CN102277350A - 单载体的多环芳烃降解菌剂及其制备方法 - Google Patents
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Abstract
本发明公开了一种单载体的多环芳烃降解菌剂，其由Mycobacterium vanbaalenii.PYR-1菌悬液和作为载体的黑炭组成，Mycobacterium vanbaalenii.PYR-1菌悬液与黑炭的体积/质量比为：每20～50ml的菌悬液中加入15g的黑炭；每ml的菌悬液中含有5.0～6.0*108CFU的Mycobacterium vanbaalenii.PYR-1菌体。本发明还同时公开了上述单载体的多环芳烃降解菌剂的制备方法。本发明的多环芳烃降解菌剂用于降解多环芳烃。
Description
技术领域
本发明属于微生物菌剂领域，具体地，涉及一种含有分支杆菌的多环芳烃降解微生物菌剂。
背景技术
多环芳烃(Polycyclic aromatic hydrocarbons，简称PAHs)是环境中普遍存在的一类有机污染物，它通常是指一类含有两个或两个以上的苯环，以线性、角状或簇状排列的稠环型化合物，具有熔点和沸点较高、疏水性强、蒸汽压小、正辛醇-水分配系数高等特性。
多环芳烃最突出的特性是具有强致癌性、致畸性及致突变性，并且它具有较高的亲脂性，可通过食物链进入人体，对人类健康和生态环境具有很大的潜在危害。随着煤、石油等在工农业生产、交通运输及生活中的广泛应用，由此而产生的多环芳烃已引起各国环境科学家极大的重视，是美国环保局制定的129种优先污染物的一类。
由于多环芳烃本身的性质，常规方法难以将其从环境中去除，微生物修复技术由于其成本低，无二次污染，被认为是修复多环芳烃环境污染的重要手段之一。可以降解多环芳烃的微生物被不断报道，从上个世纪80年代开始，随着分子生化分析水平的提高，各国的科学家就陆续分离得到了各种具有降解多环芳烃能力的微生物，常见微生物有红球菌属(Rhodococcus)、假单胞菌属(Pseudomonas)、分枝杆菌(Mycobacterium)、芽抱杆菌属(Bacillus)、海杆菌属(marinobacter)、鞘氨醇单胞菌属(Sphingomonas)、新鞘氨醇杆菌属(Novosphingomonas)、气单胞菌属(Aeromonas)、弧菌属(Vibrio)、拜叶林克氏菌属(Beijernckia)、棒状杆菌属(Corynebacterium)、微球菌属(Micrococcus)、蓝细菌(Cyanobacteria)、诺卡氏菌属(Nocardioides)、解环菌属(Cycloclastieus)和Stappia属等。其中分支杆菌是一类非常重要的降解细菌。
黑碳(BC)是化石燃料和生物质不完全燃烧生成的具有高度芳香化结构的含碳颗粒物，元素组成以C为主(占60％以上)，其次为H、O、N、S，它在环境大气圈、水圈、生物圈、土壤和岩石中无处不在，全球每年产生的BC主要源于生物质燃烧。
黑碳表面具有不均匀性，大部分碳原子所形成的石墨状微晶是无规则排列，为典型的非石墨化碳结构。
发明内容
本发明要解决的技术问题是提供一种成本低、降解效果好、无二次污染的单载体的多环芳烃降解菌剂及其制备方法。
为了解决上述技术问题，本发明提供一种单载体的多环芳烃降解菌剂，其由Mycobacterium vanbaalenii.PYR-1菌悬液和作为载体的黑炭组成，Mycobacteriumvanbaalenii.PYR-1菌悬液与黑炭的体积/质量比为：每20～50ml的Mycobacterium vanbaalenii.PYR-1菌悬液中加入15g的黑炭；
每ml的Mycobacterium vanbaalenii.PYR-1菌悬液中含有5.0～6.0*108CFU的Mycobacterium vanbaalenii.PYR-1菌体。
本发明还同时提供了上述单载体的多环芳烃降解菌剂的制备方法，包括如下步骤：
1)、菌悬液的制备：
利用Mycobacterium vanbaalenii.PYR-1的单菌落制备Mycobacterium vanbaalenii.PYR-1菌悬液，每ml的Mycobacterium vanbaalenii.PYR-1菌悬液中含有5.0～6.0*108CFU的Mycobacterium vanbaalenii.PYR-1菌体；
2)、载体原料的准备：
黑炭用0.005～0.015mol/L的HCL调至中性(即pH值≈7)，干燥至恒重后待用；
3)、先将步骤2)所得的黑炭进行灭菌(为常规的高压蒸汽灭菌)，然后加入步骤1)所得的Mycobacterium vanbaalenii.PYR-1菌悬液，每15g步骤2)所得的黑炭中加入20～50ml的Mycobacterium vanbaalenii.PYR-1菌悬液；再加入30～50ml的无菌水；均匀混合后冷冻干燥，得单载体的多环芳烃降解菌剂。
加入无菌水的目的是使载体(即黑炭)处于悬浮状态，从而方便菌悬液与载体的充分混匀。
作为本发明的单载体的多环芳烃降解菌剂的制备方法的改进，步骤1)为：
挑取Mycobacterium vanbaalenii.PYR-1的单菌落接种于装有LB培养基的三角瓶中，于30℃，120rpm避光水浴振荡培养46～50小时；然后调节至每ml的Mycobacterium vanbaalenii.PYR-1菌悬液中含有5.0～6.0*108CFU的Mycobacterium vanbaalenii.PYR-1菌体。
作为本发明的单载体的多环芳烃降解菌剂的制备方法的进一步改进：步骤3)中的冷冻干燥为：于-56～-50℃干燥22～26h。
作为本发明的单载体的多环芳烃降解菌剂的制备方法的进一步改进：LB培养液的制备方法如下：在每升水中加入酵母提取物(酵母膏)5g、蛋白胨10g和Nacl 5g，然后用NaOH调PH 7.4～7.6。
本发明是以菌株Mycobacterium vanbaalenii PYR-1的富集液为有效成份，将其有效的吸附于黑炭颗粒载体上，冷冻干燥后制成固体颗粒状的多环芳烃降解菌剂。
在本发明中，菌Mycobacterium vanbaalenii.PYR-1，即为分支杆菌PYR-1，分类命名为Mycobacterium vanbaalenii，菌株编号为PYR-1，可购于德国的微生物菌种保藏中心公司(详见www.dsmz.de)。黑炭，购买自海诺炭业，为100目干粉。
在本发明中，多环芳烃是指辛醇水分配系数较高的四环的芘。
在本发明中，可利用控制OD600值来调节每ml的Mycobacterium vanbaalenii.PYR-1菌悬液中含有的Mycobacterium vanbaalenii.PYR-1菌体的量。例如：当调节OD600＝0.6左右，该菌悬液含有约为5.3*108CFU的菌体。
本发明所得的单载体的多环芳烃降解菌剂无菌装袋封口，常温干燥保存，保存期一般为1～3年。
研究表明BC具有多孔性和高比表面积以及丰富的表面官能团，对有机化合物有较高的亲和力从而对PAHs有很强的吸附作用。基于黑炭的此种性质，微生物可以以黑炭为存在介质，保持生命活力。因此，以黑炭为载体的PAHs降解菌剂有广阔的发展应用前景。
本发明具有如下优点：
1.成本低。黑碳(BC)是化石燃料和生物质不完全燃烧生成的具有高度芳香化结构的含碳颗粒物，在环境大气圈、水圈、生物圈、土壤和岩石中无处不在，全球每年产生的BC主要源于生物质燃烧。由于黑炭来源广泛，成本低廉，产量巨大，因此可大量应用于实际。黑炭成本较低，无毒性，同时可以改良土壤结构，为微生物提供养分和生存空间，是作为载体很好的选择。
2.本发明的使用的多环芳烃降解菌PYR-1，对环境条件要求不苛刻。对温度、氧气量也没用特别严格的要求，同时使用方法简单，易于操作。
3.应用效果好，降解效率高。本发明利用成本较低的黑炭为菌剂载体，黑炭本身也具有很强的吸附能力，可以吸附环境中的PAHs；同时，分支杆菌PYR-1，是多环芳烃的高效降解菌株，二者结合，能有效的降解吸附环境中的多环芳烃污染。并且，实施于环境中不会造成二次污染，可大面积推广使用。
本发明的实际用法和用量如下：
在水中加入多环芳烃降解菌剂制成悬浊液，每L悬浊液中含有0.5～10g多环芳烃菌剂，然后喷洒于土壤上，按土壤中多环芳烃浓度10ppm计，每亩土壤中多环芳烃降解菌剂的用量为2～5kg。
附图说明
下面结合附图对本发明的具体实施方式作进一步详细说明。
图1为本发明的单载体的多环芳烃降解菌剂的吸附降解效果图。
具体实施方式
下面通过实施例对本实验作进一步详细说明。
实施例1、一种单载体的多环芳烃降解菌剂的制备方法，依次进行如下步骤：
1)、菌悬液的制备：
将Mycobacterium vanbaalenii.PYR-1的单菌落接种于装有LB培养基的三角瓶中，于30℃，120rpm避光水浴振荡培养48h。得菌悬液。将上述菌悬液调至OD600＝0.6左右，即每ml的Mycobacterium vanbaalenii.PYR-1菌悬液中含有5.3*108CFU的Mycobacteriumvanbaalenii.PYR-1菌体。
LB培养液的制备方法如下：在每升水中加入酵母提取物(酵母膏)5g、蛋白胨10g和Nacl 5g，用NaOH调PH 7.4～7.6，然后经常规的高压灭菌而得。
2)、载体原料的准备：
将黑炭(为100目)用0.01mol/L的HCL洗涤至中性(即pH≈7)，自然风干至恒重后待用。
3)、称取15g步骤2)所得的黑炭进行常规的高压蒸汽灭菌3次，每次30分钟；然后加入30ml步骤1)所得的Mycobacterium vanbaalenii.PYR-1菌悬液，再加入40ml无菌水；均匀混合后于-53℃干燥24h，得约15g的单载体的多环芳烃降解菌剂。
所得的单载体的多环芳烃降解菌剂装袋封口，常温干燥保存，保存期一般为1～3年。
实例1、
将0.05克芘(辛醇水分配系数较高的四环的芘)溶于100ml丙酮，配制成500ppm芘的母液，将芘的母液1ml添加到10ml矿质培养液中，使芘的最终浓度50ppm。静置过夜，待丙酮完全挥发后，称取0.1g菌剂(即实施例1所得的单载体的多环芳烃降解菌剂)加入，于30℃，120rpm，避光培养6天，分别在第0、3、6天测定芘的残留量，以不加菌剂的矿质培养液为空白对照，设三个重复。
该矿质培养液的配方为(每升)：K2HPO4 4g，Na2HPO4 4g，(NH4)2SO4 2g，MgSO4·7H2O 0.2g，CaCL2 1mg，FeSO4·7H2O 1mg，其余为水；用NaOH调PH≈7；然后经常规的高压灭菌而得。
芘的残留量测定：用20ml正己烷分四次将所述培养液洗至50ml离心管，斡旋，过0.22μm滤膜，用GC-MASS测定其芘含量。
经过6天的降解实验，芘的浓度从最初添加的50ppm，经由第0天的直接吸附，降至14.7ppm，在第3天基本吸附降解完全，芘的浓度减少至0.828ppm，降解效率可达98％。至第6天时，芘的浓度为0.914ppm，与第三天芘的浓度基本没差异，说明被吸附在黑炭上的芘并没有释放出来。
而空白对照的结果为：在同样的时间内，CK中芘的浓度保持在50mg/kg左右，未见明显的下降趋势。
通过上述实验，我们能得到以下结论：实验结果说明本发明的菌剂对液体环境下高环多环芳烃的修复效果非常好，且修复速度快。
对比例1、
将上述实例1中的0.1g菌剂改成0.2ml的实施例1的步骤1)所得的Mycobacteriumvanbaalenii.PYR-1菌悬液(即每ml的Mycobacterium vanbaalenii.PYR-1菌悬液中含有5.3*108CFU的Mycobacterium vanbaalenii.PYR-1菌体)，即，保证Mycobacteriumvanbaalenii.PYR-1菌体有效用量一致。其余均等同。
结果为：当液体环境下芘的浓度为50ppm时，经过6d处理，添加菌悬液的处理其浓度降为27.6ppm，降解率为44.8％，如图1所示。与实例1中使用本发明的单载体的多环芳烃降解菌剂的降解效果相比，本发明的效果明显高于单纯的Mycobacterium vanbaalenii.PYR-1菌悬液。
说明：本发明的单载体的多环芳烃降解菌剂更加具有降解多环芳烃的优势。
最后，还需要注意的是，以上列举的仅是本发明的一个具体实施例。显然，本发明不限于以上实施例，还可以有许多变形。本领域的普通技术人员能从本发明公开的内容直接导出或联想到的所有变形，均应认为是本发明的保护范围。
Claims (5)
1.单载体的多环芳烃降解菌剂，其特征是：由Mycobacterium vanbaalenii.PYR-1菌悬液和作为载体的黑炭组成，所述Mycobacterium vanbaalenii.PYR-1菌悬液与黑炭的体积/质量比为：每20～50ml的Mycobacterium vanbaalenii.PYR-1菌悬液中加入15g的黑炭；
所述每ml的Mycobacterium vanbaalenii.PYR-1菌悬液中含有5.0～6.0*108CFU的Mycobacterium vanbaalenii.PYR-1菌体。
2.如权利要求1所述的单载体的多环芳烃降解菌剂的制备方法，其特征是包括如下步骤：
1)、菌悬液的制备：
利用Mycobacterium vanbaalenii.PYR-1的单菌落制备Mycobacterium vanbaalenii.PYR-1菌悬液，所述每ml的Mycobacterium vanbaalenii.PYR-1菌悬液中含有5.0～6.0*108CFU的Mycobacterium vanbaalenii.PYR-1菌体；
2)、载体原料的准备：
黑炭用0.005～0.015mol/L的HCL调至中性，干燥；
3)、先将步骤2)所得的黑炭进行灭菌，然后加入步骤1)所得的Mycobacteriumvanbaalenii.PYR-1菌悬液，所述每15g的黑炭中加入20～50ml的Mycobacterium vanbaalenii.PYR-1菌悬液；再加入30～50ml的无菌水；均匀混合后冷冻干燥，得单载体的多环芳烃降解菌剂。
3.根据权利要求2所述的单载体的多环芳烃降解菌剂的制备方法，其特征是：所述步骤1)为：
挑取Mycobacterium vanbaalenii.PYR-1的单菌落接种于装有LB培养基的三角瓶中，于30℃，120rpm避光水浴振荡培养46～50小时；然后调节至每ml的Mycobacterium vanbaalenii.PYR-1菌悬液中含有5.0～6.0*108CFU的Mycobacterium vanbaalenii.PYR-1菌体。
4.根据权利要求3所述的单载体的多环芳烃降解菌剂的制备方法，其特征是：所述步骤3)中的冷冻干燥为：于-56～-50℃干燥22～26h。
5.根据权利要求4所述的单载体的多环芳烃降解菌剂的制备方法，其特征是：所述LB培养液的制备方法如下：在每升水中加入酵母提取物5g、蛋白胨10g和Nacl 5g，然后用NaOH调PH 7.4～7.6。
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