CN102286072B - 一种抗金黄色葡萄球菌AgrC群体感应系统的AIP多肽衍生物及其应用 - Google Patents

一种抗金黄色葡萄球菌AgrC群体感应系统的AIP多肽衍生物及其应用 Download PDF

Info

Publication number
CN102286072B
CN102286072B CN 201110175328 CN201110175328A CN102286072B CN 102286072 B CN102286072 B CN 102286072B CN 201110175328 CN201110175328 CN 201110175328 CN 201110175328 A CN201110175328 A CN 201110175328A CN 102286072 B CN102286072 B CN 102286072B
Authority
CN
China
Prior art keywords
aip
mouse
agrc
staphylococcus aureus
aip030
Prior art date
Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
Expired - Fee Related
Application number
CN 201110175328
Other languages
English (en)
Other versions
CN102286072A (zh
Inventor
罗晓星
侯征
孟静茹
于茜
周颖
薛小燕
达飞
Current Assignee (The listed assignees may be inaccurate. Google has not performed a legal analysis and makes no representation or warranty as to the accuracy of the list.)
Fourth Military Medical University FMMU
Original Assignee
Fourth Military Medical University FMMU
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by Fourth Military Medical University FMMU filed Critical Fourth Military Medical University FMMU
Priority to CN 201110175328 priority Critical patent/CN102286072B/zh
Publication of CN102286072A publication Critical patent/CN102286072A/zh
Application granted granted Critical
Publication of CN102286072B publication Critical patent/CN102286072B/zh
Expired - Fee Related legal-status Critical Current
Anticipated expiration legal-status Critical

Links

Images

Landscapes

  • Measuring Or Testing Involving Enzymes Or Micro-Organisms (AREA)
  • Medicines That Contain Protein Lipid Enzymes And Other Medicines (AREA)

Abstract

本发明提供了两条抗金黄色葡萄球菌AgrC群体感应系统的AIP衍生物，这两条Auto-induced peptide(AIP)衍生物能够有效阻断金黄色葡萄球菌的AgrC群体感应系统，在金黄色葡萄球菌感染模型中能够有效抑制溶血素的释放，且具有毒性低的优点。本发明所述的AIP衍生物可用于制备抗敏感及耐药金黄色葡萄球菌的药物。

Description

一种抗金黄色葡萄球菌AgrC群体感应系统的AIP多肽衍生物及其应用
技术领域
本发明涉及2条抗金黄色葡萄球菌AgrC群体感应系统的Auto-induced peptide(AIP)衍生物及治疗金黄色葡萄球菌感染的应用。 
背景技术
金黄色葡萄球菌是人类化脓感染中最常见的病原菌，《2006-2007年度卫生部全国细菌耐药监测报告》报道了10409株金黄色葡萄球菌对12种临床常用抗菌药物的耐药率，发现对红霉素和克林霉素的耐药率分别高达82％和71％；对头孢唑啉(一代)、头孢呋辛(二代)、头孢西丁(二代)和头孢曲松(三代)的耐药率分别为56％、58％、56％和54％；对左氧氟沙星、苯唑西林、庆大霉素耐药率非常接近，在59～62％之间。对利福平的耐药率为31％；对万古霉素和替考拉宁均没有产生耐药性。表明金黄色葡萄球菌对除万古霉素和替考拉宁外，几乎对所有类别的抗生素都产生了耐药，且耐药率均很高，基本都在50％以上。 
人类滥用抗生素是导致细菌发生耐药的最主要原因之一，在持续的抗生素选择性压力作用下，细菌耐药是一个必然发生的事件，每一种新的抗生素一经问世，很快便会产生耐药。因此采用经典策略研发的抗生素很难从根本上解决细菌耐药问题。探索和研制不易诱导细菌产生耐药的抗菌新策略和新药物是当今世界各国科学家必须面对的紧迫研究课题。群体感应(Quorum Sensing，QS)系统是广泛存在于细菌内的一种群体行为调控机制，它不仅控制细菌间的信息交流和细菌的多种生命活动，而且也是致病菌生物被膜形成、毒力因子释放、致病力大小，以及耐药性发生的重要调控系统。其中在革兰氏阳性葡萄球菌的QS系统中，AgrC尤为重要。当AgrC与同源或非同源自诱导肽(Autoinducing peptides，AIPs)结合后，AgrC开始启动自磷酸化，继而又触发转录因子AgrA的磷酸化过程，随后AgrA结合到启动子P2和P3基因间的区域，最终启动RNAIII的转录，诱导多种致病葡萄球菌外毒素的产生和生物被膜的形成；同时AgrC激活后还可诱导自身正反馈调控机制，诱导表达和释放内源性AIP，激活AgrC，进一步增强致病毒力因子的表达和释放。由于人类细胞膜表面不表达AgrC，AIP衍生物不会与人体细胞结合，因此是识别金黄色葡萄球菌的理想配体。通过干扰QS系统发挥抗菌作用是抗菌新策略研究领域的最新热点，以QS系统信号分子为靶点的新型抗菌药物研究，代表着不诱导耐药新型抗菌剂研究的新趋势，也是新型抗菌药物研究领域最有希望的突破口。 
体内外实验证实，AIP(YSPWTNF-NH2)可以作为AgrC的抑制剂，选择性阻断AgrC介导的QS系统信号传递，抑制致病葡萄球菌外毒素的产生和生物被膜的形成，降低致病毒力因子的表达和释放。本发明对AIP序列YKPITNF-NH2进行改造，得到了2条抗金黄色葡萄球菌AgrC群体感应系统的AIP衍生物。 
发明内容
本发明需要解决的技术问题之一是提供2条抗金黄色葡萄球菌AgrC群体感应系统的AIP衍生物。 
本发明需要解决的技术问题之二是公开所述2条抗AgrC群体感应系统的AIP衍生物的抗敏感及耐药金黄色葡萄球菌的应用。 
本发明的构思如下：以已知AIP(YKPITNF-NH2)(本文命名为AIP001)为参照，应用ChemBioDraw和Accelrys/InsightII分子模型软件包进行空间结构分析，对其进行改造。 
本发明提供的AIP衍生物是在对已知AIP001的序列、结构分析的基础上设计合成的，它们的名称及序列分别为：AIP030(YKPVTNF-NH2)和AIP 031(YKPLTNF-NH2)。 
所述的AIP衍生物，羧基末端全部酰胺化修饰。 
采用微量稀释法检测这两条AIP衍生物体外是否具有抗金黄色葡萄球菌ATCC29213的活性。结果表明本发明制备出的这两条AIP衍生物和AIP001均无杀菌活性。 
本发明还检测了AIP衍生物是否对人体红细胞具有溶血霉性，实验结果表明，AIP030和AIP031在128μg/ml时，都没有发生溶血。 
采用AIPs对金黄色葡萄球菌ATCC29213所致的BALB/c小鼠脓毒血症的治疗作用。AIP衍生物对S.aureus所致的BALB/c小鼠脓毒血症的治疗作用结果证明，AIP001与改造后的AIP衍生物AIP030、AIP031均能明显延长BALB/c小鼠的生存时间、提高小鼠的生存率；且AIP030在延长小鼠生存时间上优于AIP031和AIP001。 
通过金黄色葡萄球菌ATCC29213感染BALB/c小鼠败血症实验，测定小鼠血液内CFU的含量。结果证明，AIP001、AIP030、AIP031能够明显抑制小鼠血液内细菌的生长，且AIP030在抑制血液细菌生长上优于AIP031和AIP032。 
通过红细胞溶血实验间接测定AIPs作用后小鼠血清中溶血素的分泌情况。结果表明模型组小鼠感染8h和30h较其它组血清中分泌有大量溶血素；AIP030和AIP031组血清中分泌较少溶血素；并且AIP030组血清分泌的溶血素无论8h和30h均最少。 
采用AIPs对耐甲氧西林金黄色葡萄球菌(MRSA)所致的BALB/c小鼠脓毒血症的治疗作用。AIP衍生物对MRSA所致的BALB/c小鼠脓毒血症的治疗作用结果证明，AIP001与改造后的AIP衍生物AIP030、AIP031均能明显延长BALB/c小鼠的生存时间、提高小鼠的生存率；且AIP030在提高小鼠的生存率上优于AIP031和AIP001。 
附图说明
现结合附图和实施例对本发明的内容作进一步说明。 
图1是AIPs体外抗菌活性(MIC)； 
图2是AIPs的溶血曲线； 
图3是金黄色葡萄球菌ATCC29213脓毒血症模型中，AIPs作用于BALB/c小鼠后的生长曲线； 
图4是金黄色葡萄球菌ATCC29213脓毒血症模型中，小鼠血液内CFU含量的测定； 
图5是金黄色葡萄球菌ATCC29213脓毒血症模型中，AIPs作用后小鼠血清中溶血素分泌的测定； 
图6是MRSA脓毒血症模型中，AIPs作用于BALB/c小鼠后的生长曲线。 
具体实施方式
下面通过具体实施例，进一步详述本发明。 
实施例1 AIPs体外抗菌活性的测定。 
第一步，倍比稀释药物。称取2mg药物加入1ml稀释液中混匀，药物原液浓度为2mg/ml。原液稀释好以后用过滤法除菌，小量分装备用。512μl原液加入488μl M-H肉汤培养基中，混合后抗菌药物的最高浓度为1024μg/ml。吸取100μl最高浓度的药物加入每排第1号孔内，l号孔经混合后吸出100μl，加入2号内，依次倍比稀释至10号后，吸出100μl弃去，这样药物的梯度浓度依次为512、256、128、64、32、16、8、4、2、1μg/ml。 
第二步，复苏细菌。取冻存于-20℃的检测菌，划线接种于M-H琼脂培养基，在孵箱(35±2℃)中孵育20～24h。次日挑取单克隆菌落，接种于2ml营养肉汤中，180rpm、37℃摇菌过夜。处于对数生长期的细菌菌液，稀释后的菌液应在15min内接种。 
第三步，菌株接种。用微量加样器取100μl稀释后的菌液依次加到96孔板中，最终接种细菌浓度为每孔5×105/ml。这时从第1孔到第10孔药物的浓度依次为256、128、64、32、16、8、4、2、1、0.5μg/ml。将96孔板置微型振荡器上振荡1min，使各孔内菌液混匀，微 孔板加盖以减少孵育过程中的蒸发，并置湿盒内35℃孵育16～20h。同时每组设无药生长对照孔(即第11孔内只加100μl M-H肉汤和100μl复苏后的菌液，不加药物)和无菌对照孔(即第12孔内只加200μl M-H肉汤)。 
第四步，判断结果。无菌对照孔在整个试验过程中始终保持清亮，表明整个实验是无菌操作。与生长对照孔中细菌生长特性(如微孔内肉汤呈混浊状，孔底出现沉淀等)相比较进行判断，无肉眼可见生长的最低药物浓度为测定药物对检测菌的MIC。 
结果如图1所示，CLSI规定苯唑西林、万古霉素对此菌的标准范围分别是0.12～0.5μg/ml和0.5～2μg/ml，测得苯唑西林对此菌的MIC值为0.25和0.5，均符合它们各自的标准范围，说明实验方法准确可靠。3条多肽AIP001、AIP030和AIP031的MIC均≥256μg/ml，表明它们在体外均无抗菌活性。 
实施例2 AIPs的溶血毒性的测定。 
第一步，取抗凝的新鲜小鼠外周血，3000r/min离心10min，分层后吸取下层的血细胞，加入0.01M PBS缓冲液重悬、洗涤以去除血浆和棕黄色血膜层，重复3次，最后重悬于不同体积的0.01M PBS中，得到4％和20％的红细胞悬液。 
第二步，取100μl重悬的红细胞和100μl二倍梯度稀释的抗菌肽(红细胞终浓度为2％)，在37℃的孵箱中孵育。 
第三步，1h后，将反应液离心，540nm处测其光密度值。 
第四步，红细胞悬液与等体积0.01M PBS孵育的OD540作为0％溶血，与等体积Triton-100(终浓度1％)孵育的OD540100％对照。以抗菌肽浓度为横坐标，ΔOD％为纵坐标绘制曲线，求得50％溶血的抗菌肽浓度HC50。 
结果如图2所示，AIP001、AIP030和AIP031在128μg/ml时，都没有发生溶血，而TritonX-100在2.5μg/ml时，发生明显的溶血反应。 
实施例3 BALB/c小鼠金黄色葡萄球菌ATCC29213脓毒血症模型中，BALB/c小鼠生存曲线的测定。 
BALB/c小鼠腹腔注射一定量的S.aureus混悬液构建脓毒血症模型，小鼠感染1h后，给予小鼠10mg/kg AIP030、AIP031，另外一组给予抗生素盐酸去甲万古霉素治疗，连续观察7天，记录小鼠的生存时间。 
结果如图3所示，AIP001与改造后的AIP衍生物AIP030、AIP031均能明显延长BALB/c小鼠的生存时间、提高小鼠的生存率；且AIP 030在延长小鼠生存时间上优于AIP031和AIP001。7天后，AIP030、AIP031、AIP001小鼠的存活率分别为77.78％、77.78％和77.78％。表明AIP030、AIP031、AIP001能够明显提高BALB/c小鼠的生存率。 
实施例4金黄色葡萄球菌ATCC29213脓毒血症模型中，小鼠血液内CFU含量的测定。 
第一步，BALB/c小鼠腹腔注射一定量的S.aureus混悬液构建脓毒血症模型，小鼠感染1h后，给予小鼠10mg/kg AIP030、AIP031，另外一组给予抗生素盐酸去甲万古霉素治疗。 
第二步，感染30h后，小鼠眼眶取血，进行108倍稀释，每个数量级吸取50μl稀释菌液均匀涂布于M-H琼脂培养基表面，35℃恒温孵育48h，计数CFU。 
结果如图4所示，对照组小鼠血液中均有大量S.aureus存在(菌落数在1010～1012之间)；AIP030组中血液中的S.aureus菌落数较降低(菌落数在106～107之间)；AIP031和AIP032组血液中的S.aureus菌落数相似(菌落数在107～108之间)万古霉素组的血液中的S.aureus菌落数也有所降低(菌落数在105～107之间)。说明AIP衍生物作用QS系统的AgrC上能够明显抑制小鼠血液内细菌的生长。 
实施例5血清中溶血素的测定。 
第一步，BALB/c小鼠腹腔注射一定量的S.aureus混悬液构建脓毒血症模型，小鼠感染1h后，给予小鼠10mg/kg AIP030、AIP031，另外一组给予抗生素盐酸去甲万古霉素治疗。 
第二步，感染8h和30h后，小鼠分别眼眶取血，离心，取血清25μl，与75μl红细胞悬 液(终浓度为2％)35℃恒温共孵育24h，测定红细胞悬液的OD540，比较感染8h和30h血清中溶血素分泌情况。 
结果如图5所示，模型组小鼠感染8h和30h较其它组血清中分泌有大量溶血素；AIP030和AIP031组血清中分泌较少溶血素；并且AIP030组血清分泌的溶血素无论8h和30h均最少，说明AIP衍生物AIP030作用QS系统的AgrC上能够明显减轻脓毒血症小鼠炎症反应。 
实施例6 BALB/c小鼠MRSA脓毒血症模型中，BALB/c小鼠生存曲线的测定。 
BALB/c小鼠腹腔注射一定量的MRSA混悬液构建脓毒血症模型，小鼠感染1h后，给予小鼠10mg/kg AIP030、AIP031，另外一组给予抗生素盐酸去甲万古霉素治疗，连续观察7天，记录小鼠的生存时间。 
结果如图6所示，AIP001与改造后的AIP衍生物AIP030、AIP031均能明显延长BALB/c小鼠的生存时间、提高小鼠的生存率；且AIP030在延长小鼠生存时间上优于AIP031和AIP001。7天后，AIP030、AIP031、AIP001小鼠的存活率分别为45.45％、27.27％和18.18％。表明AIP030、AIP031、AIP001能够明显提高BALB/c小鼠的生存率。 
Figure IDA0000373730500000011

Claims (2)

1.2条Auto-induced peptide(AIP)衍生物AIP030和AIP031，其特征在于，其氨基酸序列为：
Figure FDA0000374882870000011
式中英文缩写表示：Asn天冬酰胺，Leu亮氨酸，Lys赖氨酸，Phe苯丙氨酸，Pro脯氨酸，Thr苏氨酸，Tyr酪氨酸，Val缬氨酸。
2.权利要求1所述的2条Auto-induced peptide(AIP)衍生物AIP030和AIP031在制备治疗金黄色葡萄球菌ATCC29213或耐甲氧西林金黄色葡萄球菌（MRSA）所致的BALB/c小鼠脓毒血症药物中的用途。
CN 201110175328 2011-06-27 2011-06-27 一种抗金黄色葡萄球菌AgrC群体感应系统的AIP多肽衍生物及其应用 Expired - Fee Related CN102286072B (zh)

Priority Applications (1)

Application Number Priority Date Filing Date Title
CN 201110175328 CN102286072B (zh) 2011-06-27 2011-06-27 一种抗金黄色葡萄球菌AgrC群体感应系统的AIP多肽衍生物及其应用

Applications Claiming Priority (1)

Application Number Priority Date Filing Date Title
CN 201110175328 CN102286072B (zh) 2011-06-27 2011-06-27 一种抗金黄色葡萄球菌AgrC群体感应系统的AIP多肽衍生物及其应用

Publications (2)

Publication Number Publication Date
CN102286072A CN102286072A (zh) 2011-12-21
CN102286072B true CN102286072B (zh) 2013-12-18

Family

ID=45332847

Family Applications (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
CN 201110175328 Expired - Fee Related CN102286072B (zh) 2011-06-27 2011-06-27 一种抗金黄色葡萄球菌AgrC群体感应系统的AIP多肽衍生物及其应用

Country Status (1)

Country Link
CN (1) CN102286072B (zh)

Families Citing this family (2)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN107188937B (zh) * 2016-09-21 2021-02-09 中国人民解放军第四军医大学 一种抗多重耐药葡萄球菌感染药物rip1183的制备方法
CN112481278B (zh) * 2020-12-09 2023-02-21 江南大学 一种基于aip诱导的生物传感器及其应用

Citations (4)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN101175507A (zh) * 2005-04-04 2008-05-07 N·巴拉班 Rip在治疗金黄色葡萄球菌感染中的应用
CN101189020A (zh) * 2005-05-10 2008-05-28 N·巴拉班 用于给予rnaⅲ-抑制肽的组合物
CN101200483A (zh) * 2007-05-11 2008-06-18 中国人民解放军第四军医大学 抗耐甲氧西林金黄色葡萄球菌耐药基因的反义核酸
CN101418294A (zh) * 2008-12-01 2009-04-29 中国人民解放军第四军医大学 抗耐甲氧西林金黄色葡萄球菌耐药基因mecA的反义核酸

Patent Citations (4)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN101175507A (zh) * 2005-04-04 2008-05-07 N·巴拉班 Rip在治疗金黄色葡萄球菌感染中的应用
CN101189020A (zh) * 2005-05-10 2008-05-28 N·巴拉班 用于给予rnaⅲ-抑制肽的组合物
CN101200483A (zh) * 2007-05-11 2008-06-18 中国人民解放军第四军医大学 抗耐甲氧西林金黄色葡萄球菌耐药基因的反义核酸
CN101418294A (zh) * 2008-12-01 2009-04-29 中国人民解放军第四军医大学 抗耐甲氧西林金黄色葡萄球菌耐药基因mecA的反义核酸

Non-Patent Citations (4)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Title
"Confinement-induced quorum sensing of individual Staphylococcus aureus bacteria";Eric C Carnes等;《Nature Chemical Biology》;20091122;第6卷(第1期);第41-45页 *
"Quorum-sensing systems in staphylococci as therapeutic targets";Niamh Harraghy等;《Anal Bioanal Chem》;20061028;第387卷(第2期);第437-444页 *
Eric C Carnes等."Confinement-induced quorum sensing of individual Staphylococcus aureus bacteria".《Nature Chemical Biology》.2009,第6卷(第1期),第41-45页.
Niamh Harraghy等."Quorum-sensing systems in staphylococci as therapeutic targets".《Anal Bioanal Chem》.2006,第387卷(第2期),第437-444页.

Also Published As

Publication number Publication date
CN102286072A (zh) 2011-12-21

Similar Documents

Publication Publication Date Title
Silva et al. Myricetin protects Galleria mellonella against Staphylococcus aureus infection and inhibits multiple virulence factors
Vilela et al. Lactobacillus acidophilus ATCC 4356 inhibits biofilm formation by C. albicans and attenuates the experimental candidiasis in Galleria mellonella
Xiong et al. Role of the serine-rich surface glycoprotein GspB of Streptococcus gordonii in the pathogenesis of infective endocarditis
Çam et al. The effects of temperature, pH, and iron on biofilm formation by clinical versus environmental strains of Vibrio vulnificus
Appleman et al. Efficacy of vancomycin and daptomycin against Staphylococcus aureus isolates collected over 29 years
Molhoek et al. A cathelicidin-2-derived peptide effectively impairs Staphylococcus epidermidis biofilms
Ibrahim et al. Disruption of methicillin-resistant Staphylococcus aureus protein synthesis by tannins
Kanakadandi et al. The Austrian syndrome: a case report and review of the literature
Daniel et al. Significance of Staphylococcus Haemolyticus in Hospital Acquired Infections.
Kaku et al. Antimicrobial and immunomodulatory effects of tedizolid against methicillin-resistant Staphylococcus aureus in a murine model of hematogenous pulmonary infection
CN102286072B (zh) 一种抗金黄色葡萄球菌AgrC群体感应系统的AIP多肽衍生物及其应用
Irani et al. The inhibitory effect of the combination of two new peptides on biofilm formation by Acinetobacter baumannii
Arsene et al. Prolonged exposure to antimicrobials induces changes in susceptibility to antibiotics, biofilm formation and pathogenicity in Staphylococcus aureus
WO2010147145A1 (ja) 抗グラム陰性菌剤
Sivakamavalli et al. Purification of WAP domain-containing antimicrobial peptides from green tiger shrimp Peaneaus semisulcatus
Castanheira et al. Update of the in vitro activity of daptomycin tested against 6710 Gram-positive cocci isolated in North America (2006)
Thangamani et al. Antibacterial activity and therapeutic efficacy of Fl-PRPRPL-5, a cationic amphiphilic polyproline helix, in a mouse model of staphylococcal skin infection
Xu et al. Therapeutic potential of kaempferol on Streptococcus pneumoniae infection
Gillis et al. Vancomycin-tolerance among clinical isolates of Streptococcus pneumoniae in Mississippi during 1999-2001
Savithri et al. Epidemiology and significance of coagulase-negative staphylococci isolated in blood cultures from critically ill adult patients
Tan et al. Four temporin-derived peptides exhibit antimicrobial and antibiofilm activities against methicillin-resistant Staphylococcus aureus: Anti-MRSA peptides derived from temporin
Hagiya et al. Emergence of Daptomycin-Resistant Staphylococcus aureus during treatment
Geertsema et al. Bovine plasma proteins increase virulence of Haemophilus somnus in mice
Kimura et al. Factors affecting the course and severity of transnasally induced Staphylococcus aureus pneumonia in mice
CN107827957A (zh) 抗临床多重耐药菌小肽

Legal Events

Date Code Title Description
C06 Publication
PB01 Publication
C10 Entry into substantive examination
SE01 Entry into force of request for substantive examination
C14 Grant of patent or utility model
GR01 Patent grant
CF01 Termination of patent right due to non-payment of annual fee
CF01 Termination of patent right due to non-payment of annual fee

Granted publication date: 20131218

Termination date: 20160627