒定区。
用于本发明的抗体还可使用本领域内已知的各种噬菌体展示法来产生并且包括由Brinkman等人(J.Immunol.Methods，1995，182：41-50)，Ames等人(J.Immunol.Methods，1995，184：177-186)，Kettleborough等人(Eur.J.Immunol.1994，24：952-958)，Persic等人(Gene，1997 187 9-18)，Burton等人(Advances in Immunology，1994，57：191-280)以及WO 90/02809；WO 91/10737；WO 92/01047；WO92/18619；WO 93/11236；WO 95/15982；WO 95/20401；以及US 5,698,426；5,223,409；5,403,484；5,580,717；5,427,908；5,750,753；5,821,047；5,571,698；5,427,908；5,516,637；5,780,225；5,658,727；5,733,743和5,969,108公开的那些。
完全人抗体是其中重链和轻链的可变区和恒定区(当存在时)全都是人来源的或与人来源的序列大体上相同但不必来自相同抗体的抗体。完全人抗体的实例可包括例如，利用上述噬菌体展示法产生的抗体和由其中鼠免疫球蛋白可变区和任选地恒定区基因已被它们的人对应物替代的小鼠产生的抗体，例如如EP 0546073，US 5,545,806，US 5,569,825，US 5,625,126，US 5,633,425，US 5,661,016，US 5,770,429，EP0438474和EP 0463151中概括地描述的。
在一个实施方案中，本发明提供了具有对于人IL-13的特异性的拮抗性抗体，其包含重链，其中重链的可变结构域包含如下的至少一个：具有图1，SEQ ID NO：1给出的CDR-H1序列的CDR、具有SEQ ID NO：2中给出的CDR-H2序列的CDR和/或具有SEQ ID NO：3中给出的CDR-H3序列的CDR。
在另一个实施方案中，本发明提供了具有对于人IL-13的特异性的拮抗性抗体，其包含重链，其中重链的可变结构域的CDR-H1、CDR-H2和CDR-H3中的至少2个选自下列：SEQ ID NO：1中给出的CDR-H1序列、SEQ ID NO：2中给出的CDR-H2序列以及SEQ ID NO：3中给出的CDR-H3序列。例如，抗体可包含重链，其中CDR-H1具有SEQ ID NO：1中给出的序列以及CDR-H2具有SEQ ID NO：2中给出的序列。可选地，抗体可包含重链，其中CDR-H1具有SEQ ID NO：1中给出的序列以及CDR-H3具有SEQ ID NO：3中给出的序列，或抗体可包含重链，其中CDR-H2具有SEQ ID NO：2中给出的序列以及CDR-H3具有SEQ ID NO：3中给出的序列。为了避免疑义，应理解，包括所有排列。
在另一个实施方案中，本发明提供了具有对于人IL-13的特异性的拮抗性抗体，其包含重链，其中重链的可变结构域包含SEQ ID NO：1中给出的CDR-H1的序列、SEQ ID NO：2中给出的CDR-H2的序列和SEQ IDNO：3中给出的CDR-H3的序列。
在一个实施方案中，本发明提供了具有对于人IL-13的特异性的拮抗性抗体，其包含轻链，其中轻链的可变结构域包含如下的至少一个：具有图1，SEQ ID NO：4中给出的CDR-L1序列的CDR、具有SEQ ID NO：5中给出的CDR-L2序列的CDR和/或具有SEQ ID NO：6中给出的CDR-L3序列的CDR。
在另一个实施方案中，本发明提供了具有对于人IL-13的特异性的拮抗性抗体，其包含轻链，其中轻链的可变结构域的CDR-L1、CDR-L2和CDR-L3中的至少两个选自下列：SEQ ID NO：4中给出的CDR-L1的序列、SEQ ID NO：5中给出的CDR-L2的序列以及SEQ ID NO：6中给出的CDR-L3的序列。例如，抗体可包含轻链，其中CDR-L1具有SEQ ID NO：4中给出的序列并且CDR-L2具有SEQ ID NO：5中给出的序列。可选地，抗体可包含轻链，其中CDR-L1具有SEQ ID NO：4中给出的序列并且CDR-L3具有SEQ ID NO：6中给出的序列，或抗体可包含轻链，其中CDR-L2具有SEQ ID NO：5中给出的序列并且CDR-L3具有SEQ ID NO：6中给出的序列。为避免疑义，应理解，包括所有排列。
在另一个实施方案中，本发明提供了具有对于人IL-13的特异性的拮抗性抗体，其包含轻链，其中可变结构域包含SEQ ID NO：4中给出的CDR-L1的序列、SEQ ID NO：5中给出的CDR-L2的序列和SEQ ID NO：6中给出的CDR-L3的序列。
本发明的抗体分子适当地分别包含互补轻链或互补重链。
因此，在一个实施方案中，根据本发明的抗体包含重链和轻链，其中重链的可变结构域包含SEQ ID NO：1中给出的CDR-H1的序列、SEQ IDNO：2中给出的CDR-H2的序列和/或SEQ ID NO：3中给出的CDR-H3的序列，并且其中轻链的可变结构域包含SEQ ID NO：4中给出的CDR-L1的序列、SEQ ID NO：5中给出的CDR-L2的序列和/或SEQ ID NO：6中给出的CDR-L3的序列。
应当理解，可对本发明提供的CDR进行一个或多个氨基酸置换、添加和/或缺失而不显著改变抗体结合IL-13和中和IL-13活性的能力。可由本领域技术人员，例如通过使用本文中描述的方法，特别是实施例中举例说明的用以测定IL-13结合和对IL-13/IL-13受体相互作用的抑制的方法容易地测试任何氨基酸置换、添加和/或缺失的影响。
因此，本发明提供了具有对于人IL-13的特异性的抗体，其包含选自CDRH-1(SEQ ID NO：1)、CDRH-2(SEQ ID NO：2)、CDRH-3(SEQ ID NO：3)、CDRL-1(SEQ ID NO：4)、CDRL-2(SEQ ID NO：5)和CDRL-3(SEQ ID NO：6)的一个或多个CDR，其中所述CDR的一个或多个中的一个或多个氨基酸已被另一个氨基酸例如下文中定义的相似氨基酸置换。
在一个实施方案中，本发明提供了具有对于人IL-13的特异性的抗体，其包含CDRH-1(SEQ ID NO：1)、CDRH-2(SEQ ID NO：2或SEQ IDNO：20)、CDRH-3(SEQ ID NO：3)、CDRL-1(SEQ ID NO：4)、CDRL-2(SEQID NO：5)和CDRL-3(SEQ ID NO：6)，例如其中所述CDR的一个或多个中的一个或多个氨基酸已被另一个氨基酸例如本文下文中定义的相似氨基酸置换。
在一个实施方案中，本发明的抗体包含重链，其中重链的可变结构域包含3个CDR，其中CDRH-1的序列与SEQ ID NO：1中给出的序列具有至少60％的同一性或相似性，CDRH-2的序列与SEQ ID NO：2中给出的序列具有至少60％的同一性或相似性和/或CDRH-3的序列与SEQ ID NO：3中给出的序列具有至少60％的同一性或相似性。在另一个实施方案中，本发明的抗体包含重链，其中重链的可变结构域包含3个CDR，其中CDRH-1的序列与SEQ ID NO：1中给出的序列具有至少70％、80％、90％、95％或98％的同一性或相似性，CDRH-2的序列与SEQ ID NO：2中给出的序列具有至少70％、80％、90％、95％或98％的同一性或相似性和/或CDRH-3的序列与SEQ ID NO：3中给出的序列具有至少70％、80％、90％、95％或98％的同一性或相似性。
″同一性″，如本文中所使用的，表示在比对的序列的任何特定位点上，氨基酸残基在序列之间是相同的。″相似性″，如本文中所使用的，表示在比对的序列的任何特定位点上，氨基酸残基在序列之间是相似的类型的。例如，亮氨酸可替代异亮氨酸或缬氨酸。通常可彼此替代的其他氨基酸包括但不限于：
-苯丙氨酸、酪氨酸和色氨酸(具有芳香族侧链的氨基酸)；
-赖氨酸、精氨酸和组氨酸(具有碱性侧链的氨基酸)；
-天冬氨酸和谷氨酸(具有酸性侧链的氨基酸)；
-天冬酰胺和谷氨酰胺(具有酰胺侧链的氨基酸)；和
-半胱氨酸和甲硫氨酸(具有含硫侧链的氨基酸)。可容易地计算同一性和相似性的程度(Computational Molecular Biology，Lesk，A.M.，ed.，Oxford University Press，New York，1988；Biocomputing.Informatics and Genome Projects，Smith，D.W.，ed.，Academic Press，New York，1993；Computer Analysis of Sequence Data，第1部分，Griffin，A.M.和Griffin，H.G.，eds.，Humana Press，New Jersey，1994；Sequence Analysis in Molecular Biology，von Heinje，G.，Academic Press，1987，Sequence Analysis Primer，Gribskov，M.和Devereux，J.，eds.，M Stockton Press，New York，1991，可从NCBI获得的BLASTTM软件(Altschul，S.F.等人，1990，J.Mol.Biol.215：403-410；Gish，W.& States，D.J.1993，Nature Genet.3：266-272.Madden，T.L.等人，1996，Meth.Enzymol.266：131-141；Altschul，S.F.等人，1997，Nucleic Acids Res.25：3389-3402；Zhang，J.& Madden，T.L.1997，Genome Res.7：649-656)。
在另一个实施方案中，本发明的抗体包含轻链，其中轻链的可变结构域包含3个CDR，其中CDRL-1的序列与SEQ ID NO：4所给的序列具有至少60％的同一性或相似性，CDRL-2与SEQ ID NO：5所给的序列具有至少60％的同一性或相似性和/或CDRL-3与SEQ ID NO：6所给的序列具有至少60％的同一性或相似性。在另一个实施方案中，本发明的抗体包含轻链，其中轻链的可变结构域包含3个CDR，其中CDRL-1的序列与SEQID NO：4所给的序列具有至少70％、80％、90％、95％或98％的同一性或相似性，CDRL-2与SEQ ID NO：5所给的序列具有至少70％、80％、90％、95％或98％的同一性或相似性和/或CDRL-3与SEQ ID NO：6所给的序列具有至少70％、80％、90％、95％或98％的同一性或相似性。
在一个实施方案中，本发明提供的抗体为单克隆抗体。
在一个实施方案中，本发明提供的抗体为嵌合抗体。
在一个实施方案中，本发明提供的抗体为包含SEQ ID NO：1、2、3、4、5、6中提供的CDR或其变体中的一个或多个的CDR-移植抗体分子。如本文中所使用的，术语‘CDR-移植抗体分子’是指这样的抗体分子，其中重链和/或轻链包含移植入受体抗体(acceptor antibody)(例如人抗体)的重链和/或轻链可变区构架的一个或多个来自供体抗体(例如鼠或大鼠单克隆抗体)的CDR(必要时，包括一个或多个经修饰的CDR)。关于综述，参见Vaughan等人，Nature Biotechnology，16，535-539，1998。在一个实施方案中，不是转移完整的CDR，而是仅将来自本文上述任一个CDR的一个或多个决定特异性的残基转移至人抗体构架(参见例如，Kashmiri等人，2005，Methods，36，25-34)。在一个实施方案中，只将来自本文中描述的CDR的一个或多个中的确定特异性的残基转移至人抗体构架。在另一个实施方案中，只将来自本文中描述的CDR的每一个中的确定特异性的残基转移至人抗体构架。
当移植CDR或决定特异性的残基时，可在考虑CDR所源自的供体抗体的种类/类型的情况下，使用任何适当的受体可变区构架序列，包括小鼠、灵长类动物和人构架区。适当地，根据本发明的CDR-移植抗体具有包含人受体构架区以及一个或多个上述CDR或决定特异性的残基的可变结构域。因此，在一个实施方案中，提供了其中可变结构域包含人受体构架区和非人供体CDR的中和性CDR-移植抗体。
可用于本发明的人构架的实例为KOL、NEWM、REI、EU、TUR、TEI、LAY和POM(Kabat等人，同上)。例如，KOL和NEWM可用于重链，REI可用于轻链，EU、LAY和POM可用于重链和轻链。可选地，可使用人种系序列；这些序列可在：http://vbase.mrc-cpe.cam.ac.uk/上获得。
在本发明的CDR-移植抗体中，受体重链和轻链不一定需要来源于相同抗体，并且必要时，可包含具有来源于不同链的构架区的复合链(composite chain)。
本发明的CDR-移植抗体的重链的适当的构架区来源于与JH4一起的人亚组VH2序列3-1 2-26(SEQ ID NO：41)。因此，提供了包含至少一个非人供体CDR的中和性CDR-移植抗体，其中重链构架区来源于与JH4一起的人亚组VH2序列3-1 2-26。人JH4的序列如下：(YFDY)WGQGTLVTVS(Seq ID No：43)。YFDY基序是CDR-H3的部分而不是构架4的部分(Ravetch，JV.等人，1981，Cell，27，583-591)。
本发明的CDR-移植抗体的轻链的适当的构架区来源于与JK4一起的人种系亚组VK1序列2-1 1-02(SEQ ID NO：39)。因此，提供了包含至少一个非人供体CDR的中和性CDR-移植抗体，其中轻链构架区来源于与JK4一起的人亚组序列2-1 1-02。JK4的序列如下：(LT)FGGGTKVEIK(Seq ID No：44)。LT基序是CDR-L3的部分而不是构架4的部分(Hieter，PA.，等人，1982，J.Biol.Chem.，257，1516-1522)。
在一个实施方案中，轻链和/或重链构架选自SEQ ID No：39至42所示的序列。
同样地，在本发明的CDR-移植抗体中，构架区不必具有与受体抗体的序列完全相同的序列。例如，可将稀有残基改变成对于该受体链种类或类型更为频繁发生的残基。可选地，可改变受体构架区中所选择的残基以便它们相应于在供体抗体的相同位置上发现的残基(参见Reichmann等人，1998，Nature，332，323-324)。应当使此类改变保持至恢复供体抗体的亲和力所必需的最低程度。用于选择受体构架区中可能必须改变的残基的方案示于WO 91/09967中。
适当地，在本发明的CDR-移植抗体分子中，如果受体重链具有人VH2序列3-12-26和JH4，那么除了一个或多个供体CDR外，重链的受体构架区还在位点49和71(根据Kabat等人，(同上))的至少一个上包含供体残基(参见图12)。
因此，提供了CDR-移植抗体，其中至少重链可变结构域的位点49和71上的残基是供体残基。
供体残基是来自供体抗体，即CDR最初所源自的抗体，的残基。优选地，残基是分别位于位点49和71上的甘氨酸和精氨酸。
在一个实施方案中，本发明的抗体包含重链，其中重链的可变结构域包含SEQ ID NO：31中给出的序列。
应当理解，可对本发明提供的抗体的可变结构域进行一个或多个氨基酸置换、添加和/或缺失而不显著改变抗体结合IL-13和中和IL-13活性的能力。可由本领域技术人员，例如通过使用实施例中描述的测定IL-13结合和/或配体/受体阻断的方法容易地测试任何氨基酸置换、添加和/或缺失的影响。
在另一个实施方案中，本发明的抗体包含重链，其中重链的可变结构域包含与SEQ ID NO：31中给出的序列具有至少60％的同一性或相似性的序列。在一个实施方案中，本发明的抗体包含重链，其中重链的可变结构域包含与SEQ ID NO：31中给出的序列具有至少70％、80％、90％、95％或98％的同一性或相似性的序列。
在一个实施方案中，本发明的抗体包含轻链，其中轻链的可变结构域包含SEQ ID NO：23中给出的序列。
在另一个实施方案中，本发明的抗体包含轻链，其中轻链的可变结构域包含与SEQ ID NO：23中给出的序列具有至少60％的同一性或相似性的序列。在一个实施方案中，本发明的抗体包含轻链，其中轻链的可变结构域包含与SEQ ID NO：23中给出的序列具有至少70％、80％、90％、95％或98％的同一性或相似性的序列。
在一个实施方案中，本发明的抗体包含重链(其中重链的可变结构域包含SEQ ID NO：31中给出的序列)和轻链(其中轻链的可变结构域包含SEQ ID NO：23中给出的序列)。
在本发明的另一个实施方案中，抗体包含重链和轻链，其中重链的可变结构域包含与SEQ ID NO：31中给出的序列具有至少60％的同一性或相似性的序列，并且轻链的可变结构域包含与SEQ ID NO：23中给出的序列具有至少60％的同一性或相似性的序列。适当地，抗体包含重链和轻链，其中重链的可变结构域包含与SEQ ID NO：31中给出的序列具有至少70％、80％、90％、95％或98％的同一性或相似性的序列，并且轻链的可变结构域包含与SEQ ID NO：23中给出的序列具有至少70％、80％、90％、95％或98％的同一性或相似性的序列。
本发明的抗体分子可包含具有全长重链和轻链的完整抗体分子或其片段，并且可以是但不限于Fab、经修饰的Fab、Fab′、经修饰的Fab′、F(ab′)2、Fv、单结构域抗体(例如VH或VL或VHH)、scFv、二价、三价或四价抗体、Bis-scFv、双链抗体(diabody)、三链抗体(triabody)、四链抗体(tetrabody)和任何上述抗体的表位结合片段(参见例如Holliger和Hudson，2005，Nature Biotech.23(9)：1126-1136；Adair和Lawson，2005，Drug Design Reviews-Online 2(3)，209-217)。用于产生和制造此类抗体片段的方法在本领域内是公知的(参见例如Verma等人，1998，Journal of Immunological Methods，216，165-181)。用于本发明的其他抗体片段包括国际专利申请WO2005/003169、WO 2005/003170和WO 2005/003171中描述的Fab和Fab′片段以及国际专利申请WO2009/040562中描述的Fab-dAb片段。多价抗体可包括多种特异性或可以是单特异性的(参见例如WO 92/22853和WO05/113605)。
可在考虑提及的抗体分子功能，特别是可能需要的效应子功能的情况下选择本发明的抗体分子的恒定区结构域(如果存在的话)。例如，恒定区结构域可以是人IgA、IgD、IgE、IgG或IgM结构域。特别地，当希望抗体分子用于治疗性用途并且需要抗体效应子功能时，可使用人IgG恒定区结构域，特别是IgG1和IgG3同种型的恒定区结构域。可选地，当希望抗体分子用于治疗目的并且抗体效应子功能不是必需的，例如仅用于阻断IL-13活性时，可使用IgG2和IgG4同种型。应当理解，还可使用此类恒定区结构域的序列变体。例如可使用其中位点241上的丝氨酸被改变成脯氨酸的IgG4分子，如Angal等人，MolecularImmunology，1993，30(1)，105-108中所描述的。本领域技术人员还理解抗体可经历多种翻译后修饰。此类修饰的类型和程度通常取决于用于表达抗体的宿主细胞系以及培养条件。此类修饰可包括糖基化、甲硫氨酸氧化、哌嗪二酮形成、天冬氨酸异构化和天冬酰胺脱酰胺化的变化。常见修饰是因羧肽酶的作用而导致的羧基末端碱性残基(例如赖氨酸或精氨酸)的丢失(如Harris，RJ.Journal of Chromatography 705：129-134，1995中描述的)。然而，在本发明的Ab652实施方案的重链或轻链上都不存在C末端赖氨酸。
在一个实施方案中，抗体重链包含CH1结构域并且抗体轻链包含κ或λCL结构域。
在一个实施方案中，本发明提供的抗体是具有对于人IL-13的特异性的拮抗性抗体，其中重链恒定区包含经修饰的铰链区。因此，本发明提供了其中重链包含或由SEQ ID No：35中给出的序列组成的抗体。
应当理解，可对本发明提供的抗体可变和/或恒定结构域进行一个或多个氨基酸置换、添加和/或缺失而不显著改变抗体结合IL-13和中和IL-13活性的能力。可由本领域技术人员，例如通过使用本文中描述的方法，特别是实施例中举例说明的测定IL-13结合和对IL-13/IL-13受体相互作用的阻断的那些方法来容易地测试任何氨基酸置换、添加和/或缺失的影响。
在本发明的一个实施方案中，抗体包含重链，其中重链包含与SEQID NO：35中给出的序列具有至少60％的同一性或相似性的序列。适当地，抗体包含重链，其中重链包含与SEQ ID NO：35中给出的序列具有至少70％、80％、90％、95％或98％的同一性或相似性的序列。
在一个实施方案中，根据本发明的抗体分子包含含有SEQ ID NO：27中给出的序列的轻链。
在本发明的一个实施方案中，抗体包含轻链，其中轻链包含与SEQID NO：27中给出的序列具有至少60％的同一性或相似性的序列。例如，抗体包含轻链，其中轻链包含与SEQ ID NO：27中给出的序列具有至少70％、80％、90％、95％或98％的同一性或相似性的序列。
在一个实施方案中，本发明提供了抗体，其中重链包含SEQ IDNO：35中给出的序列或由所述序列组成并且轻链包含SEQ ID NO：27中给出的序列或由所述序列组成。
在本发明的一个实施方案中，抗体包含重链和轻链，其中重链包含与SEQ ID NO：35中给出的序列具有至少60％的同一性或相似性的序列并且轻链包含与SEQ ID NO：27中给出的序列具有至少60％的同一性或相似性的序列。通常，抗体包含重链和轻链，其中重链包含与SEQ ID NO：35中给出的序列具有至少70％、80％、90％、95％或98％的同一性或相似性的序列，其中轻链包含与SEQ ID NO：27中给出的序列具有至少70％、80％、90％、95％或98％的同一性或相似性的序列。
生物学分子例如抗体或片段包含酸性和/或碱性官能团，从而赋予分子净正电荷或负电荷。总体“观察到的”电荷的量取决于实体的绝对氨基酸序列、3D结构中带电荷的基团的局部环境和分子的环境条件。等电点(pI)是特定分子或表面不携带净电荷时所处的pH。在一个实施方案中，根据本发明的抗体或片段具有至少7的等电点(pI)。在一个实施方案中，抗体或片段具有至少8的等电点，例如8.5、8.6、8.7、8.8或9。在一个实施方案中，抗体的pI为8。
本发明的IL-13抗体和片段可经改造而具有适当的等电点。这可导致具有更强的性质，特别是适当的溶解性和/或稳定性特征的抗体和/或片段。
因此在一个方面中，本发明提供了经改造而具有不同于最初鉴定的抗体的等电点的人源化的IL-13抗体。可以例如通过替代氨基酸残基例如用一个或多个碱性氨基酸残基替代酸性氨基酸残基来改造抗体。可选地，可添加碱性氨基酸残基或可除去酸性氨基酸残基。可选地，如果分子具有不可接受的高pI值，那么可按要求引入酸性残基以降低pH。经改造的抗体或片段的pI可以例如为8或以上，例如8.5或9。重要的是当操纵pI时，必须小心保留抗体或片段的期望的活性。因此，在一个实施方案中，经改造的抗体或片段具有与“未修饰的”抗体或片段相同或大体上相同的活性。
程序如**ExPASY http://www.expasy.ch/tools/pi_tool.html和http://www.iut-arles.up.univ-mrs.fr/w3bb/d_abim/compo-p.html可用于预测抗体或片段的等电点。
在一个实施方案中，本发明的抗体适合用于吸入递送(例如通过雾化作用)。在一个实例中，本发明的抗体的物理性质例如结合亲和力和效能(potency)基本上不被雾化作用改变。在一个实例中，本发明的抗体是高度稳定的。抗体稳定性的一个量度是熔解温度(melting temperature，Tm)。熔解温度可利用本领域内已知的任何适当方法，例如使用Thermofluor(Ericsson等人，Analytical Biochemistry 357(2006)289-298)或DSC(差示扫描量热法)来测定。优选地，本发明提供的抗体具有通常至少75℃的高熔解温度(Tm)。在一个实例中，本发明的抗体具有至少75℃的Tm。在一个实例中，本发明的抗体具有至少80℃的Tm。在一个实例中，本发明的抗体具有至少83℃的Tm。
本发明还提供了被本发明提供的抗体特别是包含重链序列(SEQ IDNO：35)和/或轻链序列(SEQ ID NO：27)的抗体结合的人IL-13的特定区域或表位。
人IL-13多肽的该特定区域或表位可利用本领域内已知的任何适当的表位作图法结合本发明提供的任何抗体来鉴定。此类方法的实例包括就与本发明的抗体的结合筛选来源于IL-13的不同长度的肽，可特异性结合抗体的最小片段包含被抗体识别的表位的序列。可合成地或通过IL-13多肽的蛋白水解降解产生IL-13肽。结合抗体的肽可利用例如质谱分析来鉴定。在另一个实例中，可将NMR光谱法或x射线衍射晶体分析法用于鉴定被本发明的抗体结合的表位。在鉴定后，结合本发明的抗体的表位片段，必要时，可用作免疫原来获得结合相同表位的另外的拮抗性抗体。
交叉阻断根据本发明的抗体，特别是包含重链序列(SEQ ID NO：31)和轻链链序列(SEQ ID NO：27)的抗体的结合的抗体可类似地用于拮抗IL-13活性。因此，本发明还提供了具有对于人IL-13的特异性的拮抗性抗体，其交叉阻断上述抗体的任一抗体与人IL-13的结合和/或被此类抗体的任一抗体交叉阻断与IL-13的结合。在一个实施方案中，这样的抗体结合与本文中上述抗体结合的表位相同的表位。在另一个实施方案中，交叉阻断中和抗体结合与本文中上述抗体结合的表位邻接和/或交叠的表位。在另一个实施方案中，本发明的该方面的交叉阻断中和抗体不结合与本发明的抗体结合的表位相同的表位或不结合与所述表位邻接和/或交叠的表位。
可使用本领域内的任何适当方法，例如通过使用其中交叉阻断性抗体与人IL-13的结合阻止本发明的抗体的结合或反之亦然的竞争性ELISA或BIAcore测定法来鉴定交叉阻断性抗体。
在一个实施方案中，提供了具有对于人IL-13的特异性的拮抗性抗体，其交叉阻断其中重链包含SEQ ID NO：35所示的序列并且轻链包含SEQ ID NO：27所示的序列的抗体与人IL-13的结合。在一个实施方案中，本发明提供的交叉阻断抗体抑制包含SEQ ID NO：35所示的重链序列和SEQ ID NO：27所示的轻链序列的抗体的结合超过80％，例如超过85％，例如超过90％，特别地超过95％。
可选地或此外，根据本发明的该方面的拮抗性抗体与人IL-13的结合可被包含SEQ ID NO：35所示的重链序列和SEQ ID NO：27所示的轻链序列的抗体交叉阻断。因此还提供了具有对于人IL-13的特异性的拮抗性抗体分子，其与人IL-13的结合可被包含SEQ ID NO：35所示的重链序列和SEQ ID NO：27所示的轻链序列的抗体交叉阻断。在一个实施方案中，由本发明的该方面提供的拮抗性抗体与人IL-13的结合可被包含SEQ ID NO：35所示的重链序列和SEQ ID No：27所示的轻链序列的抗体抑制超过80％，例如超过85％，例如超过90％，特别地超过95％。
在一个实施方案中，本发明提供的交叉阻断抗体是完全人的。在一个实施方案中，本发明提供的交叉阻断抗体是人源化的。在一个实施方案中，本发明提供的交叉阻断抗体具有100pM或更好的对于人IL-13的亲和力。在一个实施方案中，本发明提供的交叉阻断抗体具有50pM或更好的对于人IL-13的亲和力。
在一个实施方案中，交叉阻断抗体具有至少7，例如至少8，例如8.5、8.6、8.7、8.8、8.9或9.0的等电点。
本发明的抗体分子适当地具有高结合亲和力，特别是皮摩尔级亲和力。可使用本领域内已知的任何适当方法，包括利用表面等离子共振技术(包括如本文实施例中描述的BIAcore)，使用分离的天然或重组IL-13测量亲和力。在一个实例中，如本文的实施例中描述的，使用重组人IL-13测量亲和力。在一个实施方案中，本发明的抗体分子具有约100pM或更好的结合亲和力。在一个实施方案中，本发明的抗体分子具有约50pM或更好的结合亲和力。在一个实施方案中，本发明的抗体分子具有约40pM或更好的结合亲和力。在一个实施方案中，本发明的抗体分子具有约30pM或更好的结合亲和力。在一个实施方案中，本发明的抗体分子具有约20pM或更好的结合亲和力。在一个实施方案中，本发明的抗体分子是完全人或人源化的并且具有约100pM或更好的结合亲和力。在一个实施方案中，本发明的抗体分子是完全人或人源化的并且具有约30pM或更好的结合亲和力。
应理解，可使用本领域内已知的任何适当方法改变本发明提供的抗体的亲和力。因此，本发明还涉及本发明的抗体分子的变体，所述变体具有提高的对于IL-13的亲和力。此类变体可通过许多亲和力成熟方案包括突变CDR(Yang等人，J.Mol.Biol.，254，392-403，1995)、链改组(Marks等人，Bio/Technology，10，779-783，1992)、使用大肠杆菌的增变株(Low等人，J.Mol.Biol.，250，359-368，1996)、DNA改组(Patten等人，Curr.Opin.Biotechnol.，8，724-733，1997)、噬菌体展示(Thompson等人，J.Mol.Biol.，256，77-88，1996)和有性PCR(sexual PCR)(Crameri等人，Nature，391，288-291，1998)来获得。Vaughan等人(同上)讨论了此类亲和力成熟方法。
在一个实施方案中，本发明的抗体分子阻断IL-13与IL-13受体之间的相互作用，特别地本发明的抗体分子阻断IL-13与IL-13Rα1之间的相互作用和IL-13与IL-13Rα2之间的相互作用。在本文的实施例中描述了适合用于测定抗体阻断该相互作用的能力的许多测定法。在一个实施方案中，本发明提供了具有对于人IL-13的特异性的中和抗体。在一个实施方案中，测定中所使用的人IL-13受体是天然人IL-13Rα1或天然人IL-13Rα2。在一个实施方案中，测定中所使用的人IL-13受体是重组人IL-13Rα1或重组人IL-13Rα2。在一个实施方案中，测定中所使用的人IL-13是重组人IL-13。在一个实施方案中，中和抗体是人源化或完全人抗体或其片段。
必要时，可将本发明中使用的抗体缀合至一个或多个效应分子。应理解，效应分子可包括单个效应分子或两个或更多个此类分子(其被连接以形成可被连接至本发明抗体的单个部分)。当想要获得连接至效应分子的抗体片段时，这可利用标准化学或重组DNA法来制备，在所述方法中将抗体片段直接或通过偶联剂连接至效应分子。用于将此类效应分子缀合至抗体的技术在本领域内是公知的(参见，Hellstrom等人，ControlledDrug Delivery，第2版，Robinson等人，eds.，1987，pp.623-53；Thorpe等人，1982，Immunol.Rev.，62：119-58和Dubowchik等人，1999，Pharmacology and Therapeutics，83，67-123)。具体的化学方法包括例如WO 93/06231，WO 92/22583，WO 89/00195，WO 89/01476和WO 03031581中描述的方法。可选地，当效应分子是蛋白质或多肽时，可使用重组DNA法例如如WO 86/01533和EP 0392745中描述的方法来实现连接。
如本文中所用的，术语效应分子包括例如抗肿瘤剂、药物、毒素、生物学活性蛋白例如酶、其他抗体或抗体片段、合成或天然存在的聚合物、核酸和其片段例如DNA、RNA和其片段、放射性核素特别是放射性碘化物、放射性同位素、螯合金属、纳米颗粒和报告基团例如荧光化合物或可通过NMR或ESR光谱法检测的化合物。
效应分子的实例可包括细胞毒素或细胞毒性剂，包括对细胞有害(例如杀伤)的任何试剂。实例包括考布他汀(combrestatins)、多拉司他汀、埃博霉素、星孢菌素、maytansinoids、海绵抑制素、根霉素(rhizoxin)、软海绵素、杆孢菌素、hemiasterlins、紫杉醇、细胞松弛素B、短杆菌肽D、溴化乙锭、依米丁(emetine)、丝裂霉素、依托泊苷、替尼泊苷(tenoposide)、长春新碱、长春碱、秋水仙碱、多柔比星、柔红霉素、二羟基蒽二酮、米托蒽醌、光辉霉素、放线菌素D、1-去氢睾酮、糖皮质激素、普鲁卡因、丁卡因、利多卡因、普萘洛尔和嘌呤霉素及其类似物或同源物。
效应分子还包括但不限于抗代谢物(例如甲氨蝶呤、6-巯基嘌呤、6-硫鸟嘌呤、阿糖胞苷、5-氟尿嘧啶达卡巴嗪)、烷化剂(例如氮芥、thioepa苯丁酸氮芥、美法仑、卡莫司汀(BSNU)和洛莫司汀(CCNU)、环磷酰胺、白消安、二溴甘露醇、链脲霉素、丝裂霉素C和顺-二氯二胺铂(II)(DDP)顺铂)、蒽环类(例如柔红霉素(以前称为道诺霉素)和多柔比星)、抗生素类(例如放线菌素D(以前称为放线菌素)、博来霉素、光辉霉素、安曲霉素(AMC)、卡奇霉素或多卡米星)和抗有丝分裂剂(例如长春新碱和长春碱)。
其他效应分子可包括螯合的放射性核素例如111In和90Y、Lu177、铋213、锎252、铱192和钨188/铼188；或药物例如但不限于，烷基磷酸胆碱、拓扑异构酶I抑制剂、紫杉烷(taxoid)和舒拉明。
其他效应分子包括蛋白质、肽和酶。目的酶包括但不限于蛋白水解酶、水解酶、裂合酶、异构酶、转移酶。目的蛋白质、多肽和肽包括但不限于免疫球蛋白、毒素例如相思豆毒蛋白、蓖麻毒素A、假单胞菌外毒素或白喉毒素、蛋白质例如胰岛素、肿瘤坏死因子、α-干扰素、β-干扰素、神经生长因子、血小板衍生生长因子或组织型纤溶酶原激活物、凝血剂或抗血管生成剂例如血管他丁(angiostatin)或内皮他丁(endostatin)或生物学应答调节剂例如淋巴因子、白细胞介素-1(IL-1)、白细胞介素-2(IL-2)、粒细胞巨噬细胞集落刺激因子(GM-CSF)、粒细胞集落刺激因子(G-CSF)、神经生长因子(NGF)或其他生长因子和免疫球蛋白。
其他效应分子可包括用于例如诊断的可检测的物质。可检测的物质的实例包括多种酶、辅基、荧光材料、发光材料、生物发光材料、放射性核素、正电子发射金属(用于正电子发射断层摄影术)和非放射性顺磁性金属离子。关于可被缀合至抗体以用作诊断剂的金属离子，通常参见美国专利4,741,900。适当的酶包括辣根过氧化物酶、碱性磷酸酶、β-半乳糖苷酶或乙酰胆碱酯酶；适当的辅基包括链霉抗生物素蛋白、抗生物素蛋白和生物素；适当的荧光材料包括伞形酮，荧光素，异硫氰酸荧光素，罗丹明，二氯三嗪基胺荧光素、丹磺酰氯和藻红蛋白；适当的发光材料包括鲁米诺；适当的生物发光材料包括萤光素酶，萤光素和水母荧光素；以及适当的放射性核素包括125I，131I，111In和99Tc。
在另一个实例中，效应分子可增加抗体的体内半衰期，和/或减小抗体的免疫原性和/或增强抗体穿过上皮屏障至免疫系统的递送。该类型的适当的效应分子的实例包括聚合物、白蛋白、白蛋白结合蛋白或白蛋白结合化合物例如WO 05/117984中描述的化合物。
当效应分子是聚合物时，其通常可以是合成的或天然存在的聚合物，例如任选地被取代的直链或支链聚亚烷基(polyalkylene)、聚亚烯基(polyalkenylene)或聚氧化亚烷基(polyoxyalkylene)聚合物或分支或未分支的多糖例如同多糖或杂多糖。
可存在于上述合成聚合物上的具体的任选取代基包括一个或多个羟基、甲基或甲氧基。
合成聚合物的具体实例包括任选地被取代的直链或支链聚(乙二醇)、聚(丙二醇)聚(乙烯醇)或其衍生物，特别是任选地被取代的聚(乙二醇)例如甲氧基聚(乙二醇)或其衍生物。
具体的天然存在的聚合物包括乳糖、直链淀粉、葡聚糖、糖原或其衍生物。
如本文中所用的，“衍生物”意欲包括反应性衍生物，例如巯基选择性反应性基团，例如马来酰亚胺等。可将反应性基团直接或通过接头区段连接至聚合物。应当理解，此类基团的残基在一些情况下可以作为抗体片段与聚合物之间的连接基团构成产物的部分。
聚合物的大小可根据需要而变化，但通常在500Da至50000Da，例如5000至40000Da，例如20000至40000Da的平均分子量范围内。可特别地基于产物的预期用途例如定位至某些组织例如肿瘤的能力或延长循环半衰期的能力选择聚合物的大小(关于综述，参见Chapman，2002，Advanced Drug Delivery Reviews，54，531-545)。因此，例如，当期望产物离开循环并且渗入组织时，可有利地使用小分子量聚合物(例如具有约5000Da的分子量的聚合物)。对于其中产物保持在循环中的应用，可有利地使用更高分子量的聚合物，例如具有在20000Da至40000Da的范围内的分子量的聚合物。
适当的聚合物包括聚亚烷基聚合物例如聚(乙二醇)或特别地甲氧基聚(乙二醇)或其衍生物，并且特别地具有在约15000Da至约40000Da的范围内的分子量。
在一个实例中，将用于本发明的抗体与聚(乙二醇)(PEG)部分连接。在一个具体的实例中，抗体是抗体片段并且可通过任何可获得的氨基酸侧链或位于抗体片段中的末端氨基酸官能团例如任何游离氨基、亚氨基、巯基、羟基或羧基连接PEG分子。此类氨基酸可天然存在于抗体片段中或可使用重组DNA法(参见例如US 5,219,996；US 5,667,425；WO98/25971)将其改造入片段。在一个实例中，本发明的抗体分子是经修饰的Fab片段，其中修饰是将一个或多个氨基酸加至其重链的C末端以允许效应分子的连接。适当地，额外的氨基酸形成经修饰的铰链区，所述铰链区包含可将效应分子与其连接的一个或多个半胱氨酸残基。多个位点可用于连接两个或更多个PEG分子。
适当地，可通过位于抗体片段中的至少一个半胱氨酸残基的巯基共价连接PEG分子。可将连接至经修饰的抗体片段的每一个聚合物分子共价连接至位于片段中的半胱氨酸残基的硫原子。共价键通常是二硫键或特别地硫-碳键。当将巯基用作附着点时，可使用适当地活化的效应分子，例如巯基选择性衍生物例如例如马来酰亚胺和半胱氨酸衍生物。可将活化的聚合物在如上所述的聚合物修饰的抗体片段的制备中用作起始材料。活化的聚合物可以是包含巯基反应性基团例如α-卤代羧酸或酯例如碘乙酰胺、二酰亚胺例如马来酰亚胺、乙烯基砜或二硫化物的任何聚合物。此类起始材料可商购获得(例如从Nektar，以前称为Shearwater Polymers Inc.，Huntsville，AL，USA获得)或可使用常规化学法从商购可得的起始材料制备。具体的PEG分子包括20K甲氧基-PEG-胺(可获自Nektar，以及称为Shearwater；Rapp Polymere；和SunBio)和M-PEG-SPA(可获自Nektar，以前称为Shearwater)。
在一个实施方案中，抗体是经修饰的Fab片段或diFab，其已例如按照EP 0948544或EP 1090037中公开的方法进行了PEG化，即，具有与其共价连接的PEG(聚(乙二醇))[也参见″Poly(ethyleneglycol)Chemistry，Biotechnical and Biomedical Applications″，1992，J.Milton Harris(ed)，Plenum Press，New York，″Poly(ethyleneglycol)Chemistry and Biological Applications″，1997，J.Milton Harris和S.Zalipsky(eds)，American Chemical Society，Washington DC和″Bioconjugation Protein Coupling Techniques for the BiomedicalSciences″，1998，M.Aslam和A.Dent，Grove Publishers，New York；Chapman，A.2002，Advanced Drug Delivery Reviews 2002，54：531-545]。在一个实例中，将PEG连接至铰链区的半胱氨酸。在一个实例中，PEG修饰的Fab片段具有共价地连接至经修饰的铰链区中的单个巯基的马来酰亚胺基团。可将赖氨酸残基共价地连接至马来酰亚胺基团和可将赖氨酸残基上的每一个胺基与具有约20,000Da的分子量的甲氧基聚(乙二醇)聚合物连接。从而连接至Fab片段的PEG的总分子量可以为约40,000Da。
在一个实施方案中，本发明提供了具有对于IL-13的特异性的拮抗性抗体分子，其为经修饰的Fab′片段，所述片段具有包含SEQ ID NO：35中给出的序列的重链和包含SEQ ID NO：27中给出的序列的轻链并且在其重链的C末端具有经修饰的铰链区，所述铰链区包含至少一个与效应分子连接的半胱氨酸酸残基。适当地，效应分子是PEG并且使用WO98/25971和WO 2004072116中或WO 2007/003898中描述的方法连接。可使用国际专利申请WO 2005/003169，WO 2005/003170和WO2005/003171中描述的方法将效应分子连接至抗体片段。
在一个实施方案中，抗体或片段未被连接至效应分子。
本发明还提供了编码本发明的抗体分子的重链和/或轻链的分离的DNA序列。适当地，DNA序列编码本发明的抗体分子的重链或轻链。本发明的DNA序列可包含合成的DNA(例如通过化学处理产生的DNA)、cDNA、基因组DNA或其任意组合。
编码本发明的抗体分子的DNA序列可利用本领域技术人员公知的方法来获得。例如，可根据需要从确定的DNA序列或基于相应的氨基酸序列合成编码抗体重链和轻链的部分或全部的DNA序列。
编码受体构架序列的DNA对于本领域技术人员来说是可广泛获得的，并且可基于它们的已知的氨基酸序列容易地合成。
可使用分子生物学的标准技术制备编码本发明的抗体分子的DNA序列。可使用寡核苷酸合成技术完整或部分地合成所需DNA序列。适当时可使用定点诱变和聚合酶链式反应(PCR)技术。
本文中提供了适当的序列的实例。其中可编码适当的重链的信号肽，例如鼠信号肽MEWSWVFLFF LSVTTGVHS(SEQ ID NO：45)。其中可编码适当的轻链的信号肽，例如鼠信号肽MSVPTQVLGL LLLWLTDARC(SEQ ID NO：46)，其被切除以产生本发明的拮抗性抗体分子。本发明还提供了编码本发明的抗体的重链的分离的DNA序列，其包含SEQ ID NO：32、34或36或38。本发明还提供了编码本发明的抗体的轻链的分离的DNA序列，其包含SEQ ID NO：24、26、28或30。
可籍以构建载体的一般方法、转染方法和培养方法对于本领域技术人员来说是公知的。在该方面，参考“Current Protocols in MolecularBiology”，1999，F.M.Ausubel(ed)，Wiley Interscience，New York和由Cold Spring Harbor Publishing出版的Maniatis Manual。
还提供了包含一个或多个含有一个或多个编码本发明的抗体的DNA序列的克隆或表达载体的宿主细胞。任何适当的宿主细胞/载体系统可用于编码本发明的抗体分子的DNA序列的表达。可使用细菌例如大肠杆菌(E.coli)和其他微生物系统或也可使用真核(例如哺乳动物)宿主细胞表达系统。适当的哺乳动物宿主细胞包括CHO、骨髓瘤或杂交瘤细胞。
本发明还提供了用于产生根据本发明的抗体分子的方法，其包括在适合于导致从编码本发明的抗体分子的DNA表达蛋白质的条件下培养包含本发明的载体的宿主细胞，和分离所述抗体分子。
抗体分子可只包含重链或轻链多肽，在该情况下只需要将重链或轻链多肽编码序列用于转染宿主细胞。为了生产包含重链和轻链的产物，可用两个载体(编码轻链多肽的第一载体和编码重链多肽的第二载体)转染细胞系。可选地，可使用单个载体，所述载体包括编码轻链和重链多肽的序列。
根据本公开内容的抗体和片段以良好的水平从宿主细胞表达。因此抗体和/或片段的性质得到最优化并且有助于商业加工。
当本发明的抗体用于治疗和/或预防病理状态时，本发明还提供了包含与一种或多种药学上可接受的赋形剂、稀释剂或载体组合的本发明的抗体分子的药物或诊断组合物。因此，提供了本发明的抗体用于制造药物的用途。通常将组合物作为通常包含药学上可接受的载体的无菌药物组合物的部分来提供。本发明的药物组合物可额外地包含药学上可接受的佐剂。
本发明还提供了用于制备药物或诊断组合物的方法，其包括添加和混合本发明的抗体分子与一种或多种药学上可接受的赋形剂、稀释剂或载体。
抗体分子可以是药物或诊断组合物中的唯一活性成分或可伴随其他活性成分，包括其他抗体成分例如抗-TNF、抗-IL-1β、抗-T细胞、抗-IFNγ或抗-LPS抗体或非抗体成分例如黄嘌呤。其他适当的活性成分包括能够诱导耐受性的抗体，例如抗-CD3或抗-CD4抗体。
在其他实施方案中，将根据本公开内容的抗体、片段或组合物与其他药学活性剂例如皮质类固醇(例如丙酸氟替卡松)和/或β-2-激动剂(例如沙丁胺醇(salbutamol)、沙美特罗或福莫特罗)或细胞生长和增殖的抑制剂(例如雷帕霉素、环磷酰胺、甲氨蝶呤)或可选地CD28和/或CD40抑制剂组合使用。在一个实施方案中，抑制剂是小分子。在另一个实施方案中，抑制剂是特异于靶的抗体。
药物组合物适当地包含治疗有效量的本发明的抗体。如本文中所使用的，术语“治疗有效量”是指治疗、改善或预防靶向的疾病或状态或展示可检测的治疗或预防效果所需的治疗剂的量。对于任何抗体，最初可在细胞培养测定法或动物模型中，通常在啮齿类动物、兔、狗、猪或灵长类动物中估计治疗有效量。动物模型也可用于测定施用的适当的浓度范围和途径。然后此类信息可用于确定用于人施用的有用剂量和途径。
用于人受试者的精确的治疗有效量将取决于疾病状态的严重性、受试者的总体健康状况、受试者的年龄、体重和性别、饮食、施用的时间和频率、药物组合、对治疗的反应灵敏度和耐受性/应答。该量可通过常规实验测定并且在临床医生的判断能力之内。通常，治疗有效量可为0.01mg/kg至50mg/kg，例如0.1mg/kg至20mg/kg。可选地，剂量可为1至500mg/天例如10至100、200、300或400mg/天。可方便地以包含预定量的本发明的活性剂的单位剂量形式提供药物组合物。
可将组合物单独地给患者施用，或可将其与其他试剂、药物或激素组合(例如，同时、依次地或分开地)施用。
本发明的抗体分子所施用的剂量取决于待治疗的病况的性质、呈现的炎症的程度以及抗体分子是用于预防性用途还是用于治疗已存在的病况。
剂量频率取决于抗体分子的半衰期和其作用的持续时间。如果抗体分子具有短的半衰期(例如2至10小时)，那么可能必需每天提供一个或多个剂量。可选地，如果抗体分子具有长的半衰期(例如2至15天)，那么可能只需每天1次、每周1次或甚至每1或2个月1次提供剂量。
药学上可接受的载体本身不应当诱导对接受组合物的个体有害的抗体产生并且不应当具有毒性。适当的载体可以是大的、缓慢代谢的大分子例如蛋白质、多肽、脂质体、多糖、聚乳酸、聚乙醇酸、多聚氨基酸、氨基酸共聚物和灭活的病毒颗粒。
可使用药学上可接受的盐，例如矿物酸盐，例如盐酸盐、氢溴酸盐、磷酸盐和硫酸盐，或有机酸的盐，例如乙酸盐、丙酸盐、丙二酸盐和苯甲酸盐。
治疗性组合物中的药学上可接受的载体可额外地包含液体例如水、盐水、甘油和乙醇。此外，辅助物质例如湿润剂或乳化剂或pH缓冲物质，可存在于此类组合物中。此类载体使得药物组合物能够被配制为用于患者摄入的片剂、丸剂、锭剂、胶囊、液体、凝胶、糖浆剂、膏剂和悬浮液。
用于施用的适当的形式包括适合于胃肠外施用(例如通过注射或输注，例如通过弹丸注射(bolus injection)或连续输注)的形式。当产物用于注射或输注时，其可采取在油性或水性媒介物中的悬浮液、溶液或乳剂的形式，并且其可包含配制剂例如混悬剂、防腐剂、稳定剂和/或分散剂。可选地，抗体分子可以为干燥形式，用于在使用前利用适当的无菌液体重构。
在配制后，可将本发明的组合物给受试者直接施用。待治疗的受试者可以是动物。然而，在一个或多个实施方案中，组合物适合于给人受试者施用。
在一个实施方案中，在根据本公开内容的制剂中，最终制剂的pH与抗体或片段的等电点的值不相似，因为如果制剂的pH为7，那么8-9或以上的pI可以是适当的。然而不希望受理论束缚，据认为，这最终可提供具有提高的稳定性的最终制剂，例如抗体或片段保持在溶液中。
可通过许多途径施用本发明的药物组合物，包括但不限于口服、静脉内、肌内、动脉内、髓内、鞘内、心室内、透皮、经皮(例如，参见WO98/20734)、皮下、腹膜内、鼻内、经肠、局部、舌下、阴道内或直肠途径。还可使用皮下注射器施用本发明的药物组合物。通常，可将治疗性组合物制备为可注射的液体溶液或悬浮液。还可制备适合于在注射之前溶解或悬浮于液体媒介物中的固体形式。优选，通过吸入或局部途径皮下施用本发明的抗体分子。
通常可通过皮下、腹膜内、静脉内或肌内注射来实现组合物的直接递送或将其递送至组织的胞间隙。还可将组合物施用入特定的目的组织。剂量治疗可以是单剂量方案或多剂量方案。
应理解，组合物中的活性成分是抗体分子。因此，其在胃肠道中易于降解。因此，如果通过利用胃肠道的途径来施用组合物，那么组合物必须包含保护抗体免受降解并且一旦其从胃肠道被吸收，就释放抗体的试剂。
药学上可接受的载体的详尽论述可在Remington′sPharmaceutical Sciences(Mack Publishing Company，N.J.1991)中获得。
在一个实施方案中，以用于局部施用(包括吸入)的制剂提供制剂。
适当的可吸入制剂包括可吸入粉剂、包含抛射剂气体的计量气雾剂或不含抛射剂气体的可吸入溶液(例如可雾化(nebulisable)溶液或悬浮液)。包含活性物质的根据本公开内容的可吸入粉剂可仅由上述活性物质组成或可由上述活性物质与药学上可接受的赋形剂的混合物组成。
此类可吸入粉剂可包括单糖(例如葡萄糖或阿拉伯糖)、二糖(例如乳糖、蔗糖、麦芽糖)、低聚糖和多糖(例如葡聚糖)、多元醇(例如山梨醇、甘露醇、木糖醇)、盐(例如氯化钠、碳酸钙)或此类物质彼此的混合物。可适当地使用单糖或二糖，使用乳糖或葡萄糖，特别地但非排他地以它们的水合物形式使用。
用于在肺中沉着的颗粒需要小于10微米，例如1-9微米，例如0.1至5μm，特别地1至5μm的颗粒大小。活性物质(例如抗体或片段)的颗粒大小是最重要的。
可用于制备可吸入气雾剂的抛射剂气体在本领域内是已知的。适当的抛射剂气体选自烃类例如正-丙烷、正-丁烷或异丁烷和卤代烃例如甲烷、乙烷、丙烷、丁烷、环丙烷或环丁烷的氯化和/或氟化衍生物。上述抛射剂气体可单独使用或以其混合物形式使用。
特别适合的抛射剂气体是选自TG 11、TG 12、TG 134a和TG227的卤代烷衍生物。在上述卤代烃中，TG134a(1，1，1，2-四氟乙烷)和TG227(1，1，1，2，3，3，3-七氟丙烷)及其混合物是特别适合的。
含有抛射剂气体的可吸入气雾剂还可包含其他成分例如共溶剂、稳定剂、表面活化剂(表面活性剂)、抗氧化剂、润滑剂和用于调整pH的工具。所有这些成分在本领域内是已知的。
根据本发明的含有抛射剂气体的可吸入气雾剂可包含多至按重量计算5％的活性物质。根据本发明的气雾剂包含例如，按重量计算0.002-5％、按重量计算0.01-3％、按重量计算0.015-2％、按重量计算0.1-2％、按重量计算0.5-2％或按重量计算0.5-1％的活性物质。
可选地，对肺的局部施用还可以是液体溶液或悬浮液制剂的施用，例如利用装置例如雾化器，例如与压缩机连接的雾化器(例如，由PariRespiratory Equipment，Inc.，Richmond，Va.制造的与Pari Master(R)压缩机连接的Pari LC-Jet Plus(R)雾化器)进行施用。
在一个实施方案中，以分开的包含单位剂量的安瓿形式提供用于通过雾化作用递送的制剂。
在一个实施方案中，以冻干的形式(用于重构)或可选地作为悬浮液制剂提供抗体。
可将本发明的抗体分散在溶剂中，例如以溶液或悬浮液的形式递送。可将其悬浮在适当的生理溶液例如生理盐水、药学可接受的溶剂或缓冲溶液中。本领域内已知的缓冲溶液可包含0.05mg至0.15mg依地酸二钠、8.0mg至9.0mg NaCl、0.15mg至0.25mg聚山梨酯、0.25mg至0.30mg无水柠檬酸和0.45mg至0.55mg柠檬酸钠/1ml水，以获得约4.0至5.0的pH。如上文中所提及的，可例如从冻干的抗体制备悬浮液。
治疗性悬浮液或溶液制剂还可包含一种或多种赋形剂。赋形剂在本领域内是公知的并且包括缓冲剂(例如，柠檬酸盐缓冲剂、磷酸盐缓冲剂、乙酸盐缓冲剂和碳酸氢盐缓冲剂)、氨基酸、尿素、醇、抗坏血酸、磷脂、蛋白质(例如，血清白蛋白)、EDTA、氯化钠、脂质体、甘露醇、山梨醇和甘油。可将溶液或悬浮液封装在脂质体或生物可降解的微球体中。通常利用无菌制造方法以基本上无菌的形式提供制剂。
这可包括通过下列生产和灭菌：过滤用于制剂的缓冲溶剂溶液、将抗体无菌悬浮于无菌缓冲溶剂溶液中，和利用本领域技术人员熟悉的方法将制剂分配至无菌容器中。
可以提供根据本公开内容的可雾化制剂，例如作为包装在箔封袋中的单个剂量单位(例如，密封塑料容器或小瓶)。每一个小瓶在例如2ml的溶剂/溶液缓冲液的体积中包含单位剂量。
本公开内容的抗体被认为适合于通过雾化作用递送。
还设想可通过利用基因疗法来施用本发明的抗体。为了实现该设想，将处于适当的DNA元件控制之下的编码抗体分子的重链和轻链的DNA序列导入患者，以便抗体链从DNA序列表达并且原位装配。
本发明还提供了用于控制炎性疾病例如急性或慢性炎性疾病的抗体分子(或包含其的组合物)。适当地，可将抗体分子(或包含其的组合物)用于减轻炎性过程或预防炎性过程。在一个实施方案中，提供了活化的T细胞，特别是参与不适当的炎性免疫应答，例如被招募至此类应答的附近/位置的那些活化的T细胞的体内减少。
活化的T细胞的减少，如本文中所用的，可以是与治疗前或与不治疗相比较10、20、30、40、50、60、70、80、90％或更多的减少。
有利地，利用本发明的抗体、片段或组合物的治疗可使活化的T细胞的水平降低，而不降低患者的T细胞(未活化的T细胞)的总水平。这可导致更少的副作用，并且可防止患者的T细胞耗竭。
本发明还提供了用于治疗或预防由IL-13介导的或与增加的IL-13水平相关的病理病症的本发明的抗体分子。
病理状况或病症可以例如选自：感染(病毒性、细菌性、真菌性和寄生虫性)、与感染相关的内毒素性休克、关节炎例如类风湿性关节炎、哮喘例如严重哮喘、慢性阻塞性肺病(COPD)、盆腔炎性疾病、阿尔茨海默病、炎性肠病、克罗恩病、溃疡性结肠炎、派罗尼病(Peyronie′sDisease)、腹部疾病(coeliac disease)、胆囊疾病、藏毛病、腹膜炎、银屑病、血管炎、手术粘连(surgical adhesions)、中风、I型糖尿病、莱姆病、脑膜脑炎、自身免疫性葡萄膜炎、免疫介导的中枢和周围神经系统的炎性病症例如多发性硬化、狼疮(系统性红斑狼疮)和格林-巴利综合征(Guillain-Barr syndrome)、特应性皮炎、自身免疫性肝炎、纤维化肺泡炎、格雷夫斯氏病(Grave′s disease)、IgA肾病、特发性血小板减少性紫癜、梅尼埃病(Meniere′s disease)、天疱疮、原发性胆汁性肝硬化、结节病、硬皮病、韦格纳肉芽肿、其他自身免疫性疾病、胰腺炎、创伤(手术)、移植物抗宿主病、移植排斥、心脏病包括局部缺血性疾病例如心肌梗塞以及动脉粥样硬化、血管内凝血、骨质吸收(boneresorption)、骨质疏松、骨关节炎、牙周炎和胃酸过少。
本发明还提供了用于治疗或预防疼痛，特别是与炎症相关的疼痛的根据本发明的抗体分子。
在一个实施方案中，根据本发明的抗体降低对炎症治疗的抗性，特别是肺对炎症治疗的抗性。
在一个实施方案中，根据本发明的抗体与例如治疗前的水平相比较降低支气管组织中的IL-13蛋白水平。降低可以是5、10、20、30、40％或更多。
在一个实施方案中，根据本发明的抗体与例如治疗前的水平相比较降低鼻灌洗液和/或支气管肺泡液中的IL-13蛋白水平。降低可以是5、10、20、30、40％或更多。
在一个实施方案中，根据本发明的抗体与例如治疗前的水平相比较降低嗜酸性粒细胞流入。降低可以是5、10、20、30、40％或更多，例如当治疗1、2、3、4、5、6或更多周时。
在一个实施方案中，根据本发明的抗体适合于降低不适当的杯形细胞的水平，例如在杯形细胞增生例如慢性杯形细胞增生的治疗中。在治疗1、2、3、4、5、6或更多周后可观察到降低。
在一个实施方案中，根据本发明的抗体适合于降低呼出的一氧化氮(FeNO)的水平(与治疗前的水平相比较)。呼出的一氧化氮被认为是肺部炎症的风险因子或标志物。
在一个实施方案中，根据本发明的抗体适合于预防与炎性应答相关的不适当的胶原沉着，特别是支气管周胶原沉着。
在一个实施方案中，根据本发明的抗体适合于预防与炎性应答相关的不适当的血管生成。
因此，提供了用于治疗的根据本发明的抗体和利用所述抗体的治疗方法。
如本文中所使用的，根据本发明的抗体也指本说明书中公开的片段和衍生物。
本发明还提供了根据本发明的抗体分子、片段或组合物在制造药物中的用途，所述药物用于治疗或预防由IL-13介导的或与增加的IL-13水平相关的病理病症，例如本文中描述的病理病症，特别地所述病理病症是类风湿性关节炎、哮喘或COPD。
本发明还提供了根据发明的抗体分子、片段或组合物在制造药物中的用途，所述药物用于治疗或预防本文中描述的一个或多个医学适应症。
可在其中需要减弱IL-13在人体或动物体内的作用的任何疗法中利用本发明的抗体分子、片段或组合物。IL-13可在体内循环或可以以不希望的高水平存在于体内特定位置，例如炎症位置。
在一个实施方案中，本发明的抗体分子或包含其的组合物用于控制炎性疾病，例如本文中描述的炎性疾病。
本发明还提供了治疗患有IL-13介导的病症或处于发生所述病症的风险中的人或动物受试者的方法，所述方法包括给受试者施用有效量的本发明的抗体分子，或包含所述抗体的组合物。在一个实例中，通过吸入施用抗体分子。
在一个实例中，病症选自上文中提供的任何医学适应症。在一个实例中，病症选自：哮喘病症、特应性病症、慢性阻塞性肺疾病(COPD)、牵涉气道炎症的状况、嗜酸性粒细胞增多症、纤维化和过度粘液产生(excess mucus production)、炎性状况、自身免疫性状况、肿瘤或癌症、病毒感染和1型保护性免疫应答的表达的抑制。
在一个实施方案中，提供了用于纯化抗体(特别是根据本发明的抗体或片段)的方法。
在一个实施方案中，提供了用于纯化抗体(特别是根据本发明的抗体或片段)的方法，其包括步骤：
以非结合模式进行阴离子交换层析以便杂质保留在柱子上并且抗体保留在未结合的级分中。可以例如在约6-8的pH下进行该步骤。
所述方法还包括，利用在例如约4至5的pH下进行的阳离子交换层析的初始捕获步骤。
所述方法还包括额外的层析步骤，以确保产物和过程相关杂质从产物流适当地析出。
纯化方法还可包括一个或多个超滤步骤，例如浓缩和渗滤步骤。
因此在一个实施方案中，以大体上纯化的形式(特别是不含或大体上不含内毒素和/或宿主细胞蛋白质或DNA)提供了纯化的IL-13抗体或片段，例如人源化抗体或片段，特别是根据本发明的抗体或片段。虽然如此，但通常在哺乳动物细胞中制备根据本发明的抗体，从而内毒素含量通常不是问题。事实上当在细菌细胞中制备抗体时，更要考虑内毒素含量。
如上文中使用的，纯化形式意指至少90％的纯度，例如91、92、93、94、95、96、97、98、99％w/w或更高的纯度。
大体上不含内毒素通常意指1EU/mg抗体产物或更低例如0.5或0.1EU/mg产物的内毒素含量。
大体上不含宿主细胞蛋白或DNA通常意指400μg/mg抗体产物或更低例如100μg/mg抗体产物或更低，适当时，特别地20μg/mg抗体产物的宿主蛋白质和/或DNA含量。
本发明的抗体分子还可用于诊断，例如用于牵涉IL-13的疾病状态的体内诊断和成像。
用于测试根据本发明的抗体的性质的适当的体内测定法包括：慢性屋螨(house mite)模型、对乙酰甲胆碱的高应答性和/或变应性肺炎症的卵白蛋白模型。
本说明书上下文中的包含意指包括。
当技术上适当时，可组合本发明的实施方案。
实施方案在本文中被描述为包含某些特征/元素。本公开内容也扩展至由或大体上由所述特征/元素组成的分开的实施方案。
在参考附图的下列实施例中通过举例说明的方式进一步描述本发明，其中：
图1显示：
来自重链(CDR H)的CDR 1、2、3和来自轻链(CDR L)的CDR 1、2、3的每一个的氨基酸序列(SEQ ID NO 1-6)，
大鼠抗体轻链可变区的氨基酸序列(SEQ ID NO：7)，
大鼠抗体轻链可变区的DNA序列(SEQ ID NO：8)，和
具有信号序列的大鼠抗体轻链可变区的氨基酸序列(SEQ ID NO：9)。
图2显示：
具有信号序列的大鼠抗体轻链可变区的DNA序列(SEQ ID NO：10)，
大鼠抗体轻链可变区和恒定区的氨基酸序列(SEQ ID NO：11)，
大鼠抗体轻链可变区和恒定区的DNA序列(SEQ ID NO：12)，
具有信号序列的大鼠抗体轻链的氨基酸序列(SEQ ID NO：13)。
图3显示：
具有信号序列的大鼠抗体轻链的DNA序列(SEQ ID NO：14)，
大鼠抗体重链可变区的氨基酸序列(SEQ ID NO：15)，
大鼠抗体重链可变区的DNA序列(SEQ ID NO：16)，
具有信号序列的大鼠抗体重链可变区的氨基酸序列(SEQ IDNO：17)。
图4显示：
具有信号序列的大鼠抗体重链可变区的DNA序列(SEQ ID NO：18)，
大鼠抗体重链可变区和恒定区的氨基酸序列(SEQ ID NO：19)。
图5显示：
大鼠抗体重链可变区和恒定区的DNA序列(SEQ ID NO：20)，
具有信号序列的大鼠抗体重链可变区和恒定区的氨基酸序列(SEQID NO：21)。
图6显示：
具有信号序列的大鼠抗体重链可变区和恒定区的DNA序列(SEQ IDNO：22)。
图7显示：
人源化抗体轻链可变区的氨基酸序列(SEQ ID NO：23)，
人源化抗体轻链可变区的DNA序列(SEQ ID NO：24)，
具有信号序列的人源化抗体轻链可变区的氨基酸序列(SEQ IDNO：25)，
具有信号序列的人源化抗体轻链可变区的DNA序列(SEQ ID NO：26)，
人源化抗体轻链可变区和恒定区的氨基酸序列(SEQ ID NO：27)。
图8显示：
人源化抗体轻链可变区和恒定区的DNA序列(SEQ ID NO：28)，
具有信号序列的人源化抗体轻链可变区和恒定区的氨基酸序列(SEQ ID NO：29)，
具有信号序列的人源化抗体轻链可变区和恒定区的DNA序列(SEQID NO：30)。
图9显示：
人源化抗体重链可变区的氨基酸序列(SEQ ID NO：31)，
人源化抗体重链可变区的DNA序列(SEQ ID NO：32)，
具有信号序列的人源化抗体重链可变区的氨基酸序列(SEQ IDNO：33)，
具有信号序列的人源化抗体重链可变区的DNA序列(SEQ ID NO：34)，
人源化抗体重链可变区和恒定区的氨基酸序列(SEQ ID NO：35)。
图10显示：
人源化抗体重链可变区和恒定区的DNA序列(SEQ ID NO：36)，
具有信号序列的人源化抗体重链可变区和恒定区的氨基酸序列(SEQ ID NO：37)，
人源化抗体重链可变区和恒定区的DNA序列(SEQ ID NO：38)。
图11显示：
人VK 12-1-(1)02 JK4受体构架的氨基酸和DNA序列(SEQ ID NO：39和SEQ ID NO：40)以及VH2 3-1 2-26 JH4受体构架的氨基酸和DNA序列(SEQ ID NO：41和SEQ ID NO：42)。
图12显示：
大鼠的轻链、受体构架和人源化轻链的比对以及重链的比对。CDR以粗体和下划线标示。供体残基G49和R71以粗体、斜体和高亮突出显示。
图13.哮喘的非人灵长类动物模型中在变应原攻击后24小时测量的Ab652对BAL嗜酸细胞活化趋化因子-3的作用。数据表示为平均值±SEM，n＝4-8/组。
图14.哮喘的非人灵长类动物模型中在变应原攻击后24小时测量的Ab652对BAL嗜酸性粒细胞计数的作用。将数据针对在研究的筛选期测量的BAL嗜酸性粒细胞计数进行标准化。平均值±SEM，n＝4-8/组。
图15.哮喘的非人灵长类动物模型中在变应原攻击后测量直至15分钟的Ab652对峰值气道阻力的作用。将数据表示为平均值±SEM，n＝4-8/组。
图16.哮喘的非人灵长类动物模型中在变应原攻击后24小时测量的Ab652对气道阻力的作用。将数据针对在暴露于变应原之前测量的气道阻力进行标准化。平均值±SEM，n＝4-8/组。
实施例
1.治疗性抗体的产生/选择
用纯化的人IL-13(Peprotech)或表达人IL-13(在培养上清液中表达约1ug/ml)的大鼠成纤维细胞或在一些情况下两者的组合免疫大鼠。在3至6次攻击后，杀死动物，收获PBMC、脾、骨髓和淋巴结。在ELISA中监测血清与人IL-13的结合，并且还在HEK-293 STAT-6报告细胞测定(HEK-Blue测定，Invivogen)中监测其中和hIL-13的能力。
利用与Zubler等人(J.Immunol.1985)描述的方法相似的方法制备SLAM培养物(B细胞培养物)。简而言之，在37℃下在5％CO2的大气中，将来自经免疫的动物的500-5000个脾细胞或PBMC培养在数百个96-孔平板的批次中，使用200μl/孔的补充有10％FCS(PAA laboratories1td)、2％HEPES(Sigma Aldrich)、1％L-谷氨酰胺(Gibco BRL)、1％青霉素/链霉素溶液(Gibco BRL)、0.1％β-巯基乙醇(Gibco BRL)、3％活化的兔脾细胞培养上清液和γ-辐照的EL-4-B5鼠胸腺瘤细胞(5×104/孔)的RPMI 1640培养基(Gibco BRL)，进行7天。在筛选测定法中测试B细胞培养上清液并且将阳性上清液合并至主皿(masterplates)中。将培养的B细胞于-80℃下冷冻于100μl 10％DMSO(在FCS中)中。
首先在FMAT中，在基于珠粒的测定法中就它们结合hIL-13的能力筛选SLAM培养上清液。这是使用包被在链霉抗生物素蛋白珠粒上的生物素化的人IL-13和山羊抗-大鼠Fc-Cy5缀合物的均一测定。然后将来自该测定的阳性样品用于HEK-293 IL-13R-STAT-6报告细胞测定(HEK-Blue测定，Invivogen)以鉴定中和样品(neutraliser)。随后在Biacore中分析中和上清液以评估解离率(off-rate)并且表征中和的作用模式。中和作用被分类为栈1(bin 1)或栈2。栈1代表结合人IL-13并且阻止IL-13Rα1的结合，从而也阻断IL-4R的结合的抗体。栈2代表以这样的方式结合hIL-13的抗体，所述方式允许结合IL-13Rα1但阻止IL-4R至复合物内的招募。我们选择通过栈1起作用的抗体。
在初步FMAT筛选中从总共27x100-平板SLAM实验中鉴定了约7500个IL-13特异性阳性孔。800个孔在HEK-blue测定中显示中和作用。170个孔具有期望的Biacore特征，即，具有小于5x10-4s-1的解离率的栈1抗体。尝试从这170个孔克隆可变区并且160个成功地产生了荧光焦点(fluorescent foci)。在逆转录(RT)-PCR后，100个孔产生重链和轻链可变区基因对。将这些V-区基因克隆为小鼠IgG1全长抗体并且将其在HEK-293瞬时表达系统中重新表达。序列分析显示，存在抗人IL-13抗体的27个独特家族。随后在基于细胞的测定中重新测试这些重组抗体的阻断重组hIL-13(大肠杆菌来源的和哺乳动物来源的)、重组变异hIL-13(R130Q)(大肠杆菌来源的)、天然野生型和变异hIL-13(人供体来源的)以及食蟹猴IL-13(哺乳动物来源的)的能力。也在Biacore中测试重组抗体结合变异的人IL-13(R130Q)和食蟹猴IL-13的能力。根据该表征，5个抗体家族满足我们的标准，即，对于所有的人和食蟹猴IL-13制剂具有最小的效能和亲和力下降的sub-100pM抗体。
进行所有5个家族的人源化。基于人源化移植物的中和效能、亲和力和供体含量，选择人源化的CA154_652(参见下文)用于进一步研究。
1.1人源化
通过将来自大鼠抗体V-区(SEQ ID NO 7和15)的CDR(本文在序列1至6中公开的CDR)移植至人种系抗体V-区构架上来制备本文中例举的人源化抗体(Ab652)。大鼠抗体(供体)V-区序列与人种系抗体(受体)V-区序列的比对，与设计的人源化序列一起，示于图12中。从供体移植至受体序列的CDR由Kabat(Kabat等人Sequence of proteins ofimmunological interest(1987).Bethesda MD，National Institutesof Health，US)确定，除CDR-H1(其使用组合的Chothia/Kabat定义来确定)(参见，Adair等人(1991)Humanised antibodies WO 91/09967)外。选择人V-区VH2 3-12-26加JH4 J-区域(V BASE，http://vbase.mrc-cpe.cam.ac.uk/)作为人重链CDR的受体。除残基49和71(Kabat编号)(其中分别保留供体残基甘氨酸(G49)和精氨酸(R71))外，重链构架残基全部来自人种系基因。这两个供体残基的保留是人源化抗体的完全活性所必需的。选择人V-区VK1 2-1-(1)02加JK4 J-区(V BASE，http://vbase.mrc-cpe.cam.ac.uk/)作为轻链CDR的受体。轻链构架残基全部来自人种系基因。
利用由Entelechon GmbH提供的自动化合成方法设计和构建编码初始V-区序列的基因。通过用寡核苷酸指导的诱变修饰VH基因来产生重链的许多不同变体。将gL1基因序列克隆入UCB-Celltech人轻链表达载体pKH10.1，其包含编码人κ链恒定区(Km3同种异型)的DNA-参见SEQ ID No：26和SEQ ID NO：30。将8个移植的VH基因(gH1至gH8)克隆入UCB-Celltech人γ-4重链表达载体pVhγ4P FL，所述载体包含编码具有铰链稳定化突变S241P的人γ-4重链恒定区的DNA(Angal等人，Mol Immunol.1993，30(1)：105-8)。就效能和生物物理特征(在下文中描述)将gH2VH基因选择为最佳重链移植物，随后将其亚克隆入UCB-Celltech人γ-1 Fab载体pVhγ1F3，所述载体包含编码人γ-1CH1结构域(G1m17同种异型)的DNA(SEQ ID NO：38)。所得到的重链质粒与轻链质粒至CHO-L761h细胞中的共转染导致人源化抗体以期望的Fab形式表达。该抗体在本文中称为Ab652(也称为Ab652Fab)。
为了促进表达抗体Ab652的稳定细胞系的产生，产生包含编码重链和轻链表达盒以及谷氨酰胺合成酶(GS)选择标记的DNA的单个质粒。GS基因使得能够通过允许在补充有GS抑制剂甲硫氨酸砜亚胺的培养基中生长来选择重组CHO细胞(Bebbington等人，Biotechnol.1992，10(2)：169-175)。
1.2结合亲和力的测定
BIAcore技术实时监测生物分子之间的结合而不需要进行标记。相互作用物之一，称为配体，被直接固定或捕获在固定的表面上，而另一个，称为分析物，在溶液中于捕获表面上方流过。当分析物结合配体从而在表面上形成复合物时，传感器检测传感器表面上质量的变化。这相应于结合过程。当分析物被缓冲液替代时，监测分析物与配体的解离。在亲和力BIAcore测定中，配体为Ab652并且分析物为人IL-13。
1.3受体交叉阻断测定
Biacore受体交叉阻断测定需要捕获抗IL-13Fab，然后使IL-13(作为第一分析物)在捕获的配体上方流过以在传感器表面上形成稳定的复合物。随后使第二分析物(重组可溶性IL-13受体)在该稳定的复合物上方流过。然后监测第二分析物与稳定复合物结合的量。不允许第二分析物结合稳定的抗体：IL-13复合物的抗IL-13抗体被分类为位点1竞争剂。允许第二分析物结合稳定的抗体：IL-13复合物的那些抗IL-13抗体被分类为位点2竞争剂。
材料
仪器
3000，Biacore AB，Uppsala，Sweden
传感器芯片
CM5(研究级)目录号：BR-1001-14，Biacore AB，Uppsala，Sweden.将芯片于4℃下贮存。
胺偶联试剂盒
目录号：BR-1000-50，Biacore AB，Uppsala，Sweden。
乙基-3-(3-二甲基氨基丙基)碳二亚胺盐酸盐(EDC)。75mg/mL(于蒸馏水中)并且以200μL的等分于-70℃下贮存。
N-羟基琥珀酰亚胺(NHS)。11.5mg/mL(于蒸馏水中)并且以200μL的等分于-70℃下贮存。
1M乙醇胺盐酸盐-NaOH，pH 8.5。以200μL的等分于-70℃下贮存。
缓冲液
运行缓冲液：HBS-EP(为0.01M HEPES pH 7.4，0.15M NaCl，3mMEDTA，0.005％表面活性剂P20)。目录号：BR-1001-88，Biacore AB，Uppsala，Sweden。于4℃下贮存缓冲液。
固定缓冲液：醋酸盐5.0(为10mM醋酸钠pH 5.0)。目录号：BR-1003-51，Biacore AB，Uppsala，Sweden。于4℃下贮存缓冲液。
配体捕获
Affinipure F(ab′)2片段山羊抗人IgG，F(ab′)2片段特异性的。Jackson ImmunoResearch Inc(Pennsylvania，USA)目录号：109-006-097。于4℃下贮存试剂。
配体
Ab652(2.51，21.7和3.86mg/ml Fab)，于4℃下贮存。
抗-hIL-13mIgG(R&D Systems Europe Ltd，Abingdon，Oxon.Catalogue number MAB-213，Lot number RL04)。
分析物
重组人IL-13(0.2mg/ml，来自D.Lightwood；R&D Systems EuropeLtd，Abingdon，Oxon，目录号213-IL-050)，于-70℃下贮存并且对于每一次测定，解冻1次。
重组人IL-13受体1hFc(R&D Systems Europe Ltd，Abingdon，Oxon，目录号146-IL-100)。于-70℃下贮存并且对于每一次测定，解冻1次。
重组人IL-13受体2hFc(R&D Systems Europe Ltd，Abingdon，Oxon，目录号614-IL-100)。于-70℃下贮存并且对于每一次测定，解冻1次。
再生溶液
40mM HCl，通过用蒸馏水稀释从11.6M原液(BDH，Poole，England，目录号：101254H)制备。
5mM NaOH，通过用蒸馏水稀释从50mM原液制备。目录号：BR-1003-58，Biacore AB，Uppsala，Sweden。
关键设备
Biacore 3000 Biosensor，GE Healthcare Ltd，Amersham Place，Little Chalfont，Buckinghamshire，HP7 9NA。按照制造商的方案维护仪器。
1.4Ab652结合亲和力的测量
测定形式是通过固定的抗-人F(ab′)2捕获Ab652，然后在捕获表面上滴定人hIL-13。
使用BIAcore 3000(BIAcore AB)进行BIA(生物分子相互作用分析(Biamolecular Interaction Analysis))。将Affinipure F(ab′)2片段，山羊抗人IgG(F(ab′)2片段特异性的)(Jackson ImmunoResearch)通过胺偶联化学固定在CM5传感器芯片上，捕获水平约4000应答单位(RU)。以相似的方式(从所述方法中略去F(ab′)2片段)制备空白表面。以10μl/分钟的流速将HBS-EP缓冲液(10mM HEPES pH 7.4，0.15M NaCl，3mM EDTA，0.005％表面活性剂P20，BIAcore AB)用作运行缓冲液。以约0.2μg/mL注射的10μl Ab652Fab用于被固定的抗-人I gG-F(ab′)2捕获，以允许足够的IL-13结合并且还使质量运输限制的结合作用降至最低。以30μL/分钟的流速在不同浓度(10nM至0.31nM)下在捕获的Ab652上方滴定人IL-13。通过注射10μL 40mM HCl，然后以10μL/分钟的流速注射5μL 5mM NaOH来再生表面。
按照标准方法使用BIAevaluation软件(版本3.2)分析本底扣除结合曲线。根据拟合算法测定动力学参数。
表1
1.5IL-13受体交叉阻断研究
BIAcore受体交叉阻断测定需要捕获抗IL-13Fab，然后使IL-13(作为第一分析物)在捕获的配体上方流过以在传感器表面上形成稳定的复合物。随后使第二分析物(重组可溶性IL-13受体)在该稳定的复合物上方流过。然后监测第二分析物与稳定复合物结合的量。不允许第二分析物结合稳定的抗体：IL-13复合物的抗IL-13抗体被分类为Axis 1竞争剂。允许第二分析物结合稳定的抗体：IL-13复合物的那些抗IL-13抗体被分类为Axis 2竞争剂。
在25℃下使用Biacore 3000生物传感器进行所有实验。将HBS-EP缓冲液以10μL/分钟(min)的流速用作运行缓冲液。如对于亲和力测定所描述的，使用相同的传感器表面。
以约0.2μg/mL注射的10μl抗人IL-13Fab用于被抗人F(ab′)2-片段特异性的山羊F(ab′)2IgG传感器表面捕获。0.2ug/ml的抗人IL-13Fab提供足够的抗-人IL-13结合。在捕获的抗体上方注射25nM的人IL-13，紧接着立即以10μL/分钟的流速注射100nM的可溶性人IL-13受体。通过两次注射30μL的40mM HCl，然后以30μL/分钟的流速注射5μL 5mM NaOH来再生表面。
按照标准方法使用由制造商提供的BIAevaluation软件(版本3.2)分析本底扣除结合曲线。
表2.Biacore阻断总结
  抗体   Ab结合   hIL-13结合   hIL-13Ra1结合   hIL-13Ra2结合
  Ab652   103.1   22.4   -   1.5
  Ab652   72.6   18.5   -0.4   -
  对照抗体   138.4   13.9   -   51.4
  对照抗体   126   11.6   15.4   -
IL-13与两种受体(IL-13Rα1和IL-13Rα2)之任一种相互作用形成复合物。只有hIL-13/hIL-13α1复合物发出信号。因此，抑制IL-13依赖性信号转导的抗-IL13抗体可通过阻断与hIL-13α1的相互作用介导该效应。在BIAcore测定中确定人IL-13上Ab652的相互作用的位点。Ab652被固定的抗-人F(ab′)2表面捕获，随后hIL-13又被Ab652捕获。评估可溶性IL-13Rα1与捕获的IL-13/抗体复合物的结合。用hIL-13Rα2取代hIL-13Rα1，重复该测定。由Ab652呈递的IL-13不能结合任一种IL-13受体，但商业对照抗-IL-13抗体(mAb 213)能够将IL-13呈递给可溶性IL-13受体。综上所述，Ab652抑制IL-13与两种hIL-13受体亚单位的结合，从而将其确定为Axis 1竞争剂。
表3：纯化的Ab652 Fab对hIL-13的亲和力
在3个分开的测定中在Biacore测定中测定Ab652对hIL-13的亲和力。亲和力在9-24pM的范围内，平均值为13.4(+4.8)pM
1.6基于细胞的效能
利用HEK-BLUETM STAT-6测定(Invivogen)研究Ab652Fab中和IL-13的体外效能。所述测定包括稳定地表达人STAT-6和稳定地表达处于融合至4个STAT-6结合位点的IFN-β最小启动子控制之下的分泌型胚胎碱性磷酸酶(SEAP)的HEK293细胞。使用不同类型的人IL-13(以250pg/mL用于测定)评估Ab652的中和效能(IC50)。评估针对从细菌(大肠杆菌)和哺乳动物(大鼠成纤维细胞)宿主细胞产生的重组野生型人IL-13的中和效能。评估针对从人T淋巴细胞产生的天然野生型和变异R130Q人IL-13和针对在哺乳动物细胞中产生的重组食蟹猴IL-13的中和效能。R130Q hIL-13未被纯化并且浓度利用hIL-13ELISA来测定。食蟹猴IL-13未被纯化并且以在测定中提供与250pg/mL hIL-13等同的应答的浓度使用。此外，在使用PARI网孔式雾化器雾化后测量CA154_652.g2Fab的中和效能。表4：HEK Blue测定中Ab652Fab抗多种形式的IL-13的IC50值。为了测定功能性亲和力，在固定浓度的Ab652存在的情况下进行IL-13滴定。将Schild-plot分析应用于数据以测定重组人野生型IL-13和重组食蟹猴IL-13的中和的KD值。表5：HEK Blue测定中Ab652Fab抗多种形式的IL-13的IC50和KD值。
表4
  IL-13来源(250pg/ml)   IC50Ab652Fab(ng/ml)
  大肠杆菌来源的，野生型   1.05
  哺乳动物(大鼠成纤维细胞)，野生型   0.57
  天然人T细胞，野生型   2.12
  天然人T细胞，R130Q变体   1.66
  食蟹猴对人受体(1/4,000＝250pg/ml)   1.61
  雾化的Fab   1.15
表5
总体上，这些数据显示，Ab652Fab在中和从细菌和哺乳动物来源产生的重组和天然人IL-13上效能相似。在该测定中CA154_652.g2针对食蟹猴IL-13的效能不低于针对也从大鼠成纤维细胞产生的人IL-13的效能的1/3。CA154_652.g2的效能在使用PARI雾化器雾化后未被改变。
1.7Ab652的物理特征
如上所述，使用来源于选择的大鼠抗体的CDR(SEQ ID NO：1-6，图1)产生8个不同的抗体移植的可变区。基于如上所述的效能和生物物理特征从这8个移植物选择Ab652(gL1gH2)。
基于对于所有测试的移植的可变区产生的数据，选择抗体652，因为其：
·保持最高的对hIL-13和变异IL-13的亲和力
·具有最高的熔解温度，Tm(更高的稳定性的指标)
·最大的pH稳定性(通过圆二色性)，即在低pH下显示更小的扰动
·当振荡或雾化时不聚集
相反地，一些其他测试的移植物显示结合亲和力的降低、较差的pH稳定性以及由振荡和/或雾化导致的聚集。
1.7.1雾化的影响
为了确定Ab652是否适合于雾化，使用PARI雾化器。在环境温度(约21℃)下雾化2.5mL体积的在50mM醋酸钠/125mM氯化钠pH5中的Ab652溶液，通过将雾化物(nebulisate)凝缩在冷却的收集管中来进行收集。随后的分析显示无明显降解。还使用在PBS，pH 7中的溶液重复该研究。IgG4用作阳性对照，已发现其在雾化过程中聚集。为了检测聚集的材料的存在，通过大小排阻、SDS-PAGE、动态光散射和配体结合分析雾化的样品。这些技术的任一技术未检测出明显的变化，表明Ab652在雾化过程中对损害具有抗性。
1.7.2Ab652的物理特征的概述
pI(等电点)8(2个测定的平均值)
热稳定性Tm 84℃
当将抗体经历搅拌/振荡或雾化时未观察到Ab652的聚集
2.Ab652在哮喘的非人灵长类动物模型中的作用
目的
本研究的目的是评估Ab652在哮喘的非人灵长类动物模型中的功效。主要终点包括对支气管肺泡灌洗(BAL)细胞计数、趋化因子水平以及早期和晚期肺功能变化(如通过肺阻力(RL)评估的)的影响。
方法
使用网孔式雾化器雾化Ab652。利用研究设施中使用的标准呼吸机参数和管道设置(tubing set-up)进行呼吸模拟研究。呼吸模拟研究的结果显示，40.4％的装载在雾化器中的材料将以气管导管(endotrachealtube)的水平被递送。
基于历史肺功能值和BAL嗜酸性粒细胞计数选择研究动物。在筛选期间，在分配至处理组之前将动物经历猪蛔虫(A.suum)抗原攻击以表征它们对猪蛔虫的正常(未治疗的)应答。在该筛选期后，基于来自筛选期的BAL细胞计数和肺功能数据将动物分配至剂量组。在处理期间，动物以雾化器中0.1、1、10或60mg/动物/天的剂量水平接受雾化的媒介物(PBS)或雾化的Ab652。在第-2、-1、1、2和3天通过雾化器施用剂量。在第1和2天，在猪蛔虫攻击前约30分钟进行处理施用。
攻击方案对于两个时期是相同的。在第1和2天攻击每只动物，在每次抗原攻击后记录肺功能值(RL)至少15分钟和在每次变应原攻击后24小时记录肺功能值(RL)。在第一次攻击前和在第二次攻击后约24小时收集BAL液，用于估计总细胞数、形态学和白细胞分类计数，以评估肺部炎症的程度。收集和分析BAL上清液样品，以测定趋化因子浓度。
结果
雾化的Ab652以低mg/天剂量显著抑制BAL嗜酸细胞活化趋化因子-3的增加(图13)。雾化的Ab652引起在筛选期与处理期之间测量的BAL嗜酸性粒细胞的增加的剂量依赖性抑制(图14)。雾化的Ab652在处理期显著且剂量依赖性地抑制蛔虫攻击后测量直至15分钟的第2天的峰值早期应答(图15)。雾化的Ab652显著且剂量依赖性地抑制第2天变应原攻击后24小时测量的晚期应答(图16)。
结论
在食蟹猴的哮喘的蛔虫模型中利用雾化的Ab652产生的数据证明：IL-13-驱动的变应性肺部炎症对在气雾剂中被直接递送至气道的中和性抗-IL-13Fab片段的药理调节敏感。Ab652是显著有效的，这证明了在低mg/天剂量上的功效。
当然应理解，本发明仅以举例说明的方式进行了描述，其绝不意味着是限定性的，并且可在下文的权利要求的范围内进行细节的变动。本发明的每一个实施方案的优选特征经必要的修正后可用于每一个其他实施方案。本说明书中引用的所有公开案，包括但不限于专利和专利申请，通过引用并入本文，就如同明确且单独地指明，将每一个公开案以全文通过引用并入本文。

Claims (30)

1.结合人IL-13的拮抗性抗体，其包含重链和轻链，其中所述重链的可变结构域包含如SEQ ID NO:1所示的CDR-H1，如SEQ ID NO:2所示的CDR-H2，以及如SEQ ID NO:3所示的CDR-H3，并且其中所述轻链的可变结构域包含如SEQ ID NO:4所示的CDR-L1，如SEQ ID NO:5所示的CDR-L2，以及如SEQ ID NO:6所示的CDR-L3。
2.权利要求1的拮抗性抗体，其中所述重链的可变结构域由SEQID NO:31中给出的序列组成。
3.权利要求1的拮抗性抗体，其中所述轻链的可变结构域由SEQID NO:23中给出的序列组成。
4.权利要求1至3的任一项的拮抗性抗体，其中所述抗体选自：具有全长重链和轻链的完整抗体分子或其片段，其中所述片段是Fab、经修饰的Fab'、Fab'、F(ab')2、Fv或scFv片段。
5.结合人IL-13的拮抗性抗体，其具有由SEQ ID NO:31中给出的序列组成的重链可变结构域和由SEQ ID NO:23中给出的序列组成的轻链可变结构域。
6.结合人IL-13的拮抗性抗体，其具有由SEQ ID NO:35中给出的序列组成的重链和由SEQ ID NO:27中给出的序列组成的轻链。
7.权利要求1、5和6的任一项的拮抗性抗体，其具有与其连接的效应分子或报告分子。
8.权利要求1、5和6的任一项的拮抗性抗体，其具有30pM或更好的对于分离的人IL-13的结合亲和力。
9.分离的DNA序列，其编码权利要求1至8的任一项的拮抗性抗体的重链和/或轻链。
10.克隆或表达载体，其包含一种或多种权利要求9的DNA序列。
11.权利要求10的克隆或表达载体，其中所述载体包含SEQ IDNO:36和SEQ ID NO:28中给出的序列。
12.宿主细胞，其包含一种或多种权利要求11的克隆或表达载体。
13.用于产生权利要求1至8的任一项的拮抗性抗体的方法，其包括培养权利要求12的宿主细胞和分离所述拮抗性抗体。
14.药物组合物，其包含与一种或多种药学上可接受的赋形剂、稀释剂或载体组合的权利要求1至8的任一项的拮抗性抗体。
15.权利要求14的药物组合物，其还包含其他活性成分。
16.权利要求1至8的任一项的拮抗性抗体在制造药物中的用途，所述药物用于治疗或预防由IL-13介导的或与增加的IL-13水平相关的病理病症。
17.权利要求1至8的任一项的拮抗性抗体在制造药物中的用途，所述药物用于治疗或预防由IL-13介导的或与增加的IL-13水平相关的病理病症，其中所述药物通过吸入进行施用。
18.权利要求16或17的用途，其中所述病理病症为哮喘病症。
19.权利要求16或17的用途，其中所述病理病症为特应性病症。
20.权利要求16或17的用途，其中所述病理病症为慢性阻塞性肺疾病。
21.权利要求16或17的用途，其中所述病理病症为牵涉气道炎症的状况。
22.权利要求16或17的用途，其中所述病理病症为嗜酸性粒细胞增多症。
23.权利要求16或17的用途，其中所述病理病症为纤维化。
24.权利要求16或17的用途，其中所述病理病症为过度粘液产生。
25.权利要求16或17的用途，其中所述病理病症为炎性状况。
26.权利要求16或17的用途，其中所述病理病症为自身免疫性状况。
27.权利要求16或17的用途，其中所述病理病症为肿瘤。
28.权利要求16或17的用途，其中所述病理病症为癌症。
29.权利要求16或17的用途，其中所述病理病症为病毒感染。
30.权利要求16或17的用途，其中所述病理病症为1型保护性免疫应答的表达的抑制。
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