CN102311992A - 针对混合、微量检材进行个体识别的方法 - Google Patents

Abstract

本发明提供了一种针对混合、微量检材进行个体识别的方法，联合应用了显微操作法和LV-PCR系统，具体包括以下步骤：利用显微操作法捕获细胞，将捕获的细胞直接置于LV-PCRs反应玻片上进行扩增分型，扩增结束后进行PCR产物检测。本发明利用显微操作技术和LV-PCR体系对混合、微量检材进行检验，成功解决针对混合、微量检材中不同来源人的精确分离检验问题。

Description

针对混合、微量检材进行个体识别的方法

技术领域

本发明涉及一种针对混合、微量检材进行个体识别的方法，尤其涉及一种通过提取单个细胞中的DNA，针对混合、微量检材中不同来源人精确分离检验，进行个体识别的方法，属于生物技术以及法医学领域。

背景技术

DNA检验技术通过对犯罪现场遗留的血迹、精斑、唾液斑、毛发等生物检材的检验来进行个体识别，进而认定和排除嫌疑人，在案件侦破过程中发挥着至关重要的作用。但在实际检案中经常会遇到一些疑难生物检材，应用现有技术无法很好解决，如案发现场的混合样品。性侵害案件在暴力犯罪中占很大的比重，在此类案件中混合斑，咬痕等是比较常见的混合检材，经常会由于女性物质过多男性物质相对较少，使用常规检测方法只能得到两个人DNA样本的混合图谱。虽然通过计算峰面积有可能推断出各个供者的图谱，但是其过程很复杂，结论也很难确定。并且当遇到三个或三个以上的供者时，通过计算峰面积来区分每个人的DNA分型就几乎不可能了。对于即使只有两个供者的情况，由于检验过程中多种因素的影响，这种推断也极易出错，往往只能给出模糊结论，不能给出作为直接认定的证据，现有检测方法针对混合、微量检材不能进行有效的个体识别。

发明内容

本发明提供了一种针对混合、微量检材进行个体识别的方法，可获得良好的个体识别效果。

本发明提供的针对混合、微量检材进行个体识别的方法，包括：

利用显微操作法捕获检材细胞的单个细胞；

利用低体积扩增系统对捕获的所述单个细胞的DNA进行扩增分型；

对扩增分型后的产物进行检测，以进行个体识别。

其中所述显微操作法包括显微操作仪捕获法或激光显微切割法。

其中所述扩增分型包括应用低体积扩增反应玻片，以及STR MiniFiler或STR MiniFiler荧光标记复合扩增试剂盒对DNA进行扩增分型。

当目标细胞为口腔上皮细胞时，操作如下：

(1)显微操作捕获口腔上皮细胞

将含口腔上皮细胞的检材放入含有1mL TNE的1.5mL Eppendorf离心管中，使其上的细胞充分脱落。振荡离心管，使溶液中的细胞尽量离散开。

将灭菌后的载玻片置于显微镜载物台上，吸取30μL细胞悬液滴加到载玻片上，并用枪头使悬液展平，静置2分钟，让细胞充分沉降到载玻片表面在4×10倍镜下调整显微操作仪吸针(直径80μm)进入细胞悬液并位于视野中央，然后在10×10倍镜下微调吸针，使之接近分散良好、膜完整而轮廓清晰的上皮细胞。通过小心调整油泵的吸吐旋钮，在捕获细胞的同时进行计数。将吸针抬离液面，获得捕获出的单细胞，也可重复如上步骤，获得多个单细胞。

(2)对所述检材的细胞DNA扩增分型

把捕获的细胞置于低体积扩增反应玻片上，加入0.75μL蛋白酶K(0.4mg/mL)，5μL封闭液密封，56℃孵育1h，99℃孵育10min，然后利用加样尖穿过封闭液再加入0.75μL Master mix，按照所述STR Identifiler试剂盒或所述STR Minifiler试剂盒扩增条件设定程序进行扩增。

扩增结束后将1.5μL扩增产物及5μL封闭液全部吸走，使用3130XL型遗传分析仪检测，检测操作按照仪器说明书进行。

当目标细胞为精子细胞时，操作如下：

(1)显微操作捕获精子细胞

剪取适量精斑检材，剪碎后放入1.5mL Eppendorf离心管中，加一定量的TE至能淹没检材为准，再加入SDS和PK使其终浓度为1wt％和0.1mg/mL，56℃浸泡2h以上，期间用消毒镊翻转挤压载体使精子细胞最大限度地从检材上洗脱下来；

漩涡震荡后套管离心去除检材，弃上清，沉淀物用纯水重悬，再离心，并重复3-4次，以充分去除液体中游离DNA；

将沉淀物重悬，获得未染色的精子细胞悬液；或加入5μL左右的1％酸性品红染色液染色1min获得经染色的精子细胞悬液；

取50μL左右的未染色或染色的精子细胞悬液滴加到干净载玻片上，将其放置于显微镜载物架上，静置约2min左右，让精子细胞能够充分沉降到载玻片表面，以利于精子细胞的提取；

选择好合适的视野，调节毛细针管，将其移至精子细胞附近，并通过调节油泵的细螺旋，控制精子细胞的吸入同时计数；

将吸针轻轻抬离液面，将针头慢慢浸入含有裂解液的1.5mL eppendorf管中，轻调油泵细螺旋，将细胞缓慢打出，观察直至针头上方的空气柱进入到液体中，有小气泡冒出为止；获得捕获出的单细胞，重复如上步骤，获得多个单细胞。

(2)对所述检材的细胞DNA扩增分型

把捕获的精子细胞置于低体积扩增反应玻片上，加入0.75μL精子细胞裂解液(PK 0.1mg/mL和DTT 5mmol/L)，5μL封闭液密封，56℃孵育1h，99℃孵育10min，然后利用加样尖穿过封闭液再加入0.75μL Master mix，按照所述STRIdentifiler试剂盒或所述STRMinifiler试剂盒扩增条件设定程序进行扩增。

扩增结束后将1.5μL扩增产物及5μL封闭液全部吸走，使用3130XL型遗传分析仪检测，检测操作仪器说明书进行。

其中，捕获口腔上皮细胞的步骤(1)以及捕获精子细胞的步骤(1)均可按MMI公司激光显微切割法或PALM公司的激光显微切割法进行。

同一个体的各个组织细胞的DNA具有相同的序列特征，即个体组织同一性。单个细胞的分析，即使来源于多人的混合细胞，也可以确保获得的信息是来自一个单独的个体，因此可以利用单细胞的DNA分析来解决混合斑的问题，同样也可以对微量检材进行单个细胞的提取、富集，进行有效的分型鉴定。单细胞捕获和扩增技术在医学和神经生物学研究领域应用较多，但其在法医学中的应用尚属少数。目前获取微量甚至单个细胞的常见的方法有：流式细胞仪分离法、激光捕获显微切割分离法、显微操作仪捕获法等。

如何在保证使用现有PCR-STR分型技术基础上，提高检测的灵敏度，达到单个细胞的水平(pg级)，从而真正的解决混合斑的个人识别问题，同时也在单细胞水平提高微量生物物证的最大限度的利用率，其最根本的问题就在于最大限度的保存DNA信息，同时进行无污染的有效扩增。

最近几年发展起来的微量化反应扩增，即低体积扩增(lowvolume-polymerase chain reaction，LV-PCR)成为提高灵敏度，经济而有效的方法。AmpliGrid 1微升PCR系统是基于显微镜玻片平面印刷的专利技术，玻片表面构建48个1μL亲水性基因座，使DNA模板、反应混合物锚定在此特定位置上，形成具有最佳半球状结构的反应空间，疏水性位点使覆盖在反应试剂上的油性封闭液互相隔离，保证PCR反应过程中无气溶胶产生、无交叉污染；AmpliSpeed热循环仪针对以玻片为载体的PCR反应系统而设计，采用高平整度的硅晶平面具有极好的热传导性能，同时1μL半球状的空间构象，提供了微量反应最佳的环境，使灵敏度大大提高。Ampligrid 1微升PCR系统不仅可以应用于法医案例分析中的LCN DNA样本，还可以进行单细胞PCR反应，以解决混和检材问题。

本发明应用显微技术从混合样品中分离特定细胞进行同一认定，具有以下技术效果：

1.建立了基于显微操作仪捕获法或激光显微切割法的单细胞捕获方法与LV-PCR法联用的针对混合、微量检材的通过对单个细胞中的DNA扩增分型以进行个体识别的方法，并成功地用于口腔上皮细胞和精子细胞的分离和检测。通过对模拟混合斑的检验研究，发现当精子细胞数目较少时，采用本发明的方法优于差异裂解法。

2.以口腔上皮细胞为检测模型，建立了低体积扩增技术平台。目前可以成功检测出3个新鲜口腔上皮细胞的Identifiler和MiniFiler试剂盒的全部分型，1个口腔上皮细胞进行60次Identifiler扩增检测，其中26次获得13个以上的位点(43.4％)，1个口腔上皮细胞进行70次MiniFiler扩增检测，其中34次获得完整分型(48.6％)。将该平台应用到精子细胞检测中，可以成功检测出20个精子细胞的Identifiler试剂盒的全部分型。

3.通过模拟案例和实际案例检材的检测进一步证明了本发明方法的有效性和优势，选择常规方法检测不理想的混合、微量检材，可以成功获得单个个体的DNA图谱，有效的解决现有检测方法的不足。

4.本发明的方法灵敏度较高；与常规方法相比，显微操作分离单细胞法与LV-PCR法联用的检验用于混合、微量样品检验有优势，这种优势在混合样品检验中更为明显。

附图说明

图1A和图1B示出了显微捕获法捕获精子细胞(×400)；图1A为接近精子细胞，图1B为捕获精子细胞。

图2示出了PALM激光显微切割分离、收集精子细胞的图；a为涂片上的精子细胞，b为精子细胞的切割，c为精子细胞被弹射，d为玻片收集到的带有精子细胞的薄膜。

图3A、图3B示出了显微操作捕获口腔上皮细胞成功获得了所需数目的细胞；显微吸针吸取口腔上皮细胞，箭头所指处为口腔上皮细胞。

图4示出了ID扩增的单个口腔上皮细胞图。

图5示出了Minifiler扩增的单个口腔上皮细胞图。

图6示出了Minifiler扩增的口杯上的脱落细胞。

图7示出了Minifiler扩增的口香糖上的脱落细胞(图示：出现异常增高的Stutter峰和非特异性扩增产物)。

图8示出了门把手上的脱落细胞。

图9-图11分别示出了20、10、1个精子细胞的ID分型结果。

图12-图13分别示出了实施例4中检材的常规方法检测结果以及显微操作检测结果。

图14-图15分别示出了实施例5中检材的常规方法检测结果以及显微操作检测结果。

图16-图18分别示出了实施例7中差异裂解法提取得到混合分型图谱、PALM联合低体积扩增提取精子细胞分型结果、以及嫌疑人血样的分型结果。

图19-图21分别示出了实施例8中差异裂解法提取得到混合分型图谱、PALM联合低体积扩增提取精子细胞分型结果以及嫌疑人血样的分型结果。

具体实施方式

下述实施例中健康志愿者含口腔上皮细胞的检材样本的采集单位为中国人民公安大学；健康志愿者精液以及健康志愿者阴道拭子的提供单位为北京民航总医院检验科和山西省柳林县人民医院检验科；案件检材提供单位为公安部物证鉴定中心。

所用方法如无特别说明均为常规方法。所用试剂如下表所示：

实施例1、针对精子细胞进行个体识别的方法

一、显微操作捕获精子细胞

1.剪取适量精斑检材，剪碎后放入1.5mL Eppendorf离心管中，加一定量的TE至能淹没检材为准，再加入SDS和PK使其终浓度为1％和0.1mg/mL，56℃浸泡2h以上，期间用消毒镊翻转挤压载体使精子细胞最大限度地从载体上洗脱下来。

2.漩涡震荡后套管离心去除载体，弃上清，沉淀物用纯水重悬，再离心，并重复3-4次，以充分去除液体中游离释放的女性DNA。

3.将沉淀物重悬，加入5μL左右的1％酸性品红染色液染色，约1min；(由于精子细胞折光性较好，不染色也可以)。

4.取50μL左右的染色后的精液滴加到干净载玻片上，将其放置于显微镜载物架上，静置约2min左右，让细胞能够充分沉降到载玻片表面，以利于细胞的提取。

5.选择好合适的视野，调节毛细针管，将其移至精子附近，并通过调节油泵的细螺旋，控制精子的吸入同时计数。

6.将吸针轻轻抬离液面，将针头慢慢浸入含有裂解液的eppendorf管中，轻调油泵细螺旋，将细胞缓慢打出，观察直至针头上方的空气柱进入到液体中，有小气泡冒出为止。

二、精子细胞DNA的LV-PCR扩增分型

1.DNA提取

将精子细胞置于LV-PCR反应玻片上加入0.75μL精子裂解液(PK 0.1mg/mL和DTT 5mmol/L)；然后用5μL封闭液密封，56℃孵育1h，99℃孵育10min，然后加样尖穿过封闭液再加入0.75μL PCR反应MIX，将微量反应玻片放在AmpliSpeed热循环仪上。

Identifiler反应体系：

95℃11min；94℃20sec，59℃1min 15sec，72℃1min 15sec，28个循环；60℃延伸45min；4℃保存。

2.Minifiler试剂盒扩增的体系和扩增程序同前。

3.PCR产物检测

扩增结束后将1.5μL扩增产物及5μL封闭液全部吸走，3130XL型遗传分析仪检测，检测操作按照试剂和仪器说明书进行。

三、显微操作捕获精子细胞的基因分型

①显微操作法和差异裂解法比较

用显微操作法(图1A和图1B)制备两组包含不同精子数目的混合斑：70、93、126、159、177、201、232、258、284、325、347，制备方法见实验方法5。然后分别用传统的差异裂解法和显微操作法提取精子细胞(用QIAamp DNAMicro-kit试剂盒提取精子DNA)。将13个以上的位点分型正确、各位点的等位基因峰高于100RFUs的样本判定为分型成功的样本(表1-1)。对所得数据采用四格表卡方检验法进行统计学分析(表1-2)。

表1-1差异裂解法和显微操作法分型结果比较

注：*依据标准位点分型正确、各位点的等位基因峰高于100RFUs的位点数

表1-2统计学分析

X²＝(ad-bc)2n/(a+b)(c+d)(a+c)(b+d)＝16.7

df＝1

p＜＜0.01

实验所设对照正确，显微操作法检测12例检材。其中含70个精子的检材分型结果显示等位基因缺失明显，仅有包括性别在内的四个片段长度小于200bp的位点出峰，且RFU值低于100，其余11份检材图谱完整，均能按标准成功分型并与已知分型结果比对正确，成功率为92％(11/12)；差异裂解法检测12份检材，有11份检材等位基因缺失明显，峰值普遍低于100RFU，出现非特异性扩增以及不平衡扩增。另有含381个精子细胞检材分型成功，与已知分型结果比对正确，成功率为8％(1/12)，两者差异显著(P＜0.05)。

本实验使用模拟混合斑进行显微捕获技术和差异裂解法的比较。结果显示显微操作技术对混合斑检验结果要优于后者。当检材中精子数少于300个，差异裂解法很难发挥作用。差异裂解法在精子细胞所占比例较少的情况下，可能会由于黏附于载体上的精子细胞洗脱效率低，或者是从载体上洗脱时由于反复移液操作使本已量微的精子细胞丢失而影响分型结果。显微操作捕获技术通过镜下直视状态捕获精子细胞，一方面能定性定量，另一方面制备细胞悬液时由于混合斑已被尽可能稀释，4μm玻璃吸针专为捕获精子细胞“量身定做”，女性上皮细胞及其他杂质被“拒之门外”，从而排除了干扰。从实验结果来看，显微操作法捕获70个精子细胞分型不成功以及126个精子细胞峰值低可能与精子细胞DNA降解，纯化过程中纯化柱回收率以及仪器灵敏度有关。而且，精子细胞是单倍体，在收集时无法保证均衡地收集两种单倍体细胞，为此在实际操作中应尽可能多的收集精子细胞。

对于轮奸案件可以用显微操作法针对性地捕获单个精子细胞，使用有效的扩增模板的方法进行单个精子细胞DNA检测有望提供关键性线索。常规混合斑检材检测过程中，通常第一步是确证精子细胞的存在，即HE染色光学显微镜下检测精子细胞。接下来才进行细胞分离，DNA提取和分型。近年来，随着技术的进步，低拷贝模板检出率不断提高，以前许多不能分型的案件检材可能只保留用于镜检的玻片，这些玻片通过显微操作法仍可提取出精子细胞，用于检测。设想将这些玻片编号保存，有望今后进行复检。

本发明构建了基于显微操作的单细胞分离、富集和检验方法，并成功的应用到口腔上皮细胞和精子细胞的检验中。使用显微操作法捕获新鲜口腔上皮细胞检测时，在ID分型中，10个以上的细胞能够得到完整的分型；在MF分型中，3、5个细胞能够得到完整的分型。进行混合斑检验时，发现对于精子细胞数相对较少的检材，显微操作法比传统的差异裂解法有明显优势。法医DNA检测重要环节是有效提取模板DNA。特别是一些案件检材量少、条件差，每一个细胞都可能对成功分型至关重要。显微操作法的优势在于：1.直接提取检材中的细胞并对其进行裂解纯化，检测过程中不需反复移液操作，减少了模板DNA的损失和可能的污染；2.节省检材，利于检材的重复提取和复检。

实施例2、PALM激光显微切割分离精子细胞

通过PALM系统对精子细胞进行切割、捕获，收集到LV-PCR反应玻片上，随即进行下一步的裂解、扩增。由图2可见使用该方法可以成功地切割分离单个细胞。PALM系统采用激光压力弹射(LPC)技术实现对样品的切割与分离，相对于前述两种经典的LCM技术来说，有以下优点：①不需要特制的贴附有EVA膜的塑料帽，可减小试验消耗。②采用激光压力弹射技术使样品从载玻片直接弹射到LV-PCR反应玻片上。③样品直接涂片，干燥后即可进行细胞分离，不需染色、固定等步骤，避免了样品损失。可以用于法医微量样品的检测。

实施例3、联合应用显微操作和LV-PCR系统技术对微量细胞DNA扩增分型

本部分联合应用显微操作和LV-PCR系统进行单细胞检验研究，用以提高检测灵敏度。

1.低体积扩增体系的建立

显微操作吸取5个口腔上皮细胞，放置于LV-PCR反应玻片上后，分别采用如下五种方法裂解和扩增，并设置重复实验。

①加入0.5μL H₂O和0.5μLMaster mix，5μL封闭液密封。按照Identifiler试剂盒扩增条件设定程序进行扩增。

②加入0.75μLH₂O和0.75μL Master mix，5μL封闭液密封。按照Identifiler试剂盒扩增条件设定程序进行扩增。

③加入0.5μL蛋白酶K(0.4mg/mL)，5μL封闭液密封，56℃1h，99℃10min。然后加样尖穿过封闭液再加入0.5μL Master mix。按照Identifiler试剂盒扩增条件设定程序进行扩增。

④加入0.75μL蛋白酶K(0.4mg/mL)，5μL封闭液密封，56℃孵育1h，99℃孵育10min，然后加样尖穿过封闭液再加入0.75μL Master mix。按照Identifiler试剂盒扩增条件设定程序进行扩增。

⑤加样方法同④。Identifiler扩增条件退火和延伸步骤各延长15sec。

五种方法的结果统计见表1-3，表1-4。

表1-35个细胞不同方法ID分型情况

表1-4相同程序不同方法ID分型基因座ADO情况

本实验除严格控制污染外，同时设置阴性和阳性对照，结果显示阴性和阳性对照正确，说明本实验没有受到外源DNA的污染。五种方法共进行29次检测，方法一，二，三，四分别进行6次，方法五进行5次。前四种方法所利用的程序为ID推荐的标准程序，通过标准ID程序扩增的0.5H₂O+0.5MIX，0.75H₂O+0.75MIX，0.5PK+0.5MIX，0.75PK+0.75MIX比对，发现加入裂解液蛋白酶K的方法明显优于不加蛋白酶K的方法，方法一中未加入蛋白酶K进行细胞裂解，而是直接加入PCR反应液，通过酶预热这一步直接进行热裂解，，方法三和方法四均获得满意结果，考虑到在实际操作中的可行性，选择0.75PK+0.75MIX作为单个细胞LV-PCR的方案，原因为：0.5μLPK经常不能将细胞完全覆盖，并且很容易蒸发；方法三中出现一次无任何扩增产物，分析原因为液体未盖全细胞，此步可以在显微镜下观察得知，方法五中进行了程序优化，比对方法四和方法五，将退火和延伸时间增加了15秒，结果显示这样更有利于大片段的扩增，并且使扩增更加平衡。

由本实验还可以看出，利用显微捕获技术联合低体积扩增对微量细胞的DNA分型具有可行性，比常规体系扩增具有极大优势。

2.显微操作联合低体积扩增检测口腔上皮细胞

①单个口腔上皮细胞检测

显微操作捕获新鲜的口腔上皮细胞(参见图3A、图3B)，使用Identifiler和Minifiler^TM试剂盒进行低体积扩增，3个口腔上皮细胞能够获得完整的两种试剂盒的分型图谱。一个口腔上皮细胞进行Identifiler(共60次)和Minifiler(共70次)扩增，结果为：Identifiler扩增时(见表1-5)，有13次获得完整16个位点分型(图4)，其中2次出现非特异峰，13次获得13-15个基因座，有5次出现非特异峰，15次获得9-12个位点，有5次出现非特异峰；Minifiler扩增时(见表1-6)，有34次获得完整分型(图5)，其中5例出现非特异峰，13次获得6-8个基因座，有10例出现非特异峰，8例获得3-5个峰，有6次出现非特异峰。

表1-5单个细胞ID分型中得到的基因座情况

表1-6单个细胞MF分型中得到的基因座情况

②模拟检材单个口腔上皮细胞检测

模拟检材为：志愿者口杯、口香糖和实验室门把手。首先捕获单个细胞，然后用Minifiler扩增，并重复四次实验，结果见表1-7。对于口杯检材(kb)，其中三次实验均获得完整分型(见图6)，一次发生一个基因座内等位基因丢失；对于口香糖检材(kxt)，其中两次实验获得完整分型，一次实验中两个基因座部分等位基因丢失，一次stutter峰偏高并且出现非特异性扩增，影响判型(见图7)，其中口杯和口香糖供者非同一志愿者(均已知基因型)。对于门把手模拟检材，仅有个别基因座出现峰值，故四次试验均没有获得成功(见图8)。

表1-7模拟检材Minifiler扩增分型结果

③单细胞叠加有关问题

单细胞DNA分型所得图谱需经多次扩增结果叠加后方可确认。一般情况下，应满足以下条件：1.一次分型结果不能作为分型的依据，至少3次以上方有意义；2.单细胞扩增过程中，非特异性扩增随机发生，同一基因座出现该峰两次以上才可进行统计；3.单细胞扩增中，不同等位基因座，不同等位基因之间扩增不平衡，在一些情况下，杂合子等位基因之间比例可以＜1/10，不要盲目认为此峰为纯合子的影子带；4.单细胞叠加时，16个位点的扩增试剂盒，推荐13个位点以上有峰方可作为累计的基础，对于9个位点的MF试剂盒，推荐6个位点以上有峰方可作为累计的基础。举例如下：见表1-8。

表1-8单细胞检测五次叠加结果

通过实验结果可以看出显微捕获联合低体积扩增技术在研究微量和超微量检材中具有重要意义，目前，常规方法对微量、超微量生物学检材的STR分型尚较困难，经常会出现：不平衡扩增、等位基因丢失、Stutter峰增强、非特性扩增等现象。其中不平衡扩增，等位基因丢失尤其严重，经常导致无法正确分型。本发明提供的利用显微操作技术和LV-PCR体系进行超微量生物学检材的研究，通过减少PCR反应体积，提高PCR反应灵敏度的方法，成功解决了理想检材单个口腔上皮细胞的扩增问题，并进行了模拟检材研究，取得了较好成果，这为实际案例中超微量和混合检材的检验提供了基础。

3.显微操作联合低体积扩增检测精子细胞

取志愿者精斑样本(2009年2月收集)，显微操作吸取20个细胞进行3次重复检测，结果与标准分型一致，见下表1-9。吸取单个精子细胞进行12次重复检测，其中10次出现有效分型，2次分型失败，结果见表1-10。某些基因座出现两条带，分析原因为非特异性扩增或者是增高的stutter峰。对这10次结果尝试进行叠加，以某一等位基因位点重复出现两次以上为正确分型的判定标准，可以叠加出正确的基因分型。由实验可以看出，20个精子细胞可以成功检测分型。对单个精子细胞进行分型检测时，对结果进行叠加可以得出正确的基因分型，但检测时会出现失败的反应位点，可能原因在于：1.载体干扰或DNA降解，没有吸到真正有核的精子细胞；2.扩增体系蒸发。

本发明建立了显微操作法联合应用LV-PCR系统进行单个细胞分离检测的方法，可以完整检测出3个口腔上皮细胞的Identifiler和MiniFiler试剂盒的全部分型，1个口腔上皮细胞进行60次Identifiler扩增检测，其中26次获得13个以上的位点(43.4％)，1个口腔上皮细胞进行70次MiniFiler扩增检测，其中34次获得完整分型(48.6％)。将该方法应用于模拟案例中口腔上皮细胞检测，取得了满意效果。将该方法用于精子细胞检测时，选取1例志愿者样品，20个精子细胞进行了3次Identifiler扩增检测，均获得正确分型。

表1-920个精子细胞低体积扩增结果

表1-10单精子10次检测结果

4.PALM激光显微切割系统联合低体积扩增检测精子细胞

使用Identifiler试剂盒分型检测，1、10、20个精子细胞各重复检测8次，结果见表1-11，1-12，1-13，图9-图11为部分分型图谱。其中20个精子细胞8次分型中，出现一次杂合子基因座D21S11变成了纯合子，其余7次分型结果完全正确。10个精子细胞8次分型中，出现一次两个杂合子基因座CSF1PO、D18S51均变成了纯合子，一次杂合子基因座CSF1PO变成了纯合子，两次杂合子基因座FGA变成了纯合子，其余4次分型结果完全正确。1个精子细胞8次分型中，出现位点的基因座均在10个以上，其中出现一次D7S820基因座分型结果错误，一次FGA基因座出现非特异性扩增，一次D2S1338基因座出现异常增高的stutter峰。以同一基因座出现该峰两次以上为准对8次结果进行叠加统计，20、10个精子均获得完整的分型结果，1个精子8次结果进行叠加，vWA和TPOX各缺失一个等位基因，其余基因座均得到完整的分型结果。此实验结果与常规方法检测结果完全一致，充分说明了该方法的可靠性。

从结果中，精子细胞数为20个时，8次重复有7次获得完整分型，10个精子细胞8次重复中出现4次完整分型，这是由于精子细胞是单倍体，仅含有一半的基因组信息，很难均衡的取到两种单倍体的细胞，细胞数目多时获得完整分型的可能性就增加。根据前述分型结果叠加原则，叠加出20个和10个细胞的完整分型，1个细胞获得14个位点分型，充分证明了这种方法的可行性。另外，本实验采用的是理想精斑，样本保存条件很好，当进行实际案例检材检测时，由于细胞降解及载体等干扰因素的存在，需要适当增加细胞数目。

表1-11  20个精子细胞8次ID分型结果

表1-1210个精子细胞8次ID分型结果

表1-131个精子细胞8次ID分型结果

实施例4

2009年1月1日，×××被强奸。检材为现场烟头。

①检测方法

将烟头嘴滤纸部分剪取三分之一直接放入1.5mL Eppendorf管中浸泡四十分钟，期间震动三次，套管离心除去载体，10000r/min离心3min，弃上清留细胞沉渣约30μL，混匀后滴于载玻片上捕获三个细胞放置玻片上，共捕获七次。

②检测结果

该检材按常规方法用检测结果是混合型图谱(图12)。通过显微操作吸取3个细胞进行7次检测的结果见下表1-14，其中一次的图谱见图13。按照同一基因座出现该峰两次以上进行统计的原则进行结果叠加。结果与现场提取的1个避孕套和卫生纸上的精斑、及1枚烟头上的DNA分型一致，说明显微操作法检测出了一个个体的DNA分型，没有检测出混合图谱中另一个供者的原因可能是：1、该供者遗留在烟头上的细胞较少，这由混合图谱上的峰高差异也能初步判断出来，经过案件检验者重复擦拭检测之后，烟头上的细胞更少甚至没有了。所以只吸到了一个供者的细胞。该检材检测的结果证明了显微操作法用于混合样品检测的有效性。

表1-14该检材三个细胞Identifiler分型结果

实施例5

2009年2月26日，发现×××死亡。检材为死者的右乳头拭子。

①检测方法

剪取拭子棉头放入1.5mL Eppendorf管中浸泡四十分钟，期间震动三次，套管离心除去载体，10000r/min离心3min，弃上清留细胞沉渣约30μL，混匀后滴于载玻片上捕获单个细胞放置玻片上，共捕获八次。

②检测结果

该检材按常规方法用检测结果是混合型图谱(图14)。该检材捕获单个细胞进行检测，重复了八次，其中七次都没有检测结果，只有一次检测到13个位点，所出的等位基因都包含在常规方法所得的混合图谱中(图15)。该检测结果说明：吸取单个细胞可以检测到单个个体的STR分型，但是检测成功率还不高，可能的原因在于：1.载体可能会影响细胞的判断，导致没有吸到真正的细胞；2.常规方法已经检测过，剩余检材的量很少，细胞数目则更少；3.检材放置时间长，DNA降解严重，影响单个细胞检测的成功率。所以，用显微操作法检测案件检材时，建议吸取2-3个细胞。

实施例6

三个案件中的烟头，检材编号分别为I、II、III。

①检测方法

将烟头嘴滤纸部分剪取三分之一直接放入1.5mL Eppendorf管中浸泡四十分钟，期间震动两次，套管离心除去载体，10000r/min离心3min，弃上清留细胞沉渣约50μL，取30μL滴于载玻片上捕获单个细胞进行后续检测，每份检材重复检测三次。

②检测结果

案件检材I、II进行了ID扩增，其中检材I进行了3次单细胞捕获，结果为(表1-15)：一次成功获得15个位点，一次成功获得12基因座位点，一次未出结果；检材II进行了3次单细胞捕获，结果为(表1-16)：一次成功获得15个等位基因位点，一次成功获得13个基因座位点，D3S1358出现一次非特异性扩增，一次成功获得全部16个等位基因位点；案件检材III进行了3次MF扩增(表1-17)，一次成功获得9个全部位点，一次D21S11丢失一个等位基因，D18S51出现非特异性扩增；一次D7S820丢失一个等位基因。其中红色为出现的非特异性扩增。

本实验应用显微捕获联合低体积扩增系统进行实际案例检材的研究，取得了初步成果，但是很多微量检材里的细胞形态变化很大，在镜下看到的很多都是无核的细胞，致使单细胞捕获时经常捕获到没有细胞核的细胞，不能得出任何结果，即使有少数有核细胞，其形态也极不典型，并常伴随降解，给单细胞检验带来困难，特别是一些陈旧降解的检材，在显微镜下仅存在少量形态完整的细胞，因此如何在镜下发现有核细胞成了本实验的难点，在以后的试验中我们设想进行细胞核的特异性染色，在找到有核细胞后，联合应用LV-PCR体系进行后续扩增分型。

表1-15检材I Identifiler分型结果

表1-17检材IIIMinifiler分型结果

实施例7

2009年6月4日，×××被强奸。检材为受害者内裤上的可疑精斑I。

①检测方法

使用PALM激光显微切割联合低体积扩增技术，分离捕获约40个精子细胞，然后进行低体积扩增检测。

②检测结果

用常规差异裂解法处理该检材，得到的是男女混合图谱(见图16)，原因在于女性物质相对较多，而精子细胞较少，即使进行两步消化也不能完全去除女性物质。取剩余检材进行单个细胞分离捕获方法检测，结果为一男性个体图谱(见图17)，且与嫌疑人的分型结果一致(见图18)。说明直接吸取检材中的精子细胞进行检测，可以有效的防止女性成分的干扰，从而获得单个个体的分型图谱。

实施例8

2009年5月4日，×××被强奸。检材为受害者内裤上的可疑精斑II。

①检测方法

使用PALM激光显微切割联合低体积扩增技术，分离捕获约40个精子细胞，然后进行低体积扩增检测。

②检测结果

用差异裂解法提取结果为混合型(图19)，取剩余检材进行单个细胞分离捕获方法检测，其中一次的分型结果见图20，与嫌疑人的分型一致(图21)。最终结果见表1-18。

表1-18精斑II分型结果

精斑I和精斑II两份混合斑检材的成功检测，为女性物质去除不完全的混合样品提供了一条非常有效的解决方案。与传统的差异裂解法相比，该方法的优势如下：首先，准确的捕获精子细胞进行检测，有效的防止了女性细胞成分的干扰从而使分型结果由混合型变成了单一型；其次，精子细胞的裂解和扩增都在同一反应位点上，不需要反复离心、移液，从而减少操作过程中的污染。另外，缩短了检验时间，浸泡检材、涂片和捕获细胞后，即可进行精子细胞裂解和扩增，而差异裂解法采用二步消化，检材浸泡后，需要首先消化女性物质，然后再对精子细胞消化。

通过上述实施例的实施，与常规方法相比，本发明提供的显微分离联合低体积扩增技术用于单个细胞检验对于检验混合、微量样品有很大优势，这种优势在混合样品检验中更为明显；由于实际案件检材载体复杂，保存条件差，检测时可吸取多个细胞，同时进行多次重复，以保证结果的准确性。

最后应说明的是：以上实施例仅用以说明本发明的技术方案，而非对其限制；尽管参照前述实施例对本发明进行了详细的说明，本领域的普通技术人员应当理解：其依然可以对前述各实施例所记载的技术方案进行修改，或者对其中部分技术特征进行等同替换；而这些修改或者替换，并不使相应技术方案的本质脱离本发明各实施例技术方案的精神和范围。

Claims (10)

1.一种针对混合、微量检材进行个体识别的方法，其特征在于，包括：

利用显微操作法捕获检材细胞的单个细胞；

利用低体积扩增系统对捕获的所述单个细胞的DNA进行扩增分型；

对扩增分型后的产物进行检测，以进行个体识别。

2.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述显微操作法包括显微操作仪捕获法或激光显微切割法。

3.根据权利要求2所述的方法，其特征在于，所述检材细胞为口腔上皮细胞。

4.根据权利要求3所述的方法，其特征在于，利用显微操作仪捕获法捕获检材细胞的单个细胞包括：

将含口腔上皮细胞的检材放入含有1mL TNE的1.5mL Eppendorf离心管中，使其上的细胞充分脱落；振荡离心管，使溶液中的细胞尽量离散开；

将灭菌后的载玻片置于显微镜载物台上，吸取30μL细胞悬液滴加到载玻片上，并用枪头使悬液展平，静置2分钟，让细胞充分沉降到载玻片表面，在4×10倍镜下调整显微操作仪吸针进入细胞悬液并位于视野中央，然后在10×10倍镜下微调吸针，使之接近分散良好、膜完整而轮廓清晰的上皮细胞；通过调整油泵的吸吐旋钮，在捕获细胞的同时进行计数；将吸针抬离液面，获得捕获出的单细胞；重复如上步骤，获得多个单细胞。

5.根据权利要求3或4所述的方法，其特征在于，所述利用低体积扩增系统对捕获的所述单个细胞的DNA进行扩增分型包括：

利用所述低体积扩增系统，以及STR Identifiler或STR MiniFiler荧光标记复合扩增试剂盒对所述单个细胞的DNA进行扩增分型。

6.根据权利要求5所述的方法，其特征在于，所述利用低体积扩增系统对捕获的所述单个细胞的DNA进行扩增分型具体包括：

把捕获的细胞置于低体积扩增反应玻片上，加入0.4mg/mL的蛋白酶K 0.75μL，5μL封闭液密封，56℃孵育1h，99℃孵育10min，然后利用加样尖穿过封闭液再加入0.75μL Master mix，按照所述STR Identifiler试剂盒或所述STRMinifiler试剂盒扩增条件设定程序进行扩增分型。

7.根据权利要求2所述的方法，其特征在于，所述检材细胞为精子细胞。

8.根据权利要求7所述的方法，其特征在于，利用显微操作仪捕获法捕获检材细胞的单个细胞包括：

剪取适量精斑检材，剪碎后放入1.5mL Eppendorf离心管中，加一定量的TE至能淹没检材为准，再加入SDS和PK使其终浓度为1wt％和0.1mg/mL，56℃浸泡2h以上，期间用消毒镊翻转挤压载体使精子细胞最大限度地从检材上洗脱下来；漩涡震荡后套管离心去除检材，弃上清，沉淀物用纯水重悬，再离心，并重复3-4次，以充分去除液体中游离DNA；将沉淀物重悬，获得未染色的精子细胞悬液；或加入5μL左右的1％酸性品红染色液染色1min获得经染色的精子细胞悬液；

取50μL的未染色或染色的精子细胞悬液滴加到干净载玻片上，将其放置于显微镜载物架上，静置2min，让精子细胞能够充分沉降到载玻片表面，以利于精子细胞的提取；选择好合适的视野，调节毛细针管，将其移至精子细胞附近，并通过调节油泵的细螺旋，控制精子细胞的吸入同时计数；将吸针抬离液面，将针头浸入含有裂解液的1.5mL eppendorf管中，油泵细螺旋，将精子细胞缓慢打出，观察直至针头上方的空气柱进入到液体中，有小气泡冒出为止；获得捕获出的单细胞，重复如上步骤，获得多个单细胞。

9.根据权利要求7或8所述的方法，其特征在于，所述利用低体积扩增系统对捕获的所述单个细胞的DNA进行扩增分型包括：

利用所述低体积扩增系统，以及STR Identifiler或STR MiniFiler荧光标记复合扩增试剂盒对所述单个细胞的DNA进行扩增分型。

10.根据权利要求9所述的方法，其特征在于，所述利用低体积扩增系统对捕获的所述单个细胞的DNA进行扩增分型具体包括：

把捕获的精子细胞置于低体积扩增反应玻片上，加入0.75μL精子细胞裂解液，5μL封闭液密封，56℃孵育1h，99℃孵育10min，然后利用加样尖穿过封闭液再加入0.75μL Master mix，按照所述STR Identifiler试剂盒或所述STRMinifiler试剂盒扩增条件设定程序进行扩增分型。

Images