CN102337281A

CN102337281A - 预测晚期非小细胞肺癌铂类化疗疗效的分子标记及其应用

Info

Publication number: CN102337281A
Application number: CN201110313664XA
Authority: CN
Inventors: 卢大儒; 范薇薇; 李欢; 陈红岩
Original assignee: Fudan University
Current assignee: Fudan University
Priority date: 2011-10-17
Filing date: 2011-10-17
Publication date: 2012-02-01

Abstract

本发明属于医学分子遗传学和临床医学技术领域，具体为一种预测晚期非小细胞肺癌铂类化疗疗效的分子标记及其应用。所述分子标记包括与晚期非小细胞肺癌(NSCLC)铂类化疗后生存期相关的XPD基因，及该基因上单核苷酸多态位点Asp312Asn,Asp711Asp。作为上述分子标记的应用，本发明还提供用以预测NSCLC患者含铂化疗后生存期的XPD基因多态性检测试剂盒。本发明可用于预测晚期非小细胞肺癌患者铂类化疗后生存期，为此类病患个体化治疗的实现提供依据。

Description

预测晚期非小细胞肺癌铂类化疗疗效的分子标记及其应用

技术领域

本发明属于医学分子遗传学和临床医学技术领域，具体涉及一种预测晚期非小细胞肺癌患者含铂化疗疗效的分子标记及其应用。

背景技术

肺癌是对人类健康和生命危害最大的恶性肿瘤之一，全球每年有一百多万人死于肺癌，是目前肿瘤导致死亡的主要病因之一。非小细胞肺癌（non-small cell lung cancer, NSCLC）约占肺癌的80%，其中有三分之二的患者在确诊时已经处在晚期，失去了手术机会。晚期NSCLC的标准治疗是以化疗为主的综合治疗，而铂类药物因其较强的抗肿瘤作用成为临床治疗NSCLC的常用药。目前，以铂类药物为主的联合化疗方案在晚期NSCLC的治疗中取得了显著的疗效：有效率30%左右，中位生存期8~10个月，2年生存率10%~15%。然而从临床上来看，不同个体对化疗药物的敏感性存在明显不同，疗效差异显著。因此，深入研究影响NSCLC化疗疗效的相关因素，从而提高药物的有效率，具有重要的临床意义，这也是当今肺癌个性化医疗的研究热点。

随着分子生物学和基因组医学的发展，针对肺癌个体化治疗的研究已由传统的基于体外药敏实验的研究方法逐步发展为建立在功能基因组学和蛋白质组学基础上的高通量筛选肿瘤化疗的生物标志物的研究方法，包括肿瘤组织表达谱、甲基化、miRNA以及单核苷酸多态性（single neucleotide polymorphism, SNP）等。其中，SNP因其存在的普遍性、特异性、以及高通量检测技术的成熟发展，逐渐成为在个体化治疗研究中应用最为广泛的生物遗传标志。在肺癌疗效评估方面，虽然肺癌组织的基因组、转录组和蛋白质组的变化和化疗疗效最直接相关，最有可能筛选得到有效的生物标志物，然而大半的晚期肺癌患者不能手术, 肿瘤组织不易获取，因此常用比较容易获得的外周血进行基因组SNP等多态性检测，探索SNP与药物疗效的关系。总之，通过外周血细胞检测DNA的基因多态性，成为肺癌疗效评估常用的研究方法。

核酸剪切通路（Nucleotide excision repair，NER) 是哺乳动物细胞中修复铂类导致的DNA损伤的主要途径。 XPD 基因编码了一个ATP依赖的解旋酶，它介导了NER起始所需的DNA解旋过程。多项研究表明XPD上的多态可能通过改变其蛋白质产物的功能而影响DNA修复能力。XPD的多个常见多态都与降低癌症风险相关。临床和流行病学证据证实，XPD的 Lys ⁷⁵¹ Gln位点与化疗效果相关。但是，XPD 上的另外两个多态位点Arg ¹⁵⁶ Arg and Asp ³¹² Asn 与亚洲NSCLC患者的生存期的相关数据则未见报道。而对于Asp ⁷¹¹ Asp位点也暂无其与生存期关系的流行病学研究。

Asp ³¹² Asn (rs1799793) 是XPD 基因第十外显子上一个造成天冬氨酸突变为天冬酰胺的G 到 A 的突变。而 Asp ⁷¹¹ Asp (rs1052555) 则是同义突变位点。

本发明研究了XPD基因的多态位点与晚期NSCLC患者含铂化疗后生存期的相关性，发现3个SNP位点与NSCLC铂类化疗后生存期显著相关，该分子标记可用于预测晚期NSCLC患者含铂化疗后生存期，为此类病人的个体化医疗提供依据。

发明内容

本发明的目的在于提供一种能够预测晚期非小细胞肺癌患者含铂化疗疗效（疗后生存期）的分子标记及其应用。

本发明提供的预测晚期NSCLC患者含铂化疗疗效的分子标记，该预测功能可通过对患者外周血基因组DNA的分子标记进行检测而实现。上述分子标记包括与晚期非小细胞肺癌铂类化疗疗效相关的XPD基因，及该基因上单核苷酸多态位点Asp ³¹² Asn, Asp ⁷¹¹ Asp。

作为上述分子标记的应用，本发明还提供用以预测NSCLC患者含铂化疗疗效的XPD基因多态性检测试剂盒。

该试剂盒包括：

⑴ 检测XPD基因上Asp ³¹² Asn, Asp ⁷¹¹ Asp多态位点基因型的特异性引物对。所述的特异性引物对是指针对XPD基因Asp ³¹² Asn, Asp ⁷¹¹ Asp多态位点而设计，能特异性扩增出包含这2个SNP位点的DNA片段的引物对以及分别检测出这2个SNP位点不同等位基因型的特异性引物序列。引物序列如表1所示，特异性引物对可用常规的合成技术进行合成。

⑵ 聚合酶链式反应（polymerase chain reaction, PCR）及测序反应组件，包括：1 U Taq酶100μl以及10 x Taq缓冲液1ml、2 mM dNTP混合液1ml、1U虾碱性磷酸酶100μl、1U核酸外切酶100μl、BigDye v3.1测序试剂及其配套缓冲液1ml（Applied Biosystems）、120mM乙二胺四乙酸1ml、95%甲酰胺1ml、无水乙醇和超纯水。

使用上述试剂盒可对晚期NSCLC患者铂类化疗远期疗效进行预测，具体步骤如下：

（1）采集被检测者的外周血2ml，保存于-20℃冰箱；

（2）采用盐酸胍法从外周血标本中抽提基因组DNA；

（3）使用本检测试剂盒，特异性扩增包含XPD基因Asp ³¹² Asn, Asp ⁷¹¹ Asp多态位点的DNA片段，并对所获得的DNA片段进行测序，得到Asp ³¹² Asn, Asp ⁷¹¹ Asp位点的基因型数据；

（4）根据所得到的Asp ³¹² Asn, and Asp ⁷¹¹ Asp位点基因型数据对被检测者进行铂类化疗疗效评估。

具体实施方式

下面结合具体实施例，进一步阐述本发明。下列实施例中未注明具体条件的实验方法，通常按照常规条件，或按照厂商所建议的条件进行。

实施例1. 预测晚期NSCLC患者含铂化疗疗效的分子标记。

1、临床样本的采集

研究对象为353名初诊的非小细胞肺癌患者。纳入标准为：病理学确诊的新

发非小细胞肺癌患者；年龄18岁以上；ⅢA-Ⅳ期，病灶可测量；无其它恶性肿瘤史，以往未接受针对非小细胞肺癌的化疗、手术和放疗；接受一线含铂化疗；身体一般状况评分PS 0-2；无主要脏器的功能障碍，血常规、肝肾功能及心脏功能基本正常；能获得完整的随访信息。所有研究对象均为无血缘关系的汉族人群，地理上主要来自上海及其周边地区。所有患者均是首次接受铂类为基础的一线治疗方案。

对上述纳入病患，收集整理其基本信息、临床信息以及治疗信息，并依据知情同意原则签署知情同意书。

2、基因组DNA的抽提

患者化疗前使用EDTA抗凝的采血管收集研究对象的外周静脉血2ml，保存于-20℃冰箱。采用盐酸胍法抽提基因组DNA。

3、SNPs分型

对包含XPD基因Asp ³¹² Asn, Asp ⁷¹¹ Asp多态位点的DNA片段进行特异性扩增，并对所获得的DNA片段进行测序，得到Asp ³¹² Asn, Asp ⁷¹¹ Asp位点的基因型数据；

4、统计分析

以Kaplan-Meier生存分析方法估算中位生存时间(median survival time， MST), 同时以Cox比例风险模型进行多变量生存分析，计算出优势比(hazards ratio, HR）及其95%置信区间（95% confidence interval, 95% CI），以此评估该位点多态性对肺癌患者化疗疗效的影响。

5、结果分析

若两个位点含有1-4个风险等位基因（Asp ³¹² Asn为A，Asp ⁷¹¹ Asp为C）数时，铂类化疗有效率较低，中位生存期仅为13个月，若不含风险等我基因，则中位生存期为20个月。若XPD基因Asp ³¹² Asn位点基因型为G/G，则平均中位生存期为19个月，若基因型为A/G或A/A，则平均中位生存期为13个月；若Asp ⁷¹¹ Asp位点基因型为C/C，则平均中位生存期为19个月，若基因型为C/T或T/T，则平均中位生存期为14个月。可见，随着该2个位点风险碱基拷贝数的增加，NSCLC患者铂类化疗的预后较差的风险增高(HR=1.67 (95% CI: 1.18-2.36))，log-rank检验的P值显著（P=0.001，见附录）。

实施例2. 检测试剂盒的使用。

1、基因组DNA的提取

采用盐酸胍法抽提基因组DNA。

2、分子标记分型

使用检测试剂盒，首先分别特异性扩增包含XPD基因Asp ³¹² Asn和Asp ⁷¹¹ Asp多态位点的2个DNA片段，引物序列如下：Asp ³¹² Asn正向引物：正向引物 5’ ACGGACGCCCACCTGGCCAA 3’（SEQ ID NO.1），反向引物5’ AGGCGGGAAAGGGACTGGG 3’（SEQ ID NO.2）；Asp ⁷¹¹ Asp正向引物5’ TGGATCCAGGAGCACCTCA 3’（SEQ ID NO.3），反向引物5’ AGGAAGTACTTGGCCACCTG 3’（SEQ ID NO.4）。反应体系（20μl）包含：10 x Taq 缓冲液2μl, 2 mM dNTP 2μl, 1 U Taq 酶1μl，样本DNA (约50 ng) 1 μl和5μM PCR引物1 μl。该扩增反应在PCR扩增仪上进行，反应条件为：95℃ 5分钟；进行30个循环的95℃ 30秒，55℃ 30秒，72℃ 30秒；72℃ 7分钟；4℃保存。

然后对获得的DNA片段进行测序。具体步骤如下：

⑴ PCR产物纯化。在10μl PCR产物中加入1U虾碱性磷酸酶和1U核酸外切酶，37℃温浴1小时, 然后75℃灭活15分钟。

⑵ 测序反应。反应体系（10μl）包含：BigDye v3.1测序试剂及其配套缓冲液（Applied Biosystems），1 μl PCR正向引物（3.2μM）及3 μl纯化产物。该测序反应在PCR扩增仪上进行，反应条件为：96℃ 10秒；进行25个循环的96℃ 10秒，50℃ 5秒，60℃ 4分钟；60℃ 4分钟；4℃保存。

⑶ 测序反应产物变性、沉淀。加入1 μl 120mM 乙二胺四乙酸，然后以无水乙醇收集产物，以75%乙醇清洗产物2次，最后加入10 μl 95%甲酰胺溶液，待检测。

⑷ ABI3130XL测序仪上样检测。

3、基因型分析

针对上述获得的原始基因型数据，使用Bioedit软件进行判读和分析。

实施例3. 对晚期NSCLC患者进行化疗后生存期预测的服务。

1、基因组DNA的提取

收集被检测者外周血标本，采用盐酸胍法抽提基因组DNA。

2、基因分型检测

使用本发明提供的试剂盒，对被检测者基因组DNA的XPD基因Asp ³¹² Asn, Asp ⁷¹¹ Asp位点进行分型。

3、个体含铂化疗生存期的预测分析

通过对被检测者XPD基因Asp ³¹² Asn, Asp ⁷¹¹ Asp位点基因型的分析，出具个体铂类药物化疗生存期评估分析报告单：当被检测者的两个位点含有1-4个风险等位基因（Asp ³¹² Asn为A，Asp ⁷¹¹ Asp为C）数时，其化疗远期疗效较差的风险是不含风险等位基因者的1.67倍。该结果可供医师参考调整用药方式和剂量。

附录：XPD基因Asp ³¹² Asn, Asp ⁷¹¹ Asp位点基因型与NSCLC患者铂类化疗预后和总生存期的相关性。

。

NOTE. Bold figures are those that remained noteworthy at the 0.8 BFDP level, suggesting true associations.

Abbreviation: MST, median survival time; HR, hazard ratio; BFDP, Bayesian false-discovery probability.

* Data were estimated from Multivariate Cox proportional hazards models and adjusted for performance status, clinical stage, and type of treatment regimen.

? At-risk alleles were defined as the minor alleles of the risk SNPs (Asp ³¹² Asn and Asp ⁷¹¹ Asp)。

<110> 复旦大学

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Claims

1.一种预测晚期非小细胞肺癌铂类化疗疗效的分子标记，其特征在于包括与晚期非小细胞肺癌铂类化疗后生存期相关的XPD基因，及该基因上单核苷酸多态位点Asp ³¹² Asn, Asp ⁷¹¹ Asp。

2.一种预测晚期非小细胞肺癌铂类化疗疗效的试剂盒，其特征在于包括检测XPD基因上Asp ³¹² Asn, Asp ⁷¹¹ Asp多态位点基因型的特异性引物对、1 U Taq酶100μl以及10 x Taq缓冲液1ml、2 mM dNTP混合液1ml、1U虾碱性磷酸酶100μl、1U核酸外切酶100μl、BigDye v3.1测序试剂及其配套缓冲液1ml、120mM乙二胺四乙酸1ml、95%甲酰胺1ml、无水乙醇和超纯水。

3.根据权利要求2所述的试剂盒，其特征在于所述的特异性引物对为：

对 Asp ³¹² Asn，正向引物：SEQ ID NO.1，反向引物：SEQ ID NO. 2 ；

对 Asp ⁷¹¹ Asp，正向引物：SEQ ID NO.3，反向引物： SEQ ID NO.4。