CN102373210B

CN102373210B - 糖尿病内皮祖细胞功能损伤相关的microRNA及其应用

Info

Publication number: CN102373210B
Application number: CN 201110366977
Authority: CN
Inventors: 王长谦; 孟舒; 张小平
Original assignee: XinHua Hospital Affiliated To Shanghai JiaoTong University School of Medicine
Current assignee: XinHua Hospital Affiliated To Shanghai JiaoTong University School of Medicine
Priority date: 2011-01-28
Filing date: 2011-11-18
Publication date: 2013-07-10
Anticipated expiration: 2031-11-18
Also published as: CN102373210A

Abstract

本发明公开一组糖尿病内皮祖细胞功能损伤相关的microRNA及其在改变内皮祖细胞血管生成能力中的应用和在制备防治糖尿病动脉粥样硬化疾病药物中的应用，所述microRNA为hsa-miR-21、hsa-miR-27a、hsa-miR-27b、hsa-miR-126和hsa-miR-130a。本发明完善了糖尿病动脉粥样硬化的形成机制，并为糖尿病动脉粥样硬化的防治开辟了新的治疗靶点。

Description

糖尿病内皮祖细胞功能损伤相关的microRNA及其应用

技术领域

本发明涉及糖尿病动脉粥样硬化疾病的治疗领域，更具体地讲，涉及糖尿病内皮祖细胞功能损伤相关的microRNA及其应用。

背景技术

冠状动脉粥样硬化性心脏病目前仍然是西方社会位居首位的死亡原因。内皮损伤是动脉粥样硬化进程的首要步骤^[1，2]。而机体损伤的内皮单层可以通过骨髓来源的内皮祖细胞(endothelial progenitor cell，EPC)分化为内皮细胞而再生。EPC通过提高血管再内皮化形成，限制了动脉粥样硬化的发生发展^[3]，因此EPC功能损伤是动脉粥样硬化的始发主要环节之一^[4]。众所周知糖尿病能促进冠状动脉粥样硬化的发生和发展，而心血管并发症是糖尿病患者死亡的主要原因^[5]。

现阶段，相关研究已发现糖尿病机体EPC数量下降和功能降低是加快糖尿病患者动脉粥样硬化进程的原因之一^[6]。针对糖尿病EPC的研究发现，糖尿病EPC功能损伤与糖尿病EPC表达的相关基因和蛋白的上调和下调有关^[7-9]。

但是，一方面高糖刺激下的EPC的基因和蛋白变化涉及细胞代谢、细胞循环和氧压反应等多个方面^[7]；另一方面，EPC内皮修复功能的实现需通过多个途径的合作，包括EPC“归巢”至血管生长活跃位置，粘附至活化或损伤的内皮细胞或细胞外基质，参与局部活化内皮细胞和/或分化成为成熟的内皮细胞，并整合至损伤的血管^[10]。因此，若仅通过改变糖尿病EPC上一种基因或蛋白表达来抑制其功能损伤可能存在一定的局限性。

随着近年来对miRNA呈爆发式增长的研究，我们知道一种miRNA在细胞内靶基因可有上百种，miRNA调控的靶基因包括转录因子、信号蛋白、脚手架蛋白、代谢酶等，而这些分子在生物网络中，如基因调控网、细胞信号转导网、蛋白质相互作用网以及代谢网中都具有核心作用，因此miRNA通过转录后水平调控这些分子广泛参与了细胞内各种生物功能^[11-13]。由此可见，糖尿病EPC上可能有大量的基因受miRNA的调控。新近研究发现了糖尿病患者的血清中存在相关miRNA表达水平的降低^[14]，但是针对糖尿病EPC功能损伤相关miRNA的研究，尚未见相关报道。

参考文献如下。

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13、O’Hara SP，Mott JL，Splinter PL，et al.MicroRNAs：key modulatorsof posttranscriptional gene expression.Gastroenterology.2009，136：17-25。

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发明内容

本发明的目的在于提供一组糖尿病内皮祖细胞功能损伤相关的microRNA。

本发明的第二个目的是提供糖尿病内皮祖细胞功能损伤相关的microRNA在改变内皮祖细胞血管生成能力中的应用。

本发明的第三个目的是提供糖尿病内皮祖细胞功能损伤相关的microRNA在制备防治糖尿病动脉粥样硬化疾病药物中的应用。

为实现以上目的，本发明公开以下技术方案：一组糖尿病内皮祖细胞功能损伤相关的microRNA，所述microRNA为hsa-miR-21、hsa-miR-27a、hsa-miR-27b、hsa-miR-126和hsa-miR-130a。

上述糖尿病内皮祖细胞功能损伤相关的microRNA在改变内皮祖细胞血管生成能力中的应用，所述改变是指：下调内皮祖细胞上所述microRNA表达将导致内皮祖细胞克隆形成能力降低，内皮祖细胞凋亡水平增加，从而降低内皮祖细胞的血管生成能力；恢复内皮祖细胞上所述microRNA的表达将促进内皮祖细胞上血管生成能力。

上述糖尿病内皮祖细胞功能损伤相关的microRNA在制备防治糖尿病动脉粥样硬化疾病药物中的应用。

糖尿病动脉粥样硬化疾病主要指糖尿病引起的大动脉粥样硬化病，主要包括冠状动脉粥样硬化性心脏病。

按照如下方法筛选出满足本发明目的的microRNA：(1)体外收集年龄、性别匹配的糖尿病患者和非糖尿病患者外周血，磁珠分选EPC；(2)应用microarray analysis技术，体外检测糖尿病EPC miRNAs表达的差异，筛选出参与糖尿病EPC功能损伤的miRNAs；(3)用tagman探针荧光定量PCR验证，然后用数据库及计算机软件分析并筛选出miRNAs所对应的靶mRNA。(4)体外检测所筛选出的miRNAs对EPC功能的影响。

hsa-miR-21、hsa-miR-27a、hsa-miR-27b、hsa-miR-126和hsa-miR-130a在糖尿病患者的EPC中表达明显下调，EPC中该组microRNA表达不足将导致EPC克隆形成能力降低，EPC凋亡水平增加，从而降低EPC的血管生成能力。因此hsa-miR-21、hsa-miR-27a、hsa-miR-27b、hsa-miR-126和hsa-miR-130a是糖尿病EPC功能损伤相关的microRNA，恢复糖尿病患者EPC上hsa-miR-21、hsa-miR-27a、hsa-miR-27b、hsa-miR-126和hsa-miR-130a的表达将促进其血管生成能力，从而预防和治疗糖尿病动脉粥样硬化的发生、发展。基于以上研究，本发明提出将hsa-miR-21、hsa-miR-27a、hsa-miR-27b、hsa-miR-126和hsa-miR-130a用于制备预防、治疗糖尿病动脉粥样硬化疾病药物中的应用。

本发明的优点在于：通过体外收集年龄、性别匹配的糖尿病患者和非糖尿病患者外周血，经磁珠分选EPC，结合microarray analysis技术，体外检测EPCmiRNAs表达的差异，筛选出可能参与糖尿病EPC功能损伤的miRNAs，然后用tagman探针荧光定量PCR验证，用数据库及计算机软件分析并预测筛选出miRNAs所对应的可能靶mRNA，并体外检测所筛选出的miRNAs对EPC功能的影响，最大程度筛选出糖尿病EPC功能损伤的miRNA，进一步完善糖尿病动脉粥样硬化的形成机制，并为糖尿病动脉粥样硬化的防治开辟新的治疗靶点和方法。

附图说明

图1为miRNA质控结果电泳图，其中，图1-1为1％agrose胶电泳总RNA，图1-2为Agilent 2100分析得到的完整的总RNA。

图2为年龄、性别匹配的糖尿病患者和非糖尿病患者EPC基因芯片筛选Cy3/Cy5信号图，其中图2-1为糖尿病患者Cy3，图2-2为糖尿病患者Cy5。

图3为芯片分析结果，非糖尿病组(value2)相比糖尿病组(value1)变化超过10倍以上，且值均大于5的miRNA，浅色部分为Q-PCR的进一步验证microrna。

图4为taqman探针荧光定量PCR验证芯片结果图，与糖尿病组相比^**P＜0.01，^*P＜0.05。

图5为EPC转染anti-miR-21、anti-miR-27a、anti-miR-27b、anti-miR-126、anti-miR-130a后，miR-21、miR-27a、miR-27b、miR-126、miR-130a表达显著下调。

图6为EPC转染anti-miR-21、anti-miR-27a、anti-miR-27b、anti-miR-126、anti-miR-130a后对其克隆形成功能的影响。

图7为EPC转染anti-miR-21、anti-miR-27a、anti-miR-27b、anti-miR-126、anti-miR-130a后对其凋亡功能的影响。

具体实施方式

下面结合附图对本发明做详细说明，实施例的作用仅是解释而非限定本发明。

实施例1、与糖尿病内皮祖细胞功能损伤相关的microRNA的筛选方法

步骤一、体外收集年龄、性别匹配的糖尿病患者和非糖尿病患者外周血，磁珠分选EPC，并表型、纯度鉴定。

1、研究对象：本研究按照年龄、性别匹配分为糖尿病患者组和非糖尿病患者组，其中，糖尿病患者15例，非糖尿病患者15例，按知情同意原则，每例患者均抽取外周血15ml。糖尿病患者入选标准(WHO1999诊断标准)：①糖尿病症状及任意时间血浆葡萄糖水平＞11.1mmol/L(200mg/dl)或②空腹血浆葡萄糖(FPG)水平≥7.0mmol/L(126mg/dl)或③OGTT(口服葡萄糖耐量试验)中，2小时血糖水平≥11.1mmol/L(200mg/dl)。两组患者都排除严重感染，严重肝肾疾患及心功能不全，酮症酸中毒以及甲状腺功能异常者。

2、人外周血EPC分离、表型、纯度鉴定：本研究采用磁珠分选人外周血内皮祖细胞(CD133+)。首先使用Ficoll-Hypaque密度梯度离心法，分离正常成人及糖尿病人外周血单个核细胞，再加入抗人P3-CD133+单克隆抗体(依据美天旎抗体说明书，货号130-080-801)标记CD133+细胞anti-PE磁珠(MiltenyiBiotech，130-048-801)孵育，通过分离柱收集CD133+细胞，离心收集细胞沉淀计数，5*105细胞/30ml。流式细胞仪检测检测CD133+细胞阳性率大于90％以上。

步骤二、应用microarray analysis技术，体外检测糖尿病EPC miRNAs表达的差异。

1、总RNA提取，小RNA富集及质控。

用TRIzol(SIGMA)方法提取总RNA。总RNA质量检测：①琼脂糖胶电泳方法，通过目测28S和18S的亮度比例可以初步评价总RNA的质量，实验结果显示(图1-1)28S∶18S≥2可以初步判定总RNA质量较好。②Lab-on-chip方法，参照Agilent 2100分析仪操作手册，制备凝胶，按照软件提示进行RNA电泳操作，显示得到完整的总RNA(图1-2)。按照说明书步骤使用QIAGEN

Kit纯化总RNA。

2、microarray analysis检测EPC microrna表达差异。

样品制备：将获取的RNA样本逆转录成cDNA，在cDNA中加入Cy3/Cy5荧光并转录生成cRNA，合成荧光标记cRNA。根据说明书使用QIAGEN

Mini Kit纯化荧光探针，计算探针浓度及插入率。

杂交检测与数据处理：用纯化所得的样品与芯片杂交、洗涤后通过使用Agilent Scanner来获取图像(图2)，使用Feature Extraction图像分析软进行定量分析并对图像进行数字化转换。通过设定荧光、背景和标准化方式(Linear&Lowess)参数，一步完成图像定量和数据标准化处理，最后以列表等形式输出包括荧光信号、背景信号、标准化后荧光信号与LogRatio值(两种荧光cy3与cy5比值的对数值)参数。

数据结果分析：ratio值在0.5-2.0范围内的基因不存在显著的表达差异，而在该范围之外的基因则被认为表达出现显著改变。根据芯片分析结果比较糖尿病患者和非糖尿病两组患者EPCs中microrna变化超过10倍以上，且值均大于5的miRNA共105个(图3-1，图3-2，表3)。实验重复3次。

步骤三、检测证实miRNAs的差异表达并预测相应miRNAs可能的靶mRNA。

根据文献以及生物信息技术将由芯片筛选出的差异最为显著的5个miRNA，进行荧光定量PCR验证(Applied Biosystems 7900HT Fast Real-TimePCR System)。

1、cDNA合成：将糖尿病患者和非糖尿病患者的样品RNA进行逆转录生成cDNA，使用TaqMan MicroRNA Reverse Transcription Kit(Applied Biosystems)，按说明书配15μL反应体系，设置循环参数16℃ 30分钟，42℃ 30分钟，85℃ 5分钟，终止温度4℃。

2、Q-PCR分析：RT产物，Taqman 2X通用PCR Master Mix和含由引物和特异探针的5X MicroRNA Assay Mix(Applied Biosystems)配制20-μL反应体系进行扩增，设置循环参数95℃ 10分钟，95℃ 15秒变性退火扩增60℃ 60秒，40个循环，重复3次。

3、实验结果：综合实验设计和芯片结果挑选出5个最有意义的miRNA行荧光定量PCR验证，验证结果与芯片筛选完全吻合，原始CT值经过统计学处理，显示miR-21，miR-27a，miR27-b，miR-126，miR-130a在糖尿病患者中显著减少(图4)，T-TEST和2way ANOVE分析P值均小于0.05，有显著性差异(表1)。miR-21，miR-27a，miR27-b，miR-126，miR-130a是糖尿病EPC功能损伤相关miRNA。经文献检索出miR-21，miR-27a，miR27-b，miR-126，miR-130a均参与了血管生成调控，其中miR-21与miR-126在糖尿病中有相关报道且变化趋势基本一致，miR-27a与文献报道的糖尿病中的趋势相反，miR-27b和miR-130a没有在糖尿病相关模型中报道过。

表1：表达差异最为显著5个microrna

miRNA	21N	21D	27aN	27aD	27bN	27bD	126N	126D	130aN	130aD
											Average	1.0093	0.0798	1.0160	0.1912	1.0222	0.1905	1.0825	0.0161	1.0642	0.1862
SD	0.1648	0.0051	0.2110	0.0366	0.2556	0.0799	0.5560	0.0023	0.413	0.0050
											SE	0.0951	0.002	0.1218	0.0211	0.1476	0.0461	0.321	0.0013	0.2384	0.0029
P-Value	0.0006		0.0026		0.0057		0.0293		0.0211

4、靶基因预测：由多个数据库targetscan，PicTar，miRanda综合分析我们预测了这些miRNAs的可能的靶基因，详细结果列于表2。

表2：microrna靶基因预测

表3：芯片筛选结果

注：非糖尿病组(value2)相比糖尿病组(value1)变化超过10倍以上，且值均大于5的miRNA。

实施例2、糖尿病内皮祖细胞功能损伤相关microRNA的体外研究

分别研究miR-21、miR-27a、miR-27b、miR-126、miR-130a下调对骨髓来源的内皮祖细胞(endothelial progenitor cell，EPC)的作用，包括对EPC克隆形成和对EPC凋亡的作用。

步骤一、miR-21、miR-27a、miR-27b、miR-126、miR-130a下调设计。

1、用于下调miRNA表达的抑制剂购自Ambion公司，货号为AM17000，阴性对照为无义的抑制剂货号为AM17010。

2、转染原代细胞株。

①用胰蛋白酶消化对数生长期的原代细胞，细胞密度为5×10⁶/L时；重新接种于10cm²细胞培养皿，37℃，5％CO₂培养箱内培养。②当细胞融合度达50％～60％时转染。先吸去培养基，然后用无菌的PBS洗一次，然后加入5ml无血清培养基。③制备干扰序列溶液：加入opti-MEM至500μL，轻轻吹吸3-5次，混匀，室温放置5min；另外取一无菌EP管，加入490μLopti-MEM，然后加入2.5/5/10μLlip2000，轻轻吹吸3-5次，混匀，室温放置5min。然后将脂质体缓慢的加入质粒DNA中，轻轻吹吸3-5次，混匀，室温放置20min。④将siRNA和脂质体混合液转移至含单层细胞的培养液中，混匀，培养6h后弃去含有转染混和物的培养液，加入PBS15mL，轻摇后弃去，重复该步骤3次。⑤每瓶细胞中加入含10％胎牛血清的细胞培养液15mL，继续培养。

3、RNA抽提(转染24h后收集RNA)。

①取10⁶个细胞加入1ml TRIzol试剂，使用RNA酶free枪头充分匀浆。②将匀浆液在室温下孵育5分钟，使核蛋白复合体充分裂解。③按1∶0.2(TRIzol∶氯仿)的体积比加入氯仿，盖严，用手剧烈摇晃几秒钟，室温下孵育2-3分钟。④于12000rpm、4℃条件下离心15分钟，离心后混合液分成三层，分别为底层红色的酚-氯仿相，中间相和无色的上层水相。RNA只存在于上层水相中，水相的体积约为加入TRIzol体积的60％。⑤将水相移入一个干净的离心管中，按照每1ml TRIzol加入0.5ml的比例加入异丙醇，混匀，15-30℃静置10分钟。⑥于12000rpm、4℃条件下离心10分钟，RNA沉淀形成胶状物沉在管底管壁。⑦RNA洗涤：倒掉上清液，按照1ml TRIzol加入1ml的比例加入75％乙醇，振荡混匀。⑧于7500rpm、4℃条件下离心5分钟，弃上清液，用移液器吸干试管内残留酒精，室温下自然干燥RNA沉淀5-10分钟，注意不要让RNA完全干燥，因RNA完全干燥后很难溶解。⑨用DEPC处理过的水重新溶解RNA。

4、miRNA逆转录与Q-PCR。

RT产物，Taqman 20X通用PCR Master Mix和含由引物和特异探针的2X MicroRNA Assay Mix(Applied Biosystems)配制20-μL反应体系进行扩增，设置循环参数95℃ 10分钟，95℃ 15秒变性退火扩增60℃ 60秒，40个循环，重复3次。

5、实验结果：EPC转染anti-miR-21、anti-miR-27a、anti-miR-27b、anti-miR-126、anti-miR-130a后，miR-21、miR-27a、miR-27b、miR-126、miR-130a表达显著下调(图5，A-E)。

步骤二、EPC转染anti-miR-21、anti-miR- 27a、anti-miR- 27b、anti-miR-126、anti-miR-130a后对其克隆形成功能的影响。

1、平板克隆形成试验：①取对数生长期的单层培养细胞，用0.25％胰蛋白酶消化并吹打成单个细胞，把细胞悬浮在10％胎牛血清的DMEM培养液中备用。②将细胞悬液作梯度倍数稀释，以适当的细胞密度(根据增殖能力)接种于培养皿中。置37℃5％CO₂及饱和湿度的环境下，静置培养14天。③经常观察，当培养皿中出现肉眼可见的克隆时，终止培养。弃去上清液，用PBS小心浸洗2次。加纯甲醇或1∶3醋酸/甲醇5mL，固定15分钟。然后去固定液，加适量Giemsa应用染色液染10～30分钟，然后用流水缓慢洗去染色液，空气干燥。④将平皿倒置并叠加一张带网格的透明胶片，用肉眼直接计数克隆，或在显微镜(低倍镜)计数大于10个细胞的克隆数。最后计算克隆形成率。

2、结果：EPC转染anti-miR-21、anti-miR-27a、anti-miR-126、anti-miR-130a后，细胞集落形成能力均下降(图6A，6B，6D，6E)；EPC转染anti-miR-27b后细胞集落形成能力无明显改变(图6C)。

步骤三、EPC转染anti-miR-21、anti-miR-27a、anti-miR-27b、anti-miR-126、anti-miR-130a后对其凋亡功能的影响。

1、细胞凋亡检测：①细胞用不含EDTA的胰酶消化收集。②用PBS洗涤细胞二次(离心2000rpm，5min)收集1-5×10⁵细胞。③加入500μL的BindingBuffer悬浮细胞。④加入2μL Annexin V-FITC混匀后，加入5μL PropidiumIodide，混匀。⑤避光、室温反应5min；用流式细胞仪检测(Ex＝488nm；Em＝530nm)细胞凋亡的情况。

2、结果：EPC转染anti-miR-21、anti-miR-27a、anti-miR-126、anti-miR-130a后，细胞凋亡水平均上升(图7A，7B，7D，7E)；EPC转染anti-miR-27b后细胞凋亡水平无明显改变(图7-C)。

实验结论：hsa-miR-21、hsa-miR-27a、hsa-miR-27b、hsa-miR-126和hsa-miR-130a在糖尿病患者的EPC中表达明显下调，EPC中该组microRNA表达不足将导致EPC克隆形成能力降低，EPC凋亡水平增加，从而降低EPC的血管生成能力。因此hsa-miR-21、hsa-miR-27a、hsa-miR-27b、hsa-miR-126和hsa-miR-130a是糖尿病EPC功能损伤相关的microRNA，恢复糖尿病患者EPC上hsa-miR-21、hsa-miR-27a、hsa-miR-27b、hsa-miR-126和hsa-miR-130a的表达将促进其血管生成能力，从而预防和治疗糖尿病动脉粥样硬化的发生、发展。

以上所述仅是本发明的优选实施方式，应当指出，对于本技术领域的普通技术人员，在不脱离本发明原理的前提下，还可以做出若干改进和润饰，这些改进和润饰也应视为本发明的保护范围。

Claims

1.糖尿病内皮祖细胞功能损伤相关的microRNA在制备防治糖尿病动脉粥样硬化疾病药物中的应用，其特征在于，所述microRNA为hsa-miR-27a、hsa-miR-27b和hsa-miR-130a中的一种或几种。

2.根据权利要求1所述的应用，其特征在于，所述糖尿病动脉粥样硬化疾病是指冠状动脉粥样硬化性心脏病。