CN102292104A - 用于诱导抗金黄色葡萄球菌的保护性免疫应答的多肽 - Google Patents

Abstract

本发明公开了包含与SEQIDNO：1结构上相关的氨基酸序列的多肽，以及这种多肽和其组合物的用途。SEQIDNO:1是全长金黄色葡萄球菌序列。发现含有氨基末端组氨酸标记物的SEQIDNO:1的衍生物产生抗金黄色葡萄球菌的保护性免疫应答。

Description

用于诱导抗金黄色葡萄球菌的保护性免疫应答的多肽

相关申请的交叉引用

本申请要求2008年11月26日提交的美国临时申请No. 61/200,308的权益，该申请通过引用并入本文。

发明背景

金黄色葡萄球菌("S. aureus")是负责许多疾病和状况的细菌病原体。尽管金黄色葡萄球菌通常在健康人的鼻和皮肤中建群，通常仅仅导致较小的感染（如丘疹、疖），但它也能导致全身感染。由金黄色葡萄球菌导致的疾病和状况的实例包括菌血症、感染性心内膜炎、毛囊炎、疖、痈、脓疱病、大疱性脓疱病、蜂窝织炎、botryomyosis、毒性休克综合征、烫伤皮肤综合征、中枢神经系统感染、感染性和炎性眼病、骨髓炎以及关节和骨的其它感染，以及呼吸道感染(The Staphylococci in Human Disease, Crossley and Archer (eds.), Churchill Livingstone Inc. 1997; Archer, 1998, Clin. Infect. Dis. 26:1179-1181)。

通常，粘膜和表皮屏障提供抗金黄色葡萄球菌感染的保护；但是，由于损伤（如烧伤、创伤或手术程序）导致的这些天然屏障的打断和损害免疫系统的疾病（如糖尿病、末期肾疾病、癌症）都显著增加感染的风险。机会性金黄色葡萄球菌感染可以变得非常严重，通常导致严重的发病率或死亡率。

在20世纪60年代引入的甲氧苯青霉素很大程度克服了金黄色葡萄球菌的青霉素抗性的问题。但是，在金黄色葡萄球菌中出现了甲氧苯青霉素抗性，以及对很多有效抗该生物的其它抗生素（如氨基糖苷类、四环素、氯霉素、大环内酯类和林可胺类(Lincosamides)）的抗性。甲氧苯青霉素抗性金黄色葡萄球菌(MRSA)成为世界范围内最重要的医源性病原体之一，并且具有严重感染控制问题。

可以采用基于免疫学的策略来控制金黄色葡萄球菌感染和金黄色葡萄球菌的传播。基于免疫学的策略包括被动和主动免疫。被动免疫采用靶定金黄色葡萄球菌的免疫球蛋白。主动免疫诱导抗金黄色葡萄球菌的免疫应答。

潜在的金黄色葡萄球菌疫苗靶定金黄色葡萄球菌多糖和多肽。可以用作可能的疫苗成分的多糖的实例包括金黄色葡萄球菌5型和8型荚膜多糖(Shinefield et al., 2002, N. Eng. J. Med. 346:491-496)。可以用作可能的疫苗成分的多肽的实例包括胶原蛋白粘附素、纤维蛋白原结合蛋白和聚集因子(Mamo et al., 1994, FEMS Immunol. Med. Mic. 10:47-54; Nilsson et al., 1998, J. Clin. Invest. 101:2640-2649; Josefsson et al., 2001, J. Infect. Dis. 184:1572-1580)。

已经从金黄色葡萄球菌基因组测序获得了关于金黄色葡萄球菌多肽序列的信息(Kuroda et al., 2001, Lancet 357:1225-1240; Baba et al.,2000, Lancet 359:1819-1827; Kunsch et al.,European Patent Publication EP 0 786 519, published July 30, 1997)。在某种程度上，已经采用了生物信息学，从而尝试表征从基因组测序获得的多肽序列（参见，例如上文引用的EP 0 786 519）。

已经使用了诸如涉及展示技术和来自受感染患者的血清的那些技术，从而尝试帮助鉴定编码潜在抗原的基因（例如，参见2001年12月27日公开的Foster等人的PCT国际公开号WO 01/98499; 2002年8月1日公开的Meinke 等人的PCT国际公开号WO 02/059148; Etz et al.,2002, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 99:6573-6578）。

发明概述

本发明公开了包含与SEQ ID NO：1结构上相关的氨基酸序列的多肽，以及这种多肽在生产药物组合物中的用途，所述组合物提供抗金黄色葡萄球菌感染的保护性免疫应答。SEQ ID NO: 1所示的氨基酸序列代表在本文中称作SACOL0912的金黄色葡萄球菌抗原的全长蛋白序列。发现具有SEQ ID NO: 2所示的氨基酸序列、含有NH₂-末端组氨酸标记物("his-tag")的SEQ ID NO: 1的衍生物在金黄色葡萄球菌感染的动物模型中产生抗金黄色葡萄球菌的保护性免疫应答。

本发明描述了包含一种氨基酸序列的多肽，所述氨基酸序列具有对SEQ ID NO: 1所示氨基酸序列的最多八个（8个）氨基酸改变。在一个实施方案中，所述多肽免疫原不由SEQ ID NO: 1和/或SEQ ID NO: 6组成。所述多肽可以用作免疫原，其中提及“免疫原”，表示该多肽提供抗金黄色葡萄球菌的保护性免疫的能力，所述金黄色葡萄球菌包括但不限于表达SEQ ID NO: 1的金黄色葡萄球菌菌株。

当在本文描述的多肽、免疫原和/或治疗方法的上下文中使用时，提及“保护性”免疫或免疫应答表示可检测水平的抗金黄色葡萄球菌感染的保护作用。这包括降低金黄色葡萄球菌感染或获得由所述感染导致的病症的可能性，以及降低感染和/或由所述感染导致的病症的严重程度的治疗和/或预防措施。因此，保护性免疫应答包括，例如，降低细菌负荷、改善与所述细菌感染相关的一种或多种病症或症状，和/或延迟由金黄色葡萄球菌感染导致的疾病进展的开始的能力。

可以用动物模型，如本文描述的那些动物模型来评估保护作用水平。例如，本文描述的某些多肽在鼠、致死攻击模型和大鼠、留置导管、亚致死攻击模型中都提供了保护作用。

“病症”是全部或部分由金黄色葡萄球菌感染导致的任何状况。

提及包含一种氨基酸序列，所述氨基酸序列具有对SEQ ID NO: 1所示氨基酸序列的最多八个（8个）氨基酸改变，表示存在SEQ ID NO: 1相关区域，并且可能存在或不存在另外的多肽区域。每个氨基酸改变独立地是氨基酸取代、缺失或添加。

本发明的另一方面描述了包含SEQ ID NO: 1相关多肽和与该多肽共价连接的一个或多个另外的区域或部分的免疫原，其中每个区域或部分独立地选自具有至少一种以下特性的区域或部分：增强免疫应答、促进纯化或促进多肽稳定性。在一个实施方案中，SEQ ID NO: 1相关多肽由一种氨基酸序列组成，所述氨基酸序列具有对SEQ ID NO: 1所示氨基酸序列的最多八个（8个）氨基酸改变。在一个另外的实施方案中，包含在该免疫原内的SEQ ID NO: 1相关多肽提供抗金黄色葡萄球菌的保护性免疫，所述金黄色葡萄球菌包括但不限于表达SEQ ID NO: 1的金黄色葡萄球菌菌株。另外的区域或部分可以是，例如，另外的多肽区域或非肽区域。

关于例如多肽提及“纯化的”或“基本上纯化的”，表示所述多肽存在于一种环境中，所述环境中缺乏与所述多肽天然相关和/或代表存在的总蛋白的至少约10%的一种或多种其它多肽。

提及 “分离的”，表示与自然中存在的形式不同的形式。所述不同的形式可以是例如，与自然中存在的纯度不同的纯度，和/或自然中不存在的结构。自然中不存在的结构包括例如具有组合在一起的不同区域的重组结构。

在本文可互换使用的术语“蛋白”或“多肽”表示连续的氨基酸序列，并且不提供最小或最大的大小限制。蛋白中存在的一个或多个氨基酸可以含有翻译后修饰，如糖基化或二硫键形成。

本发明的另一方面描述了能在患者中诱导抗金黄色葡萄球菌的保护性免疫的组合物。所述组合物包含药学可接受的载体和免疫学有效量的本文描述的多肽或免疫原。所述多肽或免疫原可以提供抗表达SEQ ID NO: 1的多肽的金黄色葡萄球菌菌株的保护性免疫。

关于多肽、免疫原或其组合物的术语“免疫学有效量”表示足够的量，其使得当引入患者时产生足够水平的预期的多肽或免疫原，导致抗金黄色葡萄球菌的免疫应答。本领域技术人员认识到该水平可以改变。该量应该足以显著预防金黄色葡萄球菌感染和/或降低金黄色葡萄球菌感染的可能性或严重性。

本发明的另一个方面描述了包含重组基因的核酸分子，所述重组基因编码产生抗金黄色葡萄球菌的免疫应答的多肽。重组基因含有重组核酸分子，其中所述核酸分子的所述核苷酸序列编码多肽以及用于适当的转录和加工的调节元件（其可以包括翻译和翻译后元件）。重组基因可以独立于宿主基因组存在，或可以是宿主基因组的部分。

所述核酸分子可以是表达载体。优选地，表达载体也含有用于在宿主细胞中自主复制的复制起点、选择标记、有限数目的有用的限制酶位点和高拷贝数目的潜能。

术语“核酸”或“核酸分子”是指核糖核酸(RNA)或脱氧核糖核酸(DNA)。

重组核酸分子是其序列和/或形式在自然中不存在的核酸分子。重组核酸分子的实例包括纯化的核酸、组合在一起提供与自然中存在的核酸不同的核酸的两个或更多个核酸区域，以及天然彼此相关的一个或多个核酸区域（例如，上游或下游区域）的缺乏。

本文还描述了重组细胞。所述重组细胞包含重组基因，所述重组基因编码提供抗金黄色葡萄球菌的保护性免疫应答的多肽。重组细胞可以用于制备所述重组基因编码的多肽，本文也描述了制备方法。该方法包括使包含编码所述多肽的重组核酸的重组细胞生长，并且纯化所述多肽。

本发明的另一方面描述了提供抗金黄色葡萄球菌的保护性免疫应答的多肽，所述多肽通过包括以下步骤的方法制备：在宿主中使含有编码所述多肽的重组核酸分子的重组细胞生长并纯化所述多肽。可以采用不同的宿主细胞。

本发明还提供了对患者进行抗金黄色葡萄球菌感染治疗的方法。所述方法包括在患者中诱导抗金黄色葡萄球菌感染的保护性免疫应答。术语“治疗”是指治疗性治疗和预防性措施这两者。需要治疗的患者包括已经有感染的那些，以及倾向于患感染的那些，或感染可能性正在降低的那些。

另外的实施方案包括免疫学有效量的SEQ ID NO: 1相关多肽或其免疫原在制备用于诱导患者中抗金黄色葡萄球菌感染的保护性免疫应答的药物中的用途。

除非特定的术语互相排斥，提及“或”，表示之一或两者的可能性。有时，短语例如“和/或”被用于突出显示之一或两者的可能性。

提及开放式的术语例如“包含”，允许另外的要素或步骤。有时，短语例如“一个或多个”与或不与开放式术语一同使用来突出显示另外的要素或步骤的可能性。

除非明确地指出，提及术语例如“一个”、“一种”或“该”，不局限于一，并且包括复数形式，除非上下文明确指出另外的意思。例如，“一个细胞”不排除“多个细胞”。有时，短语例如一个或多个被用于突出显示可能存在复数形式。

从本文提供的包括不同实施例的另外的描述，本发明的其它特征和益处是明显的。提供的实施例举例说明了在实施本发明中有用的不同成分和方法。实施例不限制所要求保护的发明。根据本公开内容，本领域技术人员可以鉴定和采用对于实施本发明有用的其它成分和方法。

附图简述

图1图解了SEQ ID NO: 2的氨基酸序列。加下划线的部分代表SEQ ID NO: 1的实质部分，仅仅缺乏SEQ ID NO: 1的起始甲硫氨酸。氨基末端不加下划线的区域是组氨酸标记物区。

图2图解了SEQ ID NO: 1的氨基酸序列。

图3图解了编码SEQ ID NO: 2的核酸序列(SEQ ID NO: 3)。编码氨基末端组氨酸标记物的部分加下划线。

图4A（实验1）和B（实验2）图解了来自两个攻击实验的结果，所述实验使用羟基磷酸铝佐剂中的SEQ ID NO: 2多肽（实线）或使用单独的佐剂（虚线）。

发明详述

下文提供的实施例中用SEQ ID NO: 2举例说明了SEQ ID NO: 1相关多肽提供抗金黄色葡萄球菌感染的保护性免疫的能力。SEQ ID NO: 2是SEQ ID NO: 1的衍生物，其含有氨基末端组氨酸标记物。该组氨基酸标记物促进多肽纯化和鉴定。

与SEQ ID NO: 1结构上相关的多肽包括这样的多肽：其含有存在于不同金黄色葡萄球菌菌株中的对应区域和天然存在的区域的衍生物。SEQ ID NO: 1的氨基酸序列图解于图2中。图1中图解了SEQ ID NOs: 1和2所示氨基酸序列之间的关系。

I. SACOL0912 (SEQ ID NO: 1) 序列

金黄色葡萄球菌SACOL0912是保守的、表面表达的蛋白。SACOL0912具有SEQ ID NO: 1所示的氨基酸序列。该序列在目前已经测序过的13种金黄色葡萄球菌菌株之间是保守的。表1列出了所述13种金黄色葡萄球菌菌株、它们的对应NCBI GenBank登记号（修订版本和最初的提交编号），以及每种基因组序列的提交者。

表1:

GenBank 登记号YP_416263公开了SACOL0912相关序列，其代表通过对金黄色葡萄球菌RF122菌株测序而鉴定的假定蛋白，其在第18位残基具有与SEQ ID NO: 1的一个氨基酸差异，在本文示为SEQ ID NO: 6。

可以基于与已知SACOL0912序列相比的高度序列相似性或连续氨基酸的存在，鉴定其它天然存在的SACOL0912序列。连续氨基酸提供了特征性标记物。在不同的实施方案中，天然存在的SACOL0912序列是存在于葡萄球菌属，优选金黄色葡萄球菌中的序列，其具有SEQ ID NO: 1中的至少20个、至少30个或至少50个连续氨基酸；和/或与SEQ ID NO: 1具有至少87%的序列相似性或同一性。

可以通过本领域公知的不同算法和技术确定与参照序列的序列相似性百分比（也称作同一性百分比）。通常，通过以下步骤确定序列相似性：首先将多肽序列与参照序列比对，以获得最大氨基酸同一性，允许序列之一中存在空位、添加和取代，然后确定对应区域中的相同氨基酸的数目。用该数目除以参照序列（如SEQ ID NO: 1）中的氨基酸总数，乘以100，然后四舍五入到最接近的整数。

II. SEQ ID NO: 1 相关多肽

SEQ ID NO: 1相关多肽含有与SEQ ID NO: 1具有至少87%同一性的氨基酸序列。提及“多肽”，不提供最小或最大的大小限制。本发明的SEQ ID NO: 1相关多肽提供抗金黄色葡萄球菌感染的保护性免疫，所述金黄色葡萄球菌包括但不限于表达SEQ ID NO: 1的金黄色葡萄球菌菌株。

含有对SEQ ID NO: 1的八个（8个）氨基酸改变的多肽与SEQ ID NO: 1具有大约87%的同一性。每个氨基酸改变独立地是氨基酸取代、缺失或添加。在不同的实施方案中，SEQ ID NO: 1相关多肽与SEQ ID NO: 1具有至少90%、至少94%、至少98%或至少99%的同一性；或与SEQ ID NO: 1的差别在于1、2、3、4、5、6、7或8个氨基酸改变。在一个实施方案中，SEQ ID NO: 1相关多肽不是SEQ ID NO: 1。在另一个实施方案中，SEQ ID NO: 1相关多肽不是SEQ ID NO: 6。

在本发明的另一方面，所述多肽包含SEQ ID NO: 1相关序列或基本上由SEQ ID NO: 1相关序列组成，所述SEQ ID NO: 1相关序列具有对SEQ ID NO: 1所示氨基酸序列的两个（2个）至八个（8个）氨基酸改变。

本发明的SEQ ID NO: 1相关多肽的实例包括这样的多肽：其包含SEQ ID NO: 1的以下氨基酸部分或基本上由SEQ ID NO: 1的以下氨基酸部分组成：氨基酸5-60、氨基酸9-64、氨基酸1-56、氨基酸4-59、氨基酸8-63、氨基酸2-57、氨基酸3-58、氨基酸7-62和氨基酸6-61。可以存在的另外的氨基酸包括另外的SEQ ID NO: 1 氨基酸或其它氨基酸区域。优选的另外的氨基酸是氨基末端甲硫氨酸。

提及“基本上由”指出的氨基酸“组成”，表示存在所提及的氨基酸并且可能存在另外的氨基酸。另外的氨基酸可以是在羧基或氨基末端。在不同的实施方式中，存在1、2、3、4、5、6、7或8个另外的氨基酸。

可以对本文描述的SEQ ID NO：1相关多肽进行改变，用于获得诱导抗金黄色葡萄球菌的保护性免疫的衍生物。可以进行改变，例如，用于获得保留了诱导抗金黄色葡萄球菌的保护性免疫的能力的衍生物，或用于获得除了提供保护性免疫之外还具有可以实现特定目的的区域的衍生物。

可以考虑对不同的SACOL0912序列和氨基酸的已知性质这两者进行改变。一般地，在取代不同氨基酸以保留活性时，优选的是交换具有相似性质的氨基酸。对于氨基酸取代，可以考虑的因素包括氨基酸大小、电荷、极性和疏水性。例如，用缬氨酸取代亮氨酸、用精氨酸取代赖氨酸或用天冬酰胺取代谷氨酰胺，代表了不诱导多肽功能改变的良好候选物。不同的氨基酸R基团对氨基酸性质的影响是本领域公知的。（参见，例如，Ausubel，Current Protocols in Molecular Biology，John Wiley，1987-2002，附录1C.）

实现特定目的的改变包括被设计以促进多肽的生产或效力；或被编码的核酸的克隆的那些。通过使用适合于重组表达的起始密码子（例如，编码甲硫氨酸）可以促进多肽生产。甲硫氨酸稍后可以在细胞加工期间被除去。例如，通过引入可伴随有氨基酸添加或改变的限制位点，可以促进克隆。

多肽诱导保护性免疫应答的效力可以通过表位增强来改善。表位增强可以使用不同的技术进行，例如，涉及改变锚定残基来改善对MHC分子的肽亲和力的那些以及提高肽-MHC复合物对T细胞受体的亲和力的那些(Berzofsky et al., 2001, Nature Review 1:209-219)。

优选地，所述多肽是纯化的多肽。“纯化的多肽”存在于缺少与其天然相关和/或占存在的总蛋白的至少约10%的一种或多种其它多肽的环境中。在不同的实施方式中，纯化的多肽占样品或制品中总蛋白的至少约50%、至少约75%或至少约95%。

在一个实施方式中，多肽是“基本上纯化的”。基本上纯化的多肽存在于缺少与所述多肽天然相关的所有或大多数其它多肽的环境中。例如，基本上纯化的金黄色葡萄球菌多肽存在于缺少所有或大多数其它金黄色葡萄球菌多肽的环境中。环境可以是，例如，样品或制品。

提及“纯化的”或“基本上纯化的”不需要多肽经历任何纯化，并且可以包括，例如，没有被纯化的化学合成的多肽。

多肽稳定性可以通过修饰多肽羧基或氨基末端来增强。可能的修饰的实例包括氨基末端保护基团，例如，乙酰基、丙基、琥珀酰基、苄基、苄氧基羰基或叔-丁氧基羰基；和羧基末端保护基团，例如酰胺、甲酰胺和乙酰胺。

在本发明的一个实施方式中，本文描述的多肽是免疫原的部分，所述免疫原含有与所述多肽共价连接的一个或多个另外的区域或部分，其中每个区域或部分独立地选自具有至少一种以下性质的区域或部分：增强免疫应答，促进纯化或促进多肽稳定性。例如，使用可以存在于氨基或羧基末端上的基团如聚乙二醇，可以增强多肽稳定性。所述另外的区域或部分可以通过蛋白的羧基末端、氨基末端或内部区域共价连接于多肽。

多肽纯化可以通过向羧基或氨基末端添加基团以促进纯化来增强。可用来促进纯化的基团的实例包括提供亲和标记物的多肽。亲和标记物的实例包括六组氨酸标记物、trpE、谷胱甘肽和麦芽糖结合蛋白。

可以使用通常增强免疫应答的基团来改进多肽产生免疫应答的能力。可以与多肽连接用于增强抗所述多肽的免疫应答的基团的实例包括细胞因子，例如IL-2(Buchan et al.,2000, Molecular Immunology 37:545-552)。

III. 多肽生产

可以使用标准技术来生产多肽，所述技术包括涉及化学合成的那些和涉及从产生所述多肽的细胞纯化的那些。多肽的化学合成的技术是本领域公知的。（参见，例如，Vincent，Peptide and Protein Drug Delivery，New York，N.Y.，Decker，1990.）重组多肽生产和纯化的技术也是本领域公知的。（参见，例如，Ausubel，Current Protocols in Molecular Biology，John Wiley，1987-2002.）

通过使用重组核酸技术来生产多肽，促进了从细胞获得多肽。用于生产多肽的重组核酸技术包括在细胞中导入或生产编码所述多肽的重组基因并表达所述多肽。

重组基因含有编码多肽的核酸以及用于多肽表达的调节元件。重组基因可以存在于细胞基因组中，或可以是表达载体的部分。

可以作为重组基因的部分存在的调节元件包括与多肽编码序列天然相关的那些，以及不与多肽编码序列天然相关的外源调节元件。外源调节元件例如外源启动子对于在特定宿主中表达重组基因或对于提高表达水平可以是有用的。一般地，重组基因中存在的调节元件包括转录启动子、核糖体结合位点、转录终止子和任选地存在的操纵子。用于真核细胞中的加工的优选元件是聚腺苷酸化信号。

通过使用表达载体促进了重组基因在细胞中的表达。除了重组基因，表达载体通常还含有用于在宿主细胞中自主复制的复制起点、选择标记、有限数目的有用的限制酶位点和高拷贝数的潜能。表达载体的实例是克隆载体、修饰的克隆载体、专门设计的质粒和病毒。

由于遗传密码的简并性，大量的不同编码核酸序列可以用于编码特定的多肽。由于几乎所有的氨基酸都由核苷酸三联体的不同组合或“密码子”编码，产生了遗传密码的简并性。由密码子编码的天然存在的氨基酸如下：

A=Ala=丙氨酸：密码子GCA，GCC，GCG，GCU

C=Cys=半胱氨酸：密码子UGC，UGU

D=Asp=天冬氨酸：密码子GAC，GAU

E=Glu=谷氨酸：密码子GAA，GAG

F=Phe=苯丙氨酸：密码子UUC，UUU

G=Gly=甘氨酸：密码子GGA，GGC，GGG，GGU

H=His=组氨酸：密码子CAC，CAU

I=Ile=异亮氨酸：密码子AUA，AUC，AUU

K=Lys=赖氨酸：密码子AAA，AAG

L=Leu=亮氨酸：密码子UUA，UUG，CUA，CUC，CUG，CUU

M=Met=甲硫氨酸：密码子 AUG

N=Asn=天冬酰胺：密码子AAC，AAU

P=Pro=脯氨酸：密码子CCA，CCC，CCG，CCU

Q=Gln=谷氨酰胺：密码子CAA，CAG

R=Arg=精氨酸：密码子AGA，AGG，CGA，CGC，CGG，CGU

S=Ser=丝氨酸：密码子AGC，AGU，UCA，UCC，UCG，UCU

T=Thr=苏氨酸：密码子ACA，ACC，ACG，ACU

V=Val=缬氨酸：密码子GUA，GUC，GUG，GUU

W=Trp=色氨酸：密码子UGG

Y=Tyr=酪氨酸：密码子UAC，UAU

用于SEQ ID NO：1相关多肽的重组核酸表达的合适的细胞是原核生物和真核生物。原核细胞的实例包括大肠杆菌（E. coli）；葡萄球菌属（Staphylococcus）的成员，例如金黄色葡萄球菌（S. aureus）和表皮葡萄球菌（S. epidermidis）；乳杆菌属（Lactobacillus）的成员，例如植物乳杆菌（L. plantarum）；乳球菌属（Lactococcus）的成员，例如乳酸乳球菌（L. lactis）；芽胞杆菌属（Bacillus）的成员，例如枯草芽孢杆菌（B. subtilis）；棒杆菌属（Corynebacterium）的成员，例如，谷氨酸棒杆菌（C. glutamicum）；以及假单胞菌属（Pseudomonas）的成员例如荧光假单胞菌（Ps. fluorescens）。真核细胞的实例包括哺乳动物细胞；昆虫细胞；和酵母细胞，例如糖酵母属（Saccharomyces）的成员（例如，啤酒糖酵母（S. cerevisiae））、毕赤酵母属（Pichia）的成员（例如，巴斯德毕赤酵母（P. pastoris））、汉逊酵母属（Hansenula）的成员（例如，多形汉逊酵母（H. polymorpha））、克鲁维酵母属（Kluyveromyces）的成员（例如，乳酸克鲁维酵母（K. lactis）或脆壁克鲁维酵母（K. fragilis））和裂殖酵母属（Schizosaccharomyces）的成员（例如，粟酒裂殖酵母（S. pombe））。

用于重组基因生产、导入细胞和重组基因表达的技术是本领域公知的。在参考文献，例如Ausubel，Current Protocols in Molecular Biology，John Wiley，1987-2002，和Sambrook 等，Molecular Cloning ， A Laboratory Manual，2^nd Edition，Cold Spring Harbor Laboratory Press，1989中提供了这些技术的实例。

如果希望，特定宿主中的表达可以通过密码子优化来增强。密码子优化包括使用更优选的密码子。在不同宿主中的密码子优化技术是本领域公知的。

SEQ ID NO：1相关多肽可以含有翻译后修饰，例如，N-连接的糖基化、O-连接的糖基化或乙酰化。提及 “多肽”或多肽的氨基酸序列，包括含有来自宿主细胞例如酵母宿主的、具有翻译后修饰结构的一个或多个氨基酸的多肽。

翻译后修饰可以化学产生或通过使用合适的宿主产生。例如，在啤酒糖酵母中，倒数第二个氨基酸的性质看起来决定了N-末端甲硫氨酸是否被除去。此外，倒数第二个氨基酸的性质还决定了 N-末端氨基酸是否是N^α-乙酰化的（Huang et al., 1987, Biochemistry 26: 8242-8246）。另一实例包括由于分泌前导区（例如信号肽）的存在被靶定用于分泌的多肽，其中蛋白被N-连接的或O-连接的糖基化修饰（Kukuruzinska et al., 1987, Ann. Rev. Biochem. 56:915-944）。

IV. 佐剂

佐剂是可以辅助免疫原产生免疫应答（例如多肽、包含多肽的药物组合物）的物质。佐剂可以通过不同的机制起作用，例如以下一种或多种：增加抗原的生物学或免疫学半衰期；改善对抗原呈递细胞的抗原送递；改善抗原呈递细胞的抗原加工和呈递；以及诱导免疫调节细胞因子的产生（Vogel, Clinical Infectious Diseases 30(suppl. 3):S266-270, 2000）。在本发明的一个实施方案中，使用了佐剂。

可以采用多种不同类型的佐剂来辅助产生免疫应答。特定佐剂的实例包括氢氧化铝；磷酸铝；或其它铝盐；磷酸钙；DNA CpG基序；单磷酰脂质A；霍乱毒素；大肠杆菌热不稳定毒素；百日咳毒素；胞壁酰二肽；氟氏不完全佐剂；MF59；SAF；免疫刺激复合物；脂质体；生物可降解的微球体；皂苷；非离子型嵌段共聚物；胞壁酰肽类似物；聚磷腈；合成的多核苷酸；IFN-γ；IL-2；IL-12和ISCOMS。(Vogel, Clinical Infectious Diseases 30(suppl 3):S266-270, 2000; Klein et al., 2000, Journal of Pharmaceutical Sciences 89:311-321; Rimmelzwaan et al.,2001, Vaccine 19:1180-1187; Kersten, 2003, Vaccine 21:915-920; O’Hagen, 2001, Curr. Drug Target Infect. Disord. 1:273-286.)

V. 诱导保护性免疫的患者

“患者”是指能被金黄色葡萄球菌感染的哺乳动物。在一个实施方案中，患者是人。患者可以被预防性地或治疗性地治疗。预防性治疗提供了足够的保护性免疫来降低金黄色葡萄球菌感染的可能性或严重程度。可以进行治疗性治疗来降低金黄色葡萄球菌感染的严重程度。

可以使用含有本文描述的多肽或免疫原的药物组合物来进行预防性治疗。这样的治疗优选对人类进行。药物组合物可以被施用给普通群体，或金黄色葡萄球菌感染风险提高的那些人。

需要治疗的那些患者包括已经患有感染的那些，以及倾向于患感染或要降低感染可能性的那些。金黄色葡萄球菌感染风险提高的人包括健康护理工作者；医院患者；具有减弱的免疫系统的患者；经历手术的患者；接受外来物体植入物，例如导管或血管装置的患者；面临导致免疫减弱的治疗的患者；涉及外来物体的诊断操作之下的患者；和从事烧伤或创伤风险提高的职业的人。

诊断或治疗操作中使用的外来物体包括留置导管或植入的聚合物装置。外来物体相关的金黄色葡萄球菌感染的实例包括败血症/心内膜炎（例如，血管内导管、血管假体、起搏器导线（pacemaker lead）、除颤器系统、假体心瓣膜、和左心室辅助装置）；腹膜炎（例如，脑室-腹膜脑脊液（CSF）旁路和连续非卧床腹膜透析导管系统）；脑室炎（例如，内部和外部CSF旁路）；以及慢性聚合物相关的综合征（例如，假体关节/髋松动、丰胸后硅酮假体的纤维荚膜的挛缩综合征、以及在白内障手术之后人工眼内晶体的植入后晚期发作的眼内炎（endophtalmisis））。（参见Heilmann and Peters, Biology and Pathogenicity of Staphylococcus epidermidis, In: Gram Positive Pathogens, Eds. Fischetti et al., American Society for Microbiology, Washington D.C. 2000.）

可以被金黄色葡萄球菌感染的非人患者包括牛、猪、绵羊、山羊、兔、马、狗、猫、大鼠和小鼠。非人患者的治疗在保护宠物和家畜，以及在评估特定治疗的效力方面是有用的。

在一个实施方案中，与涉及外来物体的治疗性或医学操作一起对患者进行预防性治疗。在另外的实施方式中，患者在所述操作前约1个月、约2个月、或约2-6个月进行免疫。

一个实施方案也包括本文描述的一种或多种多肽免疫原或其组合物，或包含所述免疫原或组合物或由所述免疫原或组合物组成的疫苗，它们(i)用于以下用途，(ii)用作药物，所述药物用于以下用途，或(iii)用于制备药物，所述药物用于以下用途：(a)治疗（例如人体的治疗）；(b)医学；(c)抑制金黄色葡萄球菌复制；(d)治疗或预防金黄色葡萄球菌感染；或(e)治疗、预防金黄色葡萄球菌相关疾病或延迟所述疾病的发作或进展。在这些用途中，多肽免疫原、其组合物和/或包含所述免疫原或组合物或由所述免疫原或组合物组成的疫苗可以任选地与一种或多种抗细菌剂联合使用（如抗细菌化合物；下文描述的联合疫苗）。

VI. 联合疫苗

SEQ ID NO：1相关多肽可以单独使用，或与其它免疫原联合使用，来诱导免疫应答。可以存在的另外的免疫原包括：一种或多种另外的金黄色葡萄球菌免疫原；靶定一种或多种其它葡萄球菌属生物例如表皮葡萄球菌（S. epidermidis）、溶血葡萄球菌（S. haemolyticus）、沃氏葡萄球菌（S. warneri）或S. lugunensi的一种或多种免疫原；和/或靶定其它感染生物的一种或多种免疫原。

一种或多种其它免疫原的实例包括ORF0657n相关多肽（Anderson 等，国际公开号WO 05/009379）；ORF0657/ORF0190杂合多肽（Anderson 等，国际公开号WO 05/009378）；sai-1相关多肽（Anderson 等，国际公开号WO 05/79315）；ORF0594相关多肽（Anderson 等，国际公开号WO 05/086663）；ORF0826相关多肽（Anderson 等，国际公开号WO 05/115113）；PBP4相关多肽（Anderson 等，国际公开号WO 06/033918）；AhpC相关多肽和AhpC-AhpF组合物（Kelly 等 国际公开号WO 06/078680）；金黄葡萄球菌5型和8型荚膜多糖（Shinefield et al., 2002, N. Eng. J. Med. 346:491-496）；胶原蛋白粘附素、纤维蛋白原结合蛋白和聚集因子（Mamo et al.,199, FEMS Immunol. Med. Microbiol. 10:47-54; Nilsson et al., 1998, J. Clin. Invest. 101:2640-2649; Josefsson et al., 2001, J. of Infect. Dis. 184:1572-1580）以及多糖细胞间粘附素和其片段（Joyce et al.,2003, Carbohydrate Research 338:903-922）。

VII. 施用

使用本文提供的指导以及本领域公知的技术，可以配制SEQ ID NO: 1相关多肽和免疫原并将其施用给患者。一般的药物施用指导提供在例如Vaccines Eds. Plotkin and Orenstein, W.B. Sanders Company, 1999; Remington's Pharmaceutical Sciences 20^th Edition, Ed. Gennaro, Mack Publishing, 2000; and Modern Pharmaceutics 2^nd Edition, Eds. Banker and Rhodes, Marcel Dekker, Inc., 1990中。

药学可接受的载体促进免疫原的保存和向患者的施用。药学可接受的载体可以含有不同的成分，例如缓冲液、无菌注射用水、生理盐水或磷酸盐缓冲盐水、蔗糖、组氨酸、盐和聚山梨酸酯（polysorbate）。因此，本发明包括能在患者中诱导抗金黄色葡萄球菌感染的保护性免疫应答的组合物，所述组合物包含免疫学有效量的SEQ ID NO: 1相关多肽或其免疫原，以及药学可接受的载体。组合物可以进一步包含佐剂。

免疫原可以通过不同的途径，例如皮下、肌内或粘膜途径来施用。皮下和肌内施用可以使用例如针头或喷射注射器来进行。

考虑本领域公知的因素，包括患者的年龄、体重、性别和医学状况；施用途径；期望的效果；和采用的特定化合物，优选地确定合适的给药方案。免疫原可以以多剂量疫苗形式使用。预计的是，剂量将由1.0μg到1.0 mg总多肽的范围构成。在本发明的不同实施方案中，剂量范围是5.0μg到500μg，0.01mg到1.0mg，或0.1 mg到1.0mg。

给药的时间取决于本领域公知的因素。在初次施用之后，可以施用一个或多个另外的剂量来维持和/或加强抗体滴度。给药方案的实例将是第1天、1个月、在4、6或12个月的第三剂量，以及根据需要在远时间的另外的加强剂量。

VIII. 抗体的产生

SEQ ID NO：1相关多肽可以用于产生结合所述多肽或金黄色葡萄球菌的抗体和抗体片段。这种抗体和抗体片段具有不同的用途，包括在多肽纯化、金黄色葡萄球菌鉴定或在抗金黄色葡萄球菌感染的治疗性或预防性治疗中使用。

抗体可以是多克隆的或是单克隆的。生产和使用抗体包括人抗体的技术是本领域公知的（参见，例如Ausubel, Current Protocols in Molecular Biology, John Wiley, 1987-2002; Harlow et al.,Antibodies, A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory, 1988; Kohler et al., 1975, Nature 256:495-497; Azzazy et al.,2002, Clinical Biochem. 35:425-445; Berger et al., 2002, Am. J. Med. Sci. 324:14-40）。

合适的糖基化对于抗体功能可以是重要的（Yoo et al., 2002, J. Immunol. Methods 261:1-20; Li et al., 2006, Nature Biotechno. 24:210-215）。天然存在的抗体含有附着于重链的至少一个N-连接的碳水化合物（Yoo et al., supra）。可能存在另外的N-连接的碳水化合物和O-连接的碳水化合物，并且对于抗体功能可能是重要的。Id。

不同类型的宿主细胞可以用于提供有效的翻译后修饰，包括哺乳动物宿主细胞和非哺乳动物细胞。哺乳动物宿主细胞的实例包括中国仓鼠卵巢（CHO）、HeLa、C6、PC12和骨髓瘤细胞（Yoo et al., supra; Persic et al., 1997, Gene 187:9-18）。非哺乳动物细胞可以被修饰，用于复制人类糖基化(Li et al., supra)。糖工程化的（Glycoengineered）巴斯德毕赤酵母（Pichia pastoris）是这样的修饰的非哺乳动物细胞的实例(Li et al., supra)。

IX. 核酸疫苗

可以利用适合于治疗性施用的载体将编码SEQ ID NO：1相关多肽的核酸导入患者中。合适的载体可以将核酸送递到靶细胞内而不引起不可接受的副作用。可以采用的载体的实例包括质粒载体和基于病毒的载体。(Barouch, 2006, J. Pathol. 208:283-289; Emini et al., 国际公开号WO 03/031588.)

利用编码需要的多肽的基因表达盒实现细胞表达。基因表达盒含有调节元件，用于在靶细胞内产生和加工足够量的核酸来实现有益效果。

病毒载体的实例包括第一和第二代腺病毒载体（adenovector）、依赖于辅助病毒的腺病毒载体、腺伴随病毒载体、逆转录病毒载体、甲病毒载体（例如委内端拉马脑炎病毒载体）以及质粒载体。(Hitt et al., 1997, Advances in Pharmacology 40:137-206; Johnston et al.,美国专利No. 6,156,588; Johnston et al.,国际PCT公开号WO 95/32733; Barouch, 2006, J. Pathol. 208:283-289; Emini et al., 国际PCT公开号WO 03/031588.)

腺病毒载体可以基于不同的腺病毒血清型，例如在人或动物中发现的那些。动物腺病毒的实例包括牛、猪、黑猩猩、鼠、犬和禽类的腺病毒（CELO）。（Emini et al., 国际PCT公开号WO 03/031588; Colloca et al., 国际PCT公开号WO 05/071093.）人腺病毒包括B、C、D或E组血清型，例如2型（“Ad2”）、4型（“Ad4”）、5型（“Ad5”）、6型（“Ad6”）、24型（“Ad24”）、26型（“Ad26”）、34型（“Ad34”）和 35型（“Ad35”）。

可以利用不同的技术和给药方案来施用核酸疫苗。（Emini 等，国际PCT公开号WO 03/031588.）例如，可以通过有或者没有一个或多个电脉冲的注射来肌内施用疫苗。通过刺激体液和细胞免疫应答这两者，电介导的转移可以辅助遗传免疫。给药方案的实例包括初免-加强以及异源的初免-加强方法。（Emini et al.，国际PCT公开号WO 03/031588.）

为了描述和公开可能与本发明关联使用的方法学和材料，将本文提到的所有公开文献通过引用并入本文。本文的内容都不应解释为承认本发明不享有下列权益：由于在先发明之故而享有早于所述公开内容的权益。

参照附图描述了本发明的优选实施方案，应该理解本发明不限于这些精确的实施方案，并且可以由本领域技术人员在其中实现各种改变和修改，而不背离所附权利要求中定义的本发明的范围或精神。因此，以下实施例举例说明但不限制本发明。

实施例1

保护性免疫

本实施例举例说明SEQ ID NO: 1相关多肽在动物模型中提供保护性免疫的能力。显示SEQ ID NO: 2，即SEQ ID NO: 1的一种组氨酸标记的衍生物，提供了保护性免疫。

SEQ ID NO: 2 克隆和表达- 设计从pETBlue-1载体(Novagen, Madison, WI)表达由SACOL0912基因编码的蛋白，所述蛋白带有由载体编码的N-末端组氨酸残基和终止密码子。此外，在甲硫氨酸起始物之后在蛋白上添加甘氨酸残基。设计PCR引物，用于扩增SACOL0912，所述SACOL0912从第一个甲硫氨酸密码子开始、在末端谷氨酸残基处的终止密码子前结束。正向和反向引物分别是：5’- ATGGGCCATCATCATCATCATCACGCAGACGAAAGTAAATTTGAAC-3’ (SEQ ID NO: 4) 和 5’-TTACTCGCCTTTGTTACC-3’ (SEQ ID NO: 5)。根据制造商的说明，用Wizard® 基因组DNA纯化试剂盒(Promega, Madison, WI)从金黄色葡萄球菌COL菌株纯化基因组DNA。该基因组DNA用作PCR反应的模板。

在50 μL体积反应物中通过PCR扩增SA0902基因，所述反应物含有250 ng基因组DNA、正向和反向引物各125 ng、1微升50 mM dNTPs、2.5单位的taq聚合酶和1X 缓冲液(Clontech advantage cDNA试剂盒)。热循环条件如下：一个循环的94℃下1分钟；32个循环的94℃下1分钟，53℃下30秒，68℃下2分钟;一个循环的68℃下4分钟。使用AccepTor载体试剂盒(Novagen)将扩增的DNA序列(216 bp)连接到pETBlue-1线性载体中。将连接反应物转化到感受态NovaBlue single^TM中。使转化混合物在37°C下在含有50 µg/mL cabenicillin、12.5 µg/mL四环素、 40 µg/mL X-Gal和20 μL 100 mM IPTG的LB (Luria-Bertani)琼脂板上生长过夜。选择白色菌落，在含有50 µg/mL氨苄青霉素的Luria Broth (LB)中生长。制备DNA小量制备物(Qiagen)，通过限制性内切核酸酶消化而确定合适的插入序列。对质粒DNA进行测序，选择不含对需要的序列的DNA改变的克隆，命名为COLSA0902 #4。

用COLSA0902 #4转化大肠杆菌Tuner (DE3) pLacI感受态细胞，并且在含有氨苄青霉素(100 μg/mL)和氯霉素(34 ng/ml)的LB板上生长。为了测试SA0902的表达，将分离的菌落接种到5 mL液体LB, 1%葡萄糖, 100 μg/ml氨苄青霉素中，在37℃, 250 rpm下孵育，直到OD₆₀₀为0.5-1.0。通过添加IPTG (最终IPTG浓度为0.4 mM)进行表达诱导，并且在37℃下孵育3小时。为了制备裂解物，分别收集来自未诱导和诱导的培养物的1.0 mL培养物体积，所述收集是通过离心和重悬浮于300 μL BugBuster HT (EMD Sciences, Madison, WI) 和3 μL蛋白酶抑制剂混合物(Sigma, St. Louis, MO)中。将混合物保持在冰上5分钟，随后超声处理3次，每次10秒，每次之间冷却。为了获得“可溶的”和“不可溶的”级份，将混合物在4℃下以13,000 rpm离心15分钟。上清液命名为“可溶的”，沉淀物重悬浮于300 μL BugBuster HT和3 μL蛋白酶抑制剂混合物中，并且命名为“不可溶的”。

为了通过SDS-PAGE的Coomassie染色分析组氨酸标记的SACOL0912（由SEQ ID NO: 2编码）的表达，在还原和变性条件下在1X MES SDS缓冲液(Invitrogen)中、在4-12 %梯度NuPage Bis-Tris凝胶(Invitrogen)上对样品进行电泳。为了评估蛋白大小，与裂解物平行进行6 -188 kDa之间的标准品(Invitrogen) 的电泳。用Bio-Safe Coomassie，即根据制造商的方案的一种Coomassie G250染料(BIO-RAD)，对凝胶进行染色。进行蛋白印迹，并且通过抗His mAb (EMD Sciences)检测信号。

通过裂解物中的Coomasie染色和蛋白印迹，特异性检测7.9-kDa蛋白。用定位于可溶级份的SACOL0912获得了良好表达。

SEQ ID NO: 2 纯化- 实现了将上述小规模过程直接扩大为具有20升工作体积的搅拌的发酵罐（30升规模）。在含有50 mL Luria-Bertani (LB)培养基（添加氨苄青霉素）的250 mL烧瓶中培养接种物，用1 mL冷冻的种子培养物接种，培养6小时。将1 mL该种子用于接种含有500 mL LB培养基（添加氨苄青霉素）的2升烧瓶，孵育16小时。用20升LB培养基（添加氨苄青霉素）培养大规模发酵罐（30升规模）。发酵罐的发酵参数是：压力= 5 psig, 搅拌速度= 300 rpm, 气流= 7.5升/分钟，温度 = 37℃。将细胞孵育到600 nm波长下光密度(OD)为1.3光密度单位，并且用浓度为1 mM的异丙基-β-K-硫代半乳糖苷(IPTG)进行诱导。用IPTG进行诱导的时间是2小时。通过将温度降低到15℃，通过500KMWCO中空纤维筒进行浓缩，并且在4℃下以8000倍重力离心20分钟，收获细胞。倒出上清液，将重组大肠杆菌湿细胞沉淀物在–70℃下冷冻。

将冷冻的重组大肠杆菌细胞糊（24克）解冻，重悬浮于2倍体积的裂解缓冲液（50 mM磷酸钠, pH 8.0, 0.15 M NaCl, 2 mM氯化镁, 10 mM 咪唑, 20 mM 2-巯基乙醇, 0.1% Tween-80, 和蛋白酶抑制剂混合物 (Complete™, 不含EDTA, Roche # 1873580-每50 ml裂解缓冲液1片)）中。将Benzonase (EM #1.01697.0002)以125个单位/mL加入细胞悬浮液。用微流化器(microfluidizer)制备裂解物。将裂解物在4℃下搅拌3小时，通过4℃下以10,000 x g离心10分钟使其澄清。将上清液通过玻璃纤维预过滤器Millipore进行过滤，加入NaCl到来自5 M母液的0.5 M的终浓度。将经过滤的上清液加入Ni-NTA琼脂糖层析树脂(Qiagen #30250)，将浆液在4℃下混合过夜。将层析树脂的浆液倒入层析柱，通过重力从柱出口收集未结合的级份。用10倍柱体积的洗涤缓冲液（50 mM磷酸钠, pH 8.0, 0.5 M NaCl, 2 mM氯化镁, 10 mM 咪唑, 20 mM 2-巯基乙醇, 0.1% Tween-80, 和蛋白酶抑制剂混合物 (Complete™, 不含EDTA, Roche # 1873580-每50 ml洗涤缓冲液1片)）洗涤柱子。用洗脱缓冲液(50 mM磷酸钠, pH 7.4, 0.3 M咪唑, 2 mM氯化镁, 0.1% Tween-80, 和20 mM 2-巯基乙醇)洗脱柱子。用Ponceau-S染色通过硝酸纤维素膜上的斑点印迹鉴定含有蛋白的级份，合并含有最高蛋白浓度的级份，从而制备Ni-IMAC产物。通过SEC对Ni-IMAC产物进行分级分离。通过采用Coomassie染色的SDS/PAGE来鉴定含有产物蛋白的SEC级份。合并含有产物的SEC级份，从而制备SEC产物。对SEC产物进行无菌过滤，以0.2 mg/ml的终浓度吸附在羟基磷酸铝佐剂上。

金黄色葡萄球菌攻击物的制备- 37℃下使金黄色葡萄球菌Becker菌株在TSA板上生长过夜。通过将5 ml PBS添加到平板上，从TSA板洗去细菌，并且用无菌涂布器轻柔重悬浮细菌。用Sorvall RC-5B离心机 (DuPont Instruments)以6000 rpm将细菌悬浮液离心20分钟。将沉淀物重悬浮于16%甘油中，将等分物在–70℃下冷冻保存。

在使用前，将接种物解冻，适当稀释，并且用于感染。滴定每个原种，以确定小鼠中的致死剂量。不断监测细菌接种物的效价（80-90%致死率），用于确保模型的可再现性。

SEQ ID NO: 2 多肽在鼠、致死攻击模型中的保护作用研究-在两个独立实验中，用3剂羟基磷酸铝佐剂(每次注射450 μg) 上的SEQ ID NO: 2 多肽(每次注射20 μg) 免疫20只BALB/c小鼠中的每一只。羟基磷酸铝佐剂(AHP)由Klein et al., 2000, Journal of Pharmaceutical Sciences 89:311-321描述。在第0、7和21天，以2次50μL肌内注射，施用所述材料。在第28天对小鼠取血，通过ELISA筛选它们的血清对SEQ ID NO: 2的反应性。给20只小鼠的每一只注射AHP作为对照组。

在每个实验的第35天，通过静脉内注射金黄色葡萄球菌（剂量7 X 10⁸ CFU/mL）攻击小鼠。在10天的阶段监测小鼠的存活。在第一个实验结束时，SEQ ID NO: 2多肽免疫组中14只小鼠存活，与之相比，PBS对照组中6只存活。结果图解于图4A中。在第二个实验中，SEQ ID NO: 2多肽免疫组中6只小鼠存活，与之相比，PBS对照组中4只存活。结果图解于图4B中。

SEQ ID NO: 2 多肽在大鼠、留置导管模型中的保护作用研究 - 为了评估抗SEQ ID NO: 2的主动免疫是否能够预防植入装置的金黄色葡萄球菌感染，使用了大鼠留置导管模型。在第0、7和21天，用3剂羟基磷酸铝佐剂(AHP) (每次注射450 μg) 上的SEQ ID NO: 2 多肽(每次注射20 μg) 腹膜内免疫3-4周龄的Sprague-Dawley大鼠，并且给10只大鼠中的每一只注射AHP（每次注射450 μg）。以单次100 μl腹膜内注射施用所述材料。在第28天对大鼠取血，通过ELISA筛选它们的血清对SEQ ID NO: 2的反应性。在第35天，动物进行手术，从而将留置导管置于颈静脉内。手术后动物休息大约10天，此时通过尾静脉，静脉内给予金黄色葡萄球菌Becker菌株 (5-7 X 10⁹ CFU)的亚致死攻击。攻击后24小时处死大鼠，取出导管。通过在甘露醇盐琼脂板上培养整个导管，评估导管上金黄色葡萄球菌细菌的存在。如果在平板上观察到任何金黄色葡萄球菌生长晕的迹象，将导管评分为培养物阳性。在两个独立实验（总共20只免疫的大鼠）后，20个导管中的10个是培养物阳性的(50%)。然而，在对照大鼠中，20个导管中的20个是培养物阳性的(100%)。结果列于表2中。

表2. 避免留置导管的抗金黄色葡萄球菌建群的保护作用

其它实施方案在以下的权利要求之内。尽管已经显示和描述了几个实施方案，可以进行各种修改而不背离本发明的精神和范围。

序列表

<110> Merck Sharp & Dohme Corp.

<120> 用于诱导抗金黄色葡萄球菌的保护性免疫应答的多肽

<130> MRL-IFD-00008

<150> 61/200,309

<151> 2008-11-26

<160> 6

<170> FastSEQ for Windows Version 4.0

<210> 1

<211> 64

<212> PRT

<213> 金黄色葡萄球菌

<400> 1

Met Ala Asp Glu Ser Lys Phe Glu Gln Ala Lys Gly Asn Val Lys Glu

1 5 10 15

Thr Val Gly Asn Val Thr Asp Asn Lys Asn Leu Glu Asn Glu Gly Lys

20 25 30

Glu Asp Lys Ala Ser Gly Lys Ala Lys Glu Phe Val Glu Asn Ala Lys

35 40 45

Glu Lys Ala Thr Asp Phe Ile Asp Lys Val Lys Gly Asn Lys Gly Glu

50 55 60

<210> 2

<211> 71

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> SEQ ID NO:1的组氨酸标记的衍生物

<400> 2

Met Gly His His His His His His Ala Asp Glu Ser Lys Phe Glu Gln

1 5 10 15

Ala Lys Gly Asn Val Lys Glu Thr Val Gly Asn Val Thr Asp Asn Lys

20 25 30

Asn Leu Glu Asn Glu Gly Lys Glu Asp Lys Ala Ser Gly Lys Ala Lys

35 40 45

Glu Phe Val Glu Asn Ala Lys Glu Lys Ala Thr Asp Phe Ile Asp Lys

50 55 60

Val Lys Gly Asn Lys Gly Glu

65 70

<210> 3

<211> 216

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 编码SEQ ID NO:2的cDNA序列

<400> 3

atgggccatc atcatcatca tcacgcagac gaaagtaaat ttgaacaagc aaaaggtaat 60

gttaaagaaa cagtaggtaa tgttactgat aataaaaatt tagaaaacga aggtaaagaa 120

gataaagctt ctggtaaagc gaaagaattc gttgaaaatg caaaagaaaa agcaactgat 180

tttattgata aagtaaaagg taacaaaggc gagtaa 216

<210> 4

<211> 46

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> PCR引物

<400> 4

atgggccatc atcatcatca tcacgcagac gaaagtaaat ttgaac 46

<210> 5

<211> 18

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> PCR引物

<400> 5

ttactcgcct ttgttacc 18

<210> 6

<211> 64

<212> PRT

<213> 金黄色葡萄球菌

<400> 6

Met Ala Asp Glu Ser Lys Phe Glu Gln Ala Lys Gly Asn Val Lys Glu

1 5 10 15

Thr Ile Gly Asn Val Thr Asp Asn Lys Asn Leu Glu Asn Glu Gly Lys

20 25 30

Glu Asp Lys Ala Ser Gly Lys Ala Lys Glu Phe Val Glu Asn Ala Lys

35 40 45

Glu Lys Ala Thr Asp Phe Ile Asp Lys Val Lys Gly Asn Lys Gly Glu

50 55 60

Claims (19)

1.包含一种氨基酸序列的多肽，所述氨基酸序列具有对SEQ ID NO: 1所示氨基酸序列的最多8个氨基酸改变，其中所述多肽不是SEQ ID NO: 1或SEQ ID NO: 6，并且其中所述多肽提供抗金黄色葡萄球菌的保护性免疫。

2.权利要求1的多肽，其中所述多肽包含SEQ ID NO: 1的选自氨基酸5-60、氨基酸9-64、氨基酸1-56、氨基酸4-59、氨基酸8-63、氨基酸2-57、氨基酸3-58、氨基酸7-62和氨基酸6-61的部分。

3.权利要求1或权利要求2的多肽，其中所述多肽是基本上纯化的。

4.权利要求1-3的任一项的多肽，其中所述多肽提供抗表达SEQ ID NO: 1的金黄色葡萄球菌菌株的保护性免疫。

5.免疫原，其包含由一种氨基酸序列组成的多肽和与所述氨基酸序列共价连接的一个或多个另外的区域或部分，所述氨基酸序列具有对SEQ ID NO: 1的最多8个氨基酸改变，其中每个区域或部分独立地选自具有至少一种以下特性的区域或部分：增强免疫应答、促进纯化或促进多肽稳定性。

6.权利要求5的免疫原，其中所述多肽提供抗表达SEQ ID NO: 1的金黄色葡萄球菌菌株的保护性免疫。

7.能够在患者中诱导抗金黄色葡萄球菌感染的保护性免疫应答的组合物，该组合物包含免疫学有效量的

(a)权利要求1-4的任一项的多肽；或，

(b)权利要求5或权利要求6的免疫原；

和药学可接受的载体。

8.能在患者中诱导抗金黄色葡萄球菌感染的保护性免疫应答的组合物，所述组合物包含免疫学有效量的包含一种氨基酸序列的多肽和药学可接受的载体，所述氨基酸序列具有对SEQ ID NO: 1所示氨基酸序列的最多8个氨基酸改变，其中所述多肽不由SEQ ID NO: 1所示的氨基酸序列组成。

9.权利要求8的组合物，其中所述组合物提供抗表达SEQ ID NO: 1的金黄色葡萄球菌菌株的保护性免疫。

10.权利要求7-9的任一项的组合物，其中所述组合物进一步包含佐剂。

11.包含重组基因的核酸分子，所述重组基因包含编码权利要求1-4的任一项的多肽的核苷酸序列。

12.权利要求11的核酸分子，其中所述核酸分子是表达载体。

13.包含重组基因的重组细胞，所述重组基因包含编码权利要求1-4的任一项的多肽的核苷酸序列。

14.制备多肽免疫原的方法，该方法包括以下步骤：

(a)使权利要求13的重组细胞在表达所述多肽的条件下生长；和

(b)纯化所述多肽。

15.在患者中诱导抗金黄色葡萄球菌感染的保护性免疫应答的方法，该方法包括给所述患者施用免疫学有效量的一种或多种以下物质的步骤：

(a)权利要求1-4的任一项的多肽；

(b)权利要求5或权利要求6的免疫原；

(c)具有SEQ ID NO: 1所示氨基酸序列的多肽；

(d)具有SEQ ID NO: 6所示氨基酸序列的多肽；或，

(e)权利要求7-10的任一项的组合物。

16.权利要求15的方法，其中所述患者是人。

17.免疫学有效量的一种或多种以下物质在制备用于在患者中诱导抗金黄色葡萄球菌感染的保护性免疫应答的药物中的用途：

(a)权利要求1-4的任一项的多肽；

(b)权利要求5或权利要求6的免疫原；

(c)具有SEQ ID NO: 1所示氨基酸序列的多肽；

(d)具有SEQ ID NO: 6所示氨基酸序列的多肽；或，

(e)权利要求7-10的任一项的组合物。

18.权利要求17的用途，其中所述药物提供抗表达SEQ ID NO: 1的金黄色葡萄球菌菌株的保护性免疫。

19.权利要求17或18的用途，其中所述患者是人。

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