CN102370700A - 丹参总酚酸在制备抑制血管内皮细胞吞饮小泡形成的药物中的应用 - Google Patents

Abstract

本发明属于医药应用领域，具体涉及丹参总酚酸在制备抑制血管内皮细胞吞饮小泡形成的药物中的应用，丹参总酚酸通过抑制血管内皮细胞吞饮小泡形成，从而抑制缺血再灌注引起肠系膜细静脉血浆白蛋白的漏出。

Description

丹参总酚酸在制备抑制血管内皮细胞吞饮小泡形成的药物中的应用

技术领域

本发明属于医药应用领域，具体涉及丹参总酚酸在制备抑制血管内皮细胞吞饮小泡形成的药物中的应用。

背景技术

缺血再灌注(ischemia/reperfusion，I/R)损伤可以发生在外伤、经皮腔内冠状动脉成形术、溶栓治疗、器官移植、失血性休克及复苏等多种疾病过程中。I/R通过次黄嘌呤氧化酶系统产生的过氧化物一方面直接损伤血管，另一方面又可促进血管内皮粘附分子ICAM-1和白细胞粘附分子CD11b/CD18的表达，引起白细胞与血管内皮粘附。粘附于血管内皮的白细胞爆发性地释放过氧化物和蛋白酶，损伤血管内皮细胞和血管基底膜，引起血浆白蛋白的外漏。I/R后血管外肥大细胞脱颗粒释放促炎性因子和血管活性物质从血管外攻击血管。I/R可诱导包括血管内皮细胞损伤、白细胞与血管壁的粘附、血浆白蛋白漏出、肥大细胞脱颗粒、炎性因子释放等的复杂性的微循环障碍，其中，过氧化物的产生、白细胞与血管内皮粘附和肥大细胞脱颗粒是I/R引起的微循环早期损伤的重要环节。改善I/R引起的微循环障碍需要对其进行多环节干预。

丹参总酚酸(Total salvianolic acid，TSA)是丹参(Salvia miltiorrhiza，SM)的水溶性有效成分，主要包括丹参素(3，4-Dihydroxy-phenyl lactic acid，DLA)、SAA(Salvianolic acidA，SAA)、SAB(Salvianolic acid B，SAB)和其他丹酚酸成分。

丹参和含有丹参的药物在临床上已经被广泛用于血管性疾病的预防和治疗，且取得了良好的临床疗效。以往的研究证明复方丹参滴丸(含有DLA和SAB等丹参水溶性成分)可以抑制I/R引起的大鼠心脏微循环障碍和心肌损伤，抑制肠I/R引起的大鼠肠系膜细静脉白细胞的粘附，抑制血浆中TNF-α表达和内毒素的产生，抑制光化学诱导的肠系膜细静脉血栓的形成。DLA可以抑制肠系膜I/R引起的过氧化物的产生和白细胞释放的粘附分子CD11b/CD18的表达。SAA具有抗氧化和改善膜通透性的作用。SAB可以抑制内毒素诱导的大鼠肠系膜微循环障碍，抑制粘附分子CD11b/CD18的表达，抑制过氧化物和负氧阴离子的产生。然而，DLA和SAB单体的提取和纯化过程复杂，获取成本较高。TSA是丹参的主要的水溶性成分，提取制备过程较简单，成本较低，成药性较好。

丹参总酚酸(TSA)的制备方法有多种，举例如下：丹参饮片或丹参粗粉先用水或稀碱于30-99℃下初提得丹参中的水溶性成分，然后提取液加酸调pH1-6，沉淀去除杂质后，直接干燥或浓缩后干燥，得浸膏粉末；干燥所得浸膏粉末用50-90％乙醇水溶液回流提取1-4次，合并提取液，静置，取上清液，即得高纯度丹参总酚酸溶液；所得溶液直接干燥或浓缩后干燥，即得所述的丹参总酚酸浸膏粉末。

发明内容

本发明的目的在于提供丹参总酚酸在制备抑制血管内皮细胞吞饮小泡形成的药物中的应用。

本发明所述丹参总酚酸通过抑制血管内皮细胞吞饮小泡形成，从而抑制缺血再灌注引起肠系膜细静脉血浆白蛋白的漏出，进而改善缺血再灌注引起的肠系膜微循环障碍。

本发明所述丹参总酚酸，可以根据现有技术制备，符合药用标准即可。

本发明所述制备的药物，是用上述丹参总酚酸作为药物活性成分制备成的药物组合物。

本发明所述的药物组合物通过抑制血管内皮细胞吞饮小泡形成，改善缺血再灌注引起的肠系膜微循环障碍。

本发明的药物组合物，以丹参总酚酸作为药物活性成分，同时含有药物可接受的载体，其中丹参总酚酸在组合物中所占重量百分比是0.1-99.9％，其余为药物可接受的载体。本发明的药物组合物，以单位剂量形式存在，所述单位剂量形式是指制剂的单位，如片剂的每片，胶囊的每粒胶囊，口服液的每瓶，颗粒剂每袋，注射剂的每支等。

本发明的药物组合物可以是任何可药用的剂型，这些剂型包括：片剂、糖衣片剂、薄膜衣片剂、肠溶衣片剂、胶囊剂、硬胶囊剂、软胶囊剂、口服液、口含剂、颗粒剂、冲剂、丸剂、散剂、膏剂、丹剂、混悬剂、粉剂、溶液剂、注射剂、栓剂、软膏剂、硬膏剂、霜剂、喷雾剂、滴剂、贴剂。

本发明的药物组合物，其口服给药的制剂可含有常用的赋形剂，诸如粘合剂、填充剂、稀释剂、压片剂、润滑剂、崩解剂、着色剂、调味剂和湿润剂，必要时可对片剂进行包衣。

适用的填充剂包括纤维素、甘露糖醇、乳糖和其它类似的填充剂。适宜的崩解剂包括淀粉、聚乙烯吡咯烷酮和淀粉衍生物，例如羟基乙酸淀粉钠。适宜的润滑剂包括，例如硬脂酸镁。适宜的药物可接受的湿润剂包括十二烷基硫酸钠。

可通过混合，填充，压片等常用的方法制备固体口服组合物。进行反复混合可使活性物质分布在整个使用大量填充剂的那些组合物中。

口服液体制剂的形式例如可以是水性或油性悬浮液、溶液、乳剂、糖浆剂或酏剂，或者可以是一种在使用前可用水或其它适宜的载体复配的干燥产品。这种液体制剂可含有常规的添加剂，诸如悬浮剂，例如山梨醇、糖浆、甲基纤维素、明胶、羟乙基纤维素、羧甲基纤维素、硬脂酸铝凝胶或氢化食用脂肪，乳化剂，例如卵磷脂、脱水山梨醇一油酸酯或阿拉伯胶；非水性载体(它们可以包括食用油)，例如杏仁油、分馏椰子油、诸如甘油的酯的油性酯、丙二醇或乙醇；防腐剂，例如对羟基苯甲酯或对羟基苯甲酸丙酯或山梨酸，并且如果需要，可含有常规的香味剂或着色剂。

对于注射剂，制备的液体单位剂型含有本发明的活性物质和无菌载体。根据载体和浓度，可以将此化合物悬浮或者溶解。溶液的制备通常是通过将活性物质溶解在一种载体中，在将其装入一种适宜的小瓶或安瓿前过滤消毒，然后密封。辅料例如一种局部麻醉剂、防腐剂和缓冲剂也可以溶解在这种载体中。为了提高其稳定性，可在装入小瓶以后将这种组合物冰冻，并在真空下将水除去。

本发明的药物组合物，在制备成药剂时可选择性的加入适合的药物可接受的载体，所述药物可接受的载体选自：甘露醇、山梨醇、焦亚硫酸钠、亚硫酸氢钠、硫代硫酸钠、盐酸半胱氨酸、巯基乙酸、蛋氨酸、维生素C、EDTA二钠、EDTA钙钠，一价碱金属的碳酸盐、醋酸盐、磷酸盐或其水溶液、盐酸、醋酸、硫酸、磷酸、氨基酸、氯化钠、氯化钾、乳酸钠、木糖醇、麦芽糖、葡萄糖、果糖、右旋糖苷、甘氨酸、淀粉、蔗糖、乳糖、甘露糖醇、硅衍生物、纤维素及其衍生物、藻酸盐、明胶、聚乙烯吡咯烷酮、甘油、土温80、琼脂、碳酸钙、碳酸氢钙、表面活性剂、聚乙二醇、环糊精、β-环糊精、磷脂类材料、高岭土、滑石粉、硬脂酸钙、硬脂酸镁等。

本发明的药物组合物在使用时根据病人的情况确定用法用量，可每日服三次，每次1-20剂，如：1-20袋或粒或片，每剂1mg-1000mg。

本发明还提供了以下试验，进一步说明丹参总酚酸的应用。

1.实验材料

1.1试药

TSA(TSA)：购于昆明风山渐(中国)，批号：09110412；DHR 123：购于Sigma ChemicalCo(St Louis，MO，USA)；FITC标记牛血清白蛋白：橙色结晶，购于Sigma Chemical Co(St Louis，MO，USA)；甲苯胺蓝：蓝色粉末，购于Aldrich公司，试剂名号：19804BA-214；肝素钠注射液(1.25万单位/2ml)：购于江苏万邦生化医药股份有限公司，试剂名号：20090219；荧光标记单克隆抗体：FITC标记的抗大鼠CD11b的抗体(试剂名号：554982)及其同型对照FITC标记的小鼠IgA κ(试剂名号：553478)；FITC标记的抗大鼠CD18的抗体(试剂名号：554979)及其同型对照FITC标记的小鼠IgG1κ(试剂名号：550616)，以上抗体均购于BD(Biosciences Pharmingen，USA)公司；溶血素(10×)：购于BD biosciences Immunocytometer Systems(USA)公司，试剂名号：349202。

1.2实验动物

200～250g的Wister雄性大鼠由北京大学医学部动物中心提供，动物合格证号：SCXK(京)2002-0001。动物被置于常规饲养环境(温度24±1℃，湿度50±5％，交替照明12h，实验前禁食给水12h)。动物的处理按照北京大学医学部规定的动物处理和伦理方针进行。

1.3实验仪器

倒置恒温显微镜，LEICA，型号：DM-IRB；DVD录像机，Malata，型号：DVR-R25；显示器，TCL，型号：J211BA；CCD彩色摄像机，TOSHIBA，型号：Jk-TU53H；超敏感荧光摄像机，LEICA，型号：DM-IRB；超高速摄影机，FASTCAM，型号：ultimate APXPHOTRON；注射泵，北京思路高高科技发展有限公司，型号：TCI-II；离心机，湘仪离心机厂，型号：TDZ5-WS；流式细胞仪，美国BD公司，型号：FACS Calibur。

2.实验方法

2.1实验过程

实验前给大鼠禁食12小时，自由饮水。以20％乌拉坦(1.25mg/kg)肌肉注射麻醉。经左颈静脉插入3Fr聚乙烯管用于滴注药物。剪去腹部毛发沿腹部正中线作2～3cm的切口，暴露小肠。将大鼠仰位在观察板上，轻轻提出小肠(回盲部向口侧10～15cm)，并将小肠展开放在有观察孔的观察板上，表面连续滴加37℃生理盐水保持温度和湿度，用配有37℃恒温装置的倒置生物显微镜(DM-IRB，Leica，Germany)进行观察。选直径在30～50μm之间，200u m长无分支，无明显弯曲的肠系膜细静脉，通过连接在倒置生物显微镜上的CCD(Charge Coupled Device，CCD)彩色摄像机(Jk-TU53HTOSHIBA，Japan)在显示屏上(J2118A，TCL，China)观察，用DVD(Digital Video Disk)录像机(DVR-R25，Malata，China)连续记录微循环的变化。10min基础观察结束后，用2-0号丝线结扎肠系膜上动静脉，10min后解除结扎进行再灌注。

2.2给药

I/R组(N＝6)：缺血前10min，经由左颈静脉连续滴注生理盐水(8ml/kg/hr)至60分钟观察结束。

假手术组(N＝6)：给药时间和给药剂量与I/R一致，但不对其进行缺血再灌注。

TSA本底对照组(TSA组，N＝6)：经由左颈静脉连续滴注TSA(5mg/kg/hr)直至60min观察结束，不对其进行缺血再灌注。

TSA前投入组(TSA+IR组，N＝6)：缺血前10min，经由左颈静脉连续滴注TSA(5mg/kg/hr)直至60分钟观察结束。

TSA后投入组(IR+TSA组，N＝6)：再灌注开始10min后，经由左颈静脉连续滴注TSA(5mg/kg/hr)直至60min观察结束。

2.3肠系膜微循环动态观察

肠系膜细静脉超微结构的变化

60min观察结束后，麻醉下，经左心室进行全身灌流，先用50ml生理盐水冲洗血管后，再用40g/L的多聚甲醛和20g/L的戊二醛配成的固定液以3mL/min的速度灌流固定。取出肠系膜组织，于30g/L的戊二醛固定液中后固定1h。按电镜样品处理方法对样品进行处理后，通过电子显微镜JEM 1230(JEOL，Japan)观察肠系膜细静脉的超微结构变化。

3.实验结果

TSA对大鼠肠系膜细静脉超微结构的影响

图1为大鼠肠系膜细静脉超微结构的图像。Sham组(A)和TSA(B)组内皮细胞表面光滑完整，有少量吞饮小泡；I/R 10min时(C)，大鼠肠系膜细静脉管腔内出现粘附的白细胞和血小板，内皮细胞中吞饮小泡数量有少量增加；I/R 60min时(D)，大鼠肠系膜细静脉超微结构有显著变化：内皮细胞中吞饮小泡数量显著增加，体积增大。TSA前投入(E)和后投入(F)显著抑制了I/R引起的大鼠肠系膜细静脉超微结构的变化，主要表现在吞饮小泡数量显著减少。

4小结

丹参总酚酸在缺血再灌注前投入和缺血再灌注后投入均可显著地抑制细静脉血管内皮细胞吞饮小泡的增加。结果提示，丹参总酚酸(TSA)能够通过抑制血管内皮细胞吞饮小泡的形成，进而改善了缺血再灌注引起的大鼠肠系膜微循环障碍。

综上所述，丹参总酚酸或其组合物在缺血再灌注前投入和缺血再灌注后投入均能够抑制血管内皮细胞吞饮小泡形成，从而改善I/R引起的大鼠肠系膜微循环障碍。

附图说明

图1、丹参总酚酸(TSA)对I/R后大鼠肠系膜细静脉超微结构变化的影响

其中，A：Sham组，B：TSA组，C：I/R 10min组，D：I/R 60min组，E：TSA+IR组，F：IR+TSA组。

En：大鼠肠系膜细静脉内皮细胞，CV：吞饮小泡，L：白细胞。

具体实施方式

通过以下具体实施例对本发明作进一步说明，但不作为对本发明的限制。

实施例1、片剂

【处方】丹参总酚酸105g    微晶纤维素55g    微粉硅胶3g  硬脂酸镁1.5g

【制法】取原、辅料分别过100目筛；丹参总酚酸、微晶纤维素，混匀，用60％乙醇适量作为粘合剂制软材，过20目筛制颗粒，60℃干燥，取出，过30目筛整粒，加入微粉硅胶及硬脂酸镁，混匀，压片，制成1000片，即得。

实施例2、片剂

【处方】丹参总酚酸85g    硫酸钙118g    微晶纤维素37g

         微粉硅胶2.4g    硬脂酸镁1.2g

【制法】取原、辅料分别过100目筛；取丹参总酚酸、硫酸钙、微晶纤维素，混匀，用60％乙醇适量作为粘合剂制软材，过20目筛制颗粒，60℃干燥，取出，过30目筛整粒，加入适量微粉硅胶及硬脂酸镁，混匀，压片，制成1000片，即得。

实施例3、片剂

【处方】丹参总酚酸133g    硫酸钙208g    微晶纤维素68g

        微粉硅胶5g    硬脂酸镁2.5g

【制法】取原、辅料分别过100目筛；取丹参总酚酸、硫酸钙、微晶纤维素，混匀，用60％乙醇适量作为粘合剂制软材，过20目筛制颗粒，60℃干燥，取出，过30目筛整粒，加入适量微粉硅胶及硬脂酸镁，混匀，压片，制成1000片，即得。

实施例4、胶囊

取丹参总酚酸60g，加入适量淀粉，硬脂酸镁等辅料，制粒，整粒，装入1号胶囊，即得。

实施例5、口服液

取丹参总酚酸7g，加入适量蔗糖，防腐剂，加水到1000ml，分装成10ml一支，即得口服液。

实施例6、颗粒剂

取丹参总酚酸83g，加入适量糊精、甜菊素，干式制粒，整粒，分装，即得。

实施例7、注射剂

取丹参总酚酸8.5g，加水溶解，另氯化钠、对羟基苯甲酸乙酯加热水溶解，混匀，调pH值。注射用水稀释至1000ml，用中空纤维膜滤过，灌装，灭菌，即得。

实施例8、注射剂

丹参总酚酸2g，加水溶解，另氯化钠、对羟基苯甲酸乙酯加热水溶解，混匀，调pH值。注射用水稀释至1000ml，用中空纤维膜滤过，灌装，灭菌，即得。

实施例9、丹参总酚酸的提取方法

(1)煎煮：加水煎煮1-4次，每次1-4小时，每次加水8-14倍量；

(2)浓缩：合并煎煮药液，浓缩至每1ml相当于含生药0.5-3g；

(3)碱处理：将浓缩液加碱调节pH至7.0-14.0；

(4)醇沉：调整药液浓度至每1ml相当于含生药0.5-3g，加乙醇沉淀使含醇量达20-70％，冷藏24-48小时；

(5)回收醇液：将醇沉液过滤，减压回收至不含乙醇；

(6)酸处理：用酸调节至pH至1.0-5.0；

(7)萃取：用等量醋酸乙酯萃取3-6次；

(8)回收醋酸乙酯：合并酯萃取液，减压回收醋酸乙酯得浸膏；

(9)水处理：浸膏加水溶解，过滤，浓缩；

(10)干燥：将上述浓缩液干燥，得丹参总酚酸。

实施例10、丹参总酚酸的提取方法

(1)提取：丹参粗粉，加4～10倍量的水或醇水溶液提取2～4次，每次1.0～2.0小时，滤过；

(2)柱层析纯化总酚酸：合并滤液离心(4000转/分钟)10分钟，取上清液过D1400型大孔吸附树脂柱，先用水洗至糖检测反应为阴性，改用10-35％醇水溶液洗2-10倍柱体积；

(3)用40-80％醇水溶液洗脱，收集洗脱液，同时分析测定洗脱液中丹酚酸A和丹酚酸B的含量，当丹酚酸A∶丹酚酸B＝0.90-1.10∶1时，收集该部分洗脱液，60℃减压浓缩洗脱液至无醇味；

(4)调pH值，有机溶剂萃取：加盐酸调节PH值至3-5，用洗脱液1-2倍量体积的有机溶剂萃取2-4次，合并有机溶剂相；

(5)浓缩干燥：减压浓缩萃取液至浸膏状，60℃真空干燥，得黄色粉末，即丹参总酚酸，其中丹酚酸A和丹酚酸B的总含量在90％以上，丹酚酸A∶丹酚酸B＝0.90-1.10∶1。

Claims (10)

1.丹参总酚酸在制备抑制血管内皮细胞吞饮小泡形成的药物中的应用。

2.根据权利要求1所述的应用，其特征在于，丹参总酚酸通过抑制血管内皮细胞吞饮小泡形成，从而抑制缺血再灌注引起肠系膜细静脉血浆白蛋白的漏出。

3.根据权利要求1所述的应用，其特征在于，丹参总酚酸通过抑制血管内皮细胞吞饮小泡形成，从而抑制缺血再灌注引起肠系膜细静脉血浆白蛋白的漏出，进而改善缺血再灌注引起的肠系膜微循环障碍。

4.根据权利要求1所述的应用，其特征在于，丹参总酚酸通过抑制血管内皮细胞吞饮小泡形成，改善缺血再灌注引起的肠系膜微循环障碍。

5.根据权利要求1所述的应用，其特征在于，丹参总酚酸在缺血再灌注前投入能够抑制血管内皮细胞吞饮小泡的形成。

6.根据权利要求1所述的应用，其特征在于，丹参总酚酸在缺血再灌注后投入能够抑制血管内皮细胞吞饮小泡的形成。

7.一种含有丹参总酚酸的药物组合物在制备预防和治疗缺血再灌注引起的微循环障碍的药物中的应用。

8.权利要求7所述的应用，其特这在于，药物组合物通过抑制血管内皮细胞吞饮小泡形成，改善缺血再灌注引起的肠系膜微循环障碍。

9.权利要求7所述的应用，其特这在于，药物组合物含有药物可接受的载体。

10.权利要求7所述的应用，其特征在于，所述药物组合物制备成任何可药用的剂型。

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