CN102375037B - 应用电泳中介微分析技术分离测定普瑞巴林手性异构体的方法 - Google Patents
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Abstract
本发明涉及一种普瑞巴林手性异构体衍生化及分离检测方法，所述方法将手性衍生化试剂Nα-(5-氟-2，4-二硝基苯基)-氨基酸类化合物溶于可加速双分子亲核取代反应的促进剂中，应用电泳中介微分析技术，于毛细管柱头以电泳为驱动力，使手性衍生化试剂与普瑞巴林及其手性异构体混合并进行衍生化反应，反应完毕，直接在线对衍生物采用非手性毛细管胶束电动色谱分离测定。本发明所提供的方法适合分离检测含普瑞巴林手性异构体的普瑞巴林原料药及含普瑞巴林的制剂等，具有样品和手性衍生化试剂的用量极少，分析成本较低，分析过程简单、快速，易于控制和自动化，分析结果重现性好等特点。
Description
技术领域
本发明属于分析化学领域，涉及化合物的在线衍生化反应及分离测定方法，具体涉及Nα-(5-氟-2，4-二硝基苯基)-L-丙胺酰胺与普瑞巴林及其手性异构体在可加速双分子亲核取代反应的促进剂中，应用电泳中介微分析技术，于毛细管柱头以电泳为驱动力进行混合并进行衍生化反应，反应完毕，直接在线对衍生物采用非手性毛细管胶束电动色谱分离测定的方法。
背景技术
众所周知，柱前衍生化方法作为测定手性化合物含量的常用方法，也是一种高检测灵敏度的检测方法。对有手性中心且无紫外吸收或紫外吸收较弱的化合物，可采用合适的衍生化方法进行含量和手性异构体杂质的准确测定。
普瑞巴林是一种弱紫外吸收的手性化合物，其化学名称为(S)-3-(氨甲基)-5-甲基己酸，用于治疗癫痫和神经疼痛。普瑞巴林手性异构体几乎没有药理活性，其化学名称为(R)-3-(氨甲基)-5-甲基己酸，是普瑞巴林的重要杂质，也是控制普瑞巴林质量的重要指标。
由于普瑞巴林及其手性异构体的紫外吸收很弱，采用常规的紫外检测存在一定困难。使用手性高效液相色谱柱-质谱检测直接分离测定普瑞巴林手性异构体，不但分离效果较差，且灵敏度低，试验成本高(Journal of Chromatograph B 875(2008)148-153)。中国发明专利(专利号：200510057381.8，公开日：2006年6月14日)和3篇文献(药物分析杂志27(2007)1884-1886；中国药科大学学报38(2007)523-526；Journalof Chromatographic Science 46(2008)42-44)公开并报道了同一种普瑞巴林手性异构体的衍生化分离测定方法。该方法以Nα-(5-氟-2，4-二硝基苯基)-L-氨基酸类化合物作为手性衍生化试剂，与普瑞巴林在水浴中加热1小时进行衍生化反应后，通过室温减压干燥以去除低沸点有机溶剂，再重组并用非手性高效液相色谱法对衍生物进行分离测定。该方法的反应时间长，后处理步骤繁琐、耗时，易造成衍生物的分解，且去除的有机溶剂污染大气环境，手性试剂消耗量大，实验成本较高。中国发明专利(专利申请号：200910045925.7，公开日：2010年7月28日)以Nα-(5-氟-2，4-二硝基苯基)-D-氨基酸类化合物作为手性衍生化试剂，与普瑞巴林在高沸点的非质子性有机溶剂中，于微波辅助条件下进行快速衍生化反应，反应完毕不经后处理直接采用非手性高效液相色谱对衍生物进行分离测定。应用该方法时应小心选择微波加热的功率和加热时间，应注意不同样品之间应受热均匀，否则易于产生副产物，干扰分离和检测，并影响测定结果的重现性。此外，应用Nα-(5-氟-2，4-二硝基苯基)-氨基酸类化合物作为手性衍生化试剂时，反应完毕一般需加入醋酸溶液以终止反应，故实验时应注意平行操作。
发明内容
本发明中所提及的名词解释如下：
普瑞巴林指的是化学名称为(S)-3-(氨甲基)-5-甲基己酸。
普瑞巴林手性异构体指的是(R)-3-(氨甲基)-5-甲基己酸。
普瑞巴林消旋体指的是含(S)-3-(氨甲基)-5-甲基己酸和(R)-3-(氨甲基)-5-甲基己酸，且含(R)-3-(氨甲基)-5-甲基己酸大于10％以上。
本发明所要解决的技术问题是提供一种简便、快速、准确并更经济的普瑞巴林及其手性异构体的分离检测方法，所述方法具有样品和手性衍生化试剂的用量极少，分析成本较低，分析过程简单、快速，易于控制和自动化，分析结果重现性好等特点。
本发明提供了一种普瑞巴林及其手性异构体的分离检测方法，包括：
A)将手性衍生化试剂溶于可加速双分子亲核取代反应的促进剂中，应用电泳中介微分析技术，依次进样手性衍生化试剂溶液、含普瑞巴林的样品溶液和手性衍生化试剂溶液，再加电压，以电泳为驱动力，使普瑞巴林与手性衍生化试剂因电泳淌度不同而混合，并在毛细管柱头进行衍生化反应。所述手性衍生化试剂为Nα-(5-氟-2，4-二硝基苯基)-L-丙胺酰胺。
B)反应完毕，直接在线对衍生物采用非手性毛细管胶束电动色谱分离测定。
上述Nα-(5-氟-2，4-二硝基苯基)-L-氨基酸类化合物选自以下任一化合物：Nα-(5-氟-2，4-二硝基苯基)-L-丙胺酰胺、Nα-(5-氟-2，4-二硝基苯基)-L-苯丙胺酰胺、Nα-(5-氟-2，4-二硝基苯基)-L-脯胺酰胺、Nα-(5-氟-2，4-二硝基苯基)-L-缬胺酰胺、Nα-(5-氟-2，4-二硝基苯基)-D-丙胺酰胺、Nα-(5-氟-2，4-二硝基苯基)-D-苯丙胺酰胺、Nα-(5-氟-2，4-二硝基苯基)-D-脯胺酰胺、Nα-(5-氟-2，4-二硝基苯基)-D-缬胺酰胺。优选Nα-(5-氟-2，4-二硝基苯基)-L-丙胺酰胺。
本发明所提供一种普瑞巴林及其手性异构体的分离检测方法主要包括以下步骤：
1)取普瑞巴林或含普瑞巴林的制剂适量，用水溶解并稀释后，配制成含普瑞巴林的样品溶液；
2)取手性衍生化试剂适量，用六甲基磷酰三胺溶解并配制成手性衍生化试剂溶液；
3)取手性衍生化试剂溶液在25mbar压力下进样1～10s，再取含普瑞巴林的样品溶液在25mbar压力下进样4s，最后取手性衍生化试剂溶液在25mbar压力下进样1～10s，每一次进样完毕、下次进样或加电压前，应先将毛细管进样端在六甲基磷酰三胺中浸一下，普瑞巴林与手性衍生化试剂的用量摩尔比为1∶1～1∶12；
4)将毛细管两端插入含操作缓冲液的小瓶中，加电压5kV并维持5～10s，使普瑞巴林与手性衍生化试剂混合，停止加电压，使普瑞巴林在45～55℃柱温下进行衍生化反应5～15min；
5)直接加电压进行非手性毛细管胶束电动色谱分离测定。
所述的衍生化试剂如上文所述，在步骤3)所述普瑞巴林与手性衍生化试剂的用量摩尔比为1∶1～1∶12，优选1∶2～1∶5，更优选1∶3，即：取手性衍生化试剂溶液在25mbar压力下进样3s，再取含普瑞巴林的样品溶液在25mbar压力下进样4s，最后取手性衍生化试剂溶液在25mbar压力下进样3s。
所述步骤4)为使普瑞巴林与手性衍生化试剂混合，加电压5kV并维持5～10s，优选6～8s，更优选7s。
所述步骤4)为加速普瑞巴林与手性衍生化试剂在毛细管柱头进行的衍生化反应，柱温应保持在45～55℃，优选48～52℃，更优选50℃。
所述步骤4)为完成普瑞巴林与手性衍生化试剂的衍生化反应，反应时间应为5～15min，优选8～12min，更优选10min。
上述衍生化反应为双分子亲核取代反应，一般需采用长时间的水浴加热或在高沸点的非质子性有机溶剂中进行微波加热以加速反应。本发明采用了可促进该类反应的六甲基磷酰三胺作为手性衍生化试剂的溶剂和“三明治”式电泳中介微分析技术，依次进样手性衍生化试剂溶液、含普瑞巴林的样品溶液和手性衍生化试剂溶液，再加电压，以电泳为驱动力，使普瑞巴林与手性衍生化试剂因电泳淌度不同而混合，并在毛细管柱头进行衍生化反应，反应完毕，直接在线对衍生物采用非手性毛细管胶束电动色谱进行分离测定。采用该方法，样品和手性衍生化试剂的用量极少，分析成本较低，分析过程简单、快速，易于控制和自动化，分析结果重现性好。
在所述的分离检测方法中，非手性毛细管胶束电动色谱使用的毛细管柱是未涂层弹性石英毛细管。检测波长为200～380nm，优选340nm。
本发明所述的分离检测方法中，所使用的操作缓冲液为含十二烷基硫酸钠的硼砂溶液-乙腈体系，所述的十二烷基硫酸钠的浓度为35～45mmol/L，优选40mmol/L所述的硼砂溶液的浓度为65～75mmol/L，优选70mmol/L；所述的硼砂溶液的pH值为9.8～10.2，优选10.0；所述的硼砂溶液与乙腈的比例为92∶8～88∶12，优选90∶10。
附图说明
图1为空白的电泳图
图2为普瑞巴林消旋体(S构型与R构型)衍生物的电泳图
图3为普瑞巴林衍生物的电泳图
具体实施方式
下面将结合实施例对本发明作进一步说明，可以使本领域专业技术人员更全面地理解本发明，但不以任何方式限制本发明。
实施例1
仪器与条件
美国Agilent G1600AX型毛细管电泳系统及工作站；非涂层弹性石英毛细管(50μm i.d，柱长为48.5cm，有效柱长为40cm，河北永年锐沣色谱器件有限公司)；新毛细管依次用1mol/L氢氧化钠溶液、1mol/L盐酸溶液、乙腈和水分别冲洗处理5min；每日使用前用1mol/L氢氧化钠溶液冲洗3min；操作缓冲液：含40mmol/L十二烷基硫酸钠的70mmol/L硼砂溶液(用硼酸调节pH值为10.0)-乙腈(90∶10)；操作电压：15kV；毛细管温度：50℃；检测波长：340nm(参比波长：off)；两次进样中间用依次用0.1mol/L氢氧化钠溶液和操作缓冲液冲洗毛细管2min。
实施步骤
取普瑞巴林消旋体约20mg置10ml量瓶中，用水溶解并稀释至刻度，摇匀，作为样品溶液；另取Nα-(5-氟-，4-二硝基苯基)-L-丙胺酰胺12mg，加入六甲基磷酰三胺2ml使溶解，摇匀，作为手性衍生化试剂溶液。取手性衍生化试剂溶液在25mbar压力下进样3s，再取样品溶液在25mbar压力下进样4s，最后取手性衍生化试剂溶液在25mbar压力下进样3s，每一次进样完毕、下次进样或加电压前，应先将毛细管进样端在六甲基磷酰三胺中浸一下；将毛细管两端插入含操作缓冲液的小瓶中，加电压5kV并维持7s，停止加电压10min，再直接加操作电压进行分离测定。结果见图2。
图2中1为过量的衍生化试剂峰；2为副产物峰；3和4分别为普瑞巴林(S构型)衍生物和普瑞巴林手性异构体(R构型)衍生物的色谱峰。表明普瑞巴林衍生物与其手性异构体衍生物、过量的衍生化试剂以及反应副产物可以达到基线分离。
实施例2
取普瑞巴林约20mg置10ml量瓶中，以下按照实施例1的实验步骤操作，并按实施例1的条件下进行毛细管胶束电动色谱分析，结果见图3。
图3中1为过量的衍生化试剂峰；2为副产物峰；3和4分别为普瑞巴林(S构型)衍生物和普瑞巴林手性异构体(R构型，0.3％)衍生物的色谱峰。表明普瑞巴林衍生物与其手性异构体衍生物、过量的衍生化试剂以及反应副产物可以达到基线分离，并能准确测定普瑞巴林中含有的手性异构体杂质。
实施例3
按照实施例1的实验步骤，以水代替样品溶液进行操作，并按实施例1的条件下进行毛细管胶束电动色谱分析，结果见图1。
图1中1为衍生化试剂峰；2为副产物峰；在普瑞巴林(S构型)衍生物和普瑞巴林手性异构体(R构型)衍生物的迁移时间处无色谱峰，表明衍生化试剂以及反应副产物不干扰测定。
Claims (12)
1.一种应用电泳中介微分析技术分离测定普瑞巴林手性异构体的方法，包括以下步骤：
1）取普瑞巴林或含普瑞巴林的制剂适量，用水溶解并稀释后，配制成含普瑞巴林的样品溶液；
2）取手性衍生化试剂适量，用六甲基磷酰三胺溶解并配制成手性衍生化试剂溶液；
3）取手性衍生化试剂溶液在25mbar压力下进样1～10s，再取含普瑞巴林的样品溶液在25mbar压力下进样4s，最星后取手性衍生化试剂溶液在25mbar压力下进样1～10s，每一次进样完毕、下次进样或加操作电压前，应先将毛细管进样端在六甲基磷酰三胺中浸一下，普瑞巴林与手性衍生化试剂的用量摩尔比为1：1～1：12；
4）将毛细管两端插入含操作缓冲液的小瓶中，加电压5kV并维持5～10s，使普瑞巴林与手性衍生化试剂混合，停止加电压，使普瑞巴林在45～55℃柱温下进行衍生化反应5～15min；
5）反应完毕，直接加电压进行非手性毛细管胶束电动色谱分离测定；
所述手性衍生化试剂为Nα-(5-氟-2,4-二硝基苯基)-氨基酸类化合物。
2.根据权利要求1所述的方法，其特征在于所述的手性衍生化试剂选自以下任一化合物：Nα-(5-氟-2,4-二硝基苯基)-L-丙胺酰胺、Nα-(5-氟-2,4-二硝基苯基)-L-苯丙胺酰胺、Nα-(5-氟-2,4-二硝基苯基)-L-脯胺酰胺、Nα-(5-氟-2,4-二硝基苯基)-L-缬胺酰胺、Nα-(5-氟-2,4-二硝基苯基)-D-丙胺酰胺、Nα-(5-氟-2,4-二硝基苯基)-D-苯丙胺酰胺、Nα-(5-氟-2,4-二硝基苯基)-D-脯胺酰胺、Nα-(5-氟-2,4-二硝基苯基)-D-缬胺酰胺。
3.根据权利要求2所述的方法，其特征在于所述的手性衍生化试剂为Nα-(5-氟-2，4-二硝基苯基)-L-丙胺酰胺。
4.根据权利要求1所述的方法，其特征在于所述的步骤3）普瑞巴林与手性衍生化试剂的用量摩尔比为1：2～1：5。
5.根据权利要求1所述的方法，其特征在于所述的步骤4）加操作电压5kV并维持6～8s使普瑞巴林与手性衍生化试剂混合，停止加电压，使普瑞巴林在45～55℃柱温下进行衍生化反应8～12min。
6.根据权利要求1所述的方法，其特征在于所述的非手性毛细管胶束电动色谱使用的毛细管柱是未涂层弹性石英毛细管。
7.根据权利要求1所述的方法，其特征在于所述的非手性毛细管胶束电动色谱的检测波长为200～380nm。
8.根据权利要求1～7所述的任一方法，其特征在于所述的非手性毛细管胶束电动色谱使用的操作缓冲液为含十二烷基硫酸钠的硼砂溶液-乙腈体系，所述硼砂溶液的pH值为9.8～10.2。
9.根据权利要求8所述的方法，其特征在于所述的十二烷基硫酸钠的浓度为35～45mmol/L。
10.根据权利要求8所述的方法，其特征在于所述的硼砂溶液与乙腈的比例为92：8～88：12。
11.根据权利要求8所述的方法，其特征在于所述的硼砂溶液的浓度为65～75mmol/L。
12.根据权利要求8所述的方法，其特征在于所述的硼砂溶液的pH值使用硼酸调节。
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