CN102272321A - 神经毒性甾醇糖苷 - Google Patents

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Abstract

本发明涉及用于神经变性疾病的动物模型的组合物及其使用方法。更具体地说，本发明涉及神经毒性甾醇糖苷或神经毒性糖酯，或其组合物对神经变性疾病的动物模型的用途。调节神经毒性的色原烯醇也可与神经毒性甾醇糖苷或神经毒性糖酯或其组合物一起联合用于这些动物模型中。

Description

神经毒性甾醇糖苷
相关申请的交叉参照
本申请依据35U.S.C.§119(e)，要求2008年10月31日提交的美国临时申请系列号61/110,389和2009年5月1日提交的美国临时申请系列号61/174,707的优先权，它们的公开通过引用结合于本文。
技术领域
本发明涉及用于神经变性疾病的动物模型的组合物及其使用方法。更具体地说，本发明涉及神经毒性甾醇糖苷(sterol glycosides)或神经毒性糖酯或其组合在神经变性疾病的动物模型中的用途。调节神经毒性的色原烯醇也可与神经毒性甾醇糖苷或神经毒性糖酯或其组合联合用于这些动物模型。
背景和概述
典型地，仅在临床发现行为缺陷之后，才诊断为神经变性疾病、阿尔茨海默氏病(AD)、帕金森氏病(PD)、肌萎缩性侧索硬化(ALS)和肌萎缩性侧索硬化-帕金森痴呆复征(ALS-PDC)(Arasaki和Tamaki，1998；Leenders等，1990；Whitehouse等，1982)。在阿尔茨海默氏病中，失去来自大脑皮层和海马的各个区域的神经元，并表现为认知功能的丧失(Odle，2003)。帕金森氏病涉及黑质纹状体系统的选择部分的变性(Schapira和Olanow，2003)。最初，失去含多巴胺神经元的末端突起。最后，来自黑质(SN)的多巴胺能神经元的细胞体丧失。这一结果导致运动控制的紊乱并介导震颤、运动功能减退和僵硬(Dauer和Przedborski，2003)。终末期的肌萎缩性侧索硬化的特征在于，控制运动功能的脊髓和皮层运动神经元尤其是隔的进行性丧失(Rowland和Shneider，2001)，导致麻痹和死亡。
在上述各种疾病中，相对明确的神经细胞群的退化并导致特定的行为后果。相信AD、PD和ALS是起因于独特的病因学并导致互斥行为和神经病理学后果的截然不同的疾病。该观点基于不同的最初症状和病理学发现。然而，更加近期的工作已经表明各神经变性疾病之间的大量交叉重叠(参见Calne和Eisen，1989；Muchowski和Wacker，2005)。例如，PD和ALS患者都会表现出认知功能下降，而这按惯例是AD特性(Aarsland等，2003；Vaphiades等，2002)。而且，AD患者可能经受震颤，这是主要与PD有关的特征(Yokoyama等，2002)。AD和PD之间的另一个交叉重叠现象是，某些PD患者经历的步态不稳是发展AD--样痴呆的前兆(Verghese等，2002)。已经表明，ALS和PD部分交叉重叠显著，因此，伴有痴呆和/或帕金森氏病特征的ALS病例被称为ALS-+(Zoccolella等，2002)。
AD、PD和ALS死后组织评价也已经发现这些疾病状态之间的许多相似性。具体说来，与蛋白折叠和聚合有关的分子机理方面的相似性已经得到越来越多的关注(Muchowski和Wacker，2005)。尽管在特定神经变性疾病中聚集的特异性蛋白往往不涉及基本氨基酸序列，但AD、PD和ALS的特征性损害典型地含有具有类似生物化学特征的纤维状、淀粉样结构(Dobson，2003)。然而，透过疾病分类，已经观察到具有普通基本氨基酸序列的蛋白质内含物的实例。例如，已经在某些ALS(Kokubo等，2000)和PD(Arima等，1999)患者中鉴别出主要与AD有关的神经原纤维缠结(NFT)。在同样的情况下，也已经在PD路易体和路易神经突中鉴别出首先在AD患者的淀粉样蛋白斑中鉴别出的α-突触核蛋白(Lucking和Brice，2000)。
尽管与年老相关的疾病AD、PD和ALS有相似性，但相似性有限。相比之下，神经病肌萎缩性侧索硬化-帕金森痴呆复征(ALS-PDC)的特征在于各种老年病和其它许多神经病所共有的广泛范围的行为和神经病理学特性。ALS-PDC可表示为ALS的经典形式或表示为有AD特征的帕金森氏病的形式。而且，已经观察到Guam或Rota的某些ALS-PDC患者呈现这些症状的组合(Steele和Guzman，1987)。因此，认为了解ALS-PDC将导致更好地了解作为一个整体的神经病。
为更好地在细胞水平和生物化学水平以及整个动物水平上了解这些疾病状态的潜在的神经学机制，需要神经变性疾病的动物模型。理想地，动物应该显示出近似于患有这些神经变性疾病的人所表现症状的症状。本发明已经发现这类动物模型和采用神经毒性甾醇糖苷或神经毒性糖酯或其组合监测动物神经变性疾病的方法。这些神经毒性甾醇糖苷或神经毒性糖酯或其组合也可与调节神经毒性的色原烯醇联合使用。
可采用本文所述的组合物、方法和模型模拟的示例性神经变性疾病的非限制性目录包括肌萎缩性侧索硬化、早发性帕金森氏病、迟发性帕金森氏病、阿尔茨海默氏病等。
在一个实施方案中，提供本文所述的神经变性疾病的动物模型。该动物模型包括使非人动物接触下式的神经毒性化合物
其中
R1为任选被取代的糖基；
R2是氢、烷基、链烯基、炔基、杂烷基、卤代烷基或OR4；
R3是氢、烷基、链烯基、杂烷基、卤代烷基或OR4；
R4在各种情况下独立地选自氢、烷基、杂烷基、卤代烷基、链烯基、炔基和酰基；
标有a、a’、b、c、d、e、f和g的键各自独立地选自单键和双键，前提是对于标有b、c和d的各键，相邻的键不能两者同时为双健；和其中的神经毒性化合物并非选自β-谷甾醇-β-D-葡糖苷和胆固醇葡糖苷的化合物。
在另一个实施方案中，提供本文所述的神经变性疾病动物模型。该动物模型包括使非人动物接触下式的神经毒性化合物
其中R7和R8各自独立地选自饱和脂肪酸酰基、单不饱和脂肪酸酰基和多不饱和脂肪酸酰基，它们各自任选被卤素、甲基、烷基、羟基、酮基、甲氧基或烷氧基取代；和R9是糖基。
在另一个实施方案中，提供本文所述的神经变性疾病动物模型。该动物模型包括使非人动物接触下式的神经毒性化合物
Figure BPA00001392911600042
和下式的调节神经毒性化合物
Figure BPA00001392911600043
其中
R1为任选被取代的糖基；
R2是氢、烷基、链烯基、炔基、杂烷基、卤代烷基或OR4；
R3是氢、烷基、链烯基、杂烷基、卤代烷基或OR4；
R4在各种情况下独立地选自氢、烷基、杂烷基、卤代烷基、链烯基、炔基和酰基；
标有a、a’、b、c、d、e、f和g的键各自独立地选自单键和双键，前提是对于标有b、c和d的各键，相邻的键不能两者同时为双健；
R10和R11各自独立地选自烷基和链烯基，它们各自任选被取代；
X是选自卤素、烷基和烷氧基的0-3个取代基；和其中的神经毒性化合物并非选自β-谷甾醇-β-D-葡糖苷和胆固醇葡糖苷的化合物。
在另一个实施方案中，提供神经变性疾病的动物模型。该动物模型包括使非人动物接触下式的神经毒性化合物
Figure BPA00001392911600051
下式的调节神经毒性化合物
Figure BPA00001392911600052
其中R7和R8各自独立地选自饱和脂肪酸酰基、单不饱和脂肪酸酰基和多不饱和脂肪酸酰基，它们各自任选被卤素、甲基、烷基、羟基、酮基、甲氧基或烷氧基取代；R9是糖基；R10和R11各自独立地选自烷基和链烯基，它们各自任选被取代；和X是选自已描述的卤素、烷基和烷氧基的0-3个取代基。
在另一个实施方案中，提供非人动物的神经变性疾病的监测方法。该方法包括给予非人动物含有下式的神经毒性化合物的组合物和监测非人动物的神经变性疾病的步骤
其中
R1为任选被取代的糖基；
R2是氢、烷基、链烯基、炔基、杂烷基、卤代烷基或OR4；
R3是氢、烷基、链烯基、杂烷基、卤代烷基或OR4；
R4在各种情况下独立地选自氢、烷基、杂烷基、卤代烷基、链烯基、炔基和酰基；
标有a、a’、b、c、d、e、f和g的键各自独立地选自单键和双键，前提是对于标有b、c和d的各键，相邻的键不能两者同时为双健；和其中的化合物并非选自β-谷甾醇-β-D-葡糖苷和胆固醇葡糖苷的化合物。
在另一个实施方案中，提供非人动物的神经变性疾病的监测方法。该方法包括给予非人动物含有下式的神经毒性化合物的组合物和监测非人动物的神经变性疾病的步骤
Figure BPA00001392911600062
其中
R7和R8各自独立地选自饱和脂肪酸酰基、单不饱和脂肪酸酰基和多不饱和脂肪酸酰基，它们各自任选被卤素、甲基、烷基、羟基、酮基、甲氧基或烷氧基取代；R9是糖基。
在另一个实施方案中，提供任一前述实施方案的方法，其中的组合物还包含调节神经毒性化合物。调节神经毒性化合物具有下式
Figure BPA00001392911600071
其中
R10和R11各自独立地选自烷基和链烯基，它们各自任选被取代；和X是选自卤素、烷基和烷氧基的0-3个取代基。
在另一个实施方案中，提供用于神经变性疾病模型中的神经毒性组合物。该神经毒性组合物含有下式化合物及其药学上可接受的载体
Figure BPA00001392911600072
其中
R1为任选被取代的糖基；
R2是氢、烷基、链烯基、炔基、杂烷基、卤代烷基或OR4；
R3是氢、烷基、链烯基、杂烷基、卤代烷基或OR4；
R4在各种情况下独立地选自氢、烷基、杂烷基、卤代烷基、链烯基、炔基和酰基；
标有a、a’、b、c、d、e、f和g的键各自独立地选自单键和双键，前提是对于标有b、c和d的各键，相邻的键不能两者同时为双健；和其中的化合物并非选自β-谷甾醇-β-D-葡糖苷和胆固醇葡糖苷的化合物。
在另一个实施方案中，提供用于神经变性疾病模型中的神经毒性组合物。该神经毒性组合物含有下式化合物及其药学上可接受的载体
Figure BPA00001392911600073
其中
R7和R8各自独立地选自饱和脂肪酸酰基、单不饱和脂肪酸酰基和多不饱和脂肪酸酰基，它们各自任选被卤素、甲基、烷基、羟基、酮基、甲氧基或烷氧基取代；R9是糖基。
在另一个实施方案中，提供还包含调节神经毒性化合物的任一前述实施方案的神经毒性组合物。所述调节神经毒性化合物具有下式
Figure BPA00001392911600081
其中
R10和R11各自独立地选自烷基和链烯基，它们各自任选被取代；和X是选自卤素、烷基和烷氧基的0-3个取代基。
在另一个实施方案中，提供用于神经变性疾病模型中的化合物。所述化合物具有下式
其中
R1为任选被取代的糖基；
R2是氢、烷基、链烯基、炔基、杂烷基、卤代烷基或OR4；
R3是氢、烷基、链烯基、杂烷基、卤代烷基或OR4；
R4在各种情况下独立地选自氢、烷基、杂烷基、卤代烷基、链烯基、炔基和酰基；
标有a、a’、b、c、d、e、f和g的键各自独立地选自单键和双键，前提是对于标有b、c和d的各键，相邻的键不能两者同时为双健；和其中的化合物并非选自β-谷甾醇-β-D-葡糖苷和胆固醇葡糖苷的化合物。
在另一个实施方案中，提供检查非人动物神经变性的方法。该方法包括给予动物合成的神经毒性甾醇糖苷的步骤，其中神经毒性甾醇糖苷引起动物的神经变性，和其中动物的神经变性通过观察动物的行为异常检查或就动物中枢神经系统组织的验尸检查。举例说明，甾醇糖苷可为任何上述甾醇糖苷神经毒性化合物或其组合或与上述任何调节神经毒性化合物联合使用的这些化合物中的任何一种，所述化合物可被分离(例如，大于90％、95％、96％、97％、98％、98.5％、99％、99.5％或99.7％纯)。在上述所有实施方案中，可通过选自腿伸展试验(leg extension test)、步幅长度试验(gait length test)、旋转棒试验(rotarodtest)、金属丝悬挂试验(wire hang test)、水迷宫试验、八臂迷宫试验(radial arm maze test)、Digigate系统试验、运动轨迹自动视频跟踪试验(Ethovision)、焦虑试验、抑郁试验和嗅觉系统试验的行为试验鉴别神经变性。一方面，行为异常可为运动功能异常或认知功能异常。此外，举例说明，死后检查的中枢神经系统组织可来自选自皮层、海马、脊髓和黑质的部位。举例说明，甾醇糖苷可引起神经元兴奋性毒性(excitotoxicity)。
在又一个实施方案中，提供神经毒性甾醇糖苷介导的神经变性的动物模型。该动物模型包括患有通过给予足以使非人动物引起神经变性的量的神经毒性甾醇糖苷所产生的神经变性的非人动物。举例说明，甾醇糖苷可为任何一种上述神经毒性化合物或其组合，或者甾醇糖苷可与上述任何调节神经毒性化合物组合，该化合物可被分离(例如，大于90％、95％、96％、97％、98％、98.5％、99％、99.5％或99.7％纯)并可被合成。在该实施方案中，可通过选自腿伸展试验、步幅长度试验、旋转棒试验、金属丝悬挂试验、水迷宫试验、八臂迷宫试验、Digigate系统试验、运动轨迹自动视频跟踪试验、焦虑试验、抑郁试验和嗅觉系统试验的行为试验鉴别神经变性。一方面，行为异常可为运动功能异常或认知功能异常。此外，举例说明，死后检查的中枢神经系统组织可为选自皮层、海马、脊髓和黑质的部位。举例说明，甾醇糖苷可产生神经元兴奋性毒性。
在本文所述的任一实施方案中，可在给予动物化合物前，水解甾醇糖苷中的糖苷键，例如，以确定该键的水解是否抑制甾醇糖苷的神经毒性。在这些实施方案中，可在给予动物甾醇糖苷之前，用降解神经毒性甾醇糖苷的酶处理甾醇糖苷。在本申请中所述的任一实施方案中，甾醇糖苷可为非酰化的。
在另一实施方案中，任一上述化合物的纯度大于90％、95％、96％、97％、98％、98.5％、99％、99.5％或99.7％纯。这类纯化合物为分离的化合物。在本文所述的任一实施方案中，所述化合物可为合成的。
在另一个实施方案中，提供用于神经变性疾病模型中的化合物。所述化合物具有下式
Figure BPA00001392911600101
其中
R7和R8各自独立地选自饱和脂肪酸酰基、单不饱和脂肪酸酰基和多不饱和脂肪酸酰基，它们各自任选被卤素、甲基、烷基、羟基、酮基、甲氧基或烷氧基取代；R9是糖基。
在另一个实施方案中，前段中所述的化合物的纯度大于90％、95％、96％、97％、98％、98.5％、99％、99.5％或99.7％纯。这类纯化合物为分离的化合物。在本文所述的任一实施方案中，所述化合物可为合成的。
在另一个实施方案中，提供调节神经毒性化合物。调节神经毒性化合物具有下式
Figure BPA00001392911600111
其中
R10和R11各自独立地选自烷基和链烯基，它们各自任选被取代；X是选自卤素、烷基和烷氧基的0-3个取代基。
在另一个实施方案中，前段中所述的化合物的纯度大于90％、95％、96％、97％、98％、98.5％、99％、99.5％或99.7％纯。这类纯化合物为分离的化合物。在本文所述的任一实施方案中，该化合物可为合成的。
在另一个实施方案中，描述用于神经变性疾病的胎儿暴露模型中的神经毒性组合物。所述神经毒性组合物含有下式化合物及其药学上可接受的载体
Figure BPA00001392911600112
其中
R1为任选被取代的糖基；
R2是氢、烷基、链烯基、炔基、杂烷基、卤代烷基或OR4；
R3是氢、烷基、链烯基、杂烷基、卤代烷基或OR4；
R4在各种情况下独立地选自氢、烷基、杂烷基、卤代烷基、链烯基、炔基和酰基；
标有a、a’、b、c、d、e、f和g的键各自独立地选自单键和双键，前提是对于标有b、c和d的各键，相邻的键不能两者同时为双健；其中的非人动物是胎儿动物。
在另一个实施方案中，描述用于神经变性疾病模型中的神经毒性组合物。所述神经毒性组合物含有下式化合物及其药学上可接受的载体
Figure BPA00001392911600121
其中
R7和R8各自独立地选自饱和脂肪酸酰基、单不饱和脂肪酸酰基和多不饱和脂肪酸酰基，它们各自任选被卤素、甲基、烷基、羟基、酮基、甲氧基或烷氧基取代；R9是糖基。
附图简述
图1.SG-喂养的动物及其年龄匹配的对照动物的体重。对照动物和SG-喂养的动物之间的体重值的比较显示体重在各组之间并无显著性差异并随时间的过去稳定地增加。
图2.SG-喂养的动物降低旋转棒表现。在研究期间采用旋转棒试验以监测动物的运动协调性。SG-暴露的动物在旋转棒上表现出降低表现的趋势，但数量未达到统计学上的显著性。
图3.SG-喂养介导对腿伸展反射试验的表现下降。在研究期间用腿伸展反射试验监测SG-暴露的动物及其年龄匹配的对照动物的后肢反射。在第一个动物死亡(35周)后不久，在SG-喂养的动物中表现的稳定下降明显。将发现表现有意义的时间点标上星号(t检验：*p＜0.05)。相比之下，对照动物在研究期间完全未表现出后肢反射的紊乱。
图4.SG-喂养降低了前肢力量分析试验中的表现。在研究期间用金属丝悬挂试验监测SG-喂养的动物及其年龄匹配的对照动物肌肉力量。在第一只动物死亡(35周)前表现下降明显，到饲养后14周，表现的差异性具有统计显著性(t检验：*p＜0.05)并一直保持这样，直到余下小鼠死亡时。
图5.随着SG-喂养对运动神经元计数。用焦油紫辨别尼氏小体的运动神经元。于35和52周对腰脊髓α-和γ-运动神经元进行计数(A)。运动神经元被细分为正常、健康外观的那些(下标“H”)、染色质溶解的那些(下标“C”)和固缩的那些(下标“p”)。于35和52周时，观察到对照组在腰脊髓的腹侧角有许多健康的α-和γ-运动神经元。随着运动神经元的逐个计数，只发现在52周时对照动物和SG-喂养组之间的“健康”α-运动神经元数量之间的统计显著性(t检验：-55％，p＜0.05)(A)。当在各组之间的α-运动神经元总数之间进行统计分析时，发现各时间点上的显著差异(t检验，于35周时：-29％，*p＜0.05；t检验，52周时：-47％，*p＜0.05；红线表示归为得到α-运动神经元“总数”的亚类)。此外，发现SG-喂养组的α-运动神经元总数量在35和52周之间经历了显著的下降(t检验：-36％，*p＜0.05；蓝线表示图表中亚组的总和)。
图6.SG-喂养的小鼠脊髓中的胆碱能运动神经元。抗胆碱乙酰基转移酶(ChAT)免疫反应性细胞被作为胆碱能细胞计数。于35和52周时，腰脊髓的腹侧角中的量化抗-ChAT标记显示在对照组和SG-喂养组之间的显著差异。于35和52周，SG-喂养的动物分别有18％(t检验：*p＜0.05)和32％(t检验：*p＜0.05)更少的胆碱能神经元(A)。此外，SG-喂养的动物的胆碱能神经元数量在35和52周之间经历了显著的下降(t检验：-31％，*p＜0.05)。
图7.SG-喂养的小鼠腰脊髓中的活化星形胶质细胞。抗胶质纤维酸性蛋白(GFAP)免疫反应性的、星形(压紧并延长)细胞被作为星形胶质细胞计数。于35周和52周量化对照动物和SG-喂养的小鼠的腰脊髓腹侧角的抗-GFAP标记(A)。与症状前(t检验：+337％，***p＜0.001)和症状时间点(t检验：+119％，*p＜0.05)的对照动物相比，SG-喂养的小鼠具有显著更大量的星形胶质细胞。此外，当对照动物随着时间的过去经历星形胶质细胞的显著增加时(t检验：+41％，*p＜0.05)，发现在整个相同的17周时期，SG-喂养的动物经历GFAP阳性星形胶质细胞的显著下降(t检验：-30％，*p＜0.05)。
图8.SG-喂养的小鼠腰脊髓中的小胶质细胞增殖。免疫反应成离子钙结合受体-1(IBA-1)的细胞被作为小胶质细胞计数。(A)量化35周和52周的对照动物和SG-喂养的小鼠腰脊髓的腹侧角中的小胶质细胞。与症状前(Presymptomatic)(t检验：+33％，**p＜0.01)和症状(t检验：+59％，*p＜0.05)时间点(Seudent’s t检验，*p＜0.05)的对照动物相比，SG-喂养的小鼠具有显著更多的小胶质细胞。
图9.SG-喂养的小鼠脊髓中的胱天蛋白酶-3标记。于35和52周时，腰脊髓腹侧角中的抗-胱天蛋白酶-3免疫反应性细胞的量化显示，SG-喂养介导的细胞在症状前和症状时间点经历了细胞凋亡。于35周时，观察到SG-喂养动物的显著更大量的凋亡神经元(t检验，+78％，***p＜0.001)(A)。也观察到于52周时SG-喂养的动物的更大量的凋亡细胞，但数量并未达到显著性(A)。
图10.多巴胺能细胞标记消失于SG-喂养的小鼠的纹状体中。35周(t检验：-34％，***p＜0.001)和52周(t检验：-39％，*p＜0.05)时，与对照动物的黑质致密部(SNpc)相比，SG-喂养的小鼠表现出显著减少的酪氨酸羟化酶标记(光密度)。发现SG-喂养的小鼠中的SNpc的TH光密度随着时间的过去而下降(t检验：-22％，*p＜0.05)(A)。于任一时间点(t检验：不显著p＝0.0846)，未发现SG-喂养的动物的纹状体中的光密度下降(F)。对SG-喂养的小鼠的运动和黑质(niagral)纹状体引起的毒性表明，除了其它神经变性疾病之外，SG还可用于运动神经元病模型和帕金森氏病模型。
图11.SG-喂养的动物的细胞色素c氧化酶活性不受影响。分析SG-喂养的动物和年龄匹配的对照动物的细胞色素c氧化酶活性。于35或52周时，各组之间未观察到显著的差异性(A)。各组中，随着时间的过去，观察到细胞色素c氧化酶活性下降(A)。
图12.腰脊髓和背和腹侧脊神经根中脂质的油红O染色。通过油红O(红色染色)显示出各CNS区域中的脂质沉积。核用苏木精(蓝色/紫色染料)染色。观察到对照动物和SG-喂养的小鼠的运动神经元的脂质沉积，但SG-喂养的动物的腰脊髓和腹侧神经根中沉积的数量和尺寸更大。长方块(panel)A表示于35和52周时对照动物和SG-喂养的动物的脂质沉积的量化。腰索的腹侧角的组间评价显示，于35周时，SG-喂养的动物腰脊髓的腹侧角具有显著更多的脂质沉积(Student’s t检验，+28％，*p＜0.05)。于35周时，与对照动物相比，SG-喂养的动物的腹侧脊神经根也具有显著更多的脂质(Student’s t检验：+10％，*p＜0.05)。背神经根的类似比较并未显示出统计显著性差别(Student’s t检验：不显著，p＝0.3778)。于52周时，在评价的三个CNS区域中，未发现统计显著性的各组间差异(腰脊髓：Student’s t检验，p＝0.6406；背神经根：Student’s t检验，p＝0.6958；腹侧神经根：Student’s t检验，p＝0.7422)。还进行SG-喂养的动物和年龄匹配的对照动物的脂质积聚的时间-依赖性效应评价。对照动物表现出随时间的过去脂质沉积总量的统计显著性增加(Student’s t检验：+29％，p＜0.05)。SG-喂养的动物未经历随时间的过去沉积的积聚(Student’s t检验，p＝0.4864)。SG-喂养的动物和对照动物的背(Student’s t检验s-对照动物：p＝0.4864；SG-fed：p＝0.5478)或腹侧神经根(对照：p＝0.1301；SG-喂养：p＝0.5478)都未表现出时间-依赖性效应。
图13.选择的SG-喂养的小鼠在腰脊髓的腹侧角积聚磷酸化τ蛋白和含有这些磷酸化τ蛋白的子集的细胞经历细胞凋亡。饮食SG-喂养介导磷酸化τ蛋白的积聚。于52周时，动物的大多数含有磷酸化-τ蛋白的细胞活跃地经历细胞凋亡。(A)延长和圆形聚集体的数量分别被量化(A)。
图14.TDP-43病理学发生于饲养SG的小鼠的亚组的腰脊髓。存活至52周的8只饲养SG的小鼠中有两只显示TAR DNA结合蛋白(TDP)43病理学。在健康细胞中，在细胞核中发现TDP-43，在神经学疾病，诸如偶发ALS中重新分配并积聚于细胞溶质中。于35周时的对照动物、SG-喂养的动物和于52周时的大多数SG-喂养的动物未观察到TDP-43的异常易位。两个时间点的对照动物的额叶皮质、海马和运动皮层也是阴性的。长方块A描述腰脊髓中含病理磷酸化TDP-43聚结体的量化。SG-喂养的动物中的这些聚结体增加。
图15.升高在衬垫区域之上，不会落下、牢牢地抓住或从轴上跳下的旋转装置被用来测量小鼠在水平转动轴上可保持行走的时间(3.6cm直径；16rpm)。
图16-18.暴露于SG和BSSG的动物在妊娠期间及其年龄相近的对照动物的体重。喂养给妊娠小鼠各基本含有0.4mg SG和0.6mgBSSG的食物丸子，在分娩后的不同时间间隔对其幼鼠称重。在SG和BSSG-喂养的幼鼠(“处理过的动物”)和对照组在以及在处理过的雄性动物和处理过的雌性动物之间观察到体重差别。分娩后从第1天开始至第22天期间，处理过的动物比对照动物保持显著更高的体重(Student’s t检验：***p＜0.0005)(图16)，在断奶后的第5周开始至17周期间经处理的雄性动物比雄性对照动物保持显著更高的体重(Student’s t检验：*p＜0.05，**p＜0.005，***p＜0.0005)(图17)。在分娩后的第1天开始至第22天期间，与体重增加64.8％的对照动物相比，处理过的动物体重增加79.6％(Student’s t检验：***p＜0.0005)(图16)。此外，在断奶后的第5周开始至17周期间，与体重增加109.8％的雄性对照动物相比，经处理的雄性动物体重增加139.4％(t检验：*p＜0.05，**p＜0.005，***p＜0.0005)(图17)。相比之下，在断奶后的第5周开始至17周期间，经处理的雌性动物体重增加101.8％(与体重增加83％的雌性对照动物相比)(Student’s t检验：*p＜0.05，**p＜0.005)(图18)。分娩后17周后，将处理过的动物和对照动物分入单独的笼中(当动物被分入单独的笼中时，“S”表示年龄(以周龄表示))：分离后，在经处理的雌性动物、雌性对照动物(图18)和雄性对照动物中观察到体重减轻，但在经处理的雄性动物中未观察到(图17)。
图19-26.与年龄相近雄性对照动物相比，妊娠期间暴露于SG和BSSG的雄性动物在步态分析试验中显示出减弱的表现。用各实际含有0.4mg SG和0.6mg BSSG的食物丸子饲养妊娠小鼠。在分娩后8周至18周期间的各种时间间隔试验其雄性幼鼠的左和右前爪和后爪制动次数和左和右前爪和后爪站姿持续时间。如与雄性对照动物相比的那样，经处理的雄性动物的左后爪(图19)和右后爪(图20)表现出增加的制动次数和左前爪(Student’s t检验：*p＜0.05)(图21)和右前爪(Student’s t检验：*p＜0.05)(图22)表现出显著增加的制动次数。此外，与雄性对照动物相比，经处理的雄性动物表现出右前爪(图24)增加的站姿持续时间和左前爪(Student’s t检验：*p＜0.05)(图23)、左后爪(Student’s t检验：*p＜0.05，**p＜0.005)(图25)和右后爪(Student’s t检验：*p＜0.05，**p＜0.005)(图26)显著增加的站姿持续时间。
图27-41.与年龄相近对照动物相比，妊娠期间暴露于SG和BSSG的动物在旷场试验中显示减弱的表现。用各基本含有0.4mg SG和0.6mg BSSG的食物丸子喂养妊娠小鼠。在分娩后8周开始至18周期间试验它们的幼鼠在各个年龄的探索性活力。用5分钟间隔进行试验：将动物置于试验场地中央，测定几个探索性活力参数。与对照动物相比，处理过的动物总活动持续时间[(Student’s t检验：*p＜0.05，**p＜0.05(图27)；和(Student’s t检验：*p＜0.05)(图28)]；越过栅栏进入场地中央的次数[(Student’s t检验：*p＜0.05，**p＜0.005，***p＜0.0005)(图29)；和(Student’s t检验：*p＜0.05，**p＜0.005)(图30)]；离场地边缘的平均距离(表示处理过的小鼠显示更喜欢场地的边缘而不是中央)[(Student’s t检验：***p＜0.0005)(图31)；和(Student’s t检验：*p＜0.05)(图32)]；和在场地中央耗费的持续时间[(Student’s t检验：**p＜0.005)(图33)和(Student’s t检验：*p＜0.05)(图34)]表现出显著的减少。与对照动物相比，处理过的动物的平均转动角度[(Student’s t检验：*p＜0.05，**p＜0.005，***p＜0.0005)(图35)；和(Student’s t检验：*p＜0.05，*p＜0.005)(图36)]；和首次跃入场地中央的持续时间[(Student’s t检验：*p＜0.05)(图37)和(Student’s t检验：*p＜0.05)(图38)]也表现出显著的增加。此外，如与雄性对照动物相比的那样，证实经处理的雄性动物的速度显著下降(Student’s t检验：*p＜0.05)(图39)；和角速度(t检验：*p＜0.05，**p＜0.005)(图40)和迂回程度(Student’s t检验：*p＜0.05，**p＜0.005)(图41)显著增加。
示例性实施方案的详述
本文所引用的各出版物都通过全文引用结合于本文中。
在一个实施方案中，本文描述一种神经变性疾病的动物模型，其包括使非人动物接触下式的神经毒性化合物
Figure BPA00001392911600181
其中R1为任选被取代的糖基；
R2是氢、烷基、链烯基、炔基、杂烷基、卤代烷基或OR4；
R3是氢、烷基、链烯基、杂烷基、卤代烷基或OR4；
R4在各种情况下独立地选自氢、烷基、杂烷基、卤代烷基、链烯基、炔基和酰基；
标有a、a’、b、c、d、e、f和g的键各自独立地选自单键和双键，前提是对于标有b、c和d的各键，相邻的键不能两者同时为双健；和其中的神经毒性化合物并非选自β-谷甾醇-β-D-葡糖苷和胆固醇葡糖苷的化合物。
在另一个实施方案中，本文描述一种神经变性疾病的动物模型，其包括使非人动物接触下式的神经毒性化合物
Figure BPA00001392911600182
和下式的调节神经毒性化合物
其中
R1为任选被取代的糖基；
R2是氢、烷基、链烯基、炔基、杂烷基、卤代烷基或OR4；
R3是氢、烷基、链烯基、杂烷基、卤代烷基或OR4；
R4在各种情况下独立地选自氢、烷基、杂烷基、卤代烷基、链烯基、炔基和酰基；
标有a、a’、b、c、d、e、f和g的键各自独立地选自单键和双键，前提是对于标有b、c和d的各键，相邻的键不能两者同时为双健；
R10和R11各自独立地选自烷基和链烯基，它们各自任选被取代；
X是选自卤素、烷基和烷氧基的0-3个取代基；和其中的神经毒性化合物并非选自β-谷甾醇-β-D-葡糖苷和胆固醇葡糖苷的化合物。
在另一个实施方案中，本文描述一种神经变性疾病的动物模型，其包括使非人动物接触下式的神经毒性化合物
Figure BPA00001392911600192
其中R7和R8各自独立地选自饱和脂肪酸酰基、单不饱和脂肪酸酰基和多不饱和脂肪酸酰基，它们各自任选被卤素、甲基、烷基、羟基、酮基、甲氧基或烷氧基取代；和R9是糖基。
在另一个实施方案中，本文描述一种神经变性疾病的动物模型，其包括使非人动物接触下式的神经毒性化合物
下式的调节神经毒性化合物
Figure BPA00001392911600201
其中R7和R8各自独立地选自饱和脂肪酸酰基、单不饱和脂肪酸酰基和多不饱和脂肪酸酰基，它们各自任选被卤素、甲基、烷基、羟基、酮基、甲氧基或烷氧基取代；R9是糖基；
R10和R11各自独立地选自烷基和链烯基，它们各自任选被取代；和
X是选自卤素、烷基和烷氧基的0-3个取代基。
在另一个实施方案中，描述任一前述实施方案的神经变性疾病的动物模型，其中的神经毒性化合物具有下式
Figure BPA00001392911600202
在另一个实施方案中，描述任一前述实施方案的模型，其中的神经毒性化合物具有下式
在另一个实施方案中，描述任一前述实施方案的模型，其中的神经毒性化合物具有下式
Figure BPA00001392911600211
在另一个实施方案中，描述任一前述实施方案的模型，其中的神经毒性化合物具有下式
Figure BPA00001392911600212
在另一个实施方案中，本文描述任一前述实施方案的模型，其中R1选自己糖基和戊糖基，它们各自任选被取代。
在另一个实施方案中，本文描述任一前述实施方案的模型，其中R1选自己糖基和戊糖基，它们各自任选被取代；R2为甲基或乙基；和R3是氢。
在另一个实施方案中，本文描述任一前述实施方案的模型，其中R1选自己糖基和戊糖基，它们各自任选被取代；R2为甲基或乙基；R3是氢；和标有b的键是双键。
在另一个实施方案中，本文描述任一前述实施方案的模型，其中标有g的键是双键。
在另一个实施方案中，本文描述任一前述实施方案的模型，其中R1具有下式
Figure BPA00001392911600213
其中R5在各种情况下独立地选自氢、甲基和C(O)R6，其中R6为烷基、卤代烷基或杂烷基。
在另一个实施方案中，本文描述任一前述实施方案的模型，其中R1是β-D-葡糖基。在另一个实施方案中，本文描述任一前述实施方案的模型，其中的神经毒性化合物选自菜油甾醇葡糖苷、二氢菜子甾醇葡糖苷、麦角甾醇葡糖苷和燕麦甾醇(avenasterol)葡糖苷。在另一个实施方案中，本文描述任一前述实施方案的模型，其中的神经毒性化合物是菜油甾醇葡糖苷、二氢菜子甾醇葡糖苷、豆甾醇葡糖苷、麦角甾醇葡糖苷、燕麦甾醇葡糖苷或谷甾醇糖苷中的两种或更多种的混合物。
在另一个实施方案中，本文描述任一前述实施方案的模型，其中的神经毒性化合物是豆甾醇葡糖苷。在另一个实施方案中，本文描述任一前述实施方案的模型，其中的神经毒性化合物是菜油甾醇葡糖苷。在另一个实施方案中，本文描述任一前述实施方案的模型，其中的神经毒性化合物是二氢菜子甾醇葡糖苷。
在另一个实施方案中，本文描述一个模型，其中的动物接触与调节神经毒性化合物组合的任一种本文所述的神经毒性化合物。根据本发明，关于动物的短语“与......接触”和术语“接触”和“接触的”意指给予动物一种本文所述的化合物。
在另一个实施方案中，本文描述任一前述实施方案的模型，其中R9为单糖、二糖或三糖。在另一个实施方案中，本文描述任一前述实施方案的模型，其中R9为单糖。在另一个实施方案中，本文描述任一前述实施方案的模型，其中R9为二糖。
在另一个实施方案中，本文描述任一前述实施方案的模型，其中R7或R8之一为任选被取代的单不饱和脂肪酸酰基和R7或R8中的另一个为任选被取代的多不饱和脂肪酸酰基。
在另一个实施方案中，本文描述任一前述实施方案的模型，其中的调节神经毒性化合物是生育酚或生育三烯酚。在另一个实施方案中，本文描述任一前述实施方案的模型，其中调节神经毒性化合物是β-生育酚。
在示例性实施方案中，用于神经变性疾病动物模型的非人动物可为任何适用的实验室动物。例如，非人动物可为啮齿动物，诸如小鼠、大鼠、仓鼠、豚鼠、沙鼠等。在其它实施方案中，非人动物可为灵长目动物，例如，猴、黑猩猩、猕猴、松鼠猴、猿或用于神经变性疾病动物模型的其它任何灵长目动物。在示例性其它实施方案中，非人动物可为兔、狗、猫或任何其它适用的实验室动物。在另一个实施方案中，非人动物可为哺乳动物。在另一个实施方案中，动物可为猪。
在任何一个前述实施方案中，神经变性疾病可选自各种疾病状态。神经变性疾病可选自进行性核上性麻痹、阿尔茨海默氏病、额颞叶痴呆(例如，皮克病、额颞叶变性、进行性失语和语义性痴呆)、运动神经元疾病(例如，肌萎缩性侧索硬化、原发性侧索硬化、进行性延髓性麻痹、假延髓性麻痹、进行性肌萎缩症和脊髓性肌萎缩症)、神经病、周围神经病、早发性帕金森氏病和迟发性帕金森氏病。在本文所述的模型的另一实施方案中，神经变性疾病可选自肌萎缩性侧索硬化、早发性帕金森氏病、迟发性帕金森氏病和阿尔茨海默氏病。在又一个实施方案中，神经变性疾病为阿尔茨海默氏病或帕金森氏病。作为选择，在任何一个前述实施方案中，神经变性疾病可为肌萎缩性侧索硬化。在另一个实施方案中，神经变性一般是有意的。
在另一示例性实施方案中，提供非人动物神经变性疾病的监测方法。该方法包括给予非人动物含有下式的神经毒性化合物的组合物
其中R1为任选被取代的糖基；
R2是氢、烷基、链烯基、炔基、杂烷基、卤代烷基或OR4；
R3是氢、烷基、链烯基、杂烷基、卤代烷基或OR4；
R4在各种情况下独立地选自氢、烷基、杂烷基、卤代烷基、链烯基、炔基和酰基；
标有a、a’、b、c、d、e、f和g的键各自独立地选自单键和双键，前提是对于标有b、c和d的各键，相邻的键不能两者同时为双健；和其中的化合物并非选自β-谷甾醇-β-D-葡糖苷和胆固醇葡糖苷的化合物；和监测非人动物的神经变性疾病的步骤。
在另一个实施方案中，提供非人动物神经变性疾病的监测方法。该方法包括给予非人动物含有下式的神经毒性化合物的组合物
Figure BPA00001392911600241
其中
R7和R8各自独立地选自饱和脂肪酸酰基、单不饱和脂肪酸酰基和多不饱和脂肪酸酰基，它们各自任选被卤素、甲基、烷基、羟基、酮基、甲氧基或烷氧基取代；R9是糖基；和监测非人动物的神经变性疾病的步骤。
在任何一个前述实施方案中，神经毒性组合物可进一步含有下式的调节神经毒性化合物
Figure BPA00001392911600242
其中R10和R11各自独立地选自烷基和链烯基，它们各自任选被取代；和X是选自卤素、烷基和烷氧基的0-3个取代基。
在另一个实施方案中，本文描述任一前述实施方案的方法，其中R1选自己糖基和戊糖基，它们各自任选被取代。
在又一个实施方案中，本文描述任一前述实施方案的方法，其中R1选自己糖基和戊糖基，它们各自任选被取代；R2为甲基或乙基；和R3是氢。
在又一个实施方案中，本文描述任一前述实施方案的方法，其中R1选自己糖基和戊糖基，它们各自任选被取代；R2为甲基或乙基；R3是氢；和标有b的键是双键。
在另一个示例性实施方案中，本文描述任一前述实施方案的方法，其中标有g的键是双键。
在另一个实施方案中，本文描述任一前述实施方案的方法，其中R1具有下式
Figure BPA00001392911600251
其中R5在各种情况下独立地选自氢、甲基和C(O)R6，其中R6为烷基、卤代烷基或杂烷基。
在又一个实施方案中，本文描述任一前述实施方案的方法，其中R1是β-D-葡糖基。在供选择的实施方案中，本文描述任一前述实施方案的方法，其中的神经毒性化合物选自菜油甾醇葡糖苷、二氢菜子甾醇葡糖苷、麦角甾醇葡糖苷和燕麦甾醇葡糖苷。进一步举例说明，在任一前述实施方案的方法中，所述神经毒性化合物可为菜油甾醇葡糖苷、二氢菜子甾醇葡糖苷、豆甾醇葡糖苷、麦角甾醇葡糖苷、燕麦甾醇葡糖苷或谷甾醇糖苷中的两种或多种的混合物。在另一实施方案中，神经毒性化合物可选自豆甾醇葡糖苷、菜油甾醇葡糖苷、二氢菜子甾醇葡糖苷、麦角甾醇葡糖苷和燕麦甾醇葡糖苷。
在另一个示例性方法实施方案中，神经毒性化合物可为豆甾醇葡糖苷。在另一个实施方案中，本文描述任一前述实施方案的方法，其中的神经毒性化合物是菜油甾醇葡糖苷。在另一个方法实施方案中，神经毒性化合物可为二氢菜子甾醇葡糖苷。
在另一个实施方案中，本文描述任一前述实施方案的方法，其中R9为单糖、二糖或三糖。在另一个实施方案中，本文描述任一前述实施方案的方法，其中R9为单糖。在另一个实施方案中，本文描述任一前述实施方案的方法，其中R9为二糖。
在任一个前述方法实施方案中，R7或R8之一可说明性地为任选被取代的单不饱和脂肪酸酰基，以及R7或R8的另一个为任选被取代的多不饱和脂肪酸酰基。
在另一个实施方案中，本文描述任一前述实施方案的方法，其中的调节神经毒性化合物是生育酚或生育三烯酚。在又一个方法实施方案中，调节神经毒性化合物可为β-生育酚。
在示例性实施方案中，用于监测神经变性疾病的方法的非人动物可为任何合适的实验室动物。例如，非人动物可为啮齿动物，诸如小鼠(例如CD-1小鼠，Charles River)、大鼠(例如，Sprague-Dawley大鼠，Charles River)、仓鼠、豚鼠、沙鼠等。在其它实施方案中，非人动物可为灵长目动物，例如，猴、黑猩猩、猕猴、松鼠猴、猿或用于监测神经变性疾病方法的其它任何灵长目动物。在其它示例性实施方案中，非人动物可为兔、狗、猫或其它任何合适的实验室动物。在另一个实施方案中，非人动物可为哺乳动物。在另一个实施方案中，哺乳动物可为猪。
在任一前述方法实施方案中，神经变性疾病可选自各种疾病状态。本文所述方法中的神经变性疾病可选自进行性核上性麻痹、阿尔茨海默氏病、额颞叶痴呆(例如，皮克病、额颞叶变性、进行性失语和语义性痴呆)、运动神经元疾病(例如，肌萎缩性侧索硬化、原发性侧索硬化、进行性延髓性麻痹、假延髓性麻痹、进行性肌萎缩症和脊髓性肌萎缩症)、神经病、周围神经病、早发性帕金森氏病和迟发性帕金森氏病。在另一本文所述的方法实施方案中，神经变性疾病可选自肌萎缩性侧索硬化、早发性帕金森氏病、迟发性帕金森氏病和阿尔茨海默氏病。在又一个实施方案中，神经变性疾病为阿尔茨海默氏病或帕金森氏病。作为选择，在任一个前述方法实施方案中，神经变性疾病可为肌萎缩性侧索硬化。在另一个实施方案中，神经变性通常是有意的。
在任一前述实施方案中，可通过本领域技术人员熟知的方法，使非人动物接触神经毒性化合物或调节神经毒性化合物，或者可给予非人动物神经毒性化合物或调节神经毒性化合物。例如，在任何一个前述实施方案中，可通过将神经毒性化合物或调节神经毒性化合物或含有神经毒性化合物或调节神经毒性化合物的组合物加入饮食中，改变非人动物的日常饮食并喂给非人动物该饮食，给予非人动物含有神经毒性化合物或调节神经毒性化合物的组合物，或者可使非人动物接触神经毒性化合物或调节神经毒性化合物。除神经毒性化合物或调节神经毒性化合物或含有神经毒性化合物或调节神经毒性化合物的组合物之外，可用其它添加剂进一步改善非人动物的任何标准饮食。示例性非限制性添加剂的目录有维生素、矿物质(例如，钙和磷)、氨基酸、乳化剂、矫味剂、掩味剂、芳香剂、抗生素、抗-驱虫剂、抗-反胃剂、蛋白质、脂肪、纤维和它们的组合物。
实验室动物的标准饮食为本领域熟知的，举例说明，可采用任何标准丸状、基于谷物的饮食(例如，Rodent Diet 20、PicoLab；TekladRodent Diet#8064，Harlan Teklad，Madison，Wis.；Mouse DietTM，Purina，St.Louis Mo；Prolab Rat，Mouse，Hamster 3000，St.Louis Mo.)。通常允许动物自由饮水。
在其它实施方案中，可通过用任何可接受的载体诸如液体醇、二醇(例如，聚乙二醇)、葡萄糖溶液(例如，5％)、酯、酰胺、无菌水或缓冲盐水(包括缓冲溶液如磷酸盐或醋酸盐；例如，等渗盐水)强饲喂养或胃肠外注射，使非人动物接触神经毒性化合物或调节神经毒性化合物，或者给予神经毒性化合物或调节神经毒性化合物。例如，可给予神经毒性化合物或调节神经毒性化合物，或者可使动物接触呈丸剂、糊剂或片剂的这些化合物。根据神经毒性化合物或调节神经毒性化合物的剂型，可与神经毒性化合物或调节神经毒性化合物一起包含于组合物中的其它示例性组分有植物油、明胶、乳糖、直链淀粉、硬脂酸镁、增溶剂、局部麻醉剂(例如，利多卡因)、赋形剂、防腐剂、稳定剂、润湿剂、乳化剂、盐和润滑剂。
在另一个实施方案中，可经胃肠外给予含有神经毒性化合物或调节神经毒性化合物的组合物，举例说明，这样的注射可为腹膜内注射、皮下注射、肌内注射或静脉注射。在另一个实施方案中，可采用慢泵递送或给予含有神经毒性化合物或调节神经毒性化合物的组合物。胃肠外剂型的实例包括活性成分在熟知的药学上可接受的液体载体诸如液体醇、二醇(例如，聚乙二醇)、葡萄糖溶液(例如，5％)、酯、酰胺、无菌水或缓冲盐水(包括缓冲液如磷酸盐或醋酸盐；例如，等渗盐水)中的含水溶液。在另一示例性方面，胃肠外剂型可呈含有神经毒性化合物剂量的可重新构成的冻干剂(lyophilizate)形式。在各个方面，可采用增溶剂、局部麻醉剂(例如，利多卡因)、赋形剂、防腐剂、稳定剂、润湿剂、乳化剂、盐和润滑剂。
在各实施方案中，任一前述实施方案的神经毒性化合物剂量可在约0.1mg/kg动物体重每日至约500mg/kg动物体重每日范围内。在另一个实施方案中，神经毒性化合物或调节神经毒性化合物的剂量可在约1.0mg/kg动物体重每日至约400mg/kg动物体重每日范围内。在其它实施方案中，神经毒性化合物或调节神经毒性化合物的剂量可在约10mg/kg动物体重每日至约300mg/kg动物体重每日、约10mg/kg动物体重每日至约200mg/kg动物体重每日、约10mg/kg动物体重每日至约100mg/kg动物体重每日或约10mg/kg动物体重每日至约50mg/kg动物体重每日范围内。
在任一前述实施方案中，可作为单一剂量或可分开的多剂量给予和作为每日多剂量方案给予含有神经毒性化合物或调节神经毒性化合物的组合物。此外，交错方案，例如，每周1-6天、每周一次或每月1-3次可用作每日给药的供选择的方案。而且，每日给药是适当的。
在另一个实施方案中，本文描述动物模型或本文所述的任一实施方案的方法，其中用选自腿伸展试验、步幅长度试验、旋转棒试验、金属丝悬挂试验、水迷宫试验、八臂迷宫试验、Digigate系统试验、运动轨迹自动视频跟踪试验、焦虑试验、抑郁试验和嗅觉系统试验的任何一种或多种行为异常试验监测或研究或检查神经变性疾病。进行这些试验监测和研究神经变性和神经变性疾病的程序描述于本文的实施例中，并为本领域技术人员所熟知。
一方面，行为异常可为运动功能异常或认知功能异常。此外，举例说明，可通过死后检验中枢神经系统组织，监测或检验神经变性，该组织可来自选自皮层、海马、脊髓和黑质的部位。死后检验中枢神经系统组织的方法为本领域熟知并详述于本申请的实施例章节中。
确定和测量体内和体外神经毒性对非人动物的神经系统的细胞和组织的影响和研究暴露于本文所述的神经毒性化合物或调节神经毒性化合物和组合物的非人动物的行为的方法也详述于WO2002/37122中，其公开通过全文引用结合于本文。
在另一个实施方案中，本文描述用于神经变性疾病模型中的含有下式化合物及其药学上可接受的载体的神经毒性组合物
Figure BPA00001392911600291
其中
R1为任选被取代的糖基；
R2是氢、烷基、链烯基、炔基、杂烷基、卤代烷基或OR4；
R3是氢、烷基、链烯基、杂烷基、卤代烷基或OR4；
R4在各种情况下独立地选自氢、烷基、杂烷基、卤代烷基、链烯基、炔基和酰基；
标有a、a’、b、c、d、e、f和g的键各自独立地选自单键和双键，前提是对于标有b、c和d的各键，相邻的键不能两者同时为双健；和其中的化合物并非选自β-谷甾醇-β-D-葡糖苷和胆固醇葡糖苷的化合物。
在另一个实施方案中，本文描述用于神经变性疾病模型中的含有下式化合物及其药学上可接受的载体的神经毒性组合物
Figure BPA00001392911600301
其中
R7和R8各自独立地选自饱和脂肪酸酰基、单不饱和脂肪酸酰基和多不饱和脂肪酸酰基，它们各自任选被卤素、甲基、烷基、羟基、酮基、甲氧基或烷氧基取代；R9是糖基。
在另一个实施方案中，本文描述的是任一前述权利要求的神经毒性组合物，其进一步含有下式的调节神经毒性化合物
Figure BPA00001392911600302
其中
R10和R11各自独立地选自烷基和链烯基，它们各自任选被取代；和X是选自卤素、烷基和烷氧基的0-3个取代基。
在另一个实施方案中，本文描述任一前述实施方案的神经毒性组合物，其中R1选自己糖基和戊糖基，它们各自任选被取代。
在另一个实施方案中，本文描述任一前述实施方案的神经毒性组合物，其中R1选自己糖基和戊糖基，它们各自任选被取代；R2为甲基或乙基；和R3是氢。
在另一个实施方案中，本文描述任一前述实施方案的神经毒性组合物，其中R1选自己糖基和戊糖基，它们各自任选被取代；R2为甲基或乙基；R3是氢；和标有b的键是双键。
在另一个实施方案中，本文描述任一前述实施方案的神经毒性组合物，其中标有g的键是双键。
在另一个实施方案中，本文描述任一前述实施方案的神经毒性组合物，其中R1具有下式
Figure BPA00001392911600311
其中R5在各种情况下独立地选自氢、甲基和C(O)R6，其中R6为烷基、卤代烷基或杂烷基。
在另一个实施方案中，本文描述任一前述实施方案的神经毒性组合物，其中R1是β-D-葡糖基。在另一个实施方案中，本文描述任一前述实施方案的神经毒性组合物，其中的神经毒性化合物选自菜油甾醇葡糖苷、二氢菜子甾醇葡糖苷、麦角甾醇葡糖苷和燕麦甾醇葡糖苷。在另一个实施方案中，本文描述任一前述实施方案的神经毒性组合物，其中的神经毒性化合物是菜油甾醇葡糖苷、二氢菜子甾醇葡糖苷、豆甾醇葡糖苷、麦角甾醇葡糖苷、燕麦甾醇葡糖苷或谷甾醇糖苷中的两种或多种的混合物。在另一实施方案中，神经毒性化合物可选自豆甾醇葡糖苷、菜油甾醇葡糖苷、二氢菜子甾醇葡糖苷、麦角甾醇葡糖苷和燕麦甾醇葡糖苷。
在另一个实施方案中，本文描述任一前述实施方案的神经毒性组合物，其中的神经毒性化合物是豆甾醇葡糖苷。在另一个实施方案中，本文描述任一前述实施方案的神经毒性组合物，其中的神经毒性化合物是菜油甾醇葡糖苷。在另一个实施方案中，本文描述任一前述实施方案的神经毒性组合物，其中的神经毒性化合物是二氢菜子甾醇葡糖苷。
在另一个实施方案中，本文描述任一前述实施方案的神经毒性组合物，其中R9为单糖、二糖或三糖。在另一个实施方案中，本文描述任一前述实施方案的神经毒性组合物，其中R9为单糖。在另一个实施方案中，本文描述任一前述实施方案的神经毒性组合物，其中R9为二糖。
在另一个实施方案中，本文描述任一前述实施方案的神经毒性组合物，其中R7或R8之一为任选被取代的单不饱和脂肪酸酰基，以及R7或R8中的另一个为任选被取代的多不饱和脂肪酸酰基。
在另一个实施方案中，本文描述任一前述实施方案的神经毒性组合物，其中调节神经毒性化合物是生育酚或生育三烯酚。在另一个实施方案中，本文描述任一前述实施方案的神经毒性组合物，其中调节神经毒性化合物是β-生育酚。
在任一前述组合物实施方案中，神经变性疾病可选自多种疾病状态。神经变性疾病可选自进行性核上性麻痹、阿尔茨海默氏病、额颞叶痴呆(例如，皮克病、额颞叶变性、进行性失语和语义性痴呆)、运动神经元疾病(例如，肌萎缩性侧索硬化、原发性侧索硬化、进行性延髓性麻痹、假延髓性麻痹、进行性肌萎缩症和脊髓性肌萎缩症)、神经病、周围神经病、早发性帕金森氏病和迟发性帕金森氏病。在本文所述的组合物的另一实施方案中，神经变性疾病可选自肌萎缩性侧索硬化、早发性帕金森氏病、迟发性帕金森氏病和阿尔茨海默氏病。在又一个实施方案中，神经变性疾病是阿尔茨海默氏病或帕金森氏病。作为选择，在任一前述组合物实施方案中，神经变性疾病可为肌萎缩性侧索硬化。
在其它实施方案中，对于强饲喂养或胃肠外注射，神经毒性组合物可呈在任何可接受载体诸如液体醇、二醇(例如，聚乙二醇)、葡萄糖溶液(例如，5％)、酯、酰胺、无菌水或缓冲盐水(包括缓冲液如磷酸盐或醋酸盐；例如，等渗盐水)中的形式。考虑强饲喂养或胃肠外注射。例如，也可给予呈丸剂、糊剂或片剂形式的神经毒性组合物。根据神经毒性组合物的剂型，除神经毒性化合物或调节神经毒性化合物外，还可包含于组合物中的其它示例性组分为植物油、明胶、乳糖、直链淀粉、硬脂酸镁、增溶剂、局部麻醉剂(例如，利多卡因)、赋形剂、防腐剂、稳定剂、润湿剂、乳化剂、盐和润滑剂。根据本发明，短语“药学上可接受的载体”指任何这些载体或组分或本领域已知的其它任何药学上可接受的载体。
在另一个实施方案中，可胃肠外注射含有神经毒性化合物或调节神经毒性化合物的组合物，举例说明，这类注射可为腹膜内注射、皮下注射、肌内注射或静脉注射。在另一个实施方案中，可采用慢泵递送或给予含有神经毒性化合物或调节神经毒性化合物的组合物。胃肠外剂型的实例包括活性成分在熟知的药学上可接受的液体载体诸如液体醇、二醇(例如，聚乙二醇)、葡萄糖溶液(例如，5％)、酯、酰胺、无菌水或缓冲盐水(包括缓冲液如磷酸盐或醋酸盐；例如，等渗盐水)中的含水溶液剂。在另一示例性方面，胃肠外剂型可呈含有神经毒性化合物或调节神经毒性化合物的剂量的可重新构成的冻干剂形式。在不同的方面，可采用增溶剂、局部麻醉剂(例如，利多卡因)、赋形剂、防腐剂、稳定剂、润湿剂、乳化剂、盐和润滑剂。
在各实施方案中，任一前述实施方案的组合物中的神经毒性化合物或调节神经毒性化合物的剂量可在约0.1mg/kg动物体重每日至约500mg/kg动物体重每日的范围内。在另一个实施方案中，神经毒性化合物或调节神经毒性化合物的剂量可在约1.0mg/kg动物体重每日至约400mg/kg动物体重每日范围内。在其它实施方案中，神经毒性化合物或调节神经毒性化合物的剂量可在约10mg/kg动物体重每日至约300mg/kg动物体重每日、约10mg/kg动物体重每日至约200mg/kg动物体重每日、约10mg/kg动物体重每日至约100mg/kg动物体重每日或约10mg/kg动物体重每日至约50mg/kg动物体重每日范围内。
在任一前述实施方案中，可作为单一剂量或可分开的多剂量给予和作为多剂量的日剂量方案给予含有神经毒性化合物或调节神经毒性化合物的组合物。此外，交错方案，例如，每周1-6天、每周一次或每月1-3次可用作每日给药的供选择的方案。而且，每日给药是合适的。
在一个示例性实施方案中，神经毒性化合物或调节神经毒性化合物是合成的。在本发明的一个方面，可自商业途径得到的甾醇通过本领域已知的方法制备本文所述的神经毒性化合物或调节神经毒性化合物。一个示例性实施例公开于US 2006/0252705A1，其公开通过全文引用结合于本文。另一方面，可根据本领域熟知的方法，通过全部或部分合成制备所述化合物。示例性实施例被Nagatsu等，Bioorg.和Medicinal Chem.4卷，1619-1622，1994；Ohta等，Chem.Pharm.，39卷，1337-1339，1991；Shibuya等Chem.Pharm.，40卷，1166-1169，1992公开，它们各通过全文引用结合于本文中。示例的合成方法也描述于本申请的实施例章节中。
在另一个实施方案中，本文描述的是任一前述实施方案，其中的神经毒性化合物或调节神经毒性化合物被纯化。可通过本领域技术人员已知的任何常规技术，诸如，凝胶过滤、离子交换层析、柱层析、亲和层析、溶剂-溶剂萃取、分子蒸馏、结晶、超滤和HPLC，纯化神经毒性化合物或调节神经毒性化合物。举例说明，β-谷甾醇-β-D-葡糖苷、菜油甾醇β-D-葡糖苷、二氢菜子甾醇β-D-葡糖苷、豆甾醇β-D-葡糖苷和b-谷甾醇β-D-葡糖苷的纯化描述于Khabazian，I.，等，Journalof Neurochemistry，2002，82，516-528；其公开通过全文引用结合于本文中。例如，神经毒性化合物或调节神经毒性化合物可大于90％、95％、96％、97％、98％、98.5％、99％、99.5％或99.7％纯。这类纯化合物为分离的化合物。在本文所述的任一实施方案中，化合物可为合成的。
在任一上述实施方案中，接触神经毒性化合物或调节神经毒性化合物的非人动物可为胎儿动物。在本发明的这个方面，可通过给予妊娠雌性动物神经毒性化合物或调节神经毒性化合物和通过随之发生的暴露于妊娠雌性动物的体液的胎儿“给予”胎儿动物，给予接触神经毒性化合物或调节神经毒性化合物的胎儿动物神经毒性化合物或调节神经毒性化合物。在该实施方案中，可监测年幼动物出生后的神经变性(即，通过给予妊娠雌性动物给予胎儿神经毒性化合物或调节神经毒性化合物和可监测出生后的动物(例如，幼仔)的神经变性)。在该胎儿暴露实施方案中，被监测神经变性的年幼动物可为雄性动物或雌性动物。
在该实施方案中，用于胎儿暴露的神经毒性化合物或调节神经毒性化合物的纯度可大于90％、95％、96％、97％、98％、98.5％、99％、99.5％或99.7％纯。这类化合物为分离的化合物。在该实施方案中，化合物可为合成的。在胎儿暴露的示例性实施方案中，神经毒性化合物或调节神经毒性化合物可为本文所述的任何化合物，其包含选自豆甾醇葡糖苷、菜油甾醇葡糖苷、二氢菜子甾醇葡糖苷、麦角甾醇葡糖苷、燕麦甾醇葡糖苷的任何化合物及其组合。在该胎儿暴露实施方案中，神经毒性化合物也可选自β-谷甾醇-β-D-葡糖苷和胆固醇葡糖苷，或者这些化合物与任何一种豆甾醇葡糖苷、菜油甾醇葡糖苷、二氢菜子甾醇葡糖苷、麦角甾醇葡糖苷、燕麦甾醇葡糖苷及其组合的组合。
在另一个实施方案中，提供检验非人动物的神经变性的方法。该方法包括给予动物合成的神经毒性甾醇糖苷的步骤，其中的神经毒性甾醇糖苷引起动物的神经变性，和其中动物的神经变性通过观察动物行为异常检查或就动物中枢神经系统组织验尸检查。举例说明，甾醇糖苷可为上述任何甾醇糖苷神经毒性化合物或其组合，或者与上述任何调节神经毒性化合物组合的任何这些化合物，且所述化合物可被分离(例如，大于90％、95％、96％、97％、98％、98.5％、99％、99.5％或99.7％纯)。在上述所有实施方案中，可通过选自腿伸展试验、步幅长度试验、旋转棒试验、金属丝悬挂试验、水迷宫试验、八臂迷宫试验、Digigate系统试验、运动轨迹自动视频跟踪试验、焦虑试验、抑郁试验和嗅觉系统试验的行为试验鉴别神经变性。在一方面，行为异常可为运动功能异常或认知功能异常。此外，举例说明，死后检查的中枢神经系统组织可来自选自皮层、海马、脊髓和黑质的部位。举例说明，甾醇糖苷可引起神经元兴奋性毒性。
在又一个实施方案中，提供神经毒性甾醇糖苷介导的神经变性的动物模型。该动物模型包括患有通过给予足以使非人动物产生神经变性的量的神经毒性甾醇糖苷引起的神经变性的非人动物。举例说明，甾醇糖苷可为任何一种上述神经毒性化合物或其组合，或者甾醇糖苷可与上述任何调节神经毒性化合物组合，及所述化合物可被分离(例如，大于90％、95％、96％、97％、98％、98.5％、99％、99.5％或99.7％纯)并可被合成。在该实施方案中，可通过选自腿伸展试验、步幅长度试验、旋转棒试验、金属丝悬挂试验、水迷宫试验、八臂迷宫试验、Digigate系统试验、运动轨迹自动视频跟踪试验、焦虑试验、抑郁试验和嗅觉系统试验的行为试验鉴别神经变性。在一方面，行为异常可为运动功能异常或认知功能异常。此外，举例说明，死后检查的中枢神经系统组织可为选自皮层、海马、脊髓和黑质的部位。举例说明，甾醇糖苷可引起生神经元兴奋性毒性。
在本文所述的任一实施方案中，可在给予动物化合物前，水解甾醇糖苷中的苷键，例如，以确定该键的水解是否抑制甾醇糖苷的神经毒性。在这些实施方案中，可在给予动物甾醇糖苷之前，用降解神经毒性甾醇糖苷的酶处理甾醇糖苷。在本申请中所述的任一实施方案中，甾醇糖苷可为非酰化的。
在示例性实施方案中，描述形成本文所述的式I神经毒性化合物的方法，
该方法包括使D-葡萄糖与新戊酰氯接触的步骤，
其中R2是氢、烷基、链烯基、炔基、杂烷基、卤代烷基或OR4；
R3是氢、烷基、链烯基、杂烷基、卤代烷基或OR4；
R4在各种情况下独立地选自氢、烷基、杂烷基、卤代烷基、链烯基、炔基和酰基；
标有a、a’、b、c、d、e、f和g的键各自独立地选自单键和双键，前提是对于标有b、c和d的各键，相邻的键不能两者同时为双健；
在另一个示例性实施方案中，描述本文所述式I的神经毒性化合物的形成方法，
该方法包括使β-D-葡萄糖五新戊酸酯与HBr/HOAc混合物接触以形成第一种中间体的步骤，
以及使第一种中间体与在水和溶剂混合物中的Ag2CO3接触，形成2，3，4，6-四-O-新戊酰-β-D-吡喃葡萄糖。
在另一个示例性实施方案中，描述本文所述的式I神经毒性化合物的形成方法，
该方法包括使2，3，4，6-四-O-新戊酰-β-D-葡萄糖与三氯乙腈和碱接触，形成2，3，4，6-四-O-新戊酰-α-D-吡喃葡萄糖基三氯亚氨逐乙酸酯的步骤。
在另一个示例性实施方案中，描述形成本文所述的式I神经毒性化合物的方法，
该方法包括在无水溶剂中，在三氟化硼乙醚络合物的存在下，使式II甾醇
与2，3，4，6-四-O-新戊酰-α-D-吡喃葡萄糖基三氯亚氨逐乙酸酯接触，形成式III化合物的步骤
Figure BPA00001392911600382
其中P是新戊酰。
在另一个示例性实施方案中，描述形成本文所述的式I神经毒性化合物的方法，
该方法包括使式III甾醇与甲醇中的甲醇钠接触的步骤。
在又一个实施方案中，描述本文所述的式I神经毒性化合物的形成方法，该方法包括两个或更多个呈任何组合的前述方法实施方案。
本文所述的某些化合物含有一个或多个手性中心，或者可另外能够作为多种立体异构体存在。本发明的范围包括纯立体异构体以及立体异构体的混合物，诸如对映异构体、非对映异构体和富含对映异构体或非对映异构体的混合物。本文所述的某些化合物可作为几何异构体存在。本发明的范围包括纯几何异构体或几何异构体的混合物。
本领域技术人员也容易认识到，在以普通方式将各成员一起分组的情况下，诸如以马库什基团分组，本发明不仅涵盖作为整体列出的全部基团，而且涵盖单独基团和主要基团的所有可能的亚组的各个成员。因此，为了所有的目的，本发明不仅涵盖主要基团组，而且涵盖缺乏一个或多个基团成员的主要基团组。本发明还涵盖一个或多个任何基团成员的明确排除。
当考虑到以下示例性实施方案的详细描述时，本发明的其它特征对于本领域的技术人员而言，将变得显而易见。
实施例1
动物
小鼠：
5月龄雄性CD-1小鼠(30.1-35.7g，7.5cm-8.8cm)购自CharlesRiver(Wilmington，MA)。选择成年小鼠模拟ALS-PDC发作的平均年龄(Kurland，L.T.(1988a)Trends Neurosci.11，51-4；Kurland，L.T.，等(1994)Guam的肌萎缩性侧索硬化-帕金森氏病-痴呆复征：流行病学和病原学视角.109-131)。将用于SG研究的30只小鼠随机分为2组(14只对照动物和16只实验动物)。12小时光/暗循环下，保持22℃，使所有动物单独居住于室内的无病毒栅栏设施中。使小鼠可随意取得食物和水。
实施例2
饲养方案
饲养：
将合成SG与磨细的Purina Chow鼠粮丸(Mouse DietTM，Purina)混合，制作每丸SG含量1000μg的实验丸。用无菌硅胶刮铲使干燥原料混合。针对每5g的标准饮食，加入2.5mL双蒸水(dd)H2O，揉捏生面团并滚成小丸。在加入正常鼠粮(随意)之前，每天早晨将含有单一甾醇糖苷的小丸放入饲养盘(feeding tray)中。每日小鼠吃光所有的实验丸。用无添加剂的同一重量的鼠粮丸喂养对照小鼠。每日进行SG饲养15周，监测小鼠行为直至于35周(时间点1)或52周(时间点2)处死为止。两组动物表现出正常的体重增加。参见图1。
实施例3
行为试验
行为监测：
普通条件：在无病毒设施中，在标准光条件下，在10a.m.和5p.m.之间用各行为实验单个测试小鼠(Crawley，J.N.(2000)我的小鼠出现什么问题了？：转基因和基因敲除小鼠的行为显型.65-69)。按每时间段在各组间随机排列小鼠的试验程序。在记录行为时，观察者不知各动物所属的实验组。
旋转棒(Rotorod)：用旋转棒评价运动功能、协调和平衡(Jones，B.J.，等(1968)Naunyn Schmiedebergs Arch Exp Pathol Pharmakol.259，211；Sango，K.，等(1995)Nat Genet.11，170-6；Gerlai，R.，等(1996)Neurobiol Learn Mem.66，143-54；Sango，K.，等(1996)Nat Genet.14，348-52；Chapillon，P.，等(1998)Behav Brain Res.93，77-81；Carter，R.J.，等(1999)J Neurosci.19，3248-57；Crawley，J.N.(1999)Brain Res.835，18-26；Gerlai等，1996)。测量小鼠在衬垫区域上的在升高的转动轴上(3.6cm直径；16rpm)可保持水平行走而不掉下(Norflus，F.，等(1998)J Clin Invest.101，1881-8)、抓紧或跳下轴(Crawley，1999)的时间，参见图15。将各小鼠置于棒的中间(Chen，C.，等(1995)Cell.83，1233-42)和每周测试两次最大值160秒(Barneoud，P.，等(1999)ExpNeurol.155，243-51；Crawley，1999)。SG喂养的小鼠表现出未掉下的时间下降，参见图2。
金属丝悬挂：用金属丝悬挂(或悬挂金属丝(hanging wire))试验测试神经肌肉力量(Wilson，J.，等(2003d)Neuromolecular Med.3，105-18；Wilson，J.M.，等(2004c)Neuroimage.23，336-43；Wilson，J.M.，等(2005)Soc Neurosci.Abstr.online；Tabata，R.C.，等(2008)Neuromolecular Med.10，24-39)。小鼠需要平衡和握力以保持其身体悬空(Crawley，2000)。将小鼠置于软着陆表面上升高50cm的金属丝笼盖(wire cage lid)上。自金属丝装置倒转(180°)时起计量自金属丝跌落的等待时间(最大值60秒)(Sango等，1996)。每两周进行一次金属丝悬挂试验。对照动物组表现出装置倒置和跌落之间的时间的增加，而SG喂养的小鼠并不表现出这种时间的增加。参见图4。
腿伸展反射试验：用腿伸展反射试验作为运动神经元功能异常的测量(Barneoud等，1999)。用其变换形式区别更细微的行为变化。采用考虑到可能的动物响应而开发出的0-4级评分(Wilson，J.M.，等(2002a)Neuromolecular Med.1，207-21)：给出4分是指动物两腿表现出完全伸展。认为这样的响应是正常的响应。当动物伸展的两腿有些震颤和/或蹬出一条腿时，给出3分。2分表示动物伸出一条腿并缩回另一条腿，或者动物表现出两肢震颤。1分表示动物缩回一条腿且另一条腿表现出震颤。当两腿缩回时认定为0分。每周对每个动物测试腿伸展反射三次。由于在先前的苏铁和甾醇糖苷研究中已经发现正常反射渐进性恶化为震颤并随后完全缩回，故设计该等级评分试验以表明功能的进行性丧失(Wilson，J.M.，等(2002b)Neuromolecular Med.1，207-21；Tabata等，2008)。研究期间SG-喂养的小鼠的肢伸长评分下降，参见图3。
旷场监测：认为旷场中自发性活动是运动功能的一种最标准化的常规测试(Crawley，2000)。旷场试验也能显示动物的应急响应(即，电极包埋(defensive burying)或趋触性)(Karl等，Exp Toxicol Pathol.，2003，55(1)：69-83)。每两周对各动物进行旷场试验。将单个鼠置于四个旷场区/盆(约1m直径)之一中，每5分钟试验测试四只动物。已经表明，5分钟足以评价运动的总体异常和极其显著的活动过度或行为镇静(behavioral sedation)(Crawley，2000)。由于他们更好地界定“区域”(即，中央和周边)和允许小鼠覆盖更长的距离并表现出更广泛的运动变化，采用大区域。这依次增加基于恐惧的行为的检测可能性(Crawley，2000)并将动物对旷场的适应性减至最低(Crawley，2000)。在测试各动物之前，用70％乙醇清洁测试场地，各试验期结束时用quatricide清洁场地。用安装在顶棚上的摄影机纪录整个活动。回放视频剪辑，手工评分，或用自动视频跟踪软件(Ethovision
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3.1，Noldus信息技术公司，Leesburg，VA，USA)自动分析。根据录像带播放而不是试验时亲自进行评分，以避免由于观察者近距离接近小鼠的出现而产生混乱的可变因素(Crawley，2000)。
步态分析：为在向前运动期间检验前肢和后肢的步姿(steppingpatterns)的空间和时间指标(temporal indices)，需要使小鼠在设定为30rpm，带不闪烁(no-flicker)光源(90-250 VAC；25kHZ，Mouse Specifics，Inc.，Boston，MA，USA)的无色(PVC和聚碳酸酯)、笔直、水平、有壁机动带(walled motorized belt)(DigigaitTM，跑步机马达(treadmillmotor)：DC，HP；扭距45lb-in，Mouse Specifics，Inc.，Boston，MA，USA)上行走，(相对于动物)前侧安装摄像机以便能够对活动进行连续前侧水平摄像(每秒至多150帧)。用互补数字成像软件(DigigaitTM，Mouse Specifics，Inc.，Boston，MA，USA)按厂商的指示进行步态指标分析。简单地说，该软件将“爪印”转变为数字信号并生成脚爪位置(pawplacement)的短暂纪录，并将数字文件拆分为三个主要参数：步幅持续时间、摆动持续时间和站姿持续时间。站姿持续时间是肢爪接触带表面的时间段。该软件进一步将站姿持续时间细分为两个部分：制动持续时间(整个离散时间间隔时期的爪接触区的增加)和推进持续时间(整个离散时间间隔时期的爪接触区的减少)。摆动持续时间是爪未接触带表面的时间段。除这些因素之外，还产生超过一打的其它特征，包括站姿因素、步进顺序方式、推进和节奏，以提供25种步态指标的电子数据报表格式(spreadsheet format report)。
实施例4
器官收集和冷冻切除
处死35周龄(35.9-48.6g)和52周龄(41.2-51.4g)小鼠用于组织学分析。包括来自各时间点的年龄匹配的对照小鼠以作比较。用4％异氟烷深度麻醉笼中小鼠，并心脏内输注经过滤的PBS(pH 7.4)，直到流出液无血(2分钟)，随后输注在0.1M磷酸盐缓冲液(pH 7.4)中的冷(4℃)4％低聚甲醛(PFA)5分钟(30mL)。PBS和PFA经分开的无菌铂金硬化硅胶管(Cole-Parmer Canada Inc.，Montreal，Canada)和蠕动泵(MasterFlex peristaltic pump，Cole-Parmer Canada Inc.，Montreal，Canada)递送。切开大脑和脊髓并4℃下固定过夜，在pH 7.4、增加浓度的磷酸盐缓冲液(10、20和25％)中的蔗糖中平衡3天的时期。当组织下沉到装有25％蔗糖的闪烁管的底部时，就认为组织完全平衡。平衡后，将脊髓和大脑标本置于沉浸于干冰上的异戊烷(BDH LaboratorySupplies，UK)浴冰冻的最适宜切片温度(OCT)凝胶-蔗糖混合物的模(Tissue-tek Cryomold，Sakura Finetek，USA，Torrance，CA)中，并于-80℃下贮存直到处理。
组织的冷冻切除(Oryosectioning)：用Hacker-Bright低温保持器(Hacker Instruments和Industries Inc.，Winnsboro，SC)切割冷冻的冠状切片(脊髓：20μm，脑：30μm)并固定在带电载玻片(SuperfrostPlus；Fisher Scientific，Pittsburgh，PA)上，这样各片上的相邻CNS切片表示脊髓和脑分别相隔100μm和150μm范围(Tabata等，2008)。于-80℃下贮存各片，直到组织学处理。为确保各动物间的CNS切片相匹配，采用鼠脑图谱证实解剖标志(Paxinos和Franklin，小鼠脑立体定位坐标(The mouse brain in stereotaxic coordinates)：第二版，K.B.J.，学术出版社，纽约，2001)。
实施例5
组织学
运动神经元的组织学和量化：将来自各动物的脊髓和大脑切片进行尼氏体染色。于室温(RT)下，在等级乙醇系列(95％：15min；70％：1min；50％：1min)中漂洗切片至再水合和自组织除去脂质并固定化学药品。然后在二次交换蒸馏水中再漂洗组织2min，用两次过滤的甲酚紫染色剂(1.25g醋酸甲酚紫、0.75mL冰醋酸至250mL蒸馏水)染色，在蒸馏水中漂洗(1分钟)，然后脱水(50％乙醇：1分钟；1％冰醋酸-70％乙醇：2分钟；95％乙醇：2分钟；95％乙醇：3dips；100％乙醇：1分钟)和在二甲苯中清除。然后用Entellen浸片剂(Merck，Darmstadt，Germany)浸泡载玻片。随机开始选择组织固定的载玻片并自腰第2至第6区域开始取样。最初通过腹侧和背神经根计数确定腰和胸脊髓的高低分界线(superior-inferior boundaries)，并通过比较小鼠脑立体定位图谱证实(Sidman，等，小鼠脑和脊髓的图谱，哈佛大学出版社，Cambridge，MA(1971))。通过侧面、中间和腹侧分界线的灰质边缘并借助于通过中央管的人工画出的线确定腹侧角的分界线。对都来自各动物的12个切片的左和右腹侧角计数。采用精确的形态学和大小标准对具和不具凋亡结构变化的α-运动神经元和γ-运动神经元计数。认为以下为非凋亡α-神经元：具有圆形浅色核的；可见的核仁；球状尼氏体染色的细胞质；和30-45μm直径的大的、多极细胞。在这种情况下，星形胶质细胞、少突胶质细胞和小胶质细胞被排除在“α-运动神经元”计数之外(Martin，L.J.(1999)J Neuropathol Exp Neurol.58，459-71；Sepkuty，J.P.，等(2002)J Neurosci.22，6372-9；Tabata等，2008)。认为经历凋亡的致密小体(pyknotic)或致密核(karyopyknotic)α-神经元是具有30μm和更大的直径、具有浓缩和黑色染色核、细胞外有或无空泡化的那些神经元。认为经历凋亡的染色质溶解的α-神经元是具有30μm和更大直径、具有不可辨别的核、核自或不自其中心位置偏移到边缘、尼氏体(嗜色细胞质(chromophil substance))裂变、细胞外有或无空泡化的那些神经元。认为健康γ-运动神经元是细胞大小在18μm和30μm之间的那些神经元(Szumanska，G.，等(1977)Neuropatol Pol.15，523-35)。认为凋亡γ-运动神经元是大小在18μm和30μm之间、带浓缩和黑色染色核、细胞外有或无空泡化的那些神经元。有完整的核(在对“健康”α-和γ-运动神经元的读数内)、核仁和胞质溶胶的那些运动神经元包含在计数内。根据未处理动物切片进行的计数充当对照物。结果见图5和8。
实施例6
免疫荧光
如下对组织固定的载玻片进行荧光显微镜法：于室温(RT)下，在科普林缸中以三种不同的PBS漂洗切片45分钟。然后于室温下，在由5％正常山羊血清(NGS)、5％正常兔血清(NRS)或5％BlokHen II(Aves Labs，Inc.，Tigard，OR)、0.05％Triton X-100和PBS制备的阻断透化溶液中孵育切片30分钟。随后，倒干净(tipped off)阻断液，在PBS中漂洗载玻片2分钟。然后于4℃下，于加湿室中用PBS缓冲溶液孵育切片过夜，该缓冲溶液含有1％NGS或1％NRS、1％牛血清白蛋白(BSA)和以下第一抗体(primary antibodies)中的一种：(a)兔抗-人/鼠ATF-3(H-90)IgG(多克隆的，1∶500；Santa Cruz Biotechnology，Inc.，Santa Cruz，CA)，(b)抗-活化胱天蛋白酶-3IgG(单克隆的，1∶250；Chemicon International，Temecula，CA)(参见图9)，(c)山羊抗人/鼠胆碱乙酰转移酶(ChAT)IgG(多克隆的，1∶100；Chemicon International，Temecula，CA)(参见图6)，(d)兔抗-鼠胶质纤维酸性蛋白IgG(多克隆的，1∶250；GeneTex Inc.，San Antonio，TX)(参见图7)，(e)兔抗人/鼠离子钙结合衔接分子1(IBA-1)IgG(多克隆的，1∶500；Wako PureChemical Industries，Ltd，Richmond，VA)，(f)鼠抗-人/鼠克隆AT8PHF-1τ(单克隆的，1∶200；Pierce Biotechnology Inc.，Rockford，IL)，(g)兔抗-人/鼠TAR DNA-结合蛋白43(TDP43)(1∶100；ProteinTech GroupInc.，Chicago，IL)(参见图14)，(h)鸡抗-人/鼠β-微管蛋白3(TuJ1抗原)(多克隆的，1∶100，Aves Labs，Inc.，Tigard，OR)，(i)兔抗-鼠酪氨酸羟化酶(多克隆的，1∶500，Chemicon International，Temecula，CA或多克隆的1∶1000，Affinity BioReagents，Golden，CO)(图10)，(j)兔抗人/鼠抗-pJunser73IgG(多克隆的，1∶200；Chemicon International，Temecula，CA)，(k)兔抗人/鼠抗-HSP-70IgG(多克隆的，1∶200；Chemicon International，Temecula，CA)或(l)兔抗人/鼠抗-HSP-25IgG(多克隆的，1∶100；Chemicon International，Temecula，CA)。在各实验中，用第一抗体和略去的第二抗体或用第二抗体和略去的第一抗体孵化其它载玻片，测试非特异性显色。在合适的情况下，也可如上处理阳性对照载玻片(阿尔茨海默氏病患者内嗅皮层(entorhinal cortex)，得自Kinsmen实验室的Drs.Claudia Schwab和Patrick McGeer，British Columbia大学，Vancouver，BC，加拿大)以便比较。在用第一抗体孵育过夜后，于RT下，在三种不同PBS中漂洗载玻片45分钟。之后立即于RT下在无光暗房中用含有5％NGS或5％NRS和荧光团共轭抗体：AlexaFluor568山羊抗-兔或兔抗-山羊IgG(单克隆的，1∶250，吸收：578nm，发射603nm；Molecular Probes，Eugene，OR)、AlexaFluor 546山羊抗兔或兔抗-山羊IgG(单克隆的；1∶250，吸收556nm，发射573nm；分子探针，Eugene，OR)或异硫氰酸荧光素(FITC)山羊抗-兔IgG(多克隆的，1∶500，吸收：494nm，emission：518nm；Sigma，Saint Louis，MO)的第二抗体溶液孵化载玻片1小时。倒干净第二抗体溶液，在三种不同PBS中漂洗载玻片15分钟。组织切片用4’6联脒并(diamidino)-2-苯基吲哚(DAPI)荧光封片介质(mounting media)(Vectashield，吸收：360nm，发射：460nm，Vector Laboratories，Burlington，ON，Canada)覆盖，以标记核，于4℃下贮存于遮光滑板箱中以阻止荧光标记的漂白。
实施例7
TAU免疫组织化学
首先用3种不同PBS漂洗载玻片-固定的腰和胸脊髓和脑的切片45分钟，然后以PBST(PBS+0.5％Triton X-100)中的3％H2O2猝灭10分钟。在2种不同PBST中漂洗载玻片4分钟。按照制造商的使用说明制备MOM小鼠Ig封闭剂。将两滴小鼠Ig原液加至2.5mL PBS中。于RT下用该溶液孵化切片1小时。该步骤后，在2种不同PBST中漂洗切片4分钟并用通过加入600Vl MOM蛋白浓缩物至7.5mLPBS中制备的MOM稀溶液孵化(5分钟)。将稀释液倒入载玻片并被由在如上讨论的相同方法制备的稀溶液中以1∶100稀释的磷酸-τ第一抗体组成的溶液置换。于RT下，孵化切片60分钟。随后，在2种不同PBST中漂洗切片4分钟，并在MOM生物素化抗-鼠IgG试剂(稀释于2.5mL MOM稀释液的10Vl MOM生物素化抗-鼠IgG)中孵化10分钟。然后在PBST中漂洗切片，并用通过来自Vectastain ABC Elite试剂盒(Vector Laboratories，Burlingame，CA，USA)的1滴第二抗体(生物素化山羊-抗-兔IgG)与3滴血清原液合并为10mL PBST制备的第二抗体孵化(RT下，1小时)。在开始用第二抗体孵化载玻片后的30分钟，通过将2滴试剂A和2滴试剂B(Vectastain Elite ABC试剂盒，VectorLaboratories，Burlingame，CA，美国)加至2.5mL PBST中制备免疫过氧化物酶溶液。在用第二抗体溶液孵化载玻片1小时后，在两种不同PBST中漂先载玻片4分钟并在免疫过氧化物酶工作液中孵化30分钟。接着，在2种不同PBST中漂洗切片4分钟。漂洗期间，为下一步骤制备DAB液体底物。按照制造商的使用说明书，合并2滴缓冲原溶、5mL ddH2O、4滴DAB原液和2滴过氧化氢溶液。RT下用该DAB溶液孵化载玻片3分钟并监测显色。在ddH2O中漂先切片5分钟以终止反应，并使载玻片离开DAB底物。用甲基绿核复染剂显示核和运动神经元体细胞。按以下方法制备0.5％甲基绿复染剂：首先，将1.36g三水合醋酸钠加至100mL蒸馏水中，用冰醋酸调节至pH4.2，制备醋酸钠缓冲液。对每100mL缓冲溶液，加入0.5g甲基绿(乙基紫，Sigma-Aldrich，Oakville，ON，Canada)以制备0.5％甲基绿溶液。RT下，将载玻片-固定的切片在以上甲基绿溶液中染色5分钟。在蒸馏水中漂洗切片，直到水变得透明。接着，用95％乙醇(5dips)和2种不同的100％乙醇(每种5dips)使切片快速脱水，然后用10dips二甲苯清除。最后，在通风橱中干燥载玻片，并用含树脂切片固定介质(Entellen，Merck，Darmstadt，Germany)覆盖。在未处理小鼠中未观察到磷酸化τ聚集。在SG-喂养的小鼠中观察到磷酸化τ聚集(参见图13)。
实施例8
酪氨酸羟化酶免疫组织化学
脑切片中的多巴胺能神经元标记经酪氨酸羟化酶抗体鉴定orrow，C.E.，Bandstra，等，(2001)Neurotoxicol Teratol.23，533-44)并直接免疫过氧化物酶染色。RT下，在封闭血清中孵化切片2小时，然后用第一抗体(兔抗-酪氨酸羟化酶，1∶500，Affinity Bioreagents，Golden，CO，USA)孵化3小时。室温下，在生物素化山羊抗-兔IgG(1∶100；Vectorlaboratories Inc.，Burlingame，USA)中漂洗并孵化切片30分钟，然后用ABS方法观察(Vectastain Elite ABC试剂盒，Vector Laboratories Inc.)。参见图10。
实施例9
细胞色素C氧化酶组织化学
对于荧光免疫组织化学，用根据(Seligman等，J.Cell.Biol.1968；38：1-14和Wong-Riley，(1979)，Brain Res.171，11-28)改编的方法，处理组织-固定的载玻片。RT下，在科普林缸中以三种不同的PBS中漂洗切片15分钟，随后用含有50mg 3，3’-二氨基联苯胺四盐酸盐(DAB)(DAB底物系统，Vector Laboratories，Burlingame，CA，USA)、90mL0.1M磷酸盐缓冲液、20mg细胞色素c(III型，Sigma-Aldrich Co.，Oakville，ON，加拿大)和4g蔗糖的培养基在浸于保持在黑暗中的37℃水浴中的碟中孵化2小时。密切监测切片的棕色反应产物出现在组织中。一旦得到棕色培养基，就自培养基移去载玻片并在3种不同的PBS中漂洗15分钟以停止反应。随后在蒸馏水中漂洗2分钟以自载玻片除去残余物。载玻片在通风橱中干燥并用Entellen(Merck，Darmstadt，Germany)覆盖。结果表明，在对照小鼠和SG-喂养的小鼠之间，不存在显著差异，尽管两组都随时间的过去表现出细胞色素c氧化酶的减少，参见图11。
实施例10
油红O组织化学
用改编自Dr.Roy Ellis(IMVS Division of Pathology，The QueenElizabeth Hospital，Woodville，South Australia)的方案，处理组织-固定的载玻片，用光学显微镜检查评价脂质分布。首先，在进行组织化学程序之前2小时制备油红O原液。通过在40℃水浴上混合油红O(0.5g，Sigma-Aldrich，Oakville，ON，Canada)和异丙醇(100mL，FisherScientific，Nepean，ON，Canada)，制备油红O染色原液。在开始油红O组织化学程序之前，即时通过每30mL油红O染色原液合并20mL蒸馏水，制备油红O工作液。过滤该工作液5次，以除去不溶解于溶剂的任何油红O。RT下，在科普林缸中以3种不同的PBS漂洗载玻片固定的切片15分钟。再于RT下，用60％异丙醇漂洗切片5分钟。然后脊髓切片用新鲜制备的油红O工作液染色20分钟，随后用60％异丙醇漂洗。通过用苏木精(苏木精，7211，Richard Allan Scientific，Kalamazoo，MI，USA)染色切片1分钟，得到核复染剂。最终，切片经蒸馏水漂洗，在通风厨中干燥并用Entellen(Merck，Darmstadt，Germany)封盖。参见图12。
实施例11
组织形像化和图像拍摄
检验免疫荧光方法处理的组织切片并用Zeiss Axiovert 200M(Carl Zeiss Canada Limited，Toronto，ON)拍摄。DAPI(蓝荧光)图像化需要359/461nm吸收/发射滤光片。FITC需要490，494/520nm滤光片。Alexa Fluor 546TM(红荧光)使用56，557/572，573nm滤光片。在40倍放大量化期间，拍摄经腰和胸脊髓部分(即，左腹侧角和右腹侧角)的两张图片。类似地，拍摄经脑区域和经背或腹侧神经根切片的两张图片。40倍图像的尺寸为350x275Vm。用AxioVision 4.3软件拍摄图像。用带AxioCam HRM的Zeiss Axiovert Zoom Axiovision 3.1分析经免疫荧光处理的数据。检验非荧光方法处理的组织切片并用Motic B5专业系列3.0显微镜(Motic Instruments Inc.，Richmond，ON)拍摄，用MoticB5 Professional，Motic Images Advanced 3.0(Motic Instruments Inc.，Richmond，ON)分析数据。
实施例12
量化免疫反应性细胞胞体或内含物
在小鼠脑图谱(2001)所界定的区域边缘内的600μm/600μm区域，用40x物镜对越过脊髓的腹侧角、越过大脑两半球或通过背或腹侧神经根的免疫反应性胞体或内含物的数量计数。对各个动物，研究经脊髓或脑髓区域的8个横切片。产生8个横切片的每一个的右和左腹侧角二者的平均数，以给出各动物在各脊髓部位的最终平均数。为量化黑质致密部和纹状体切片中腰脊髓或酪氨酸羟化酶免疫反应性的线粒体活性水平(细胞色素c氧化酶标记)，将用Motic B5专业系列3.0显微镜(Motic Instruments Inc.，Richmond，ON)拍摄和用Motic B5Professional，Motic Images Advanced 3.0(Motic Instruments Inc.，Richmond，ON)分析的图像扫描成TIFF格式文档，并用NIH Image J1.37软件分析，以测量抗体标记的密度水平。包括来自各小鼠所关注的每一区域的8-12个切片。
实施例13
统计学分析
得自各脊髓或脑切片的各半球的定量数据被平均，以产生半球平均值，然后于统计学分析前，平均各动物的数据平均值。采用Student’st检验对对照小鼠和SG-喂养的小鼠之间的差异性进行统计学评价，要出现显著性差异，需要p＜0.05。将全部数据表示为平均值的平均+/-标准误差(SEM)。采用不成对双尾t检验、单因素或两因素ANOVA，随后用Tukey’s事后分析或Fisher’s LSD(GraphPad Prism v3.0，GraphPad Software Inc.，San Diego，CA；Statistica for Windows v.6.1统计学软件包，Statsoft，Tulsa，OK)确定统计显著性。统计学分析经来自University of British Columbia的统计学系的几位校阅者独立地评述。
实施例14
神经毒性调节剂化学
一些苏铁粉(PL-粉)使喂过该粉的大鼠产生帕金森样综合征。当通过HPLC比较一流分(流分PL)该粉的萃取物和相同流分的来自不产生相同帕金森样综合征的其它三种粉的萃取物时，观察到来自PL-流分的流分在萃取物中比在其它萃取物中呈现更大的量。HPLC条件，柱SB-C18，80％MeCN，20％MeOH，0.2mL/min，30℃；未拆分，感兴趣的一个峰在7.37min。在210nm、300nm和经荧光(于330nm观察，于295nm激发)观察。在更高的温度下，峰进一步拆分成3个峰，3.50min、3.73min、4.05min，检波器设定在210nm；4.05min峰仅在检波器设定在300nm时显现。HPLC条件SB-C18，80％MeCN，20％MeOH，0.2mL/min，60℃。
流分PL的质子NMR表明，该分子中的全部质子中的大多数衍生自脂肪酸，包括单、双和/或多不饱和脂肪酸。在0.9的峰，甲基；1.3，亚甲基；1.6，β-CO亚甲基；2.1，烯丙基亚甲基；2.3，α-CO；2.8，双烯丙基峰；5.2，甘油酯；和5.3，双键。这些信号全部与提出的结构片段有一致的2D NMR相关性并组成该流分中全部质子的85％。而且，可鉴别在双重双峰的各峰的4.1和4.3ppm的亚甲基甘油酯(可能C1)。落在3.5-4.5ppm区域内的其它所有甘油酯和糖峰被加宽。在吡啶-D5中加热至80℃稍微有助于加宽糖区域，包括拆分105ppm处的异头碳，但未观察到甘油酯和糖区域的完全拆分。就NMR而言，TOCSY关联性是不完全的，且不可能确定完整的糖自旋系统。而且，加宽导致信号损失成噪音。因此，并非全部碳可经HSQC检测。
MS数据表明主要包含连着在三个HPLC峰的两个中的二酰甘油的单-和双-C6-糖的相关糖酯的存在。第三个峰含有经NMR、LCMS(M+H+417)和UV和荧光数据鉴别为β-生育酚的化合物。产生帕金森样综合征的粉中的更大量的该原料提示，它调节着苏铁粉中其它组分的神经毒性作用。
对于混合物的一种组分，MS在M+H＝417的信号和在151片段与区位异构体的β和γ生育酚的结构相符。UV和荧光发射谱也与生育酚结构一致。根据我们结果中观察到的峰，所述质子和碳NMR数据明确证实这为β-生育酚(参见以下结构)。具体说来，观察到β-生育酚的C7(1H在6.46，13C在115.3)和C8(甲基)(13C在15.8)，尽管未观察到预计为γ区域异构体(regioisomer)C5的那些峰(1H在6.37，13C在112.1)和C8(甲基)(13C在11.9)。在来自流分PL的NMR数据中，该分子的类萜尾端未被明显拆分，因为它与糖脂的脂肪酸链的信号重叠。在0.87ppm的碳C4′、C8′和C12′上的甲基未在19ppm和22ppm明显表现出与生育酚结构一致的碳信号(脂肪酸的末端甲基在该区域重叠，但具有13ppm的碳信号。在COSY和TOCSY数据(未显示)中，生育酚的C3和C4上的质子也被观察到并表现出相互偶合。
Figure BPA00001392911600521
经高分辨质谱法对流分的分析表明，并非β-生育酚的原料流分包含二糖和单糖糖酯的混合物。下面概述质谱数据。
质谱数据
二糖成分
Figure BPA00001392911600531
分析两个主要质量峰：
939峰
HRMS 939.5879，计算值C49H88NaO15[18:2，16:0，己糖，己糖，Na+]939.6021。MSMS显示在685.44、683.41、659.38、657.39和405.17的峰，表示衍生自任一脂肪酸(FA)或二者的缺失的片段，各FA中的不饱和度被混合。
965峰
HRMS 965.6033，计算值C51H90NaO15[18:2，18:1，己糖，己糖，Na+]965.6177。MSMS显示在683.41、685.42和405.17的峰，表示衍生自任一脂肪酸(FA)或二者的缺失的片段。
单糖成分
Figure BPA00001392911600532
分析一个主要质量峰：
801峰
HRMS 801.5357，计算值C45H78NaO10[(18:1，18:3)和(18:2，18:2)，己糖，Na+]801.5493。MSMS显示在519.34、521.34、523.38和243.08的峰，表明衍生自一个18:1、18:2和18:1FA或二者的缺失的片段。在335.28、337.31和339.3的峰表示通过自衍生自一个FA缺失的片断进一步缺失己糖片断所衍生的片断。
实施例15
分娩前暴露于甾基糖苷
9只5月龄CD-1雌性小鼠购自Charles River实验室(Wilmington，MA)并给予一周以适应新的动物留住设施。适应期后，在包括污染有雄性草垫的笼中将雌性小鼠分为每组3只的3组居住，以介导和同步雌性的动情周期。在第三天，在每日光循环结束时，将雌性与9只CD-1雄性年龄配对。每日早晨检查雌性的射精栓。纪录下发现栓的那天作为妊娠的第一天或作为胚胎的第1天(E1)。一旦发现栓，就使雌性与雄性分开并放回其居住的笼中。在E10和E11，根据在先前苏铁类饲养实验中所用的1g苏铁类种子中所发现的平均量，用含有两种经鉴别的苏铁类甾基糖苷(0.6mg BSSG和0.4mg豆甾醇葡糖苷(SG)的组合的小鼠食物丸粒喂5只妊娠雌性，而其余动物接受标准小鼠食物丸粒(Khabazian等，2002；Wilson等，2002)。选择E10和E11日，将目标对准在发育的神经系统中的黑质-纹状体通道的分化(Bayer等，1995；Rice和Barone，2000)。每日监测妊娠雌性的任何异常行为。分娩典型地出现在E19和E20之间，每胎的幼仔数在8-15只幼仔范围，平均为每胎约10只幼仔。对照母鼠每胎平均11.6只幼仔，而喂BSSG和SG的母鼠每胎平均9.5只幼仔。尽管对照母鼠的平均每胎数量略大，但在每胎数量或出生幼仔的性别方面，对照母鼠或BSSG和SG饲养母鼠之间没有显著的差别。幼仔的死亡率是11％，因为一只对照母鼠失去其一胎8只中的6只幼仔。两只BSSG和SG喂养的母鼠也分别自每胎8只和12只中各失去一只幼仔。在出生24hr内对全部存活幼仔称重，然后，每周进行。在第22天，使小鼠断奶，打耳孔以便识别，然后根据性别按12:12-小时光-暗循环分组居住，并随意供水和食物。仅同胞幼仔住在相同笼子中。5周龄时开始用本文所述的不同行为试验方法进行出生后行为分析。在出生后的8周开始至18周期间的各个周龄，测试小鼠的探索活力。经5分钟间隔时间进行测试：将动物置于测试场地的中央，并测量几个探索活力参数。与对照动物相比，处理过的动物在全部运动的持续时间[(Student’s t检验：*p＜0.05，**p＜0.05(图27)；和(Student’s t检验：*p＜0.05)(图28)]；跨越栅格进入场地中央的次数[(Student’s t检验：*p＜0.05，**p＜0.005，***p＜0.0005)(图29)；和(Student’s t检验：*p＜0.05，**p＜0.005)(图30)]；至场地边界的平均距离(表明处理过的小鼠表现出更喜欢场地的边缘而不是中央)[(Student’s t检验：***p＜0.0005)(图31)；和(Student’s t检验：*p＜0.05)(图32)]；和在场地中央所度过的持续时间[(Student’s t检验：**p＜0.005)(图33)和(Student’s t检验：*p＜0.05)(图34)]方面表现出显著的减少。与对照动物相比，处理过的动物还在平均转动角度[(Student’s t检验：*p＜0.05，**p＜0.005，***p＜0.0005)(图35)；和(Student’s t检验：*p＜0.05，*p＜0.005)(图36)]；和首次跨越进入场地中央的持续时间[(Student’s t检验：*p＜0.05)(图37)和(Student’s t检验：*p＜0.05)(图38)]方面表现出显著的增加。此外，与雄性对照动物相比，处理过的雄性动物在速度(Student’s t检验：*p＜0.05)(图39)方面表现出显著的下降；和在角速度方面(Student’s t检验：*p＜0.05，**p＜0.005)(图40)；和迂回程度(Student’s t检验：*p＜0.05，**p＜0.005)(图41)方面表现出显著的增加。
在邻近动物所住笼舍的室内进行行为试验。动物住在温度控制室中的无病毒屏障设施中。
表1
Figure BPA00001392911600551
Figure BPA00001392911600561
Figure BPA00001392911600581
Figure BPA00001392911600591
*p＜0.05；**p＜0.01；***p＜0.00
不显著＝ns；Lsc＝腰脊髓；Tsc＝胸脊髓；腹侧角＝VH；背神经根＝DR：-＝不存在；+＝存在
实施例16
甾醇葡糖苷的合成
Figure BPA00001392911600592
a.)新戊酰氯，1∶1吡啶，CH2Cl2；b.)i.HBr-HOAc，CH2Cl2，0℃；ii.Ag2CO3，丙酮，H2O；c.)三氯乙腈，DBU，CH2Cl2，-30℃；d.)豆甾醇或b-谷甾醇，BF3·Et2O，CH2Cl2，-30℃；e.)NaOMe/MeOH
β-D-葡萄糖五新戊酸酯(2)。如流程1中所示合成化合物2，得到78％得率。Mp：153-156℃。1H NMR(CDCl3，400MHz)：
Figure BPA00001392911600593
5.70(d，J＝8.3Hz，1H)，5.38(t，J＝9.2Hz，1H)，5.22(t，J＝9.2Hz，1H)，5.17(t，J＝9.6Hz，1H)，4.18-4.07(m，2H)，3.90-3.83(m，1H)，1.23(s，9H)，1.18(s，9H)，1.16(s，9H)，1.12(s，18H).
2，3，4，6-四-O-新戊酰-D-吡喃葡萄糖(3)。如流程1中所示合成化合物3。以99％得率分离白色泡沫物。无需进一步纯化，将粗化合物用于下一反应。
2，3，4，6-四-O-新戊酰-α-D-吡喃葡糖基(glycopyranosyl)三氯亚氨逐乙酸酯(trichloroacetimidate)(4)。如流程1中所示合成化合物4。以86％得率分离纯白色粉末。谱值与先前所报道的那些相符；mp：133℃(分解)；1H NMR(CDCl3，400MHz)：δ8.68(s，1H)，6.58(d，J＝3.5Hz，1H)，5.66(t，J＝10.0Hz，1H)，5.23(t，J＝10.0Hz，1H)，5.16(dd，J＝10.0，3.9Hz，1H)，4.28-4.05(m，3H)，1.20(s，9H)，1.18(s，9H)，1.14(s，18H).
豆甾醇2，3，4，6-四-O-新戊酰-β-D-吡喃葡糖苷(5a)。室温下，搅拌在550mL二氯甲烷中的12.45g豆甾醇(30.16mmol)、21.93g三氯亚氨逐乙酸酯4(33.18mmol)和12.75g
Figure BPA00001392911600601
分子筛悬液0.5h。0.5h后，经注射器逐滴加入2.62mL三氟化硼乙醚络合物(diethyl etherate)(20.83mmol)。室温下搅拌反应混合物2h。加入第二份三氯亚氨逐乙酸酯4(1.01g，1.53mmol)，室温下搅拌反应混合物另外2h。过滤粉红色溶液，用二氯甲烷洗涤分子筛几次。用碳酸氢钠饱和溶液洗涤溶液一次，然后用盐水洗涤。有机溶液经硫酸钠干燥，过滤并真空浓缩，得到think、浅白色固体。使该固体从乙醇中再结晶，得到22.43g(73％)白色固体。1HNMR(CDCl3，400MHz)：δ5.34-5.30(m，2H)，5.19-5.13(m，1H)，5.09-4.97(m，3H)，4.21(dd，J＝12.2，1.7Hz，1H)，4.04(q，J＝6.5Hz，1H)，3.74(qd，J＝6.5，1.7Hz，1H)，3.51-3.43(m，1H)，2.23-0.70(m，80H).
豆甾醇β-D-吡喃葡糖苷(6a)。经套管向850mL无水甲醇中的23.38g豆甾醇2，3，4，6-四-O-新戊酰-β-D-吡喃葡糖苷(5)(25.66mmol)悬液中加入2.07g金属钠的50mL无水甲醇溶液(89.81mmol)。将该反应混合物加热至回流24h。冷却混合物至室温，过滤白色固体。用Amberlite中和滤液，蒸发溶剂，得到另一份白色固体。将固体合并并悬浮于400mL水中。加热混合物至回流0.5h。冷却至室温后，该固体经过滤和干燥。使所生成的化合物溶解于300mL吡啶。然后用600mL水沉淀出产物。过滤白色沉淀，在真空干燥前，用水、甲醇和丙酮洗涤一次，得到呈白色粉末的13.36g(91％得率)标题化合物。1H NMR(DMSO，600MHz)：5.33-5.32(m，1H)，5.18-5.12(m，1H)，5.04-5.00(m，1H)，4.89(d，J＝4.8Hz，1H)，4.87(dd，J＝4.8，1.7Hz，2H)，4.43(t，J＝5.7 1H)，4.21(d，J＝7.9Hz，1H)，3.64(qd，J＝5.7，1.8Hz，1H)，3.49-3.43(m，1H)，3.40(quint.，J＝5.9Hz，1H)，3.13-3.19(m，1H)，3.08-3.05(m，1H)，3.03-2.99(m，1H)，2.91-2.87(m，1H)，2.39-2.34(m，1H)，2.12(t，J＝12.1Hz，1H)，2.06-1.99(m 1H)，1.95-1.90(m，2H)，1.82-1.78(m，2H)，1.67-1.61(m，1H)，1.53-1.36(m，9H)，1.26-1.10(m，4H)，1.07-0.67(m，18H).13C NMR(DMSO，150MHz)：δ141.3，138.1，128.8，121.2，100.8，76.9，76.8，73.5，70.1，61.1，56.3，55.3，50.6，49.6，41.9，40.0，39.9，39.1，38.3，36.8，36.2，31.4，31.3，31.2，29.3，28.5，24.9，23.9，21.1，20.9，20.6，19.11，18.9，12.2，11.9.MS(ESI)：597(M+Na+).
Figure BPA00001392911600611
a.)TsCl，吡啶，DMAP；b.)MeOH，吡啶，回流；c.)H2，5％Pd/C，EtOH；d.)TsOH，aq.二氧杂环己烷，80℃.
豆甾醇甲苯磺酸酯(8).室温下，搅拌28.29g豆甾醇(68.55mmol)、27.44g甲苯磺酰氯(143.95mmol)和0.838g 4-(二甲基氨基)吡啶(6.85mmol)的350mL经蒸馏的吡啶溶液24小时。然后将反应混合物倾入含有1.2L 10％碳酸氢钠溶液的2L Erlenmeyer烧瓶中。过滤固体，经水洗涤。使产物溶解于热丙酮并过滤除去不溶解的白色固体。蒸发丙酮至最小体积，再结晶产物，得到呈透明针状物的34.77g(89％)标题化合物。1H NMR(CDCl3，400MHz)：δ7.80(d，J＝8.3Hz，2H)7.33(d，J＝7.8Hz，2H)，5.31-5.30(m，1H)5.18-5.12(m，1H)，5.05-4.99(m，1H)，4.37-4.29(m，1H)，2.45(s，3H)，2.42-0.68(m，43H)(McCarthy，等，Org.Biomol.Chem.2005，3，3059-3065)。
豆甾醇甲醚(9)。经注射器，向2.901g豆甾醇甲苯磺酸酯(8)(5.12mmol)的40mL无水甲醇溶液加入1.24mL吡啶(15.35mmol)。加热白色悬液至回流6h。冷却反应混合物至室温，真空除去溶剂，得到白色固体。将残余物萃取至乙酸乙酯中，并用水洗涤两次，用氯化铵的饱和溶液洗涤一次。用乙酸乙酯萃取经合并的含水部分。合并的有机物经硫酸钠干燥，过滤和真空浓缩，得到透明的起泡固体。粗产物经硅胶(20∶1己烷∶乙酸乙酯)纯化，得到1.94g(89％)透明粘性油，它含有化合物9∶10的5∶1的混合物。无需进一步纯化，将粗反应混合物用于下一反应。
β-谷甾醇(12)。向10.93g化合物9和10的混合物(25.61mmol)的50mL经蒸馏的乙醇溶液加入2.73g 5％披钯碳。以50psi压力向Parr振荡器中充满氢气并振动20h。经1H NMR证实反应完成。反应混合物经Celite过滤并浓缩，得到油性固体。在加入0.487g对甲苯磺酸(tosic acid)(2.56mmol)前，使该固体溶解于150mL二氧杂环己烷和25mL水中。加热溶液至80℃5h。冷却溶液至室温，真空除去溶剂，得到白色残余物。将残余物溶于氯仿，分别用水和盐水洗涤各两次。有机层经硫酸钠干燥，过滤并浓缩，得到白色/黄色固体。粗化合物经硅胶(5∶1→1∶1己烷∶乙酸乙酯)纯化，得到5.23g(33％经过4个步骤)呈白色固体的标题化合物。1H NMR(CDCl3，400MHz)：δ5.36-5.34(m，1H)，3.56-3.48(m，1H)，2.32-0.68(m，48H).
β-谷甾醇2，3，4，6-四-O-新戊酰-β-D-吡喃葡糖苷(5b)。如流程1所示进行5b的合成，得到15.05g(74％)呈白色粉末的标题化合物；mp：185-188℃.1H NMR(CDCl3，400MHz)：5.34-5.30(m，1H)，5.07(t，J＝9.6Hz，1H)，5.00(t，J＝9.6Hz，1H)，4.63(d，J＝7.9Hz，1H)，4.21(dd，J＝11.6，1.2Hz，1H)，4.05-4.01(m，1H)，3.75-3.71(m，1H)，3.51-3.43(m，1H)，2.21-0.68(m，84H).
β-谷甾醇β-D-吡喃葡糖苷(6b)。如流程1所示进行6b的合成，得到9.13g(96％)呈白色粉末的标题化合物；mp：203℃(decomp.)；1HNMR(DMSO，400MHz)：δ5.33-5.31(m，1H)，4.87-4.82(m，3H)，4.40(t，J＝5.7Hz，1H)，4.21(d，J＝7.8Hz，1H)，3.63(dd，J＝5.7，1.3Hz，1H)，3.49-3.38(m，2H)，3.18-2.99(m，4H)，2.92-2.87(m，1H)，2.36(dd，J＝13.1，3.1Hz，1H)，2.15-0.65(m，42H).13C NMR(DMSO，100MHz)：δ207.9，141.9，122.7，102.3，78.4，78.2，74.9，71.6，62.6，57.6，56.9，51.1，46.6，43.3，39.8，38.3，37.7，36.9，34.8，32.9，32.8，32.1，30.7，30.2，29.2，26.9，25.3，24.1，22.1，21.2，20.6，20.4，20.1，13.2，13.1.MS(ESI)：599(M+Na+).
实施例17
甾醇葡糖苷的合成
胆固醇-β-D-葡糖苷的合成。根据Kunz和Harreus的方法完成葡糖苷合成[21]；在氩气下，在30ml无水乙醚中，搅拌1.45g(2.5mmol)四-O-新戊酰-α-D-吡喃葡萄糖基溴化物、1.35g(3.5mmol)胆固醇、0.83g(3mmol)碳酸银、0.05g三氟甲烷-磺酸银和5g分子筛24h。过滤反应混合物，蒸发滤液至干，残余物经用石油醚/乙酸乙酯(10∶1)作为流动相的硅胶快速层析法纯化。使纯化的胆固醇-四-O-新戊酰-β-D-葡糖苷悬浮于50ml甲醇中，加入10ml甲醇钠(0.1mol/l)。回流24h后，冷却溶液，并用100ml甲醇稀释。滤出沉淀的产物，用水煮沸，再次过滤，在减压下干燥。使粗晶体溶解于热吡啶，并通过向热溶液加水沉淀。在约4℃下放置悬液过夜后，滤出产物。用水和丙酮洗涤无色晶体，经氢氧化钾真空干燥，得到纯胆固醇β-D-葡糖苷。相应地，处理二氢胆固醇和豆甾醇，得到二氢胆固醇-β-D-葡糖苷和豆甾醇-β-D-葡糖苷。用NMR(1H和13C)和高分辨质谱法(HRMS)进行标准物质的特征鉴定。也采用与ELSD和UV检测组合的HPLC证实纯度。
胆固醇-β-D-葡糖苷：得率：1.9g(85％)，纯度＞99％(HPLC)，MP262-263℃.13C NMR(100MHz，吡啶-d5)：δ＝12.16，19.11，19.60，21.47，22.85，23.10，24.31，24.66，28.41，28.67，30.45，32.24，32.36，36.20，36.66，37.11，37.67，39.53，39.90，40.15，42.66，50.55，56.54，57.01，63.05，71.91，75.53，78.29，78.67，78.80，102.78，122.10，141.10.HRMS计算值C33H56O6(M+)：548.4077，实测值548.4093.
二氢胆固醇-β-D-葡糖苷：得率：1.0g(70％)，纯度＞99％(HPLC)，MP 256-258℃.13C NMR(100MHz，吡啶-d5)：δ＝12.42，12.49，19.07，21.63，22.85，23.10，24.31，24.61，28.41，28.69，29.22，30.20，32.45，35.03，35.78，35.91，36.20，36.64，37.41，39.90，40.41，42.95，44.80，54.66，56.69，56.74，63.15，72.01，75.56，77.36，78.73，78.85，102.32.HRMS计算值C33H58O6(M+)：550.4233，实测值550.4218.
豆甾醇-β-n-葡糖苷：得率：1.1g(73％)，纯度＞96％(HPLC)，MP297-298℃.13C NMR(100MHz，吡啶-d5)：δ＝12.17，12.54，19.21.19.44，21.29，21.31，21.50，24.57，25.72，29.33，30.29，32.09，32.19，36.97，37.51，39.38，39.86，40.80，42.39，50.39，51.45，56.11，56.96，62.89，71.75，75.38，78.12，78.51，78.65，102.61，121.93，129.50，138.85，140.95.HRMS计算值C35H58O6(M+)：574.4233，实测值574.4251.
尽管上面已经描述和/或举例说明了本发明的某些实施方案，仍预期它们可能有相当多的变化和修饰。因此，本发明不限于本文所述和/或举例说明的具体实施方案。

Claims (127)

1.一种神经变性疾病的动物模型，其包括使非人动物接触下式的神经毒性化合物
Figure FPA00001392911500011
其中
R1为任选被取代的糖基；
R2是氢、烷基、链烯基、炔基、杂烷基、卤代烷基或OR4；
R3是氢、烷基、链烯基、杂烷基、卤代烷基或OR4；
R4在各种情况下独立地选自氢、烷基、杂烷基、卤代烷基、链烯基、炔基和酰基；
标有a、a′、b、c、d、e、f和g的键各自独立地选自单键和双键，前提是对于标有b、c和d的各键，相邻的键不能两者同时为双健；和其中的神经毒性化合物并非选自β-谷甾醇-β-D-葡糖苷和胆固醇葡糖苷的化合物。
2.一种神经变性疾病的动物模型，其包括使非人动物接触下式的神经毒性化合物
和下式的调节神经毒性化合物
Figure FPA00001392911500021
其中
R1为任选被取代的糖基；
R2是氢、烷基、链烯基、炔基、杂烷基、卤代烷基或OR4；
R3是氢、烷基、链烯基、杂烷基、卤代烷基或OR4；
R4在各种情况下独立地选自氢、烷基、杂烷基、卤代烷基、链烯基、炔基和酰基；
标有a、a′、b、c、d、e、f和g的键各自独立地选自单键和双键，前提是对于标有b、c和d的各键，相邻的键不能两者同时为双健；
R10和R11各自独立地选自烷基和链烯基，它们各自任选被取代；
X是选自卤素、烷基和烷氧基的0-3个取代基；和其中的神经毒性化合物并非选自β-谷甾醇-β-D-葡糖苷和胆固醇葡糖苷的化合物。
3.权利要求1-2的任一项的模型，其中R1选自己糖基和戊糖基，它们各自任选被取代。
4.权利要求1-2的任一项的模型，其中R2为甲基或乙基和R3是氢。
5.权利要求1-2的任一项的模型，其中标有b的键是双键。
6.权利要求1-2的任一项的模型，其中标有g的键是双键。
7.权利要求1-2的任一项的模型，其中R1具有下式
Figure FPA00001392911500022
其中
R5在各种情况下独立地选自氢、甲基和C(O)R6，其中R6为烷基、卤代烷基或杂烷基。
8.权利要求1-2的任一项的模型，其中标有a、a’、c、d、e和f的各键为单键。
9.权利要求1-2的任一项的模型，其中R1通过具有β构型的端基异构健连接于所述化合物的其余部分。
10.权利要求1-2的任一项的模型，其中R1是β-D-葡糖基。
11.权利要求1-2的任一项的模型，其中的神经毒性化合物选自菜油甾醇葡糖苷、二氢菜子甾醇葡糖苷、豆甾醇葡糖苷、麦角甾醇葡糖苷和燕麦甾醇葡糖苷。
12.权利要求1-2的任一项的模型，其中的神经毒性化合物是豆甾醇葡糖苷。
13.权利要求1-2的任一项的模型，其中的神经毒性化合物是二氢菜子甾醇葡糖苷。
14.权利要求1-2的任一项的模型，其中的神经毒性化合物是菜油甾醇葡糖苷。
15.一种神经变性疾病的动物模型，其包括使非人动物接触下式的神经毒性化合物
其中
R7和R8各自独立地选自饱和脂肪酸酰基、单不饱和脂肪酸酰基和多不饱和脂肪酸酰基，它们各自任选被卤素、甲基、烷基、羟基、酮基、甲氧基或烷氧基取代；和
R9为糖基。
16.一种神经变性疾病的动物模型，其包括使非人动物接触下式的神经毒性化合物
下式的调节神经毒性化合物
Figure FPA00001392911500041
其中
R7和R8各自独立地选自饱和脂肪酸酰基、单不饱和脂肪酸酰基和多不饱和脂肪酸酰基，它们各自任选被卤素、甲基、烷基、羟基、酮基、甲氧基或烷氧基取代；R9为糖基；
R10和R11各自独立地选自烷基和链烯基，它们各自任选被取代；和
X是选自卤素、烷基和烷氧基的0-3个取代基。
17.权利要求15-16的任一项的模型，其中R9为单糖、二糖或三糖。
18.权利要求15-16的任一项的模型，其中R9为单糖。
19.权利要求15-16的任一项的模型，其中R9为二糖。
20.权利要求15-16的任一项的模型，其中R7或R8之一为任选被取代的单不饱和脂肪酸酰基，和R7或R8中的另一个为任选被取代的多不饱和脂肪酸酰基。
21.权利要求15-16的任一项的模型，其中的调节神经毒性化合物是生育酚或生育三烯酚。
22.权利要求15-16的任一项的模型，其中的调节神经毒性化合物是β-生育酚。
23.权利要求15-16的任一项的模型，其中的神经毒性化合物或调节神经毒性化合物是合成的。
24.权利要求15-16的任一项的模型，其中的神经毒性化合物或调节神经毒性化合物被纯化。
25.权利要求15-16的任一项的模型，其中的非人动物是啮齿动物。
26.权利要求15-16的任一项的模型，其中的非人动物是大鼠。
27.权利要求15-16的任一项的模型，其中的非人动物是小鼠。
28.权利要求15-16的任一项的模型，其中的非人动物是灵长目动物。
29.权利要求15-16的任一项的模型，其中的神经变性疾病选自神经病，周围神经病、皮克病、肌萎缩性侧索硬化、早发性帕金森氏病、迟发性帕金森氏病和阿尔茨海默氏病。
30.权利要求15-16的任一项的模型，其中的神经变性疾病选自肌萎缩性侧索硬化、早发性帕金森氏病、迟发性帕金森氏病和阿尔茨海默氏病。
31.一种监测非人动物的神经变性疾病的方法，该方法包括给予非人动物含有下式的神经毒性化合物的组合物和监测非人动物的神经变性疾病的步骤
Figure FPA00001392911500051
其中
R1为任选被取代的糖基；
R2是氢、烷基、链烯基、炔基、杂烷基、卤代烷基或OR4；
R3是氢、烷基、链烯基、杂烷基、卤代烷基或OR4；
R4在各种情况下独立地选自氢、烷基、杂烷基、卤代烷基、链烯基、炔基和酰基；
标有a、a′、b、c、d、e、f和g的键各自独立地选自单键和双键，前提是对于标有b、c和d的各键，相邻的键不能两者同时为双健；和其中的化合物并非选自β-谷甾醇-β-D-葡糖苷和胆固醇葡糖苷的化合物。
32.权利要求31的方法，其中R1选自己糖基和戊糖基，它们各自任选被取代。
33.权利要求31-32的任一项的方法，其中R2为甲基或乙基和R3是氢。
34.权利要求31-32的任一项的方法，其中标有b的键是双键。
35.权利要求31-32的任一项的方法，其中标有g的键是双键。
36.权利要求31-32的任一项的方法，其中R1具有下式
Figure FPA00001392911500061
其中
R5在各种情况下独立地选自氢、甲基和C(O)R6，其中R6为烷基、卤代烷基或杂烷基。
37.权利要求31-32的任一项的方法，其中标有a、a’、c、d、e和f的各键为单键。
38.权利要求31-32的任一项的方法，其中R1通过具有β构型的端基异构健连接于所述化合物的其余部分。
39.权利要求31-32的任一项的方法，其中R1是β-D-葡糖基。
40.权利要求31-32的任一项的方法，其中的神经毒性化合物选自菜油甾醇葡糖苷、二氢菜子甾醇葡糖苷、豆甾醇葡糖苷、麦角甾醇葡糖苷和燕麦甾醇葡糖苷。
41.权利要求31-32的任一项的方法，其中的神经毒性化合物是豆甾醇葡糖苷。
42.权利要求31-32的任一项的方法，其中的神经毒性化合物是二氢菜子甾醇葡糖苷。
43.权利要求31-32的任一项的方法，其中的神经毒性化合物是菜油甾醇葡糖苷。
44.一种监测非人动物的神经变性疾病的方法，该方法包括给予非人动物含有下式的神经毒性化合物的组合物和监测非人动物的神经变性疾病的步骤
Figure FPA00001392911500071
其中
R7和R8各自独立地选自饱和脂肪酸酰基、单不饱和脂肪酸酰基和多不饱和脂肪酸酰基，它们各自任选被卤素、甲基、烷基、羟基、酮基、甲氧基或烷氧基取代；R9是糖基。
45.权利要求44的方法，其中R9是单糖、二糖或三糖。
46.权利要求44的方法，其中R9为单糖。
47.权利要求44的方法，其中R9为二糖。
48.权利要求44-47的任一项的方法，其中R7或R8之一为任选被取代的单不饱和脂肪酸酰基，和R7或R8中的另一个为任选被取代的多不饱和脂肪酸酰基。
49.权利要求44的方法，其中的组合物还包含下式的调节神经毒性的化合物
Figure FPA00001392911500072
其中
R10和R11各自独立地选自烷基和链烯基，它们各自任选被取代；和X是选自卤素、烷基和烷氧基的0-3个取代基。
50.权利要求49的方法，其中的调节神经毒性化合物为生育酚或生育三烯酚。
51.权利要求50的方法，其中的调节神经毒性化合物为β-生育酚。
52.权利要求49的方法，其中的神经毒性化合物或调节神经毒性化合物是合成的。
53.权利要求49的方法，其中的神经毒性化合物或调节神经毒性化合物被纯化。
54.权利要求31-32、44-47或49-53的任一项的方法，其中的非人动物是啮齿动物。
55.权利要求54的方法，其中的非人动物是大鼠。
56.权利要求54的方法，其中的非人动物是小鼠。
57.权利要求31-32、44-47或49-53的任一项的方法，其中的非人动物是灵长目动物。
58.权利要求31-32、44-47或49-53的任一项的方法，其中的给予非人动物含有神经毒性化合物的组合物的步骤包括，通过向饮食中加入含有神经毒性化合物的组合物改变非人动物的日常饮食并将该饮食喂养给非人动物的步骤。
59.权利要求31-32、44-47或49-53的任一项的方法，其中给予非人动物含有神经毒性化合物的组合物的步骤包括通过强饲法喂给予非人动物含有神经毒性化合物的组合物的步骤。
60.权利要求54的方法，其中神经变性疾病通过选自腿伸展试验、步幅长度试验、旋转棒试验、金属丝悬挂试验、水迷宫试验、八臂迷宫试验、Digigate系统试验、运动轨迹自动视频跟踪试验、焦虑试验、抑郁试验和嗅觉系统试验的试验进行监测。
61.权利要求31-32、44-47或49-53的任一项的方法，其中的神经变性疾病选自神经病、周围神经病、皮克病、肌萎缩性侧索硬化、早发性帕金森氏病、迟发性帕金森氏病和阿尔茨海默氏病。
62.权利要求31-32、44-47或49-53的任一项的方法，其中的神经变性疾病选自肌萎缩性侧索硬化、早发性帕金森氏病、迟发性帕金森氏病和阿尔茨海默氏病。
63.一种用于神经变性疾病模型的神经毒性组合物，其包含下式化合物及其药学上可接受的载体
Figure FPA00001392911500091
其中
R1为任选被取代的糖基；
R2是氢、烷基、链烯基、炔基、杂烷基、卤代烷基或OR4；
R3是氢、烷基、链烯基、杂烷基、卤代烷基或OR4；
R4在各种情况下独立地选自氢、烷基、杂烷基、卤代烷基、链烯基、炔基和酰基；
标有a、a′、b、c、d、e、f和g的键各自独立地选自单键和双键，前提是对于标有b、c和d的各键，相邻的键不能两者同时为双健；和其中的化合物并非选自β-谷甾醇-β-D-葡糖苷和胆固醇葡糖苷的化合物。
64.权利要求63的神经毒性组合物，其中R1选自己糖基和戊糖基，它们各自任选被取代。
65.权利要求63-64的任一项的神经毒性组合物，其中R2为甲基或乙基和R3是氢。
66.权利要求63-64的任一项的神经毒性组合物，其中标有b的键是双键。
67.权利要求63-64的任一项的神经毒性组合物，其中标有g的键是双键。
68.权利要求63-64的任一项的神经毒性组合物，其中R1具有下式
Figure FPA00001392911500101
其中
R5在各种情况下独立地选自氢、甲基和C(O)R6，其中R6为烷基、卤代烷基或杂烷基。
69.权利要求63-64的任一项的神经毒性组合物，其中标有a、a’、c、d、e和f的键为单键。
70.权利要求63-64的任一项的神经毒性组合物，其中R1通过具有β构型的端基异构健连接于所述化合物的其余部分。
71.权利要求63-64的任一项的神经毒性组合物，其中R1是β-D-葡糖基。
72.权利要求63-64的任一项的神经毒性组合物，其中的神经毒性化合物选自菜油甾醇葡糖苷、二氢菜子甾醇葡糖苷、豆甾醇葡糖苷、麦角甾醇葡糖苷和燕麦甾醇葡糖苷。
73.权利要求63-64的任一项的神经毒性组合物，其中的神经毒性化合物是豆甾醇葡糖苷。
74.权利要求63-64的任一项的神经毒性组合物，其中的神经毒性化合物是二氢菜子甾醇葡糖苷。
75.权利要求63-64的任一项的神经毒性组合物，其中的神经毒性化合物是菜油甾醇葡糖苷。
76.一种用于神经变性疾病模型的神经毒性组合物，其包含下式化合物及其药学上可接受的载体
其中
R7和R8各自独立地选自饱和脂肪酸酰基、单不饱和脂肪酸酰基和多不饱和脂肪酸酰基，它们各自任选被卤素、甲基、烷基、羟基、酮基、甲氧基或烷氧基取代；R9是糖基。
77.权利要求76的神经毒性组合物，其中R9为单糖、二糖或三糖。
78.权利要求76的神经毒性组合物，其中R9为单糖。
79.权利要求76的神经毒性组合物，其中R9为二糖。
80.权利要求76-79的任一项的神经毒性组合物，其中R7或R8之一为任选被取代的单不饱和脂肪酸酰基和R7或R8中的另一个为任选被取代的多不饱和脂肪酸酰基。
81.权利要求76-79的任一项的神经毒性组合物，其还包含下式的调节神经毒性化合物
Figure FPA00001392911500111
其中
R10和R11各自独立地选自烷基和链烯基，它们各自任选被取代；和X是选自卤素、烷基和烷氧基的0-3个取代基。
82.权利要求81的神经毒性组合物，其中的调节神经毒性化合物是生育酚或生育三烯酚。
83.权利要求82的神经毒性组合物，其中的调节神经毒性化合物是β-生育酚。
84.权利要求81的神经毒性组合物，其中的神经毒性化合物或调节神经毒性化合物是合成的。
85.权利要求81的神经毒性组合物，其中的神经毒性化合物或调节神经毒性化合物被纯化。
86.权利要求1-2的任一项的动物模型，其中的非人动物是胎儿动物。
87.一种神经变性疾病的动物模型，其包括使非人动物接触下式的神经毒性化合物
Figure FPA00001392911500121
其中
R1为任选被取代的糖基；
R2是氢、烷基、链烯基、炔基、杂烷基、卤代烷基或OR4；
R3是氢、烷基、链烯基、杂烷基、卤代烷基或OR4；
R4在各种情况下独立地选自氢、烷基、杂烷基、卤代烷基、链烯基、炔基和酰基；
标有a、a’、b、c、d、e、f和g的键各自独立地选自单键和双键，前提是对于标有b、c和d的各键，相邻的键不能两者同时为双健；和其中的非人动物是胎儿动物。
88.权利要求62的方法，其中的非人动物是胎儿动物。
89.一种监测非人动物的神经变性疾病的方法，该方法包括给予非人动物含有下式的神经毒性化合物的组合物和监测非人动物的神经变性疾病的步骤
Figure FPA00001392911500122
其中
R1为任选被取代的糖基；
R2是氢、烷基、链烯基、炔基、杂烷基、卤代烷基或OR4；
R3是氢、烷基、链烯基、杂烷基、卤代烷基或OR4；
R4在各种情况下独立地选自氢、烷基、杂烷基、卤代烷基、链烯基、炔基和酰基；
标有a、a’、b、c、d、e、f和g的键各自独立地选自单键和双键，前提是对于标有b、c和d的各键，相邻的键不能两者同时为双健；其中的非人动物是胎儿动物。
90.一种用于神经变性疾病的胎儿暴露模型的神经毒性组合物，其包含下式化合物及其药学上可接受的载体
Figure FPA00001392911500131
其中
R1为任选被取代的糖基；
R2是氢、烷基、链烯基、炔基、杂烷基、卤代烷基或OR4；
R3是氢、烷基、链烯基、杂烷基、卤代烷基或OR4；
R4在各种情况下独立地选自氢、烷基、杂烷基、卤代烷基、链烯基、炔基和酰基；
标有a、a’、b、c、d、e、f和g的键各自独立地选自单键和双键，前提是对于标有b、c和d的各键，相邻的键不能两者同时为双健；其中的非人动物是胎儿动物。
91.权利要求90的神经毒性组合物，其中R1选自己糖基和戊糖基，它们各自任选被取代。
92.权利要求90-91的任一项的神经毒性组合物，其中R2为甲基或乙基和R3是氢。
93.权利要求90-91的任一项的神经毒性组合物，其中标有b的键是双键。
94.权利要求90-91的任一项的神经毒性组合物，其中标有g的键是双键。
95.权利要求90-91的任一项的神经毒性组合物，其中R1具有下式
Figure FPA00001392911500141
其中
R5在各种情况下独立地选自氢、甲基和C(O)R6，其中R6为烷基、卤代烷基或杂烷基。
96.权利要求90-91的任一项的神经毒性组合物，其中标有a、a’、c、d、e和f的键为单键。
97.权利要求90-91的任一项的神经毒性组合物，其中R1通过具有β构型的端基异构健连接于所述化合物的其余部分。
98.权利要求90-91的任一项的神经毒性组合物，其中R1是β-D-葡糖基。
99.权利要求90-91的任一项的神经毒性组合物，其中的神经毒性化合物选自菜油甾醇葡糖苷、二氢菜子甾醇葡糖苷、豆甾醇葡糖苷、麦角甾醇葡糖苷和燕麦甾醇葡糖苷。
100.权利要求90-91的任一项的神经毒性组合物，其中的神经毒性化合物是豆甾醇葡糖苷。
101.权利要求90-91的任一项的神经毒性组合物，其中的神经毒性化合物是二氢菜子甾醇葡糖苷。
102.权利要求90-91的任一项的神经毒性组合物，其中的神经毒性化合物是菜油甾醇葡糖苷。
103.一种用于神经变性疾病模型的神经毒性组合物，其包含下式化合物及其药学上可接受的载体
其中
R7和R8各自独立地选自饱和脂肪酸酰基、单不饱和脂肪酸酰基和多不饱和脂肪酸酰基，它们各自任选被卤素、甲基、烷基、羟基、酮基、甲氧基或烷氧基取代；R9是糖基。
104.权利要求103的神经毒性组合物，其中R9为单糖、二糖或三糖。
105.权利要求103的神经毒性组合物，其中R9为单糖。
106.权利要求103的神经毒性组合物，其中R9为二糖。
107.权利要求103-106的任一项的神经毒性组合物，其中R7或R8之一为任选被取代的单不饱和脂肪酸酰基和R7或R8中的另一个为任选被取代的多不饱和脂肪酸酰基。
108.权利要求103的神经毒性组合物，其还包含下式的调节神经毒性化合物
Figure FPA00001392911500152
其中
R10和R11各自独立地选自烷基和链烯基，它们各自任选被取代；和X是选自卤素、烷基和烷氧基的0-3个取代基。
109.权利要求108的神经毒性组合物，其中的调节神经毒性化合物是生育酚或生育三烯酚。
110.权利要求109的神经毒性组合物，其中的调节神经毒性化合物是β-生育酚。
111.权利要求108-110的任一项的神经毒性组合物，其中的神经毒性化合物或调节神经毒性化合物是合成的。
112.权利要求108-110的任一项的神经毒性组合物，其中的神经毒性化合物或调节神经毒性化合物被纯化。
113.权利要求31的方法，其中的组合物还包含下式的调节神经毒性化合物
Figure FPA00001392911500161
其中
R10和R11各自独立地选自烷基和链烯基，它们各自任选被取代；和X是选自卤素、烷基和烷氧基的0-3个取代基。
114.权利要求113的方法，其中的调节神经毒性化合物是生育酚或生育三烯酚。
115.权利要求114的方法，其中的调节神经毒性化合物是β-生育酚。
116.权利要求113的方法，其中的神经毒性化合物或调节神经毒性化合物是合成的。
117.权利要求113的方法，其中的神经毒性化合物或调节神经毒性化合物被纯化。
118.权利要求113-117的任一项的方法，其中的非人动物是啮齿动物。
119.权利要求118的方法，其中的非人动物是大鼠。
120.权利要求118的方法，其中的非人动物是小鼠。
121.权利要求113-117的任一项的方法，其中的非人动物是灵长目动物。
122.权利要求113-117的任一项的方法，其中给予非人动物含有神经毒性化合物的组合物的步骤包括，通过向饮食中加入含有神经毒性化合物的组合物改变非人动物的日常饮食并喂给非人动物所述饮食的步骤。
123.权利要求113-117的任一项的方法，其中的给予非人动物含有神经毒性化合物的组合物的步骤，包括通过强饲法喂给予非人动物含有神经毒性化合物的组合物的步骤。
124.权利要求118的方法，其中神经变性疾病通过选自腿伸展试验、步幅长度试验、旋转棒试验、金属丝悬挂试验、水迷宫试验、八臂迷宫试验、Digigate系统试验、运动轨迹自动视频跟踪试验、焦虑试验、抑郁试验和嗅觉系统试验的试验进行监测。
125.权利要求113-117的任一项的方法，其中的神经变性疾病选自神经病、周围神经病、皮克病、肌萎缩性侧索硬化、早发性帕金森氏病、迟发性帕金森氏病和阿尔茨海默氏病。
126.权利要求113-117的任一项的方法，其中的神经变性疾病选自肌萎缩性侧索硬化、早发性帕金森氏病、迟发性帕金森氏病和阿尔茨海默氏病。
127.权利要求31的方法，其还包括给予非人动物含有下式的神经毒性化合物的组合物的步骤
Figure FPA00001392911500171
其中
R7和R8各自独立地选自饱和脂肪酸酰基、单不饱和脂肪酸酰基和多不饱和脂肪酸酰基，它们各自任选被卤素、甲基、烷基、羟基、酮基、甲氧基或烷氧基取代；R9是糖基。
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