CN102286485A

CN102286485A - 来源于棉花的miRNA-GhmiR171及其应用

Info

Publication number: CN102286485A
Application number: CN 201110214071
Authority: CN
Inventors: 刘进元; 薛伟; 王正明
Original assignee: Tsinghua University
Current assignee: Tsinghua University; Wuxi Research Institute of Applied Technologies of Tsinghua University
Priority date: 2011-07-28
Filing date: 2011-07-28
Publication date: 2011-12-21
Anticipated expiration: 2031-07-28
Also published as: CN102286485B

Abstract

本发明公开了来源于棉花的miRNA-GhmiR171及其应用。本发明保护的GhmiR171是序列表的序列1所示的RNA。本发明保护的GhmiR171前体(pre-GhmiR171)是序列表的序列2所示的RNA。本发明还保护序列1所示RNA在抑制GRAS转录因子基因表达和/或促进GRAS转录因子基因的mRNA降解中的应用。所述GRAS转录因子如序列表的序列3所示。所述GRAS转录因子基因如序列表的序列4所示。应用miRNA-GhmiR171有望获得在生长发育方面有重要表型的植株，具有重要的生物学意义和潜在应用价值，将为棉花的品质育种(如培育抗逆性棉花)提供宝贵的基因资源，带来一定的研究价值和社会效益，并最终用于实际生产。

Description

来源于棉花的miRNA-GhmiR171及其应用

技术领域

本发明涉及来源于棉花的miRNA-GhmiR171及其应用。

背景技术

MicroRNA(miRNA)是一类长度为21-22nt的，内源产生的非编码RNA，广泛存在于原核生物和真核生物(Bartel D P.MicroRNAs：genomics，biogenesis，mechanisms，and function.Cell，2004，116：281-297.)。1993年Ambros研究组在线虫中发现第一个miRNA，lin-4，至今已在105个物种中发现有9539个miRNA。miRNA特异地作用于靶基因mRNA，抑制靶基因表达，在调节生长发育、细胞增殖、凋亡、抵御环境胁迫等各种生命活动中发挥着重要的作用(Bushati N，Cohen S M.MicroRNA functions.Annu.Rev.Cell Dev.Biol.，2007，23：175-205.；金龙国，王川，刘进元.植物MicroRNA.中国生物化学与分子生物学报，2006，22：609-614.)。植物miRNA主要通过切割靶基因mRNA，或抑制靶mRNA翻译，来调控植物个体生长发育并影响其生理过程，是一种新的基因调控模式，具有重要的研究意义(Voinnet O.Origin，biogenesis，and activity ofplant microRNAs.Cell，2009，136：669-687.)。

棉花是世界最重要的经济作物之一，同时棉花纤维也是研究单细胞伸长的良好模型。与拟南芥、水稻等模式生物相比，目前已经发现的棉花miRNA数量可谓寥寥无几，因此通过高通量测序技术，有望挖掘出更多的棉花miRNA，这对于全面了解棉花乃至整个植物miRNA的形成过程、结构特点和功能机制具有现实意义。另外，棉花中miRNA可能在诸多生理过程(如纤维的起始与伸长等)发挥重要功能，但棉花中关于miRNA的生物学功能研究甚少，因此，通过关注特定发育时期、特定组织中的miRNA，有望阐明棉花miRNA参与的生理过程，以及在该过程中具体发挥的作用。

我国是世界上主要的棉花生产和消费国，棉花对于我国具有举足轻重的地位。国内外除了利用常规育种手段之外，逐步运用基因工程技术对水稻品质(产量、抗虫等)进行遗传改良已经成为了一种趋势。由于miRNA对植物有广泛的调控作用，很可能成为植物遗传改良的重点研究基因之一，因此迫切需要通过大规模测序方法充分挖掘和开发属于本国知识产权的新的miRNA基因，从而为后期定向改良和培育优质性状的棉花品种奠定基础。

发明内容

本发明的目的是提供来源于棉花的miRNA-GhmiR171及其应用。

本发明保护的miRNA-GhmiR171的序列如下(5′→3′)：

UGAUUGAGCCGUGCCAAUAUC(序列表的序列1)。

本发明保护的miRNA-GhmiR171前体(pre-GhmiR171)序列如下(5′→3′)：

UACAGGGGAAAGCUGGUGAUUGAGCCGCGCCAAUAUCCCUUGCGCGAGUACCGGAUCACCGGUUUCGAUCAGCUCUGCGGCCUGAAUUAAUUGGUCUAUUAUUGCCUGCUGAAGCUGUUGGUUCGCCAUUUCAUCAGUCACUAUC。(序列表的序列2)。

本发明还保护序列1所示RNA或序列2所示的RNA在抑制GRAS转录因子(ES822760)表达中的应用；所述GRAS转录因子的氨基酸序列为序列表的序列3；所述GRAS转录因子基因的核苷酸序列为序列表的序列4。

本发明还保护序列1所示RNA或序列2所示的RNA在促进GRAS转录因子基因(ES822760)的mRNA降解中的应用；所述GRAS转录因子的氨基酸序列为序列表的序列3。

所述GRAS转录因子基因的核苷酸序列为序列表的序列4；

所述促进GRAS转录因子基因的mRNA降解为切割GRAS转录因子基因的mRNA。

本发明还包括序列1所示RNA或序列2所示的RNA在棉花纤维品质改良中的应用。

本发明的实验证明，Solexa克服了常规miRNA克隆技术的缺点，具有灵敏度高的优点，能够检测出最少一个小RNA分子，并且准确性高，检出的小RNA分子碱基错误率极低。同时该技术还具有高通量、大规模的特点，两个文库的测序量高达500万条小RNA序列以上。基于这种最新的测序手段，将有望识别棉花中特定发育时期特定组织特异表达的新miRNA。

本发明采用国际上先进的Solexa高通量测序技术结合生物信息学分析、Northern杂交、5′RACE等多种生物学手段，首次从基因组水平鉴定到miRNA-GhmiR171，并且证实GhmiR171的靶基因为GRAS转录因子基因，参与了棉花纤维起始及胚珠发育的调控。这都将为棉花的品质育种(如提高棉纤维产量)提供宝贵的基因资源，带来一定的研究价值和社会效益，并最终用于实际生产。本发明提供的miRNA广泛参与了棉花多种生命活动的调节，具有重要的生物学意义和潜在应用价值。

附图说明

图1为小RNA测序数据中分离和鉴定新miRNA的流程图

图2为GhmiR171的前体二级结构图；黑色部分指示成熟miRNA所在的位置

图3为Northern杂交检测开花前3天至开花后3天野生型及突变体棉花胚珠中GhmiR171的表达

图4为GhmiR171的靶基因5′RACE验证；序列上方的箭头表示发生切割的位点，数值表示该切点处发生切割的克隆数与克隆总数比值

图5为实时定量PCR检测在开花前3天至开花后3天野生型及突变体棉花胚珠中GhmiR171靶基因GRAS的表达

具体实施方式

以下的实施例便于更好地理解本发明，但并不限定本发明。下述实施例中的实验方法，如无特殊说明，均为常规方法。下述实施例中所用的试验材料，如无特殊说明，均为自常规生化试剂商店购买得到的。下述实施例中的％，如无特殊说明，均为质量百分含量。

以下实施例中所用棉花品种包括陆地棉徐州142(Gossypium hirsutum cv.Xuzhou142)及其无纤维突变体，以下分别简称野生型、突变体。棉花种子来源于棉花种质中期库，野生型中期库号为110599，突变体中期库号为140142。

实施例1、miRNA-GhmiR171的发现

一、样品采集

棉花于每年四月下旬种植于田间，常规作业，开花前一天花苞套袋，防止花粉传播造成异花传粉，开花当天除袋，并挂牌标记。分别收取开花前3天、开花前1天、开花当天、开花后1天、开花后3天的棉铃，剖取胚珠，迅速冻存于液氮，保存于-80℃备用。

二、miRNA-GhmiR171的发现

1、RNA提取

将由上述一得到的棉花胚珠样品在液氮中研磨，研磨过程中加入PVP(按1/5质量比)以防止酚类氧化，用PureLink^TM Plant RNA Reagent(Invitrogen)提取总RNA，操作步骤如下(以0.1g材料为例，相应试剂量可根据材料量按比例调整)：

①磨好的胚珠粉末加入到1ml提取缓冲液中，加20μl β-巯基乙醇，混匀后置于室温10-15分钟。4度12000转/分离心5分钟，将上清转至新的离心管，加入100μl 5MNaCl，混匀后加入300μl氯仿，充分混匀，4度12000转/分离心10分钟，将上清转至新的离心管；

②将转出的溶液依次用氯仿、酚、酚∶氯仿(1∶1)、氯仿抽提，经四次抽提后的上清液转入新的离心管，加入100μl多糖去除剂(北京华越洋生物科技有限公司)，混匀后加入200μl氯仿，充分混匀，4度12000转/分离心10分钟，将上清转至新的离心管；

③加入等体积的异丙醇，混匀后置-20度1小时以上，4度12000转/分离心10分钟，弃上清，离心得到的沉淀用75％的乙醇洗涤，晾干后溶于适量的DEPC水中。

使用Ultrospec 3000型紫外分光光度计(Amersham Biosciences)测定提取的RNA在260nm(OD₂₆₀)和280nm(OD₂₈₀)波长的吸光度值以确定RNA的纯度和浓度。质量合格的RNA浓度应在1μg/μl以上，OD₂₆₀/OD₂₈₀的比值在1.8-2.0之间，且经电泳检测条带清晰，无明显降解和DNA污染。

2、小RNA文库的构建

将质量检验合格的棉花胚珠总RNA用于构建小RNA文库。5个不同时期的胚珠样品提取的RNA各取10μg等量混合，总共50μg用于构建小RNA文库。小RNA文库的构建按照Illumina Sample Preparation Protocol文库构建方法进行，构建好的文库采用Solexa高通量测序(北京华大基因研究中心)，获得高质量的18-30nt的小RNA序列。

3、小RNA文库中保守的miRNA的鉴定

植物miRNA在各物种间表现出较高的进化保守性，而且往往越是在体内发挥重要功能的miRNA，其物种间保守型越高。为了挖掘高通量测序库中的保守的miRNA，参考之前国外文献对高通量测序数据分析的成功方法(Jones-Rhoades M W，Bartel D P.Computational identification of plant miRNAs and their targets，including a stress-inducedmiRNA.Mol.Cell，2004，14：787-799.)，建立了一套计算机分析方法用来发现和鉴定测序数据中的保守的棉花miRNA(分析流程如图1所示)。①将获得的两个小RNA文库中的原始序列通过计算机方法去掉3′接头，并过滤掉序列长度在18nt以下的序列，获得所谓的“干净”序列库；②将“干净”的序列与国际权威的miRNA数据库miRBase(http://microrna.sanger.ac.uk/sequences/)中公布的miRNA成熟序列进行BLAST，从而发现哪些序列来自于已知的miRNA，已知miRNA不超过2个错配的序列再进入下一步分析；③将潜在miRNA序列库中的序列与已有的棉花数据库进行BLAST，数据库包括棉花EST(http://compbio.dfci.harvard.edu)、棉花GSS(NCBI)、以及已有的部分雷蒙德氏棉(Gossypiumraimondii)的基因组序列。将找到的棉花数据库中对应的序列进行下一步分析。④使用miRNA前体结构预测软件mireap_0.2(http://sourceforge.net/projects/mireap)，对获取的棉花数据库中有小RNA对应的序列进行二级结构分析，若能形成类似miRNA前体(pre-miRNA)的良好茎环结构则该序列可以认为是候选的新miRNA；⑤对候选的新的miRNA继续进行筛选，考察候选的新miRNA序列所在的茎环结构前体的小RNA分布特征，若主要分布在候选的新miRNA区域以及对应的miRNA^*区域，则认为该候选的新miRNA序列高度可信，是真实的miRNA序列(MeyersBC，AxtellMJ，BartelB，BartelDP，BaulcombeD，BowmanJL，CaoX，CaringtonJC，ChenX，GreenPJ，et al.Criteria for annotation of plant microRNAs.Plant Cell，2008，20：3186-3190.)。

鉴定到1个miRNA，命名为GhmiR171。

GhmiR171的序列如下(5′→3′)：UGAUUGAGCCGUGCCAAUAUC(序列1)。

野生型小RNA文库的测序次数(Q_WT)为753，突变体小RNA文库(Q_MU)的测序次数为362。

miRNA前体(pre-miRNA)序列的二级茎环结构是miRNA基因最显著的特点之一，也是所有miRNA鉴定方法都不可逾越的重要规则。

GhmiR171前体(pre-GhmiR171)序列如下(5′→3′)：

UACAGGGGAAAGCUGGUGAUUGAGCCGCGCCAAUAUCCCUUGCGCGAGUACCGGAUCACCGGUUUCGAUCAGCUCUGCGGCCUGAAUUAAUUGGUCUAUUAUUGCCUGCUGAAGCUGUUGGUUCGCCAUUUCAUCAGUCACUAUC(序列表的序列2)。

pre-GhmiR171能形成良好的茎环结构，成熟的miRNA从miRNA前体的茎部产生，完全符合miRNA前体的结构特征(见图2)。

也可人工合成序列1和序列2。

三、miRNA Northern杂交

为了进一步检测GhmiR171在开花前3天至开花后3天在棉花胚珠中的表达模式，采用miRNA Northern杂交检测其表达情况。

1、制备探针

检测GhmiR171的探针(5′→3′)的序列：GATATTGGCACGGCTCAATCA。

采用T4多聚核苷酸激酶(New England Biolabs)对上述序列末端磷酸基团进行同位素(γ-32P ATP)标记，得到探针，用Microspin G-25柱(GE Healthcare)纯化探针，去除未标记的同位素，纯化后的探针用于Northern杂交。

2、miRNA Northern杂交

Northern杂交中，每个泳道上样量为30μg总RNA，U6RNA作为内参，与miRNA在同一张膜上检测。U6基因的探针序列(5′→3′)为：TGTATCGTTCCAATTTTATCGGATGT。

(1)分别提取步骤一制备的各胚珠样品的总RNA。

(2)miRNA Northern杂交

①取30μg量的总RNA，加入等体积的2×RNA上样缓冲液(95％甲酰胺，18mMEDTA，0.1％溴酚蓝和0.1％二甲苯青)，混合后95℃变性5min，得到RNA样品。

②RNA样品用15％尿素变性聚丙烯酰胺凝胶电泳分离，随后用电转移装置(BIO-RAD)转移到HybondN+尼龙膜(Amersham Biosciences)上。

③转移有RNA样品的尼龙膜经6×SSC溶液短暂漂洗，紫外交联(Stratagene)5min，再80℃烘烤2h，使RNA完全固定在尼龙膜上。

④将转移了RNA的尼龙膜放入杂交管中，加入5ml ULTRAhyb-Oligo杂交液(Ambion)在杂交炉中42℃预杂交2h，然后加入探针，混匀，42℃杂交过夜。

⑤杂交结束后，小心倒出杂交液，加入含0.5％SDS的2×SSC溶液，42℃洗涤三次，每次10min。

⑥洗膜结束后，将膜用保鲜膜包裹，平整压于X光片下，附加增感屏，-70℃曝光2周。

⑦曝光结束后，冲洗X光片，进行光密度扫描，以对照组的杂交信号为1，计算各个样品杂交信号的相对强度。

结果见图3，Northern杂交结果显示，野生型(WT)中，GhmiR171在开花前3天至开花后3天，表达量呈现下降趋势，在突变体(MU)中，GhmiR171的表达量亦先下降后上升趋势，二者的表达谱不同，暗示了GhmiR171在棉花纤维发育过程中可能起重要的作用。

定量选用TotalLab软件对X光片上的条带进行光密度扫描，分别得到GhmiR171和U6 RNA的光密度值，二者的比值见图3中所标注的数值，即为各个胚珠样品中GhmiR171的相对含量。

实施例2、miRNA的靶基因预测与验证

由于植物miRNA与靶基因mRNA近乎完全互补，因此可以通过生物信息学方法预测GhmiR171的靶基因。采用在线软件psRNATarget(http://plantgrn.noble.org/psRNATarget/)在棉花EST数据库CGI10中寻找到能与miRNA序列近乎完全互补的cDNA或基因，即为miRNA的靶标；参数设置为：psRNATarget程序参数为默认设置，靶标的功能通过NCBI(http://www.ncbi.nlm.nih.gov/)同源性检索，以同源性最高的已知功能基因进行注释。

预测结果见表1。

表1GhmiR171的靶基因及功能

miRNA名称	预测靶基因	靶基因功能
			GhmiR171	ES822760	GRAS转录因子

GhmiR171的靶基因为GRAS转录因子基因ES822760(GenBank：ES822760.1，见序列表的序列4，其编码的蛋白质见序列表的序列3)。该基因在植物赤霉素信号通路以及根的发育中发挥着重要的作用(Hirsch S，and Oldroyd G.E.D.GRAS-domaintranscription factors that regulate plant development.Plant Signaling & Behavior，2009，4，698-700)。

赤霉素对棉花纤维分化、伸长和次生壁形成均有影响(王荣，崔百明，彭明，张根发.赤霉素信号转导与棉纤维的分子发育.遗传，2007，29：276-282.)。

实施例3、miRNA对靶基因mRNA的切割

GhmiR171对靶基因ES822760(见序列表的序列4)mRNA的切割用5′RACE方法进行验证(Jones-Rhoades M W，Bartel D P.Computational identification of plantmiRNAs and their targets，including a stress-induced miRNA.Mol.Cell，2004，14：787-799.)。靶基因mRNA被miRNA切割后，其较为稳定的3′切割产物5′端核苷酸磷酸基团暴露，用T4RNA连接酶在该切割产物5′端连接上5′RACE专用接头；通过反转录反应合成cDNA；通过靶基因特异的巢式外引物和试剂盒所带的巢式外引物进行第一轮PCR，靶基因特异的巢式内引物和试剂盒所带的巢式内引物进行第二轮PCR；将5′RACE获得的PCR产物连接到pMD 19-T载体(TaKaRa)后测序，就能知道精确的靶基因mRNA切割位点。

1、分别提取实施例1的步骤一制备的各胚珠样品的总RNA。

2、按Firstchoice RLM-RACE试剂盒(Ambion)操作说明进行5′RACE，靶基因特异的巢式外引物的序列(5′→3′)为：CGATAGGATGGTATGTCGAA，靶基因特异的巢式内引物的序列(5′→3′)为：ACAAACTGAACGAACGGCGAAACC。

3、PCR产物进行琼脂糖电泳，回收250bp左右的特异条带(图4中泳道1所示)。

4、将回收的PCR产物连接到pMD 19-T载体(TaKaRa)，并转化大肠杆菌DH5α感受态细胞(Invitrogen，SKU#18258-012)。

5、挑单克隆测序，根据测序结果确定靶基因mRNA的切割位点。

PCR产物的电泳图和测序结果显示的切割位点见图4。GhmiR171的靶基因在与其互补的区域发生了切割，这个结果强有力的证明了ES822760确实是GhmiR171体内真正调控的靶基因。

实施例4、靶基因的表达量分析

为了进一步考察GhmiR171的功能，用实时定量RT-PCR检测靶基因ES822760在开花前3天至开花后3天野生型及突变体棉花胚珠中的表达情况。

1、分别提取实施例1的步骤一制备的各棉花胚珠样品(1g)的总RNA。

2、总RNA加入DNaseⅠ(TaKaRa)，室温(25℃)放置30min以除去基因组DNA的污染。

3、加入终止缓冲液(50mM EDTA)后，70℃加热10min以变性DNaseⅠ和RNA。

4、采用TaKaRa RNA PCR Kit，用RNA合成cDNA模板，操作按试剂盒说明书进行。

5、采用Power SYBR Green PCR Master Mix(Applied Biosystems)在iCycler iQ5Multicolor实时定量PCR检测仪(Bio-Rad)上进行PCR扩增反应，通过比较CT值法(ΔΔCT值法)(Schmittgen T D.Real-Time Quantitative PCR.Methods，2001，25：383-385.)计算靶基因在不同样品中的相对表达量(野生型开花前3天基因的表达量设定为1)。靶基因的检测设置3个重复，结果取平均值。以棉花histone3基因(GenBank号为AF024716.1)作为内参。

扩增靶基因的引物如下(5′→3′)：

上游引物：TTCTCACACGCGCAAGGGAT；

下游引物：TAACAAACTGAACGAACGGC。

扩增histone3基因引物如下(5′→3′)：

上游引物：TCAAGACTGATTTGCGTTTCCA；

下游引物：GCGCAAAGGTTGGTGTCTTC。

结果见图5(横坐标的表示开花前3天(-3DPA)的到开花后3天(+3DPA))，靶基因ES822760开花后3天在野生型和突变体中的表达变化有明显的差异，通过和GhmiR171的表达(图1)进行比较，发现ES822760的表达和GhmiR171的表达呈现出明显的负相关性，即GhmiR171表达上调的时候，ES822760的表达就相应下调，这与miRNA对靶基因的负调控作用是完全一致的。实时定量PCR的结果进一步证明了ES822760确实是GhmiR171的靶基因。

Claims

1.序列表的序列1所示的RNA。

2.序列表的序列2所示的RNA。

3.权利要求1或2所述RNA在抑制GRAS转录因子基因表达中的应用；所述GRAS转录因子的氨基酸序列为序列表的序列3。

4.如权利要求2所述的应用，其特征在于：所述GRAS转录因子的基因的核苷酸序列为序列表的序列4。

5.权利要求1或2所述RNA在促进GRAS转录因子的基因的mRNA降解中的应用；所述GRAS转录因子的氨基酸序列为序列表的序列3。

6.如权利要求5所述的应用，其特征在于：所述GRAS转录因子基因的核苷酸序列为序列表的序列4；

7.权利要求1或2所述RNA在棉花纤维品质改良中的应用。