CN102297858A - 一种SOS/umu遗传毒性效应的试管测试方法及装置 - Google Patents

Abstract

本发明涉及一种专门针对化学污染物遗传毒性效应的试管测试方法，属于环境检测和评价技术范畴。设计发明一种专门的试管用于SOS/umu遗传毒性检测，采用试管作为菌液培养、毒性暴露、损伤修复、显色、测试的容器，采用移液管(或移液器)转移溶液、菌液，采用水浴恒温振荡器进行溶液的混合震荡，运用可见分光光度计进行吸光度测定。实现了对化学污染物、环境样品遗传毒性效应的简便、经济、绿色、准确检测，也便于方法的推广普及。

Description

一种SOS/umu遗传毒性效应的试管测试方法及装置

技术领域

本发明涉及的是一种SOS/umu遗传毒性效应的试管测试方法及装置，属于环境污染检测和评价技术范畴。

背景技术

随着工农业生产的快速发展，环境问题日益严重，环境污染对人类造成的危害远远超过以前的估计，而环境污染物的遗传毒性受到更为广泛的关注。遗传毒性(或称基因毒性)，是指化学物质和辐射线等对机体遗传物质直接或间接产生的毒性，主要包括基因突变和染色体畸变，均为DNA损伤所致的突变。随着遗传毒理学相关领域特别是分子生物学技术的飞速发展，遗传毒性的分子机理得到了深入的阐释，遗传毒性效应的测试、评价方法也在不断建立和改进。目前最主要的研究遗传毒性的方法有Ames实验、染色体畸变实验、微核实验、彗星实验、姐妹染色体交换实验等。利用这些方法或它们的组合，可以从基因、染色体等多个水平检测污染物的遗传毒性效应。

SOS/umu实验(简称umu实验)是1985年由日本学者Oda等根据DNA损伤时诱导SOS反应而表达umuC基因这一基本原理建立并发展起来的检测环境诱变物的短期筛选实验，由于该方法具有可靠、稳定、准确等诸多优势，1998年该方法被国际标准组织(ISO)确定为标准方法(ISO/CD13829)，沿用至今。SOS/umu测试系统是在鼠伤寒沙门氏菌TA 1535中导入携带umuC-LacZ嵌合体的特异性质粒psKl002。umuC基因在正常情况下被LexA基因产物——阻遏蛋白所封闭，一旦环境污染物使细菌的DNA受损，细菌即产生SOS反应，菌体RecA基因产物被激话，成为具有活性的蛋白水解酶，此酶可切除阻遏蛋白，使受封闭的umuC操纵子启动，并带动umuC-LacZ融合基因转录、翻译，表达出有β-半乳糖苷酶活性的融合蛋白。通过检测该酶被诱导的活性，可判断受试物引起DNA损伤的程度。在传统的SOS/umu实验操作中，采用三角瓶作为受试细菌培养的容器，采用96孔板作为暴露、修复、显色等操作的容器，采用8通道移液器作为溶液转移的工具，采用微孔板恒温振荡器作为混合震荡的工具，采用酶标仪作为测定吸光度的工具。但是，这一测试方法在实际测试和推广普及中还存在一定限制，如实验中一次性96孔板、一次性移液头(枪头)等实验耗材的用量大，8通道移液器、微孔板恒温振荡器、酶标仪等仪器设备的价格高，难以普及推广；另外，一次性“塑料”耗材还会增加环境污染负荷。因此，有必要开发一种更为简便、经济、绿色，便于推广的SOS/umu遗传毒性检测方法。

发明内容

本发明的目的是为克服传统SOS/umu遗传毒性检测方法中必须使用大量一次性实验耗材和价格昂贵、普及率不高的仪器等不足，提供一种采用试管、移液管(或单道移液器)、恒温水浴振荡器、可见分光光度计等可重复使用的材料和价廉、普及率高的仪器进行遗传毒性测试的方法，为化学污染物和环境样品遗传毒性测试方法的推广开辟一条新途径。

本发明的目的通过以下方式实现：设计发明出一种专门的试管，利用该试管作为菌液培养、污染物暴露、损伤修复、显色、测试等操作的容器，代替传统方法中使用的96孔板；同时，运用水浴恒温振荡器代替传统方法中价格昂贵的微孔板恒温震荡器，使得溶液的振荡、混合更加充分；将传统方法中溶液、菌液的体积适当放大，采用已灭菌的移液管(或移液器)转移溶液、菌液，也能实现准确转移的目的；运用可见分光光度计代替传统方法中的酶标仪进行吸光度测定。

本发明的优点主要体现在以下几个方面：(1)设计发明了一种专门的试管用于SOS/umu遗传毒性测试；(2)使用试管代替传统方法中的96孔板进行遗传毒性效应的测试，试管可以重复使用，既大大降低了测试成本，也避免了一次性“塑料”孔板的大量使用，更加符合环境保护的理念；(3)使用可见分光光度计代替传统方法中的酶标仪进行测试，可见分光光度计价格便宜，实验室普及率很高，因此，本发明既节省了实验室的建设费用，也便于检测方法的推广普及；(4)使用移液管或单通道移液器代替传统方法中的多通道移液器，降低了实验室的建设费用，减少了“塑料”移液头(枪头)的大量使用，降低了测试成本，也符合环境保护的理念；(5)采用试管作为测试容器，实验过程中可以使用水浴恒温振荡器进行溶液的混合、震荡，代替了传统方法中使用价格昂贵的微孔板恒温振荡器，降低了实验室装备费用，便于方法的推广普及；(6)本发明基本实现了常量化操作，避免了传统方法中微量溶液的移取等操作，降低了对操作人员的技术水平的要求，也便于方法的推广普及。

综上所述，本发明通过设计一种专门的试管，所有实验步骤中都利用该试管作为培养、暴露、修复、显色、测试的容器，采用移液管(或单道移液器)进行溶液转移，采用水浴恒温振荡器进行溶液的混合、震荡，运用可见分光光度计进行吸光度检测，实现对化学污染物、环境样品遗传毒性效应的简便、经济、绿色、准确检测。

附图附表说明

图1.SOS/umu遗传毒性测试用试管示意图

图2.SOS/umu遗传毒性测试用试管详图

图3.本发明实施例的4-硝基喹啉氮氧化物(4-NQO)标准曲线

具体实施方式

实施例：

将0.1毫升菌种接入盛有20毫升培养基的试管，20℃隔夜振荡培养细菌10小时，保留0.1毫升细菌，加入30毫升的培养基和不同浓度(0-60毫摩尔/升)的阳性参考物质4-NQO溶液，在20℃振荡暴露3.5小时，保留1.0毫升暴露液，加入修复溶液4.0毫升，在20℃振荡修复3.5小时，测定并记录595nm处吸光度，加入显色液20毫升，在20℃振荡显色1.5小时，加入反应中止液10毫升，在20℃振荡1.5小时，测定并记录415nm处的吸光度，代入公式计算阳性参考物的遗传毒性大小。

$I_R=\frac{A_{415,T}-A_{415,B}}{A_{415,N}-A_{415,B}}\×\frac{A_{595,N}-A_{595,B}}{A_{595,T}-A_{595,B}}$

式中：

I_R——抑制率

A_595，T——品在595nm处的吸光度

A_595，B——空白在595nm处的吸光度

A_595，N——负对照在595nm处的吸光度

A_415，T——样品在415nm处的吸光度

A_415，B——空白在415nm处的吸光度

A_415，N——负对照在415nm处的吸光度

Claims (9)

1.一种专门针对化学污染物遗传毒性效应的试管测试方法，属于环境检测和评价技术范畴。通过设计发明一种专门的试管，利用该试管进行SOS/umu实验，达到检测化学污染物遗传毒性效应的目标。该方法简便、经济、绿色、准确，需要实验耗材少，无需昂贵的仪器设备，对实验操作技术水平要求不高，便于推广应用。

2.权利要求1所述的一种化学污染物遗传毒性的试管测试方法，其特征在于：设计发明一种专门的试管，用于SOS/umu遗传毒性测试，该试管的材质包括有机玻璃、玻璃、石英、聚四氟乙烯、聚苯乙烯、聚乙烯、聚丙烯等材料。其形状为L型，其中L＝2～10cm，L’＝4～6cm，B＝0.3～6cm，B’＝1～1.5cm，H＝6～10cm，H’＝0.3～6cm，α＝60～120°。

3.权利要求1所述的一种化学污染物遗传毒性的试管测试方法，其特征在于：从受试细菌(鼠伤寒沙门氏菌)的培养，到化学污染物的暴露，到损伤细菌的修复，再到酶的显色和测试等所有步骤，都在试管中完成。实验用试管的材质包括有机玻璃、玻璃、石英、聚四氟乙烯、聚苯乙烯、聚乙烯、聚丙烯等材料。

4.权利要求1所述的一种化学污染物遗传毒性的试管测试方法，其特征还在于：不仅适用于单一化学污染物、复合化学污染物的遗传毒性效应检测，也适用于液态、固态、气态环境样品的遗传毒性效应检测，包括河流、湖泊、水库、工业废水、市政污水、家庭废水、再生水、农田排水、矿山尾水等液体样品，底泥、污泥、土壤、垃圾、生物质等其他固体样品，工厂、居室、办公室等气体样品。

5.权利要求1所述的一种化学污染物遗传毒性的试管测试方法，其特征还在于：所有细菌培养、暴露、修复、显色等过程中的振荡速度在50-2500转/分钟之间。

6.权利要求1所述的一种化学污染物遗传毒性的试管测试方法，其特征还在于：所有细菌培养、暴露、修复、显色等过程中的培养温度在5-40℃之间。

7.权利要求1所述的一种化学污染物遗传毒性的试管测试方法，其特征还在于：受试细菌暴露化学污染物的时间0.5-10小时之间。

8.权利要求1所述的一种化学污染物遗传毒性的试管测试方法，其特征还在于：受试细菌经化学污染物暴露后，受损细菌的修复时间在0-10小时之间。

9.权利要求1所述的一种化学污染物遗传毒性的试管测试方法，其特征还在于：受试细菌经化学污染物暴露、修复后的显色时间在0-5小时之间。

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