CN102286482A - EBF1基因mRNA的3’UTR在抑制基因表达中的应用 - Google Patents

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Abstract

本发明提供了EBF1基因mRNA的3’UTR在抑制基因表达中的应用，其是将编码EBF1 3’UTR的核苷酸序列与报告基因GFP重组后通过转基因整合至宿主基因组中，随宿主基因组进行表达，带有3’UTR的GFP与单独的GFP相比起蛋白产物明显减少。本发明还提供EBF1基因mRNA的3’UTR在调节植物生长发育中的应用。本发明首次发现了EBF1基因的3’UTR具有负调植物基因表达的作用。

Description

EBF1基因mRNA的3’UTR在抑制基因表达中的应用
技术领域
本发明属于基因工程领域，具体地说，涉及EBF1基因mRNA的3’UTR在抑制基因表达中的应用。
背景技术
植物激素乙烯信号转导中两个关键的转录因子EIN3/EIL1在蛋白水平上受到由两个F-Box类蛋白EBF1/EBF2所介导的泛素化降解调控。目前关于EBF1/EBF2基因功能的研究主要进展是被受体感知到的乙烯信号能够负调EBF1/EBF2蛋白积累(Plant Cell.2010Jul；22(7)：2384-401.)，从而使其蛋白量减少。但是对于这两个基因的mRNA的研究还没有人进行深入的研究，只是2004年曾有人报道(MolCell.2004 Jul 23；15(2)：173-83.)这两个基因的mRNA受到外切核酸酶EIN5的负调。
EBF1，EBF2基因成熟mRNA的3’UTR分别为695nt和590nt，至今为止还不清楚这么长的序列在生物体内是否具有某种特定的生物学功能。
发明内容
本发明的目的是提供EBF1基因mRNA的3’UTR在抑制基因表达中的应用。
为了实现本发明目的，本发明的EBF1基因mRNA的3’UTR在抑制基因表达中的应用，其是将编码EBF1 3’UTR的核苷酸序列与报告基因GFP编码序列重组得到一个结构为GFP-3’UTR的重组基因然后整合至宿主基因组中，并随宿主基因组进行表达。其中，所述宿主为植物，优选为拟南芥等。
前述编码EBF1 3’UTR的核苷酸序列如SEQ ID No：1所示，或该序列经替换、缺失或添加一个或几个核苷酸形成的具有EBF1 3’UTR同等功能的核苷酸序列。
本发明还提供EBF1基因mRNA的3’UTR在抑制植物生长发育中的应用。
本发明还提供EBF1基因mRNA的3’UTR在获得乙烯不敏感型转基因植物中的应用以及EBF1基因mRNA的3’UTR在抑制转基因植物中EIN3蛋白表达水平中的应用。过量表达EBF1基因3’UTR的拟南芥植物体内EIN3蛋白水平显著下调，具有明显的乙烯不敏感表型。
本发明首次发现了EBF1基因的3’UTR具有负调植物基因表达的功能，将3’UTR用于负调植物基因表达，具有以下优点：3’UTR为非编码序列其序列较短易于克隆，且植物过量表达3’UTR后可产生与过量表达EBF1基因编码序列相同的生物学效应。
附图说明
图1为载体pEGAD的结构示意图。
图2为将EBF1 3’UTR与载体pEGAD连接后的重组基因结构。
图3分别显示了转基因35S：：GFP-EBF1U/Col-0以及转基因35S：：GFP/Col-0拟南芥幼苗的三个部位，子叶、下胚轴、根尖的荧光强度。
图4为转基因植物mRNA及蛋白水平的检测结果。
图5为转基因植物的三重反应。
图6为转基因竹中EIN3蛋白水平的检测结果。
具体实施方式
以下实施例用于说明本发明，但不用来限制本发明的范围。
以下实施例中使用的试剂和材料均为市售商品。
实施例1  EBF1 mRNA 3’UTR的功能研究
构建一个新的重组基因。按照5’→3’方向从EBF1终止密码子TGA开始选取了长度为643nt的一段序列，以拟南芥基因组DNA为模板扩增目的片段，其核苷酸序列如SEQ ID No：1所示，扩增过程所使用的PCR反应体系为：
上述体系中所用引物序列如下：
正向引物5’-ATCGAATTCTGATCAACAATTCCACTGTC-3’；
反向引物5’-TGTGGATCCCATGAATAGTCTTAAAGGTG-3’。
PCR反应条件为：
Figure BDA0000058428240000032
然后利用EcoR I与BamH I两种内切酶分别消化目的片段与载体pEGAD(如图1所示)，然后使用T4连接酶将目的片段插入到载体中，最终的重组基因的结构如图2所示。
利用农杆菌侵染拟南芥花序将上述重组基因转移到野生型拟南芥Col-0中，并最终得到纯和的转基因植物(共3个独立的株系)，即基因型为35S：：GFP-EBF1U/Col-0的转基因植物。同时，利用相同的方法将标签蛋白GFP也转入到植物中得到基因型为35S：：GFP/Col-0的转基因植物(共3个独立的株系)，以此植物作为实验的对照组。
为了检测3’UTR的功能，将得到的转基因植物在荧光显微镜下进行GFP荧光强度观察，发现35S：：GFP-EBF1U/Col-0转基因植株荧光强度明显弱于35S：：GFP/Col-0转基因植株(图3)，这种差别在整个植物体中是一致的，图3给出了一棵拟南芥幼苗的三个部位：子叶、下胚轴、根尖。植物活体组织荧光强度检测说明带有EBF1 3’UTR的基因表达受到抑制。
为了进一步定量确认上述荧光强度观察结果，又利用GFP的抗体检测了相应转基因植物中GFP蛋白的含量，同时利用RT-PCR检测了GFP mRNA的含量。结果发现35S：：GFP-EBF1U/Col-0转基因植株与35S：：GFP/Col-0转基因植株相比虽然它们的GFP mRNA的水平相当，但GFP蛋白的水平前者明显低于后者(图4)。这进一步确定了带有EBF1 3’UTR的GFP基因其表达所受到的抑制是由3’UTR所造成的。
上述实验结果说明EBF1 mRNA 3’UTR作为一个顺式作用元件能抑制由mRNA到蛋白的翻译过程，同时也暗示EBF1 mRNA的3’UTR可能在EBF1基因本身的翻译过程中起负调作用。
实施例2  转基因植物三重反应
经典的乙烯反应就是人们所熟知的三重反应，具体表现为当施加乙烯时黄化苗呈现出下胚轴变短、变粗，根变短，顶端弯钩加剧。在含有10μM ACC(一种乙烯生物合成的前体)的培养基上生长3天的黄化苗，35S：：GFP-EBF1U/Col-0转基因植株与35S：：GFP/Col-0转基因植株相比具有明显的乙烯不敏感表型，如图5所示。具体分析发现后者的三重反应表型与野生型植物相同，而35S：：GFP-EBF1U/Col-0转基因植株其下胚轴长度，根长度均明显长于野生型，并且顶端弯钩消失。这说明35S：：GFP-EBF1U/Col-0转基因植株由于EBF1 3’UTR过量表达变得乙烯不敏感。
实施例3  转基因植物中EIN3蛋白水平检测
由于乙烯信号所引起的反应由两个最关键的转录因子EIN3/EIL1激活，因此，本发明进一步检测了35S：：GFP-EBF1U/Col-0转基因植株中转录因子EIN3/EIL1的蛋白水平。研究发现与野生型相比35S：：GFP-EBF1U/Col-0转基因植株中EIN3/EIL1的蛋白水平明显下调，如图6所示。之所以EBF1 3’UTR过量表达变得乙烯不敏感，就是因为EIN3蛋白水平下调。
从上面的结果可以看出，如果在植物中过表达EBF1 3’UTR就会引起植物对乙烯不敏感，并且与之相一致的是植物内源的EIN3蛋白水平会下调。
这给出了很好的提示，只需在植物体内过表达EBF1 3’UTR就可以使得EIN3蛋白水平下调，并且导致乙烯反应减弱。
虽然，上文中已经用一般性说明及具体实施方案对本发明作了详尽的描述，但在本发明基础上，可以对之作一些修改或改进，这对本领域技术人员而言是显而易见的。因此，在不偏离本发明精神的基础上所做的这些修改或改进，均属于本发明要求保护的范围。

Claims (9)

1.EBF1基因mRNA的3’UTR在抑制基因表达中的应用。
2.根据权利要求1所述的应用，其特征在于，其是将编码EBF13’UTR的核苷酸序列整合至宿主基因组中，随宿主基因组进行表达。
3.根据权利要求2所述的应用，其特征在于，其是将编码EBF13’UTR的核苷酸序列整合至宿主基因组中目的基因的3’端。
4.根据权利要求2或3所述的应用，其特征在于，所述编码EBF13’UTR的核苷酸序列如SEQ ID No：1所示。
5.根据权利要求2或3所述的应用，其特征在于，所述宿主为植物。
6.根据权利要求5所述的应用，其特征在于，所述宿主为拟南芥。
7.EBF1基因mRNA的3’UTR在抑制植物生长发育中的应用。
8.EBF1基因mRNA的3’UTR在获得乙烯不敏感型转基因植物中的应用。
9.EBF1基因mRNA的3’UTR在抑制转基因植物中EIN3蛋白表达水平中的应用。
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