CN102296115A - Kit信号相关基因qpcr芯片 - Google Patents
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Abstract
本发明属于生物技术领域，涉及一种用于KIT信号相关基因检测的QPCR芯片。一种KIT信号相关基因QPCR芯片，其特征在于：所述芯片以Akt1、Bcl2、Cbl、Ccnd3、Ccnd3-ps、Csf1、Crk、Ecm1、Fes、Fyn、Grb7、Hras1、Jak1、Kitl、Lyn、Map2k、Matk、Myb、Nr0b2、Ntrk1、Pdgfa、Pik3ca、Ppp1r13b、Prkcc、Raf1、Sh2b2、Shc1、Snai2、Soat1、Stat1、Zhx2基因为检测位点，以Actb为内参。本发明针对现有技术的缺陷及KIT信号研究的实际需求提供一种KIT信号相关基因QPCR芯片，该KIT信号相关基因QPCR芯片可以用于检测KIT信号相关基因表达丰度的变化，还可以根据不同信号通路的要求对个别基因加以修改，具有一定的灵活性，解决了现有的基因芯片针对性差、通量高而价格昂贵的技术缺陷。
Description
技术领域
本发明属于生物技术领域，涉及一种用于KIT信号相关基因检测的QPCR芯片。
背景技术
人KIT原癌基因起源于HZ4猫肉瘤病毒，位于人染色体4q12，在4号染色体长臂中心体周围区域，是白色斑点显性基因的等位基因。在小鼠中该基因位于第5号染色体距着丝粒约42cM处。人类KIT基因组DNA全长大约89kb，包括21个外显子。KIT基因编码的蛋白质被称为KIT或c-kit受体，是一个分子量为145kD的I型跨膜性糖蛋白，属于III型蛋白酪氨酸激酶受体超家族成员，分布于细胞膜表面。其结构类似于巨噬细胞集落刺激因子和血小板源生长因子受体，由胞外结构域、单一跨膜区及胞内酪氨酸激酶区域三部分组成。胞外区包含5个免疫球蛋白样结构域，开始的3个是SCF(干细胞因子)结合区，第4、5个结构域在稳定SCF及诱导KIT受体二聚化方面起重要作用。Broudy等研究发现第5个结构域还与KIT受体从细胞膜上的溶蛋白性裂解有关。胞内部分则包含了由ATP结合区和磷酸转移酶区组成的具有酪氨酸激酶活性的结构域。其配体为肥大细胞生长因子、干细胞生长因子、steel因子等，以分泌型和膜结合型两种方式与KIT受体结合。分泌型可使KIT受体激活、内化、降解；膜结合型则能维持KIT受体较长的激活状态。KIT受体与配体特异性结合可触发其同源二聚化和细胞膜内酪氨酸残基的磷酸化，产生停泊位点，捕获含SH2结构域的信号分子，还能直接激活蛋白激酶C、MAP激酶、Racl、JNK、Raf-1、JAK2等，通过多种信号因子的参与将细胞外的信号转导到细胞内部，引发某些基因的特异性表达。SCF/KIT共同参与多种细胞信号的转导，如：Jak/STAT信号途径、PI3K途径、Src家族激酶途径、Ras/Raf/MEK/ERK信号途径等，是各种底物激酶的酪氨酸磷酸化和丝/苏氨酸激酶磷酸化的整合步骤，并且存在着多种信号转导途径之间的交互作用(cross-talking)，从而精确地调控细胞的增殖和分化。Kit基因突变不仅仅影响黑素细胞的迁徙与分化而导致斑驳病的产生，也会影响原始生殖细胞的发育而导致不孕不育，以及影响造血细胞生成而导致贫血及肥大细胞缺乏等，严重的Kit基因突变还会导致纯合致死，同时，Kit基因是一个重要的原癌基因，Kit基因高表达会导致粒细胞白血病、精原细胞瘤及消化系统间质肿瘤。SCF/KIT共同参与的多种细胞信号转导与上述病变密切相关，这些疾病病理发育过程中相关信号过程的变化是近年来kit信号转导研究中的热点问题。
QPCR(Real-Time Quantitative PCR)在基因表达水平、病原体及产前诊断等方面得到广泛运用。其原理是在PCR指数扩增期间通过连续监测荧光信号强弱的变化即时测定特异性产物的量，并据此推断目的基因的初始量，常用的两种方法为SYBR Green(荧光染料掺入法)和Taqman probe(探针法)。SYBR Green荧光染料特异性地掺入DNA双链后，发射荧光信号。荧光染料的优势在于它能监测任何dsDNA序列的扩增，不需要探针的设计，使检测方法变得简便，同时也降低了检测的成本。然而正是由于荧光染料能和任何dsDNA结合，因此它也能与非特异的dsDNA(如引物二聚体)结合，使实验容易产生假阳性信号。引物二聚体的问题目前可以用带有熔解曲线(melting curve)分析的软件加以解决。相关论文最早发表于1996年，随后在实验方法、仪器设备上进行了一系列改善，已经在科研和临床诊断领域得到了越来越广泛的应用。近年来，对于荧光定量PCR的要求越来越规范化。从RNA的提取→RNA完整性和纯度的鉴定→逆转录→反应体系的优化→最后的数据分析都有一套严格的标准，从而增加了荧光定量PCR结果的可靠程度，也使实验的可重复性得到提高。QPCR芯片是在仪器设备更新的基础上发展起来的，将近百个或数百个QPCR反应设计在一块板子上同时进行扩增，以检测相关基因的表达丰度。
基因芯片是“高通量”现代生物技术的标志，其原理是基于核酸分子杂交，用荧光染料标记样本DNA或cDNA，与基因芯片杂交，经激光共聚焦荧光显微镜检出杂交信号，通过计算机处理、分析，得到所需信息。突出特点在于高通量、微型化和自动化。但它存在三个方面的缺点：1、费用高；2、难以检测低丰度表达的基因；3、偏重高通量(一次检测上万个甚至几万个基因)，缺少针对如皮肤、海马组织或某种肿瘤等特定组织类型的表达“芯片”。
与基因芯片相比，QPCR芯片的通量显著减低，一次至多检测96个或384个基因，基本相当于基因芯片通量的1％，但是QPCR芯片的扩增对象经过仔细选择，是某一组织或病变类型高度相关的基因，更便于数据的分析处理，检测基因还可以随研究需要加以改动，便于操作，而且价格低廉。基因芯片和QPCR芯片的原理不同，但对于基因表达谱而言，他们的检测对象(mRNA或cDNA)到实验结果(表达丰度)，QPCR芯片与基因芯片都高度一致，许多研究者都把这两种方法作为互相印证的手段，而对于几十个甚至几百个基因的表达丰度检测，QPCR技术完全可以取代基因芯片。计算机预测是将基因表达水平的数据与分子信号过程进行联系的关键步骤，广泛运用的软件是PathwayStudio。根据基因表达量的变化，计算机结合已知信号通路的信息，将“宏观表型”与分子信号过程结合。由于这一软件预测的基础是已知信号过程，并不能预测新的未知信号过程，所以对基因芯片的海量数据的利用率有限。而在QPCR芯片的设计过程中，研究者依据已知的信号过程选择检测对象，尽管选择的基因总数不多，但可能都是预测软件的参考基因，同样会得到较好的结果。也就是说，被检测基因的“质量”而不是基因信息的通量才是信号通路预测的关键。
发明内容
本发明针对现有技术的缺陷及KIT信号研究的实际需求提供一种KIT信号相关基因QPCR芯片，该KIT信号相关基因QPCR芯片可以用于检测KIT信号相关基因表达丰度的变化，还可以根据不同信号通路的要求对个别基因加以修改，具有一定的灵活性，解决了现有的基因芯片针对性差、通量高而价格昂贵的技术缺陷。
本发明的上述技术问题是通过以下技术方案得以实施的：
一种KIT信号相关基因QPCR芯片，其特征在于：所述芯片以Akt1、Bcl2、Cbl、Ccnd3、Ccnd3-ps、Csf1、Crk、Ecm1、Fes、Fyn、Grb7、Hras1、Jak1、Kitl、Lyn、Map2k、Matk、Myb、Nr0b2、Ntrk1、Pdgfa、Pik3ca、Ppp1r13b、Prkcc、Raf1、Sh2b2、Shc1、Snai2、Soat1、Stat1、Zhx2基因为检测位点，以Actb为内参，以以下32个基因的上游引物和下游引物为基础检测特定基因的表达水平：
作为优选，所述32个基因的上游引物和下游引物分别放置在同一块96孔板的各孔内，每个基因做3个复孔。
作为优选，32个基因的上游引物和下游引物分别放置在同一块384孔板的各孔内，每个基因做3个复孔，每块板检测4个标本。
发明人筛选出55个与KIT/SCF通路相关的信号分子，对包括内参Actb在内的56个基因进行引物设计，以新生C57BL/6J(简称B6)小鼠皮肤cDNA为模板验证每一基因QPCR扩增的特异性。发现GFP、Lat2、Matk、Plcg1、Stat5a基因不能有效扩增，Ptpn6基因熔解曲线产物峰之前有引物二聚体峰，不适合于下游的QPCR工作。在此基础上，从剩余的49个基因中选取出扩增特异性较好的31个基因(Akt1、Bcl2、Cbl、Ccnd3、Ccnd3-ps、Csf1、Crk、Ecm1、Fes、Fyn、Grb7、Hras1、Jak1、Kitl、Lyn、Map2k、Matk、Myb、Nr0b2、Ntrk1、Pdgfa、Pik3ca、Ppp1r13b、Prkcc、Raf1、Sh2b2、Shc1、Snai2、Soat1、Stat1、Zhx2)与内参一起，每个基因做3个复孔，在同一块96孔板上同时进行QPCR扩增。最终，每一基因均获得了理想的CT值，成功制备了针对KIT信号相关基因的QPCR芯片。QPCR芯片就是将所要检测的几十甚至上百个基因整合到同一块QPCR反应板上进行扩增，检测相关基因的表达丰度，观察这些基因的表达变化情况。
本实验所研制出的KIT信号相关基因QPCR芯片是将与KIT信号相关的32个基因整合到一块96孔反应板上，用于检测其表达丰度的变化，该“芯片”还可以根据不同信号通路的要求对个别基因加以修改，具有一定的灵活性。不仅可以用于对人类斑驳病的分子研究，还可以用于与SCF/KIT信号通路相关的一系列疾病的研究。
与基因芯片相比，本发明的KIT信号相关基因QPCR芯片具有以下优势：1、费用低；2、所涉及基因是针对某一信号通路或某一组织设计而成的，具有一定的特异性；3、操作及数据分析相对简单。
附图说明
图1是候选基因的QPCR扩增结果图，其中A：候选基因的熔解曲线；B：Ptpn6基因的熔解曲线。
图2是部分基因的凝胶电泳图。
图3是QPCR芯片示意图。
具体实施方式
以下是本发明的具体实施例；这些实施例可以对本发明作进一步的补充和说明；但本发明并不限于这些实施例。
以下实施例中所使用的技术，除非特别说明，均为本领域的技术人员已知的常规技术；所使用的仪器设备、试剂等，除非是本说明书特别说明，均为本领域的研究和技术人员可以通过公共途径获得的。
1.实验材料
a、实验动物及饲养环境
本实验所使用的B6小鼠为清洁级，由杭州师范大学实验动物中心提供，实验动物生产许可证：SCXK(浙)2005-0020，使用许可证：SCXK(浙)2005-0071。
实验所用的动物饲养在屏障动物房内，温度控制在(23+2)℃，湿度控制在(55±5)％，饲料采用Co60照射，自由采食和饮水，定期更换笼具、垫料(均经高温消毒)，室内照明采用12/12h明暗交替。
b、主要仪器和设备
动物饲养设备：苏杭实验动物设备厂，
电热恒温水浴锅：上海精宏实验设备有限公司，型号DKS-22，
离心机：Thermo公司；BECKMAN公司，
核酸蛋白测定仪：美国基因有限公司，型号ND-2000，
荧光定量PCR仪：ABI公司，型号7300RT，
电泳仪：北京市六一仪器厂，DYY-III8B型，
凝胶成像系统：天能科技(上海)有限公司，型号GIS-2008。
c、主要试剂
DEPC：BBI，
引物：上海生工生物工程有限公司，
SYBR Green：ABI公司，
DL2000DNA Marker：大连宝生物工程有限公司，
GoldviewTM核酸染料：北京赛百盛基因技术有限公司，
RNAprep pure动物组织总RNA提取试剂盒：TIANGEN生物公司，
RevertAidTM First Strand cDNA Synthesis Kit：Fermentas。
d、主要试剂的配置
DNase I储存液：将DNase I干粉(1500U)溶解在550μl RNase-free ddH2O中，轻柔混匀，分装后-20℃保存。
DEPC水：1000ml的ddH2O中加入1ml DEPC，摇床震荡过夜，次日连续高压两次。
2.1引物的设计与合成
通过查阅大量的文献，寻找到55个与KIT信号通路相关的基因，用ABI公司的PrimerExpress 3.0软件设计相关引物，基因名称及引物序列见表1。
表1 KIT信号通路相关基因及其引物
2.2RNA的提取及逆转录
1)取新生B6小鼠皮肤组织10-20mg置于玻璃匀浆器中，每个玻璃匀浆器中加400μL裂解液(操作前在裂解液中加入β-巯基乙醇至终浓度1％)，充分研磨组织。吸取研磨好的组织匀浆300μl至1.5ml EP管中，随后向匀浆液中加入590μl RNase-free ddH2O和10μl蛋白酶K，混匀后56℃处理10-20min。
2)12000rpm离心2-5min，取上清进行以下操作。
3)缓慢加入0.5倍上清体积无水乙醇，混匀(此时可能会出现沉淀)，得到的溶液和沉淀一起转入吸附柱CR3中(吸附柱放在收集管中)，12000rpm离心30-60s，弃掉收集管中的废液，将吸附柱放回收集管中。
4)向吸附柱CR3中加入350μl去蛋白液RW1，12000rpm离心30-60s，弃废液，将吸附柱放回收集管中。
5)取10μl DNA I储存液放入新的RNase-free离心管中，加入70μl ROD溶液，轻柔混匀。
6)向吸附柱CR3中央加入80μl的DNase I工作液，室温放置15min。
7)向吸附柱CR3中加入350μl去蛋白液RW1，12000rpm离心30-60s，弃废液，将吸附柱放回收集管中。
8)向吸附柱CR3中加入500μl漂洗液RW(使用前加入乙醇)，室温静置2min，12000rpm离心30-60s，弃废液，将吸附柱CR3放回收集管中。
9)重复步骤8。
10)12000rpm离心2min，倒掉废液，将吸附柱CR3置于室温放置数分钟，以彻底晾干吸附材料中残余的漂洗液。
注意：此步骤的目的是将吸附柱CR3中残余的漂洗液去除，漂洗液的残留可能会影响后续的RT等实验。
11)将吸附柱CR3转入一个新的RNase-free离心管中，向吸附膜的中央部位悬空滴加30-100μl RNase-free ddH2O，室温放置2min，12000rpm离心2min，得到RNA溶液。注意：洗脱缓冲液的体积不应少于30μl，体积过小影响回收效率。
12)将提取好的RNA用核酸蛋白测定仪测定其浓度及纯度，电泳测定其完整性。
13)将RNA逆转录成cDNA
步骤1：模板RNA 6ug
引物(Oligo(dT)18Primer) 3μl
补足DEPC水至36μl，混合后65℃孵育5min置于冰上
步骤2：5×reaction buffer 12μl
10mM dNTP mix 6μl
RibolockTM RNase Inhibitor 3μl
混合均匀后加入步骤1的液体中，37℃孵育片刻，后加入Revert AidTM M-MulVReverse Transeptase 3μl，轻柔混合后42℃孵育60min，70℃5min终止反应，4℃保存。
RNA鉴定结果
核酸蛋白测定仪测得RNA OD260/280比值为2.08，说明RNA纯度较好。RNA琼脂糖凝胶电泳可见28S和18S两条带，说明RNA完整性尚可。
2.3以cDNA为模板，QPCR验证所设计的引物
QPCR扩增用25μl反应体系：
QPCR反应程序：
QPCR扩增结果
以B6小鼠cDNA为模板，56对引物分别进行扩增，QPCR结果显示：所有基因均能扩增，但GFP、Lat2、Matk、Plcg1、Stat5a基因CT值较大，说明这些基因表达量相对较低，故不作为最佳候选基因。所扩增出产物应单一，即熔解曲线为单一峰(见图1A)；而Ptpn6基因产物峰前面还有引物二聚体峰(见图1B)，故不可用。
2.4QPCR产物电泳
2％琼脂糖凝胶的制备：1.0g琼脂糖，加入1×TAE缓冲液50ml，置250ml烧瓶中，微波炉中加热、溶解，溶液冷却到60℃左右，加入GoldviewTM核酸染料至终浓度0.5μg/ml，充分混匀后倒入装有梳子的两端封好的电泳平板中，在凝胶完全凝固后，移去梳子，将凝胶放入电泳槽中。加入恰好没过胶面约1mm深的足量1×TAE缓冲液。
在微型离心管中加入样品，一定量的6×上样缓冲液，混匀后用微量移液器将混合物加至样品槽中，中间泳道加入DL2000DNAMarker，以100V电压电泳40min。电泳结束后，在紫外灯下观察结果。
将部分基因的QPCR产物电泳，除Ptpn6基因可见少量引物二聚体外，其余基因均为100bp左右的单一条带(见图2)，该结果和QPCR结果相吻合。图2中，从左向右依次为：Mapk3、Myc、Nr0b2、Pdgtb、Pdgfc、Snai2、Stat1、Cbl、Ccnd3-ps、Stat5a、Crk1、Jak1、MarkerDL 2000、Hras1、GFP、Jak3、Fes、Myb、Pdgfd、Kitl、Ptpn6、Prkcc、Sh2b2、Src、Stat3。
2.5制成QPCR芯片
选取包括内参在内的32个基因，每个做3个复孔，将它们放在同一块96孔板(即QPCR芯片)上同时扩增，如图3所示。
QPCR芯片中各基因CT值
以新生B6小鼠皮肤cDNA为模板，同时扩增32对引物，每个做3个复孔，QPCR结果示：各基因均扩增良好，熔解曲线为单一峰，各基因CT值见表2。
表2各基因CT值
本发明可以用于一切小鼠组织细胞来源的、与kit基因相关的研究，如斑驳病、睾丸与卵巢等生殖腺发育不全、大红细胞贫血、肥大细胞缺乏症等Kit基因功能低下导致的疾病，也可以用于Kit基因功能亢进导致的粒细胞性白血病、黑色素瘤、精原细胞瘤、消化道间质瘤等的信号机制研究。只需要将病变组织细胞的mRNA提取反转录，就可以直接采用本发明方法检测。
本发明中所描述的具体实施例仅仅是对本发明精神作举例说明。本发明所属技术领域的技术人员可以对所描述的具体实施例做各种各样的修改或补充或采用类似的方式替代，但并不会偏离本发明的精神或者超越所附权利要求书所定义的范围。
尽管对本发明已作出了详细的说明并引证了一些具体实例，但是对本领域熟练技术人员来说，只要不离开本发明的精神和范围可作各种变化或修正是显然的。
Claims (3)
1.一种KIT信号相关基因QPCR芯片，其特征在于：所述芯片以Akt1、Bcl2、Cbl 、Ccnd3、Ccnd3-ps、Csf1、Crk、Ecm1、Fes、Fyn、Grb7、Hras1、Jak1、Kitl、Lyn、Map2k、Matk、Myb、Nr0b2、Ntrk1、Pdgfa、Pik3ca、Ppp1r13b、Prkcc、Raf1、Sh2b2、Shc1、Snai2、Soat1、Stat1、Zhx2基因为检测位点，以Actb为内参，以以下32个基因的上游引物和下游引物为基础检测特定基因的表达水平：
。
2. 根据权利要求1所述的一种KIT信号相关基因QPCR芯片，其特征在于：所述 32个基因的上游引物和下游引物分别放置在同一块96孔板的各孔内，每个基因做3个复孔。
3.根据权利要求1所述的一种KIT信号相关基因QPCR芯片，其特征在于：32个基因的上游引物和下游引物分别放置在同一块384孔板的各孔内，每个基因做3个复孔，每块板检测4个标本。
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