CN102274086A - 一种建立细菌生物膜感染动物模型的植入物以及方法 - Google Patents

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Abstract

本发明提供一种建立细菌生物膜感染动物模型的植入物以及方法。所述植入物为中空管状物，其一端的端部尖锐，用于刺穿待造模动物的皮肤。以及使用所述植入物建立细菌生物膜感染动物模型的方法。采用本发明的植入物以及方法不需要开放性的手术，操作简便，不仅适用于较大的动物，如兔、豚鼠、大鼠等，还可以用于小白鼠；创面小，动物能够快速恢复。因而，能够有效限制手术操作等人为因素对实验动物的不良影响，提高对模型建立过程中条件的控制。

Description

一种建立细菌生物膜感染动物模型的植入物以及方法
技术领域
本发明涉及一种建立细菌生物膜感染动物模型的植入物以及方法。
背景技术
自然界中的细菌常附着于固体物质表面，并可利用自身分泌的含水聚合物质粘附成团，形成具有特殊微环境的细菌生物膜(Bacterial biofilm)。细菌生物膜可受到多种环境因素的调控，发生机理复杂，目前尚未完全阐明。几乎所有病原菌均可形成生物膜，以表皮葡萄球菌(Staphylococcus epidermidis)为代表的凝固酶阴性葡萄球菌常粘附于植入或侵袭性操作的医疗器械表面，包括导管、假体、人工心脏瓣膜、人工关节等，并形成细菌生物膜(Bacterialbiofilm)。由于细菌生物膜感染具有耐药性强、逃避宿主免疫和可播散等特点，在临床上常表现为迁延不愈，造成了极大的临床危害。
近年来细菌生物膜感染的研究已开始受到重视。细菌生物膜形成受到复杂的调控，参与其中的因素仍未阐明，加之体内条件不宜控制，以及缺乏公认可靠的体内生物膜感染模型，目前细菌生物膜感染研究多以体外为主。但由于以体外为主的研究缺少在体免疫调节机制的参与，其临床意义受到局限。近年来已可见少量报道利用动物模型研究医疗器械相关细菌生物膜感染。其主要原理为给实验动物手术植入人工材料，接种细菌后使细菌粘附于其上形成细菌生物膜感染。其中应用较多的动物模型来源于组织笼(tissue cage)。组织笼模型由Zimmerli于1982年首次报道，其作为通用的体内细菌感染模型逐渐得到认可，近年来随着细菌生物膜感染研究的逐渐增多，有研究者借用这个模型并改进应用于生物膜感染的研究，如Kadurugamuwa等以3cm长，直径1cm的聚氟乙烯管，经设备均匀打孔(直径1mm)，内部填充玻璃珠。通过手术植入豚鼠体内，待手术恢复后再体外定位给予葡萄球菌接种造模。此类模型虽得到了一定的应用，但其容纳细菌繁殖的感染灶与细菌生物膜发生的部位有所区别，不依赖于细菌在固体表面的粘附，生物膜感染的特征性不强。也有研究者通过人体外科手术的方式植入金属假体，直接在金属假体上接种细菌，此类模型与临床细菌生物膜感染的实际情况接近，但由于感染部位的开放性使接种细菌的量和部位难以控制，给感染的评价造成困难。为避免这一缺陷，有研究者通过机械装置在动物皮下创造了一个相对封闭的空间，在内部接种细菌和形成生物膜感染，研究了细菌在动物内皮上粘附生长的过程，但这一造模过程需要复杂的器械和繁琐的手术，不易对手术过程进行控制。此外，将导管等医疗器械的一段以手术植入动物皮下的方法近年来也有采用，该方法的优点在于细菌于医疗器械(导管)内部形成生物膜，呈一个相对独立的空间，有利于生物膜感染的定位和采用生物膜发光技术检测细菌生物膜感染的形成。
现有的造模方法均需要开放性的手术，多选用较大的操作容易的动物如兔、豚鼠、大鼠等；手术操作及产生的创面对动物伤害大，动物恢复需较长时间(约3周)。由于手术过程操作繁琐，条件不易控制，加之感染评价困难等原因，目前尚无一种得到普遍认可和应用的细菌生物膜感染模型，制约了细菌生物膜感染的体内研究的广泛开展。因此，限制手术操作等人为因素对实验动物的不良影响，提高对模型建立过程中条件的控制是提高细菌生物膜感染模型效率的关键。
发明内容
本发明的目的是提供一种建立细菌生物膜感染动物模型的植入物，所述植入物为中空管状物，其一端的端部尖锐，用于刺穿待造模动物的皮肤。
优选地，所述植入物的端部尖锐的一端的直径较小，另一端的直径较大。
更优选地，所述植入物内置入可吸附细菌溶液的多孔材料
更优选地，所述植入物及其内部吸附材料均采用光学透明材质，其光学透明特性便于采用生物发光法直接检测。
更优选地，所述植入物的两端以多孔材料封堵。
本发明的另一个目的是提供一种使用所述的植入物建立细菌生物膜感染动物模型的方法，其包括以下步骤：a.备皮：提前1日对待建模动物的植入部位以8％硫化钠涂抹脱毛备皮，并洗净备皮部位；b.麻醉：以5mg/kg戊巴比妥钠对待建模动物进行腹腔注射，以碘酒和75％酒精对暴露的皮肤进行消毒；c.植入：待建模动物麻醉后，将已带菌的植入物于建模动物侧背部与脊椎平行1cm处沿水平方向刺入皮下；以及d.再消毒：完全刺入后对该部位皮肤再次消毒。
采用本发明的建立细菌生物膜感染动物模型的植入物以及使用所述的植入物建立细菌生物膜感染动物模型的方法不需要开放性的手术，操作简便，不仅适用于较大的动物，如兔、豚鼠、大鼠等，还适用于小白鼠；具有创面小，动物能够快速恢复的优点。因而，能够有效限制手术操作等人为因素对实验动物的不良影响，提高了对模型建立过程中条件的控制。
附图说明
图1为根据本发明的第一实施方式的一种建立细菌生物膜感染动物模型的植入物的简图。
具体实施方式
下面结合附图对本发明做进一步的详细说明，以令本领域技术人员参照说明书文字能够据以实施。
第一实施方式
图1是依照本发明的第一实施方式的一种建立细菌生物膜感染动物模型的植入物的简图，所述植入物由聚丙烯材质制成，中空管状，其一个端部尖锐，用于刺穿待造模动物的皮肤。所述植入物为楔形，尖锐的一端的直径较小，另一端的直径较大。这种构造有利于顺利地使植入物进入动物的皮肤。所述植入物可以根据动物的个头大小调整，一般为15mm，其内部可容纳20μL液体。
第二实施方式
在操作过程中，植入物内部容纳的液体会因较剧烈的操作动作而溢撒，在植入物内置入可吸附细菌溶液的多孔材料，如硅胶、聚乙烯。这样将有效地避免液体的溢散而保证实验有效准确。
第三实施方式
植入物的两端以多孔材料封堵，如硅胶、聚乙烯。防止细菌溶液溢散、或防止吸附细菌溶液的多孔材料脱落。
第四实施方式
接种细菌：在植入操作前，将培养至对数生长期的细菌以生理盐水(NS)稀释至约1.0×1010CFU/L，按每植入物(已经灭菌处理)10μL注入其中，随植入操作同时进行；
备皮：提前1日对植入部位以8％硫化钠涂抹脱毛备皮，并洗净备皮部位；
麻醉：以5mg/kg戊巴比妥钠对实验动物(小鼠)进行腹腔注射，给药剂量为50mg/kg，以碘酒和75％酒精对暴露的皮肤进行消毒；
植入：待小鼠麻醉后，将已带菌的植入物于小鼠侧背部与脊椎平行1cm处沿水平方向刺入皮下，双侧各一；完全刺入后对该部位皮肤再次消毒。
观察动物植物部位，植入后24h伤口愈合良好。
细菌生物膜的检测：
因植入物及其内部吸附材料均采用光学透明材质，植入物植入后的第5天，通过电子显微镜和激光共聚焦显微镜观察到植入物内部已形成显著的生物膜。显示细菌生物膜感染模型成功构建。
与多孔结构的组织笼相似，本课题所采用的植入材料为一头尖锐的中空管状物，但由于其仅两端与外界相通，在体内是否能够与体液发生正常交流是需首要考虑的因素。因此本课题在植入材料中注入NS植入体内后，发现其内总蛋白大量增加，此外也通过植入空的植入材料，24h取出后也发现其内有液体存在，证实了体液可进入植入材料内部。
测定植入物内部液体蛋白值并除以稀释倍数计算蛋白质含量。植入材料中可检测到与体液相近浓度的蛋白质，表明植入材料内部与体液间存在交流，故该模型可较客观反应细菌生物膜受体内环境因素的影响。
手术及建模时间(与组织笼模型的比较，
Figure BDA0000059277120000041
n＝8)
Figure BDA0000059277120000042
以本发明所述方法建立细菌生物膜模型，较传统的组织笼模型手术时间大幅缩短(约5倍)，无需手术后待动物恢复后再次植入细菌，且建模时间缩短了一周以上。
生物膜感染评价(与组织笼模型的比较，
Figure BDA0000059277120000051
n＝8)
比较微创模型与传统的组织笼模型的活菌数与ica相对表达量两项指标，二者大致相当，但微创模型具有更小的标准差，即以本发明所述方法建立的模型所代表的细菌生物膜感染程度，具有更小的个体差异。
尽管本发明的实施方案已公开如上，但其并不仅仅限于说明书和实施方式中所列运用，它完全可以被适用于各种适合本发明的领域，对于熟悉本领域的人员而言，可容易地实现另外的修改，因此在不背离权利要求及等同范围所限定的一般概念下，本发明并不限于特定的细节和这里示出与描述的图例。

Claims (6)

1.一种建立细菌生物膜感染的动物模型的植入物，其特征在于，所述植入物为中空管状物，其一个端部尖锐。
2.如权利要求1所述的植入物，其特征在于，所述植入物为楔形，尖锐的一端的直径较小，另一端的直径较大。
3.如权利要求2所述的植入物，其特征在于，所述植入物内置入可吸附细菌溶液的多孔材料。
4.如权利要求3所述的植入物，其特征在于，植入物及其内部吸附材料均采用光学透明材质。
5.如权利要求3所述的植入物，其特征在于，所述植入物的两端以多孔材料封堵。
6.使用如权利要求1-5中任一所述的植入物建立细菌生物膜感染动物模型的方法，其包括以下步骤：
a.备皮：提前1日对待建模动物的植入部位以8％硫化钠涂抹脱毛备皮，并洗净备皮部位；
b.麻醉：以5mg/kg戊巴比妥钠对待建模动物进行腹腔注射，以碘酒和75％酒精对暴露的皮肤进行消毒；
c.植入：待建模动物麻醉后，将已带菌的植入物于建模动物侧背部与脊椎平行1cm处沿水平方向刺入皮下；以及
d.再消毒：完全刺入后对该部位皮肤再次消毒。
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