CN102321586B - 以MyD88TIR二聚化为靶点的抗炎抑制剂筛选模型及应用 - Google Patents
以MyD88TIR二聚化为靶点的抗炎抑制剂筛选模型及应用 Download PDFInfo
- Publication number
- CN102321586B CN102321586B CN201110236314.8A CN201110236314A CN102321586B CN 102321586 B CN102321586 B CN 102321586B CN 201110236314 A CN201110236314 A CN 201110236314A CN 102321586 B CN102321586 B CN 102321586B
- Authority
- CN
- China
- Prior art keywords
- myd88
- tir
- dimerization
- myd88 tir
- protein
- Prior art date
- Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
- Expired - Fee Related
Links
Images
Landscapes
- Measuring Or Testing Involving Enzymes Or Micro-Organisms (AREA)
- Peptides Or Proteins (AREA)
- Micro-Organisms Or Cultivation Processes Thereof (AREA)
Abstract
本发明涉及一种以MyD88TIR二聚化为靶点的抗炎抑制剂筛选模型及应用，其特征在于：将MyD88TIR分别与一荧光供体和荧光受体蛋白基因GFP/RFP构建融合蛋白质粒，转染哺乳动物细胞，建立双阳性表达的细胞株。可以检测到FRET现象；当培养基中存在MyD88TIR二聚化抑制物时，提示了依赖双阳性表达GFP-MyD88-TIR和RFP-MyD88-TIR的细胞株，经体外结合分析，可以进一步确定抑制物是否直接阻断了TIR的相互作用。结合真核细胞的荧光FRET阻断结果和原核表达的重组蛋白相互作用分析，可确定MyD88TIR二聚化的抑制物。利用该模型可以对商品化的小分子库、自行制备的天然产物组分或各种化学合成物、修饰物进行广泛的筛选，从中获得有效的MyD88二聚化的抑制性化合物，参与对MyD88信号通路依赖的慢性炎症、自身免疫性疾病的药物筛选。
Description
技术领域
本发明涉及一种以MyD88 TIR二聚化为靶点的抗炎抑制剂筛选模型及应用，以实现活细胞原位的、基于荧光信号变化的MyD88二聚化抑制物的高通量筛选。
背景技术
IL-1R类受体和Toll-like受体(TLRs)共属于同一超家族，IL-1R亚家族包括IL-1β和IL-18的受体及其它成员，介导急性和慢性炎症反应。Toll-like受体亚家族有10个成员，识别病源微生物或其代谢产物(如内毒素LPS)，介导天然免疫。当IL-1R类受体和Toll-like受体与配体结合后，其胞内的TIR(Toll/IL-1receptor homologous region)结构域发生构象改变，招募存在于胞浆内的也含有TIR结构域的接头蛋白分子，这一过程对信号向胞内的传递至关重要。O’Neill LA：The interleukin-1receptor/Toll-like receptor superfamily：10 years of progress.Immunol Rev 2008，226：10-18.
接头蛋白分子主要包括MyD88(myeloid differentiation primary responseprotein 88)、Mal(MyD88-adaptor-like)，也称TIRAP、TRIF(TIRdomain-containing adaptor inducing IFN-β)、TRAM(trif-relatedadaptor molecule)、SARM(sterile αandHEAT-Armadillo motifs)[2.O’Neill LA，Bowie AG：The family of five：TIR-domain-containingadaptors in Toll-like receptor signalling.Nat Rev Immunol 2007，7(5)：353-364.
3.Watters TM，Kenny EF，O’Neill LA：Structure，function and regulationof the Toll/IL-1receptor adaptor proteins.Immunol Cell Biol 2007，85(6)：411-419.]，不同的接头蛋白决定了不同的信号转导途径-MyD88依赖信号途径和MyD88非依赖途径。
接头蛋白分子家族中第一个被鉴定的是MyD88，最初发现为骨髓分化时表达的蛋白[4.Lord KA，Hoffman-Liebermann B，Li ebermann DA：Nucleotidesequence and expression of a cDNA encoding MyD88，a novel myeloiddifferentiation primary response gene induced by IL6.Oncogene 1990，5(7)：1095-1097.]，故而得名。对MyD88依赖的信号传导机制目前为止研究的最为成熟，在胞外信号配体刺激下，MyD88可通过自身C末端的TIR结构域相互作用发生二聚化，并且MyD88的TIR结构域和受体复合物的TIR结构域也发生同源性蛋白-蛋白相互作用。MyD88分子N末端的死亡结构域(Dead Domain，DD结构域)再与IRAK家族DD结构域发生同源性相互作用，形成信号转导复合物，向下传递活化信号，上调转录因子AP-1和NF-κB的活性，诱导致炎细胞因子，如IL-1、IL-6、IL-8、IL-12和TNF-α等基因的表达。接头蛋白MyD88是信号转导通路中的关键蛋白，其TIR结构域介导的MyD88的二聚化是其被招募到受体的胞浆尾部的前提条件[5.Takeda K，Akira S：TLR signaling pathways.Semin Immunol2004，16(1)：3-9.]。MyD88作为一种重要的接头蛋白，一方面传递了TLRs介导的先天免疫信号，另一方面也参与了IL-18受体介导的非感染性炎症信号的传递。类风湿性关节炎(Rheumatoid Arthritis，RA)[6.Leung BP，Culshaw S，Gracie JA，Hunter D，Canetti CA，Campbell C，Cunha F，Liew FY，McInnes IB：A role for IL-18 in neutrophil activation.JImmunol 2001，167(5)：2879-2886.]、系统性红斑狼疮(Systmetic Lupus)[7.Favilli F，Anzilotti C，Martinelli L，Quattroni P，De MartinoS，Pratesi F，Neumann D，Beermann S，Novick D，Dinarello CA et al：IL-18 activity in systemic lupus erythematosus.Ann N Y Acad Sci2009，1173：301-309.]、I型糖尿病(Type I Diabetes)[8.Rothe H，Jenkins NA，Copeland NG，Kolb H：Active stage of autoimmune diabetesis associated with the expression of a novel cytokine，IGIF，whichis located near Idd2.J Clin Invest 1997，99(3)：469-474.]及动脉粥状硬化(Atherosclerosis)[9.Kleemann R，Zadelaar S，Kooistra T：Cytokines and atherosclerosis：a comprehensive review of studiesin mice.Cardiovasc Res 2008，79(3)：360-376.]等慢性炎症和自身免疫性疾病的炎性放大过程都与MyD88依赖的信号通路相关。
目前很多研究根据MyD88TIR结构域氨基酸序列设计合成的TIR结构类似物导入哺乳动物细胞，这些结构类似物竞争性地占据了MyD88TIR二聚化的位点，从而抑制了MyD88依赖的IL-1β和IL-18的促炎效应
[11.Davis CN，Mann E，Behrens MM，Gaidarova S，Rebek M，Rebek J，Jr.，Bartfai T：MyD88-dependent and-independent signaling by IL-1 inneurons probed by bifunctional Toll/IL-1 receptor domain/BB-loopmimetics.Proc Natl Acad Sci U S A 2006，103(8)：2953-2958.12.Loiarro M，Sette C，Gallo G，Ciacci A，Fanto N，Mastroianni D，CarminatiP，Ruggiero V：Peptide-mediated interference of TIR domaindimerization in MyD88 inhibits interleukin-1-dependent activationof NF-{kappa}B.J Biol Chem 2005，280(16)：15809-15814.
13.Loiarro M，Capolunghi F，Fanto N，Gallo G，Campo S，Arseni B，CarsettiR，Carminati P，De Santis R，Ruggiero V et al：Pivotal Advance：Inhibition of MyD88 dimerization and recruitment of IRAK1 and IRAK4by a novel peptidomimetic compound.J Leukoc Biol 2007，
82(4)：801-810.]。有些这样的工作就其所研究的有效抑制MyD88二聚化的具体化合物进行了专利申报。
FRET技术是一种检测生物大分子间是否存在直接相互作用的实验手段
[10.Mahajan NP，Linder K，Berry G，Gordon GW，Heim R，Herman B：Bcl-2and Bax interactions in mitochondria probed with green fluorescentprotein and fluorescence resonance energy transfer.Nat Biotechnol1998，16(6)：547-552.]，近年来，FRET技术常常被用来设计精巧的药物筛选模型，例如，荧光蛋白供体-受体对(如CFP-YFP)可被构建成融合蛋白质粒，中间由一段短肽(caspse酶的作用位点L/DEVD)连接，这种质粒转染哺乳动物细胞表达后，caspase酶如果活化，CFP和YFP分离，FRET不能实现，caspase酶活性如被抑制，FRET可以实现，从而可以进行caspase抑制剂的筛选
[14.Xu X，Gerard AL，Huang BC，Anderson DC，Payan DG，Luo Y：Detectionof programmed cell death using fluorescence energy transfer.Nucleic Acids Res 1998，26(8)：2034-2035.
15.He L，Wu X，Meylan F，Olson DP，Simone J，Hewgill D，Siegel R，LipskyPE：Monitoring caspase activity in living cells using fluorescentproteins and flow cytometry.Am J Pathol 2004，164(6)：1901-1913.16.Jones J，Heim R，Hare E，Stack J，Pollok BA：Development and applicationof a GFP-FRET intracellular caspase assay for drug screening.JBiomol Screen 2000，5(5)：307-318.]。
发明内容
本发明的目的在于利用荧光共振能量转移(Fluorescence Re Energy Transfer，FRET)技术，提供一种以MyD88TIR二聚化为靶点的抗炎抑制剂筛选模型；因为MyD88被招募到膜受体胞浆尾部是IL-18受体等活化后信号传递通路的第一个信号事件，阻断这一环节就抑制了信号在胞内的继续发散和向下传递，又因为MyD88TIR的二聚化是MyD88与膜受体结合的前提，所以，MyD88TIR二聚化的抑制可考虑作为上述慢性非感染性炎症和自身免疫性疾病治疗一个有效靶点；模型的建立将利于MyD88信号通路参与的慢性炎症、自身免疫性疾病的药物筛选，也会为MyD88信号传递相关的基础研究提供便利的科研工具；我们向细胞内同时转染两个质粒：荧光蛋白供体为GFP-MyD88TIR，荧光蛋白受体为RFP-MyD88TIR，建立两种荧光蛋白双阳性稳定表达的细胞株，即可获得以MyD88TIR二聚化为靶点的抗炎抑制剂筛选模型，要筛查的抑制剂作用靶点是MyD88分子的二聚化。
本发明的另一个目的在于，利用所构建的以MyD88TIR二聚化为靶点的抗炎抑制剂筛选模型，进行活细胞原位荧光信号分析，可以快速得到有效抑制MyD88TIR二聚化，进而影响MyD88依赖的信号通路以及最终的生物学效应的化合物；即：针对MyD88二聚化过程的阻断，建立一种基于细胞培养的、高通量的筛选模型，利用这一模型可以对商品化的小分子库或自行制备的天然产物组分进行广泛的筛选，筛查出未知的阻断MyD88二聚化的抑制物。
本发明的技术方案是这样实现的：以MyD88 TIR二聚化为靶点的抗炎抑制剂筛选模型，是依赖于一种被称为荧光共振能量转移(Fluorescence Re EnergyTransfer，FRET)的分子细胞生物学技术，建立活细胞原位的、基于荧光信号变化的MyD88 TIR二聚化阻断的检测模型；其特征在于：可以外源转染一对目的蛋白基因，二者分别与一荧光供体和荧光受体蛋白基因GFP/RFP(或CFP/YFP)融合。这样，两种生物大分子的距离足够近，即小于10nm，为两种分子直接相互作用的距离时，在荧光供体的激发光照射下可以产生荧光受体的发射光信号；其具体步骤如下：首先构建绿色荧光蛋白与MyD88 TIR的融合蛋白真核表达质粒(以下简称GFP-MyD88 TIR)和红色荧光蛋白与MyD88 TIR的融合蛋白真核表达质粒(以下简称RFP-MyD88 TIR)；再将二者共同转染哺乳动物细胞即HeLa，建立两种荧光蛋白双阳性稳定表达的细胞株。如果培养条件中不存在小分子抑制物，MyD88 TIR发生二聚化，488nm激发光(蓝光)照射下GFP-MyD88 TIR发出的绿色荧光会有一部分作为RFP-MyD88 TIR的激发光被吸收，进而发出红色荧光，绿荧光减弱，即FRET发生；而如果培养条件中有小分子抑制物存在的话，MyD88TIR无法发生二聚化，488nm激发光(蓝光)照射下GFP-MyD88 TIR发出的绿色荧光不会转移给RFP-MyD88 TIR，无红色荧光发出，细胞产生正常的绿色荧光。
原核表达质粒转化大肠杆菌并纯化获得重组蛋白，进行体外蛋白质-蛋白质相互作用的验证分析：当培养细胞中FRET现象被某种添加的化合物阻断了，尚不能得出是这种化合物直接阻断了MyD88TIR的二聚化结论，因为这种化合物可能引发了某种细胞内信号级联，间接地影响了MyD88TIR的二聚化；因此利用一个His-MyD88 TIR和GST-MyD88 TIR重组蛋白体外相互作用分析加以验证：在非变性缓冲液中，可以加入上述荧光筛选模型认为有效阻断MyD88二聚化的化合物，如果化合物能直接阻断MyD88TIR的二聚化，则His-MyD88 TIR体外条件下不能正常结合GST-MyD88 TIR，进行His-MyD88 TIR的Pull-down产物的westernblot分析，不能检测到GST抗体识别的信号；如果化合物不能直接阻断MyD88二聚化，His-MyD88 TIR体外条件下能够正常结合GST-MyD88 TIR，进行His-MyD88TIR的Pull-down产物的western blot分析，则可以检测到GST抗体识别的信号；经此验证模型，确切的MyD88TIR二聚化抑制剂就可得以判定。
实验材料与方法
(1)试剂与抗体：
细胞转染用脂质体Lipofectamine 2000购于Invitrogen公司。GST多克隆抗体、MyD88多克隆抗体购于Santa Cruz公司。谷胱甘肽琼脂糖凝胶4B珠子(GST-Sepharose 4B)购于Amersham公司。Ni-NTA珠子购于Qiagen公司。辣根过氧化物酶偶联的二抗购于Sigma公司。其他分析纯化学试剂来自于北京化工厂、生化试剂来自于Amresco公司或BBI公司。
(2)细胞培养：
HeLa细胞购于上海细胞研究所，培养于含10％小牛血清的IMDM培养基(Gibco公司)中，并添加10％的双抗(即，青霉素100U/ml、100ug/ml链霉素)。培养箱内空气保证湿度和5％的CO2含量。
(3)质粒构建：
MyD88TIR结构域片断通过以人源cDNA为模板进行PCR扩增获得，PCR产物长度～bp。引物设计参照核苷酸序列数据库信息(NCBI登录号：NM_002468)。将外源片断利用限制酶位点Hind III和BamH I插入pEGFP-C1载体(购于美国BDBioscience公司)，构建绿色荧光蛋白GFP-MyD88TIR融合蛋白表达重组子；将外源片断利用限制酶位点Hind III和BamH I插入pVisionRFP-C载体(购于美国BioVision公司)，构建红色荧光蛋白RFP-MyD88TIR融合蛋白表达重组子。将外源片断利用限制酶位点BamH I和EcoR I插入到pEGX-6p-1原核表达载体(购于美国GE Healthcare公司)以及利用限制酶位点BamH I和Xho I插入到pET-28a原核表达载体(购于德国Merck公司)，转化大肠杆菌BL21，可获得GST-MyD88TIR融合重组蛋白和His-MyD88 TIR融合重组蛋白。质粒构建及大肠杆菌转化等方法按常规分子克隆技术进行。
(4)GFP及其融合蛋白质粒、RFP及其融合蛋白质粒的转染及荧光显微术：
接种5×104个细胞于48孔培养板的每孔，无抗生素培养基中过夜培养。转染利用Invitroge公司的转染试剂Lipofectamine 2000，按说明书操作进行。每种质粒的用量为0.5μg。转染4-6小时后更换含抗生素和10％血清的IMDM培养基。次日，在倒置荧光显微镜(Nikon TE 2000U)的488nm及510nm激发光下观察各组转染细胞的荧光情况。
(5)重组蛋白的表达纯化：
原核表达质粒转化大肠杆菌BL21，接种于100mL含卡钠霉素的LB培养基中，37培养3小时。加入200μl 0.5Mol IPTG继续培养2-3小时，诱导表达。
His-MyD88 TIR的纯化：离心收集菌体后800μl缓冲液A(10mMol Tris-HCl(pH8.0)，500mMol NaCl，10％甘油，0.1％Tween-20，10mMol咪唑，0.1％β-巯基乙醇，10μMol ZnSO4与1mMol PMSF现用现加)重悬，超声10秒，间歇10秒，共3分钟，功率300W。加入终浓度为1％的Triton-X100混匀，13000rpm，10min，4℃离心。转移上清到新的EP管中，加入Ni-NTA珠子，4℃摇2-3小时。离心纯化His重组蛋白。缓冲液A洗珠子3-5次，再用缓冲液E(20mMol HEPES-KOHpH(7.5)，20％甘油，100mMol NaCl，10mMol咪唑，1mMol EDTA，1mMol DTT，10μMol ZnSO4与1mMol PMSF现用现加)洗珠子3次。纯化的结合于Ni-NTA珠上的His重组蛋白可用于Pull-down实验。
GST-MyD88 TIR的纯化：
诱导表达后的菌体通过离心获得，加入800μl细菌裂解液(20mMHEPES(pH7.5)，120mM NaCl，10％甘油，2mM EDTA，1mM PMSF)，重悬，超声10秒，间歇10秒，超声6次，功率300W。加入终浓度为0.5％的NP-40混匀，13000rpm，10min，4℃离心。转移上清到新的EP管中，加入50％谷胱甘肽琼脂糖凝胶4B珠子在4℃摇床上摇动1-2小时。离心纯化GST重组蛋白。先用含有0.5％NP-40的裂解液洗涤珠子3次，再用不含0.5％NP-40的裂解液洗涤珠子3次。纯化的结合于谷胱甘肽琼脂糖凝胶珠上的GST重组蛋白可用于Pull-down实验。
(6)重组蛋白体外相互作用分析：
首先，将GST融合蛋白从琼脂糖珠上洗脱。取0.1μg GST-MyD88-TIR离心吸去上清，加入等体积的谷氨酰胺洗脱缓冲液(10mMol还原型谷胱甘肽，50mMolTris-HCl(pH8.0))，冰上漩涡振荡30分钟，离心后吸上清至500μl GBT buffer，再加入1μg封闭后的His融合蛋白Ni-NTA珠，4℃摇床上摇动2-3个小时。GBT缓冲液洗2次，缓冲液A洗一次，缓冲液E洗一次，每次于冰上摇动约5分钟。离心后加入20μl上样缓冲液，沸水煮5min，免疫印记检测GST融合蛋白。
本发明的积极效果是当抑制物存在，MyD88TIR二聚化不能实现时，FRET效率受到严重影响，提示了依赖双阳性表达GFP-MyD88-TIR和RFP-MyD88-TIR的细胞株，检测不同化合物对于荧光FRET效率的影响，可以建立MyD88 TIR二聚化抑制药物的筛选模型。此外，我们构建了原核表达质粒，利用纯化的His-MyD88 TIR与GST-MyD88 TIR体外结合分析，可以进一步确定抑制物是否直接阻断了MyD88 TIR的相互作用。结合真核细胞的荧光FRET阻断结果和原核表达的重组蛋白相互作用分析，可确定MyD88 TIR二聚化的抑制物。根据以上所述技术方法，本发明的技术方案可以实现，结合高通量筛选仪，可以建立一种基于细胞培养的、活细胞原位荧光信号变化的、高通量的筛选模型，利用这一模型可以对商品化的小分子库或自行制备的天然产物组分进行广泛的筛选，筛查出未知的阻断MyD88 TIR二聚化的抑制物。
附图说明
图1HeLa细胞转染不同质粒组合，MyD88 TIR二聚化可引起GFP-MyD88 TIR和RFP-MyD88 TIR荧光共振能力转移
图2示意MyD88 TIR二聚化实现时能够介导绿色荧光蛋白(GFP)发射的荧光能够将能量转移给红色荧光蛋白(RFP)。
图3示意MyD88 TIR二聚化受抑制时GFP发射的荧光无法实现能量向RFP进行的转移
图4非变性缓冲液中，MyD88 TIR可以介导GST-MyD88 TIR和His-MyD88 TIR在体外的结合，GST的免疫印记(western blot)信号阳性
图5示意体外缓冲液中有抑制物存在时，固定于珠子上的His-MyD88 TIR无法将GST-MyD88 TIR结合下来，Western blot将检测不到GST信号
图6示意体外缓冲液中不存在抑制性成分时，固定于珠子上的His-MyD88 TIR可以将GST-MyD88 TIR结合下来，Western blot将检测到GST信号
具体实施方式
下面结合实施例对本发明做进一步的描述：
实施例1：转染哺乳动物细胞的GFP-MyD88 TIR和RFP-MyD88 TIR可以发生荧光共振能量转移
我们按图1中所示的组合，将构建好的GFP-MyD88 TIR，RFP-MyD88 TIR，GFP，RFP质粒共转染到HeLa细胞中。在488nm激发光下，共转染GFP-MyD88 TIR和RFP-MyD88TIR融合蛋白的细胞(左侧照片)发出昏暗的绿色荧光，甚至有些细胞还发出橘黄色的光。证明了GFP发出的绿色荧光应为MyD88TIR的二聚化将能量传递给RFP，实现了FRET。而对照组共转染GFP-MyD88 TIR融合蛋白和空载RFP的质粒(中间照片)，或反之，共转染空载GFP和RFP-MyD88 TIR融合蛋白的质粒(右侧照片)，488nm激发光下观察，细胞显示明亮的绿色荧光。说明：共转染GFP-MyD88 TIR和RFP或共转染GFP和RFP-MyD88 TIR的细胞因为无法形成MyD88 TIR的二聚化，荧光共振能量转移无法发生，证明了一旦MyD88 TIR的二聚化受影响，488nm激发光下GFP发射的绿色荧光无法将能量转移给RFP。(分别转染GFP-MyD88 TIR和RFP或者是GFP和RFP-MyD88 TIR的细胞在488nm激发光下发出正常的明亮绿色荧光，证明了GFP和GFP-MyD88 TIR绿色荧光的有效性；所有转染RFP或者RFP-MyD88 TIR的细胞在510nm激发光下能过发出正常的红色荧光，进一步证明了RFP或者RFP-MyD88 TIR红色荧光的有效性。)
我们完成的图1所示的实验结果提示，可以利用FRET技术建立一个活细胞培养的、基于荧光信号变化的筛选模型：将GFP-MyD88 TIR和RFP-MyD88 TIR共转染哺乳动物细胞(如HeLa)，建立稳定双表达阳性的细胞株。如图2和图3所示，如果细胞中不存在MyD88 TIR二聚化抑制物时，FRET能够发生，而当抑制物存在时，FRET受到影响。
实施例2：His-MyD88 TIR重组蛋白可以与GST-MD88 TIR重组蛋白体外相互作用
上述实施例1所述活细胞原位荧光模型尚存在一个问题：当培养细胞中FRET现象被某种添加的化合物阻断了，我们尚不能得出结论，是这种化合物直接阻断了MyD88 TIR的二聚化，还是这种化合物引发了某种细胞内信号级联，间接地影响了MyD88 TIR的二聚化。针对这一问题，我们可以利用一个His-MyD88 TIR和GST-MyD88 TIR重组蛋白体外相互作用分析加以验证。
为此，我们又构建了原核表达融合蛋白GST-MyD88 TIR和His-MyD88 TIR的质粒，转化大肠杆菌后诱导蛋白表达(重组融合蛋白可以被MyD88抗体免疫印记特异识别，证明MyD88 TIR的正确表达)。如图4所示，经纯化的结合与Ni-TNA珠上的His-MyD88 TIR重组蛋白与纯化的洗脱后的GST-MyD88 TIR重组蛋白或GST重组蛋白进行孵育，Ni-NTA琼脂糖珠结合下来的蛋白进行蛋白电泳和抗GST免疫印记分析，结果显示，GST-MyD88 TIR可以被Ni-NTA琼脂糖珠结合下来(左侧泳道)，GST蛋白(右侧泳道)却不能，说明了是MyD88 TIR二聚化介导了GST-MyD88 TIR和His-MyD88 TIR融合蛋白的体外结合
我们完成的图4所示的实验提示了，利用重组蛋白，进行体外蛋白质-蛋白质相互作用的验证分析具有可行性：在非变性缓冲液中，可以加入上述荧光筛选模型认为有效阻断MyD88二聚化的化合物。图5示意体外非变性条件下，如果有抑制物存在时，His-MyD88 TIR无法凭借MyD88 TIR的二聚化将GST-MyD88 TIR结合下来，结合物(Pull-down产物)做western blot分析检测不到GST的免疫印记信号；图6则示意无抑制物存在时，His-MyD88 TIR可以凭借MyD88 TIR的二聚化将GST-MyD88 TIR结合下来，结合物(Pull-down产物)做western blot分析可以检测到GST的免疫印记信号。
以上两实施例说明，经活细胞荧光筛选模型筛选，再经体外重组蛋白验证模型验证，确切的MyD88 TIR二聚化抑制剂就可以被确定下来。
实验材料与方法
(1)试剂与抗体：
细胞转染用脂质体Lipofectamine 2000购于Invitrogen公司。GST多克隆抗体、MyD88多克隆抗体购于Santa Cruz公司。谷胱甘肽琼脂糖凝胶4B珠子(GST-Sepharose 4B)购于Amersham公司。Ni-NTA珠子购于Qiagen公司。辣根过氧化物酶偶联的二抗购于Sigma公司。其他分析纯化学试剂来自于北京化工厂、生化试剂来自于Amresco公司或BBI公司。
(2)细胞培养：
HeLa细胞购于上海细胞研究所，培养于含10％小牛血清的IMDM培养基(Gibco公司)中，并添加10％的双抗(即，青霉素100U/ml、100ug/ml链霉素)。培养箱内空气保证湿度和5％的CO2含量。
(3)质粒构建：
MyD88 TIR结构域片断通过以人源cDNA为模板进行PCR扩增获得，PCR产物长度～bp。引物设计参照核苷酸序列数据库信息(NCBI登录号：NM_002468)。将外源片断利用限制酶位点Hind III和BamH I插入pEGFP-C1载体(购于美国BDBioscience公司)，构建绿色荧光蛋白GFP-MyD88TIR融合蛋白表达重组子；将外源片断利用限制酶位点Hind III和BamH I插入pVisionRFP-C载体(购于美国BioVision公司)，构建红色荧光蛋白RFP-MyD88TIR融合蛋白表达重组子。将外源片断利用限制酶位点BamH I和EcoR I插入到pEGX-6p-1原核表达载体(购于美国GE Healthcare公司)以及利用限制酶位点BamH I和Xho I插入到pET-28a原核表达载体(购于德国Merck公司)，转化大肠杆菌BL21，可获得GST-MyD88 TIR融合重组蛋白和His-MyD88 TIR融合重组蛋白。质粒构建及大肠杆菌转化等方法按常规分子克隆技术进行。
(4)GFP及其融合蛋白质粒、RFP及其融合蛋白质粒的转染及荧光显微术：
接种5×104个细胞于48孔培养板的每孔，无抗生素培养基中过夜培养。转染利用Invitroge公司的转染试剂Lipofectamine 2000，按说明书操作进行。每种质粒的用量为0.5μg。转染4-6小时后更换含抗生素和10％血清的IMDM培养基。次日，在倒置荧光显微镜(Nikon TE 2000U)的488nm及510nm激发光下观察各组转染细胞的荧光情况。
(5)重组蛋白的表达纯化：
原核表达质粒转化大肠杆菌BL21，接种于100mL含卡钠霉素的LB培养基中，37培养3小时。加入200μl 0.5Mol IPTG继续培养2-3小时，诱导表达。
His-MyD88 TIR的纯化：离心收集菌体后800μl缓冲液A(10mMol Tris-HCl(pH8.0)，500mMol NaCl，10％甘油，0.1％Tween-20，10mMol咪唑，0.1％β-巯基乙醇，10μMol ZnSO4与1mMol PMSF现用现加)重悬，超声10秒，间歇10秒，共3分钟，功率300W。加入终浓度为1％的Triton-X100混匀，13000rpm，10min，4℃离心。转移上清到新的EP管中，加入Ni-NTA珠子，4℃摇2-3小时。离心纯化His重组蛋白。缓冲液A洗珠子3-5次，再用缓冲液E(20mMol HEPES-KOHpH(7.5)，20％甘油，100mMol NaCl，10mMol咪唑，1mMol EDTA，1mMol DTT，10μMol ZnSO4与1mMol PMSF现用现加)洗珠子3次。纯化的结合于Ni-NTA珠上的His重组蛋白可用于Pull-down实验。
GST-MyD88 TIR的纯化：
诱导表达后的菌体通过离心获得，加入800μl细菌裂解液(20mMHEPES(pH7.5)，120mM NaCl，10％甘油，2mM EDTA，1mM PMSF)，重悬，超声10秒，间歇10秒，超声6次，功率300W。加入终浓度为0.5％的NP-40混匀，13000rpm，10min，4℃离心。转移上清到新的EP管中，加入50％谷胱甘肽琼脂糖凝胶4B珠子在4℃摇床上摇动1-2小时。离心纯化GST重组蛋白。先用含有0.5％NP-40的裂解液洗涤珠子3次，再用不含0.5％NP-40的裂解液洗涤珠子3次。纯化的结合于谷胱甘肽琼脂糖凝胶珠上的GST重组蛋白可用于Pull-down实验。
(6)重组蛋白体外相互作用分析：
首先，将GST融合蛋白从琼脂糖珠上洗脱。取0.1μg GST-MyD88-TIR离心吸去上清，加入等体积的谷氨酰胺洗脱缓冲液(10mMol还原型谷胱甘肽，50mMTris-HCl(pH8.0))，冰上漩涡振荡30分钟，离心后吸上清至500μl GBT buffer，再加入1μg封闭后的His融合蛋白Ni-NTA珠，4℃摇床上摇动2-3个小时。GBT缓冲液洗2次，缓冲液A洗一次，缓冲液E洗一次，每次于冰上摇动约5分钟。离心后加入20μl上样缓冲液，沸水煮5min，免疫印记检测GST融合蛋白。
依据上述技术原理以及实施例的实验结果，我们现将模型的建立和使用方
法详细描述如下：
(1)构建绿色荧光蛋白与MyD88TIR的融合蛋白真核表达质粒(GFP-MyD88 TIR)和红色荧光蛋白与MyD88TIR的融合蛋白真核表达质粒(RFP-MyD88 TIR)，共转染HeLa细胞，建立和筛选表达强度适当的、双阳性稳定表达GFP-MyD88 TIR和RFP-MyD88 TIR(或CFP-MyD88 TIR和YFP-MyD88 TIR)细胞株。
(2)获得上述细胞株后，将商品化购得的小分子库或自行制备的天然产物不同成分等被筛物加入到培养基中，结合高通量筛选设备和相应的计算机函数运算，可以实现高通量的、活细胞原位的MyD88二聚化抑制剂的筛选。
(3)在上述筛选过程中，对荧光FRET有影响的化合物进一步进行实施例2所描述的体外重组蛋白质(His-MyD88 TIR和GST-MyD88 TIR)相互作用验证，确认对MyD88 TIR二聚化抑制的有效性及特异性。
Claims (2)
1.以MyD88 TIR二聚化为靶点的抗炎抑制剂筛选模型，其特征在于：将MyD88分子的TIR结构域，以下称MyD88 TIR，分别与一荧光供体和荧光受体蛋白基因GFP/RFP或CFP/YFP构建融合蛋白质粒，转染哺乳动物细胞，建立双阳性表达的细胞株；如两种生物大分子即荧光供体分子和荧光受体分子的距离足够近，即小于10nm，为两蛋白分子直接相互作用的距离，在荧光供体的激发光照射下可以产生荧光受体的发射光信号，即发生荧光共振能量转移FRET；如果荧光供体分子和荧光受体分子的结合受到阻碍，则FRET受到影响；
其具体步骤如下：首先构建绿色荧光蛋白与MyD88 TIR的融合蛋白真核表达质粒，以下简称GFP-MyD88 TIR，和红色荧光蛋白与MyD88 TIR的融合蛋白真核表达质粒，以下简称RFP-MyD88 TIR；再将二者共同转染哺乳动物细胞，并建立双阳性表达的细胞株；如果培养条件中不存在小分子抑制物，MyD88 TIR发生二聚化，488 nm激发光即蓝光照射下GFP-MyD88 TIR发出的绿色荧光会有一部分作为RFP-MyD88 TIR的激发光被吸收，进而发出红色荧光，绿荧光减弱，即FRET发生；而如果培养条件中有小分子抑制物存在的话，MyD88 TIR无法发生二聚化，488 nm激发光即蓝光照射下GFP-MyD88 TIR发出的绿色荧光不会转移给RFP-MyD88 TIR，无红色荧光发出，产生正常的绿色荧光；细胞培养和药物筛选可结合高通量筛选仪及荧光值的相关函数运算；
对于上述基于荧光信号变化的筛选模型认定阳性，即对FRET有影响的化合物，还需利用原核表达并纯化的重组蛋白，进行体外蛋白质-蛋白质相互作用的验证分析：当培养细胞中FRET现象被某种添加的化合物阻断了，尚不能得出是这种化合物直接阻断了MyD88 TIR的二聚化结论，还是这种化合物引发了某种细胞内信号级联，间接地影响了MyD88 TIR的二聚化；因此利用一个His-MyD88 TIR和GST-MyD88 TIR重组蛋白体外相互作用分析加以验证；
具体步骤如下：在非变性缓冲液中，加入上述荧光筛选模型认为有效阻断MyD88 TIR二聚化的化合物，如果化合物能直接阻断MyD88 TIR的二聚化，则His-MyD88 TIR体外条件下不能正常结合GST-MyD88 TIR，进行His-MyD88 TIR结合物，即Pull-down产物的western blot分析，不能检测到GST抗体识别的信号；如果化合物不能直接阻断MyD88 TIR二聚化，His-MyD88 TIR体外条件下能够正常结合GST-MyD88 TIR，进行His-MyD88 TIR Pull-down产物的western blot分析，则可以检测到GST抗体识别的信号；经此验证模型，确切的MyD88 TIR二聚化抑制剂就可得以判定。
2.根据权利要求1所述的以MyD88 TIR二聚化为靶点的抗炎抑制剂筛选模型，其特征在于所述的筛选模型是用于对商品化的小分子库、自行制备的天然产物组分或各种化学合成物、修饰物进行广泛的筛选，获得对依赖于MyD88 TIR二聚化的慢性炎症、自身免疫性疾病有效仰制的药物筛选应用。
Priority Applications (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| CN201110236314.8A CN102321586B (zh) | 2011-08-17 | 2011-08-17 | 以MyD88TIR二聚化为靶点的抗炎抑制剂筛选模型及应用 |
Applications Claiming Priority (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| CN201110236314.8A CN102321586B (zh) | 2011-08-17 | 2011-08-17 | 以MyD88TIR二聚化为靶点的抗炎抑制剂筛选模型及应用 |
Publications (2)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| CN102321586A CN102321586A (zh) | 2012-01-18 |
| CN102321586B true CN102321586B (zh) | 2014-04-02 |
Family
ID=45449422
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| CN201110236314.8A Expired - Fee Related CN102321586B (zh) | 2011-08-17 | 2011-08-17 | 以MyD88TIR二聚化为靶点的抗炎抑制剂筛选模型及应用 |
Country Status (1)
| Country | Link |
|---|---|
| CN (1) | CN102321586B (zh) |
Families Citing this family (1)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| CN109554433B (zh) * | 2018-12-29 | 2022-04-29 | 杭州科兴生物科技有限公司 | 一种基于CD47/SIRPα阻断功能及其生物效应的药物快速筛选方法 |
Family Cites Families (2)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| CA2432542A1 (en) * | 2000-12-22 | 2002-07-04 | Synovis Limited | Methods of modulating toll-related receptor (trr) signaling |
| CN1562353A (zh) * | 2004-03-19 | 2005-01-12 | 复旦大学 | 髓样细胞分化蛋白MyD88在制备药物制剂中的用途 |
-
2011
- 2011-08-17 CN CN201110236314.8A patent/CN102321586B/zh not_active Expired - Fee Related
Also Published As
| Publication number | Publication date |
|---|---|
| CN102321586A (zh) | 2012-01-18 |
Similar Documents
| Publication | Publication Date | Title |
|---|---|---|
| Porter et al. | Sustained NFAT signaling promotes a Th1-like pattern of gene expression in primary murine CD4+ T cells | |
| De Weerd et al. | Structural basis of a unique interferon-β signaling axis mediated via the receptor IFNAR1 | |
| Ko et al. | LRRTM2 functions as a neurexin ligand in promoting excitatory synapse formation | |
| Shin et al. | U1-small nuclear ribonucleoprotein activates the NLRP3 inflammasome in human monocytes | |
| US8334101B2 (en) | Intracellular DNA receptor | |
| Memari et al. | Engagement of the aryl hydrocarbon receptor in mycobacterium tuberculosis–infected macrophages has pleiotropic effects on innate immune signaling | |
| WO2004053452A2 (en) | Assays relating to toll-like receptor activity | |
| Lai et al. | Detection of substance P and its receptor in human fetal microglia | |
| Fan et al. | Herpes B virus utilizes human nectin-1 but not HVEM or PILRα for cell-cell fusion and virus entry | |
| Young et al. | Duplex high‐throughput flow cytometry screen identifies two novel formylpeptide receptor family probes | |
| Shi et al. | A novel firefly luciferase biosensor enhances the detection of apoptosis induced by ESAT-6 family proteins of Mycobacterium tuberculosis | |
| Wang et al. | Nuclear localization and cleavage of STAT6 is induced by Kaposi’s sarcoma-associated herpesvirus for viral latency | |
| Rong et al. | Interleukin-17F signaling requires ubiquitination of interleukin-17 receptor via TRAF6 | |
| Chen et al. | Highly multiplexed bioactivity screening reveals human and microbiota metabolome-GPCRome interactions | |
| Wang et al. | ACE2 decoy receptor generated by high-throughput saturation mutagenesis efficiently neutralizes SARS-CoV-2 and its prevalent variants | |
| Sawaya et al. | Transdominant activity of human immunodeficiency virus type 1 Vpr with a mutation at residue R73 | |
| US6858400B2 (en) | Detection of surface-associated human leukocyte elastase | |
| Bartee et al. | Defining the anti-inflammatory activity of a potent myxomaviral chemokine modulating protein, M-T7, through site directed mutagenesis | |
| WO2014166429A1 (zh) | 检测蛋白质稳定性的方法及其应用 | |
| CN102321586B (zh) | 以MyD88TIR二聚化为靶点的抗炎抑制剂筛选模型及应用 | |
| Arakelyan et al. | Macrophage-derived HIV-1 carries bioactive TGF-beta | |
| Huang et al. | Lymphocyte integrins mediate entry and dysregulation of T cells by SARS-CoV-2 | |
| US7618786B2 (en) | Method for identifying modulators of human orexin-2 receptor | |
| Lei et al. | Development and application of potency assays based on genetically modified cells for biological products | |
| CN109946451B (zh) | 一种基于细胞内游离钙离子浓度变化效应的大麻素类活性物质的检测方法及其检测试剂盒 |
Legal Events
| Date | Code | Title | Description |
|---|---|---|---|
| C06 | Publication | ||
| PB01 | Publication | ||
| C10 | Entry into substantive examination | ||
| SE01 | Entry into force of request for substantive examination | ||
| C14 | Grant of patent or utility model | ||
| GR01 | Patent grant | ||
| CF01 | Termination of patent right due to non-payment of annual fee |
Granted publication date: 20140402 Termination date: 20150817 |
|
| EXPY | Termination of patent right or utility model |