CN102272147A - 用于防止细胞粘附的肽和组合物及其使用方法 - Google Patents

Abstract

本发明涉及包含经分离肽的组合物，其可例如任选包含选自由以下组成的群组的序列：FDYDWY、SFSQNKSVHSFDYDWYNVSDQADLKN或CSFSQNKSVHSFDYDWYNVS-DQADLKNC或其任一环化形式；和其使用方法，包括用于处理微生物生物膜或防止其形成和细胞至表面的粘附。

Description

用于防止细胞粘附的肽和组合物及其使用方法

技术领域

本发明涉及经分离肽和其在防止细胞粘附中的用途。

背景技术

微生物可以在环境中自由游动的个别细胞(作为浮游生物)的形式生存并增殖，或其可以包围在与各种表面和界面紧密相连的自生成聚合物基质中的高度组织化多细胞群落形式生长。后一种微生物生活方式称作生物膜。生物膜形成代表一种古老的受保护的生长模式，其使得微生物能在有害环境中存活并且使得微生物能分散并定植于新生态位中[霍尔-斯图德利(Hall-Stoodley)等人，自然微生物学综述(Nat Rev Microbiol.)(2004)2(2)：95-108]。

生物膜的组成复杂，并且不同微生物物种以及甚至在不同环境条件下的相同物种都各不相同。但是，生物膜形成代表微生物在环境中的正常生活方式，并且所有微生物均可产生生物膜。先前研究揭示，细菌生物膜形成的进展经过多个蛋白质谱不同的发展阶段[索尔(Sauer)等人，细菌学杂志(J Bacteriol.)(2002)184(4)：1140-54]，首先附着至表面上，随后移入并分裂以形成微菌落，且最后成熟，其中涉及基质聚合物的表达。各生物膜阶段内的细菌所表现的表型和所具有的特性与那些以浮游方式生长的同类细菌显著不同[索尔等人，细菌学杂志(2004)186(21)：7312-26]。

生物膜是人类全身性感染(例如医院内感染)的主要病因。在体内，生物膜可与各组织(例如内耳、牙齿、牙龈、肺、心脏瓣膜和泌尿生殖道)相关联。估计有65％的人类细菌感染具有生物膜性质。此外，在形成生物膜后，微生物往往改变其特性(有时显著改变)，从而使得通常可在悬浮培养物中杀灭生物的抗生素剂量在相同微生物呈附着或聚集生物膜形式时对所述生物完全无效(美国专利第7189351号)。

关于引入体内的产品(例如接触镜、中心静脉导管、机械心脏瓣膜和起搏器)或提供进入体内的路径的产品的一个重要问题是微生物感染和常发的生物膜形成。由于这些感染用抗生素难以治疗，因此经常需要移除装置，这对患者是创伤性的并且会增加医疗成本。因此，对于所述医疗设备，业内很久以前就开始寻找能使那些医疗设备和装置抗微生物的手段和方法。

PCT申请案第WO 06/006172号揭示抗类淀粉试剂(例如芳香族化合物)用于抑制预存在生物膜形成或使其崩解的用途。此申请案揭示预防阿兹海默氏症(Alzheimers)中形成类淀粉原纤维的化合物可抵抗生物膜中形成原纤维，并且断定具有芳香族臂(aromatic arm)的氨基酸可有效抵抗生物膜。然而，此分析仅限于全长序列。

发明内容

本发明提供从包括哺乳动物和非哺乳动物在内的动物分离的天然或合成肽，其可干扰宽范围微生物中处于初始阶段的生物膜的形成。

本文所述的所有肽都显示专门防止微生物基质粘附和所得生物膜形成的活性。其没有通常观察到的抗生素肽和次级代谢产物显示的致死性杀细菌性活性，从而通过强烈的微生物“生物潜力”为快速天然选择提供强选择性压力。另一方面，对微生物定植的宽范围抑制可拮抗细菌存活的基本机制。因此，所述机制的适应性修饰由于其生命力而具有低可能性。

谢尔(Sher)等人(毒素(Toxicon)45：865-879，2005)使用生物信息学方法鉴别出由水螅表达的推定生物活性蛋白质和多肽，其可为其种间信息素系统(allomonalsystem)的组份。水螅显示表达属于射线状孔蛋白(actinoporin)家族的刺胞动物磷脂酶A2毒素和溶细胞素的直接同源物，并且表达与类毒蛇磷脂酶、富半胱氨酸分泌性蛋白质(CRISP)、类前动力蛋白多肽和毒性脱氧核糖核酸酶类似的蛋白质。

到目前为止还没有鉴别出在从天然来源分离的肽中负责细胞毒性活性的特定序列。

除非另有说明，否则本文所用所有技术和科学术语都具有与本发明所属领域技术人员通常所了解的含义相同的含义。尽管在本发明的实践或测试中可使用与本文所述方法和材料类似或等效者，但下文仍对适宜方法和材料加以阐述。倘若出现矛盾，则以本专利说明书(包括定义)为准。另外，材料、方法和实例仅为阐释性而非限制性。

本文所用术语“包含”和“包括”或其语法变体打算用来指明所述特征、整体、步骤或组份，但不打算排除增加一个或一个以上额外特征、整体、步骤、组份或其群组。此术语涵盖术语“由......组成”和“基本由......组成”。

本文所用片语“基本由......组成”或其语法变体打算指定所述特征、整体、步骤或组份，但不打算排除增加一个或一个以上额外特征、整体、步骤、组份或其群组，但仅在所述额外特征、整体、步骤、组份或其群组不显著改变所主张组合物、装置或方法的基本和新颖特性时才不排除。

术语“方法”是指完成给定任务的方式、手段、技术和程序，包括(但不限于)那些化学、生物和生物物理领域实践者已知的或可自已知方式、手段、技术和程序容易地研发的方式、手段、技术和程序。

本文所用术语“约”是指±10％。

从以下详细说明并且从权利要求书中将明了本发明的其它特征和优点。

附图说明

本文仅以举例方式参照附图来阐述本发明。现详细地参照具体附图，应强调，所展示细节仅作为实例并且仅具有说明性论述本发明优选实施例的目的，并且是为了提供认为最有用的内容和为了使本发明原理和概念方面的描述易于理解而提出。为此，所展示本发明结构细节的详细程度仅为基本理解本发明所必需的，结合附图进行的说明可使所属领域技术人员明了如何在实践中体现本发明的若干种形式。

在图中：

图1是展示通过合成肽grZ-28C[CSFSQNKSVHSFDYDWYNVSDQADLKNC]以三种不同浓度抑制铜绿假单胞菌(Pseudomonas aeruginosa)粘附的条形图；

图2是展示对铜绿假单胞菌进行生长测试的条形图；且

图3是展示基于GPCR 137b的氨基酸序列的肽grZ35 cyc和grZ28C对铜绿假单胞菌的抗粘附活性的条形图；且

图4是展示肽grZ35 cyc和grZ28C对铜绿假单胞菌生长的效应的条形图。

具体实施方式

本发明涉及包含从动物来源分离的肽的组合物，所述肽具有一种或一种以上涉及防止细菌性基质粘附和所得生物膜形成、及任选地还防止细胞-细胞粘附的效应。另外或另一选择为，还可任选地提供其它效应。所述肽至少包含序列FDYDWY。作为非限制性实例，所述肽可任选地且优选地包含选自由以下组成的群组的序列：FDYDWY、SFSQNKSVHSFDYDWYNVSDQADLKN或CSFSQNKSVHSFDYDWYNVSDQADLKNC。

医学中的一个主要问题是微生物生物膜的形成。在人类中，在将产品(例如，接触镜、中心静脉导管、机械心脏瓣膜和起搏器)引入机体内时，生物膜是主要问题。

生物膜也是许多工业中的问题，包括食品工业、制药工业、涂料工业、水工业、海运工业和工程工业，其在宽范围有害作用中尤其导致工业系统腐蚀加速、油酸化和生物污着。例如，生物粘附至海洋或淡水环境中的任一表面可引起生物污着，所述海洋或淡水环境包括冷却或脱盐设施中的冷却塔、给水管和过滤器、灌溉站与发电站和膜，例如在废水和脱盐系统中使用的膜。生物污着也发生于养鱼场的水产养殖系统中。

此外，全世界的商业运输船队每年消耗约3亿吨燃料。如果不采取防污着措施，则此燃料消耗每年将增加多达40％，等于额外消耗1亿2千万吨燃料。其经济成本2000年估计为约75亿美元；最近估计为300亿。

生物膜极难消除，因为在其中生长的微生物高度组织化并且可耐受多种有害环境，例如高温和抗微生物剂(例如抗生素)。

包括软体水栖无脊椎动物、鱼和苔藓在内的海洋与淡水植物和生物周围存在大量微生物物种。因为所述植物和生物无特异性免疫性，因此其产生若干可防止微生物定植于机体表面上的因子。

最“敏感”生物是属于刺胞动物(cnidaria)门的无脊椎动物，其包括海葵、珊瑚、海蜇、水螅类动物、水母和海扇。所述软体生物无诸如鳞片或壳等物理保护，其使用蛋白质和次级代谢产物来保护其自身免受其周围微生物环境的影响。

先前已报导，海洋生物(例如海绵)产生表现抗细菌和抗真菌活性的次级代谢产物[阿马德等人，如前所述]。此外，已显示海葵(例如等指海葵)可产生毒性成孔肽(即马痘毒素)，其以与其它小型抗微生物肽类似的方式溶解或杀灭真核细胞[安德鲁等人，如前所述]。

从这些天然因子分离具有高度保守序列的肽，并且其合成构象在防止微生物粘附方面显示高活性。在若干海洋生物中发现保守序列，所述海洋生物包括各种已知的海葵物种、若干种鱼类(包括斑马鱼)和小立碗藓亚种(Physcomitrella patens subsp)。

基于生物信息学分析，认为所述蛋白质在上层生物(包括智人(Homo sapiens)中已改变为FDYDWY，可在大小范围为128aa至400aa的蛋白质中发现。在智人中，此肽是位于269至274处的G蛋白偶合受体137B的一部分(GENEID：7107GPR137B)。基于UniProtKB/Swiss-Prot登录号060478，始于259处且止于292处的区域是细胞外区域，其支持此肽为所述蛋白质的活性部分的理论。

对古海洋生物玻璃海鞘(Ciona intestinalis)的生物信息学分析鉴别出与G蛋白偶合受体137ba类似的368氨基酸蛋白质[GeneBank登录号XP_002125109]。与抗粘附肽类似的区域是SPLRCSELSSFNFDWYNVSDQADLVN。基于此信息和玻璃海鞘也暴露于多种微生物的事实，本发明者假定肽FNFDWY也是抗粘附剂。代表细胞外区域的非环化肽序列SFSQNKSVHSFDYDWYNVSDQADLKN(残基259-284)是利用C末端和N末端中的两个半胱氨酸来合成。

代表细胞外区域的环化肽序列SFSQNKSVHSFDYDWYNVSDQADLKNQLGDAGYV(残基259-292)是利用C末端和N末端中的两个半胱氨酸来合成，并且经S-S桥接。

根据一些实施例，本发明肽至少包含序列FDYDWY。例如，所述肽可包含以下中的至少一者：FDYDWY、SFDYDWY、SFDYDWYN、HSFDYDWYN、HSFDYDWYNV、VHSFDYDWYNV、VHSFDYDWYNVS、SVHSFDYDWYNVS、SVHSFDYDWYNVSD、KSVHSFDYDWYNVSD、KSVHSFDYDWYNVSDQ、NKSVHSFDYDWYNVSDQ、NKSVHSFDYDWYNVSDQA、QNKSVHSFDYDWYNVSDQA、QNKSVHSFDYDWYNVSDQAD、SQNKSVHSFDYDWYNVSDQAD、SQNKSVHSFDYDWYNVSDQADL、FSQNKSVHSFDYDWYNVSDQADL、FSQNKSVHSFDYDWYNVSDQADLK、SFSQNKSVHSFDYDWYNVSDQADLK、SFSQNKSVHSFDYDWYNVSDQADLKN、CSFSQNKSVHSFDYDWYNVSDQADLKN或CSFSQNKSVHSFDYDWYNVSDQADLKNC或其组合。

根据一些实施例，所述肽经环化。

根据一些实施例，所述肽不经环化。

可从任一动物分离所述肽。优选地，所述动物是脊椎动物，例如，鱼、两栖动物(包括青蛙、蟾蜍、蝾螈或火蜥蜴)、鸟、爬行动物(例如鳄鱼、蜥蜴、蛇、海龟、陆龟或食用龟)或哺乳动物(包括人类)。

所述肽也存在于属于脊索动物(Chordata)门的海洋生物玻璃海鞘中。在此生物中，所述蛋白质显示类似于高等脊椎动物中的GPCR 137b，且由于此生物的周围为微生物，因此包括序列FNFDWY的肽也是本专利的一部分。

本发明肽可任选包含上述序列中的至少两者，其由某种类型的连接体连接，以使得第一肽序列的N-末端与所述连接体的C-末端连接，并且第二肽序列的C-末端与所述连接体的N-末端连接。

本文所用术语“连接体”是指连接两个肽或环化本文所述肽的任一化学键或分子。所述连接体也可任选包含任一适宜数目的单体单元的聚合物。然而，在任一情形下，优选地，连接体的特征为活性基团，且/或经衍生以在至少两个位置中包括此一活性基团，以接合两个或两个以上肽和/或环化本文所述肽。

参照附图和随附说明可更好地理解本发明的原理和操作。

在详细阐释至少一个本发明实施例之前，应理解，本发明的应用并不限于以下说明中所述或实例中所例示的细节。本发明能具有其它实施例或以各种方式来实践或实施。同样，应理解，本文中所用措辞和术语是用于说明目的且不应视为具有限制性。

根据本发明一个方面提供包含从人类来源分离的肽的组合物，所述肽包含选自由以下组成的群组的序列：FDYDWY、SFSQNKSVHSFDYDWYNVSDQADLKN或CSFSQNKSVHSFDYDWYNVSDQADLKNC。

根据本发明其它态样提供防止单细胞生物粘附至表面的方法，所述方法包含使所述细胞与包含从人类来源分离的肽的组合物接触，所述肽包含选自由以下组成的群组的序列：FDYDWY、SFSQNKSVHSFDYDWYNVSDQADLKN或CSFSQNKSVHSFDYDWYNVSDQADLKNC，从而防止细胞至表面的粘附。

根据本发明一些实施例，优选地提供包含上述肽中的至少一者且可有效抵抗细胞粘附至表面的结构域。更优选地，所述结构域作为蛋白质的一部分加以包括。任选地且最优选地，所述结构域表现抗粘附性质，例如，防止生物膜形成和/或处理生物膜，但不表现细胞毒性性质。

本文所用术语“经分离”是指组合物已从体内位置移出。本发明经分离组合物优选地实质上不含其体内位置存在的其它物质(例如不包含抗粘附效应的其它蛋白质)(即纯化或半纯化)。经分离肽可任选地经合成或从天然来源获得，包括任选地通过使用基因工程技术在活体内表达者。

根据本发明一些实施例，本发明组合物无细胞毒性或细胞生长抑制活性，例如其不具有杀细菌性或抑菌性。

根据本发明一些实施例，本发明组合物耐冻干，例如，其在冷冻干燥后仍保持活性。

本文所用片语“单细胞生物”是指单细胞生物，也称作微小生物或微生物。本发明单细胞生物可为真核单细胞生物(例如原生动物或真菌，例如酵母)或原核单细胞生物(例如细菌或古细菌)。本发明单细胞生物可存于任何细胞环境中，例如存于生物膜中，呈分离细胞或细胞悬浮液形式。

本文所用术语“生物膜”是指细胞外基质，其中分散有微生物和/或微生物形成菌落。生物膜通常由多糖和其它大分子构成。

可根据本发明方法来防止粘附的实例性细菌细胞包括革兰氏(gram)阳性细菌和革兰氏阴性细菌。

本文所用术语“革兰氏阳性细菌”是指如下细菌：其特征在于具有肽多糖以及多糖和/或磷壁酸作为其细胞壁结构的一部分，并且特征在于其在革兰氏染色程序中的蓝-紫色反应。代表性革兰氏阳性细菌包括：放线菌属(Actinomyces spp.)、炭疽芽孢杆菌(Bacillus anthracis)、双歧杆菌属(Bifidobacterium spp.)、肉毒羧菌(Clostridiumbotulinum)、产气荚膜梭菌(Clostridium perfringens)、羧菌属(Clostridium spp.)、破伤风梭菌(Clostridium tetani)、白喉棒杆菌(Corynebacterium diphtheriae)、杰氏棒状杆菌(Corynebacterium jeikeium)、粪肠球菌(Enterococcus faecalis)、屎肠球菌(Enterococcus faecium)、猪丹毒杆菌(Erysipelothrix rhusiopathiae)、真细菌属(Eubacterium spp.)、阴道加德那菌(Gardnerella vaginalis)、麻疹孪生球菌(Gemellamorbillorum)、明串球菌属(Leuconostoc spp.)、脓肿分枝杆菌(Mycobacterium abscessus)、鸟复合分枝杆菌(Mycobacterium avium complex)、龟亚科分枝杆菌(Mycobacteriumchelonae)、偶发分枝杆菌(Mycobacterium fortuitum)、嗜血分枝杆菌(Mycobacteriumhaemophilium)、堪萨斯分枝杆菌(Mycobacterium kansasii)、麻风分枝杆菌(Mycobacterium leprae)、海分枝杆菌(Mycobacterium marinum)、瘰疬分枝杆菌(Mycobacterium scrofulaceum)、耻垢分枝杆菌(Mycobacterium smegmatis)、龟型分枝杆菌(Mycobacterium terrae)、结核分枝杆菌(Mycobacterium tuberculosis)、溃疡分枝杆菌(Mycobacterium ulcerans)、诺卡尔菌属(Nocardia spp.)、黑色消化球菌(Peptococcus niger)、消化链球菌属(Peptostreptococcus spp.)、丙酸杆菌属(Proprionibacterium spp.)、藤黄八叠球菌(Sarcina lutea)、金黄色葡萄球菌、耳葡萄球菌(Staphylococcus auricularis)、头葡萄球菌(Staphylococcus capitis)、科氏葡萄球菌(Staphylococcus cohnii)、表皮葡萄球菌(Staphylococcus epidermidis)、溶血性葡萄球菌(Staphylococcus haemolyticus)、人葡萄球菌(Staphylococcus hominis)、路邓葡萄球菌(Staphylococcus lugdanensis)、解糖葡萄球菌(Staphylococcus saccharolyticus)、腐生性葡萄球菌(Staphylococcus saprophyticus)、施氏葡萄球菌(Staphylococcusschleiferi)、模仿葡萄球菌(Staphylococcus similans)、瓦氏葡萄球菌(Staphylococcuswarneri)、木糖葡萄球菌(Staphylococcus xylosus)、无乳链球菌(Streptococcus agalactiae)(B型链球菌)、咽峡炎链球菌(Streptococcus anginosus)、牛链球菌(Streptococcus bovis)、犬链球菌(Streptococcus canis)、马链球菌(Streptococcus equi)、米勒链球菌(Streptococcusmilleri)、轻型链球菌(Streptococcus mitior)、变异链球菌(Streptococcus mutans)、肺炎链球菌(Streptococcus pneumoniae)、酿脓链球菌(Streptococcus pyogenes)(A型链球菌)、唾液链球菌(Streptococcus salivarius)、血链球菌(Streptococcus sanguis)。

本文所用术语“革兰氏阴性细菌”是指如下细菌：其特征在于在各细菌细胞周围存在双膜。代表性革兰氏阴性细菌包括乙酸钙不动杆菌(Acinetobacter calcoaceticus)、鲍氏不动杆菌、伴放射菌放线杆菌(Actinobacillus actinomycetemcomitans)、嗜水气单胞菌(Aeromonas hydrophila)、木糖氧化产碱菌(Alcaligenes xylosoxidans)、拟杆菌属(Bacteroides)、脆弱拟杆菌(Bacteroides fragilis)、杆菌状巴尔通体(Bartonellabacilliformis)、博德特菌属(Bordetella spp.)、伯氏疏螺旋体(Borrelia burgdorferi)、卡他莫拉菌(Branhamella catarrhalis)、布鲁杆菌属(Brucella spp.)、弯曲杆菌属(Campylobacter spp.)、肺炎披衣菌(Chalmydia pneumoniae)、鹦鹉披衣菌(Chlamydiapsittaci)、沙眼披衣菌(Chlamydia trachomatis)、青紫色素杆菌(Chromobacteriumviolaceum)、柠檬酸杆菌属(Citrobacter spp.)、啮蚀艾肯菌(Eikenella corrodens)、产气肠杆菌(Enterobacter aerogenes)、大肠杆菌、脑膜炎脓毒性黄杆菌(Flavobacteriummeningosepticum)、梭杆菌属(Fusobacterium spp.)、流感嗜血菌(Haemophilus influenzae)、嗜血菌属(Haemophilus spp.)、幽门螺杆菌(Helicobacter pylori)、肺炎克雷伯菌(Klebsiellapneumoniae)、克雷伯菌属(Klebsiella spp.)、军团病杆菌属(Legionella spp.)、钩端螺旋体属(Leptospira spp.)、粘膜炎莫拉菌(Moraxella catarrhalis)、摩氏摩根菌(Morganella morganii)、肺炎支原体(Mycoplasma pneumoniae)、淋病奈瑟球菌(Neisseriagonorrhoeae)、脑膜炎奈瑟球菌(Neisseria meningitidis)、多杀性巴斯德菌(Pasteurellamultocida)、类志贺邻单胞菌(Plesiomonas shigelloides)、普雷沃氏菌属(Prevotella spp.)、变形杆菌属(Proteus spp.)、雷氏普罗威登斯菌(Providencia rettgeri)、铜绿假单胞菌、假单胞菌属(Pseudomonas spp.)、普氏立克次氏体(Rickettsia prowazekii)、立氏立克次氏体(Rickettsia rickettsii)、罗克利马体菌属(Rochalimaea spp.)、沙门菌属(Salmonellaspp.)、伤寒沙门菌(Salmonella typhi)、粘质沙雷菌(Serratia marcescens)、志贺菌属(Shigella spp.)、宋氏志贺菌(Shigella sonnei)、斑点病密螺旋体(Treponema carateum)、苍白密螺旋体(Treponema pallidum)、地方性密螺旋体(Treponema pallidum endemicum)、细弱密螺旋体(Treponema pertenue)、韦荣球菌属(Veillonella spp.)、霍乱弧菌(Vibriocholerae)、创伤弧菌(Vibrio vulnificus)、小肠结肠炎耶尔森菌(Yersinia enterocolitica)、鼠疫耶尔森菌(Yersinia pestis)。

本文所用术语“真菌”是指异养型生物，其特征在于存在几丁质细胞壁，并且在大多数物种中，存在呈多细胞菌丝形式的丝状生长。可根据本发明方法来防止粘附的代表性真菌包括白色念珠菌(Candida albicans)、酿酒酵母菌(Saccharomyces cerevisiae)、光滑念珠菌(Candida glabrata)、近平滑念珠菌(Candida parapsilosis)和杜氏念珠菌(Candida dubliniensis)。

本文所用片语“防止粘附”是指减少或消除细胞与表面的附着(例如通过降低在表面上的生长速率)。优选地，如通过细胞粘附分析所测量，本发明组合物可防止多达10％、更优选地20％、更优选地30％、更优选地40％、更优选地50％、更优选地60％、更优选地70％、更优选地80％、更优选地90％并且最优选地100％的细胞粘附。实例性细胞粘附分析阐述于下文和随后的实例部分中。应了解，本发明组合物可能也能防止细胞聚集(即细胞不聚集至表面上)。

本发明涵盖防止细胞粘附至众多种表面上，包括织物、纤维、泡沫状物、薄膜、混凝土、砖石、玻璃、金属、塑料、聚合物和诸如此类。

根据一个实施例，表面包含于对生物膜形成敏感的装置中。表面为本发明所涵盖的实例性装置包括(但不限于)船壳、汽车表面、飞机表面、膜、过滤器和工业装备。

表面也可包含于医疗装置、仪器和植入物中。所述医疗装置、仪器和植入物的实例包括能暂时或永久性植入哺乳动物生物(例如人类)中的任何物品。可根据本发明使用的代表性医疗装置、仪器和植入物包括(例如)中心静脉导管、尿路导管、气管导管、机械心脏瓣膜、起搏器、血管移植物、支架和人工关节。防止细胞附着至医疗装置的方法和其其它实例阐述于下文中。

如上所述，本发明方法是通过使细胞与来自生物的能防止细胞粘附至表面的组合物接触来实施的。

本文所用术语“接触”是指将本发明组合物定位以使得其可与粘附性细胞直接或间接接触，所述接触方式使得所述组合物中所包含的活性剂能防止细胞与表面粘附。因此，本发明涵盖将本发明组合物施加至期望表面上和/或直接施加至粘附性细胞。

使组合物与表面接触可使用任一业内已知方法来实施，包括喷雾、撒施、润湿、浸渍、浸没、涂施、超声波焊接、焊接、结合或粘附。本发明组合物可以单层或多层形式来附着。

根据本发明其它实施例，上述肽可任选地经改变以形成非肽类似物，包括(但不限于)用较不稳定键替代一个或一个以上键、环化(更详细地阐述于下文中)和诸如此类。另外或另一选择为，可任选地通过计算机模拟将肽转化为小分子，如(例如)PCT申请案第WO/2007/147098号中所述，所述申请案如同完全陈述于本文中一般以引用方式并入本文中。

“拟肽有机部分”可任选地以保守取代方式与非保守取代方式二者取代本发明肽中的氨基酸残基。这些部分也称作“非天然氨基酸”且可任选地替代氨基酸残基、氨基酸或在肽内用作间隔基团代替缺失氨基酸。拟肽有机部分任选地且优选地具有与所替代的氨基酸类似的立体、电子或构型性质，并且使用所述拟肽来替代重要位置中的氨基酸，且将其视为保守取代。然而，所述相似性并非必需。对使用拟肽的唯一限制是所述组合物与本发明天然肽相比至少实质上保持其生理活性。

拟肽可任选地用于抑制肽通过酶促或其它降解过程发生的降解。拟肽可任选地且优选地通过有机合成技术产生。适宜拟肽的非限制性实例包括相应L氨基酸的D氨基酸、四唑(扎布罗基(Zabrocki)等人，美国化学学会杂志(J.Am.Chem.Soc.)110：5875 5880(1988))；酰胺键的等排体(琼斯(Jones)等人，四面体通迅(Tetrahedron Lett.)29：3853 3856(1988))；LL 3氨基2丙酮6甲酸(LL Acp)(肯姆普(Kemp)等人，有机化学杂志(J.Org.Chem.)50：5834 5838(1985))。相似类似物展示于以下文献中：肯姆普等人，四面体通迅，29：5081 5082(1988)以及肯姆普等人，四面体通迅，29：50575060(1988)；肯姆普等人，四面体通迅，29：4935 4938(1988)和肯姆普等人，有机化学杂志，54：109 115(1987)。其它适宜的例示性拟肽展示于以下文献中：永井(Nagai)和佐藤(Sato)，四面体通迅，26：647 650(1985)；迪米奥(Di Maio)等人，化学会志，帕尔金会刊(J.Chem.Soc.Perkin Trans.)1687(1985)；卡恩(Kahn)等人，四面体通讯，30：2317(1989)；奥尔森(Olson)等人，美国化学学会杂志，112：323 333(1990)；加维(Garvey)等人，有机化学杂志，56：436(1990)。其它适宜的例示性拟肽包括羟基1，2，3，4四氢异喹啉3甲酸(三宅(Miyake)等人，武田研究所报(J.Takeda Res.Labs)，43：53 76(1989))；1，2，3，4四氢-异喹啉3甲酸(格兹米亚斯基(Kazmierski)等人，美国化学学会杂志，133：2275 2283(1991))；组氨酸异喹啉酮甲酸(HIC)(泽彻尔(Zechel)等人，国际肽和蛋白质研究杂志(Int.J.Pep.Protein Res.)，43(1991))；(2S，3S)甲基苯基丙氨酸、(2S，3R)甲基苯基丙氨酸、(2R，3S)甲基苯基丙氨酸和(2R，3R)甲基苯基丙氨酸(格兹米亚斯基和赫鲁比(Hruby)，四面体通迅(1991))。

例示性、阐释性但非限制性非天然氨基酸包括β-氨基酸(β3和β2)、高氨基酸、环状氨基酸、芳香族氨基酸、Pro和Pyr的衍生物、3-取代的丙氨酸衍生物、甘氨酸衍生物、环取代的Phe和Tyr的衍生物、线性核心氨基酸或二氨基酸。其可从多个供应商购得，例如西格玛-艾德瑞克公司(Sigma-Aldrich)(美国)。

在本发明中，肽的任一部分均可任选地经化学修饰，即，通过添加官能团来改变。在分子合成期间，如果随后进行化学合成过程，则可任选地执行修饰，例如通过添加经化学修饰氨基酸来进行。然而，当分子中已经存在化学修饰(“原位”修饰)时，氨基酸的化学修饰也是可能的。

所述分子的任一序列区域的氨基酸均可任选地根据以下例示性修饰类型中的任一者(在肽中，概念上视为“化学修饰”)来修饰。非限制性例示性修饰类型包括羧甲基化、酰化、磷酸化、糖基化或脂肪酰化。醚键可任选地用于接合丝氨酸或苏氨酸的羟基与糖的羟基。酰胺键可任选地用于接合谷氨酸盐或天冬氨酸盐的羧基与糖上的氨基(贾格(Garg)和金洛兹(Jeanloz)，碳水化合物化学和生物化学进展(Advances in CarbohydrateChemistry and Biochemistry)，第43卷，科学出版社(Academic Press)(1985)；孔兹(Kunz)，德国应用化学(Ang.Chem.Int.Ed.)(英文版)26：294-308(1987))。在氨基酸与碳水化合物之间也可任选地形成缩醛和缩酮键。脂肪酸酰基衍生物可任选地通过(例如)游离氨基(例如，赖氨酸)的酰化制得(托特(Toth)等人，肽：化学、结构和生物学(Peptides：Chemistry，Structure and Biology)，里维埃(Rivier)和马歇尔(Marshal)编辑，艾思康出版社(ESCOM Publ.)，莱顿(Leiden)，1078-1079(1990))。

本文所用术语“化学修饰”在提及本发明肽时，是指氨基酸残基中的至少一者通过天然过程(例如加工或其它翻译后修饰)或通过为业内所熟知的化学修饰技术加以修饰的肽。多种已知修饰的实例通常包括(但不限于)：乙酰化、酰化、酰胺化、ADP-核糖基化、糖基化、GPI锚定物形成、脂质或脂质衍生物的共价连接、甲基化、十四烷基化、聚乙二醇化、异戊二烯化、磷酸化、泛素化或任何类似过程。

如上所述，在某些情形下医疗装置和植入物一般经伺机性细菌和其它感染性微生物(例如真菌)感染，从而被迫移除可植入装置。所述感染也可导致疾病、长住院时间或甚至死亡。因此非常需要防止生物膜形成和医疗装置感染。

因此，本发明也涵盖附着有上述组合物的医疗装置。

本文所用术语“医疗装置”是指任何植入物、仪器、设备、器具、机器、装置或任何其它类似或相关物品(包括任何组件或附件)，其打算用于诊断、治疗、治愈或预防疾病或其它病况。所述医疗装置打算用于人类或其它动物，并且预期可影响身体的结构或任何功能。所述医疗装置并非是通过化学作用来达成其最初既定目的，并且并非依赖于发生代谢来达成其最初既定目的。

本文所用术语“植入物”是指任何打算置入人类体内的并非活组织的物品。植入物可为暂时性或永久性的。植入物可为包含人工组件(例如导管或起搏器)的物件。植入物也可包括天然产生的物品，其已经处理从而使得其活组织经失活。作为一实例，骨移植物已经处理以移除其活细胞(无细胞化)，但其形状得以保留以用作来从宿主的骨向内生长的模板。作为另一实例，可处理天然存在的珊瑚虫以产生羟基磷灰石制剂，可将其施加至身体以用于某些矫形外科和牙科疗法。

因此本发明设想用本发明组合物涂布医疗装置以防止细胞粘附至所述装置上，从而降低/消除任何已知可能会在植入后发生的细胞聚集和生物膜形成。装置相关感染通常是由在装置插入或植入程序期间引入的微生物(主要指细菌)所致，或由血液传染生物附着至刚插入装置上并且随后在装置表面上增殖所致。因此，用本发明组合物涂布医疗装置可抑制一种或一种以上微生物物种的生物膜形成，可预防医疗装置相关感染，并且因此可减少对抗生素治疗或从个体移除医疗装置的需要。

可根据本发明教示涂布的医疗装置包括(但不限于)人工血管、导管和用于移除或向患者递送流体的其它装置、人工心脏、人工肾脏、矫形外科针、人工关节、板和植入物；导管和其它管道(包括泌尿插管和胆道插管、气管插管、可自外周插入的中心静脉导管、透析导管、长期留置中心静脉导管、外周静脉导管、短期中心静脉导管、动脉导管、肺导管、斯旺-甘兹(Swan-Ganz)导管、尿路导管、腹膜导管)、泌尿装置(包括长期泌尿装置、组织结合泌尿装置、人工尿道括约肌、尿道扩张器)、分流器(包括心室或动脉-静脉分流器)；假体(包括乳房植入物、阴茎假体、血管移植假体、动脉瘤修复装置、机械心脏瓣膜、人工关节、人工喉、耳部植入物)、吻合装置、血管导管端口、血管支架、夹钳、血管栓装置、伤口引流管、接目镜、牙科植入物、脑积水分流器、起搏器和可植入除颤器、无针接头、语音假体和诸如此类。

本发明组合物的另一可能应用是在医疗和牙科环境中发现的表面涂层。所述表面包括各种一次性或打算重复使用的仪器和装置的内外面。所述表面包括适合医疗应用的所有物件，包括(但不限于)解剖刀、针、剪刀，和用于侵入性外科程序、治疗性或诊断性程序的其它装置；血液过滤器。这些领域的从业人员可容易地了解其它实例。

在医疗环境中发现的表面也包括医疗服务场所的人员穿戴或携带的医疗装备工件、医疗用具的内外面。所述表面可包括打算在医疗场所中用作针对感染性生物的生物屏障的表面，例如手套、围裙和面罩。生物屏障的常用材料是热塑性材料或聚合材料，例如聚乙烯、达克龙(dacron)、尼龙(nylon)、聚酯、聚四氟乙烯、聚氨基甲酸酯、胶乳、硅酮和乙烯树脂(vinyl)。其它表面可包括用于医疗程序或用于制备呼吸治疗中所用医疗设备、管道和滤毒罐的区域中的台面和夹具，所述呼吸治疗包括投与氧、投与喷雾器中的溶解药物和投与麻醉剂。其它所述表面可包括不打算无菌的医疗或牙科装备的把手和缆线。另外，所述表面可包括那些经常遇到血液或体液或其它危险生物材料的区域中的管道和其它设备的非无菌外表面。

本发明组合物可用于这些医疗装置的表面上或这些装置内，以提供针对微生物定植的长期保护并降低装置相关感染的发病率。也可将这些组合物与抗微生物剂(例如抗生素药剂)组合纳入医疗装置涂层中。这一组合足以杀灭或抑制最初定植的细菌并预防装置相关感染，只要在装置-微生物界面处存在抑制性浓度的所述物质即可。

可在聚合物合成阶段或在装置制造阶段将本发明组合物直接纳入医疗装置的聚合物基质中。也可使组合物共价连接至医疗装置聚合物中。涂布医疗装置的这些和许多其它方法为所属领域技术人员显而易知。

可根据本发明教示处理的其它表面包括水纯化、水储存和水递送所涉及的那些物件以及食品处理所涉及的那些物件的内外面。因此，本发明设想涂布食品或饮料容器的固体表面以延长其内含物的贮存期限。

与健康相关的表面也包括提供营养、保持卫生或疾病预防中所涉及的那些家用物件的内外面。因此，本发明组合物可用于从外表面移除引发疾病的微生物。这些家用物件可包括(例如)家用食品处理装备、婴儿护理材料、棉塞、肥皂、去污剂、保健和皮肤护理产品、家用清洁器和抽水马桶。

所述表面也可为实验室物件，其包括(但不限于)显微镜载玻片、培养罩、培替式培养皿(Petri dish)或任何其它业内已知的适宜类型的组织培养器皿或容器。

本申请案的发明者也设想使用本发明组合物作为防污剂。

本文所用术语“防污剂”是指用于保护水下表面免于附着单细胞生物的化合物。这些单细胞生物包括微生物，例如细菌和真菌。

这些水下表面包括任何水浸渍表面，包括船(ship/boat)壳(即船(ship/boat)体或船的龙骨)、潜水艇、导航设备、屏幕、网、建筑、漂浮或固定近海平台(例如船坞)、浮标、发信装备和与海水或咸水接触的物件。其它水下表面包括暴露于海水中的结构，包括桩材、海洋标记、水下运输工具(例如缆线和管道)、渔网、舱壁、冷却塔、和任何在水下作业的装置或结构。

可将本发明组合物纳入海洋涂料中以限制不期望海洋污着。因此，本发明防污剂可经调配以不含毒性材料(例如重金属)且仍保持其效能。本发明防污涂料可另外含有粘合剂、颜料、溶剂和添加剂。

可用溶剂的实例包括芳香族烃，例如二甲苯和甲苯；脂肪族烃，例如己烷和庚烷；酯，例如乙酸乙酯和乙酸丁酯；酰胺，例如N-甲基吡咯烷酮和N，N-二甲基甲酰胺；醇类，例如异丙醇和丁醇；醚类，例如二噁烷、THF和二乙醚；和酮类，例如甲基乙基酮、甲基异丁基酮和甲基异戊基酮。溶剂可单独使用或组合使用。

可用粘合剂的实例包括醇酸树脂、丙烯酸系或乙烯基乳液、聚氨基甲酸酯树脂、环氧树脂、硅酮基树脂、丙烯酸系树脂、无机硅酸盐基树脂、乙烯树脂(尤其是氯乙烯/乙酸乙烯酯共聚物)和松香。

可用颜料的实例包括二氧化钛、氧化亚铜、氧化铁、滑石粉、铝片、云母片、三氧化二铁、硫氰酸亚铜、氧化锌、乙酸亚砷酸铜、铬酸锌、二甲基二硫代氨基甲酸锌、乙烯基双(二硫代氨基甲酸)锌和二乙基二硫代氨基甲酸锌。

可纳入涂料组合物中的添加剂的实例包括除湿剂、润湿/分散剂、抗沉降剂、防结皮剂、干燥/固化剂、防划剂和经常在涂料组合物中用作稳定剂和消泡剂的添加剂。此外，在海水中相对不溶的任何抗生素可与防污船舶涂料一起使用。

制备船舶防污涂料的方法详细阐释于美国专利第4,678,512号；美国专利第4,286,988号；美国专利第4,675,051号；美国专利第4,865,909号和美国专利第5,143,545号中。

本发明组合物也可用于在化妆品中提供抗细菌性质，以防止产品变质。

组合物可通过(例如)纳入牙膏、漱口药或口香糖中进一步用于向口、牙齿和牙龈提供抗细菌效应。总之，本发明教示内容描绘了众多种从生物(例如水生生物和苔藓)中分离的新颖的抗粘附剂。这些试剂的抗粘附效应的广谱性(例如抑制革兰氏阳性和革兰氏阴性细菌的粘附)以及其在易受攻击的初始阶段影响微生物生物膜形成的能力使得这些试剂成为抗生物膜剂的第一候选。此外，本文所述抗粘附剂是可克隆的，从而允许对其进行修饰和大量生产。此外，其稳定性(即对环境条件的耐受性)使得这些试剂适用于众多种应用。

所属领域技术人员在阅读以下实例后可了解本发明的其它目标、优点和新颖特征，所述实例并非打算限制本发明。另外，上文所述和下文权利要求书部分中所主张的本发明各实施例和方面各自的实验依据阐述于以下实例中。

一般来说，本文所用术语和本发明所用实验室程序包括分子、生化、微生物和重组DNA技术。所述技术在文献中有充分解释。例如，参见“分子克隆：实验室手册(MolecularCloning：A laboratory Manual)”萨姆布鲁克(Sambrook)等人，(1989)；“分子生物学现行方案(Current Protocols in Molecular Biology)”第I-III卷，奥苏伯尔R.M.(AusubelR.M.)编辑(1994)；奥苏伯尔等人，“分子生物学现行方案”，约翰威利父子出版公司(John Wiley and Sons)，巴尔的摩，马里兰(1989)；佩巴尔(Perbal)，“分子克隆实践指南(A Practical Guide to Molecular Cloning)”，约翰威利父子出版公司，纽约(1988)；沃森(Watson)等人，“重组DNA(Recombinant DNA)”，科学美国人图书(Scientific American Books)，纽约；百仁(Birren)等人(编辑)“基因组分析：实验室手册系列(Genome Analysis：A Laboratory Manual Series)”，第1-4卷，冷泉港实验室出版社(Cold Spring Harbor Laboratory Press)，纽约(1998)；美国专利第4,666,828号、第4,683,202号、第4,801,531号、第5,192,659号和第5,272,057号中所述的方法；“细胞生物学：实验室手册(Cell Biology：A Laboratory Handbook)”，第I-III卷，科利斯J.E.(Cellis J.E.)编辑(1994)“免疫学现行方案(Current Protocols inImmunology)”第I-III卷，科林根J.E.(Coligan J.E.)编辑(1994)；史蒂提斯(Stites)等人(编辑)，“基础和临床免疫学(Basic and Clinical Immunology)”(第8版)，阿普尔顿&兰格出版社(Appleton&Lange)，诺沃克(Norwalk)，CT(1994)；米舍尔(Mishell)和施吉(Shiigi)(编辑)，“细胞免疫学中的所选方法(Selected Methodsin Cellular Immunology)”，W.H.弗里曼公司(W.H.Freeman and Co.)，纽约(1980)；可用免疫分析广泛地阐述于专利和科学文献中，例如，参见美国专利第3,791,932号、第3,839,153号、第3,850,752号、第3,850,578号、第3,853,987号、第3,867,517号、第3,879,262号、第3,901,654号、第3,935,074号、第3,984,533号、第3,996,345号、第4,034,074号、第4,098,876号、第4,879,219号、第5,011,771号和第5,281,521号；“寡核苷酸合成(Oligonucleotide Synthesis)”盖特M.J.(Gait M.J.)编辑(1984)；“核酸杂交(Nucleic Acid Hybridization)”黑姆斯B.D.(Hames B.D.)和希金斯S.J.(Higgins S.J.)编辑(1985)；“转录和翻译(Transcription and Translation)”黑姆斯B.D.和希金斯S.J.编辑(1984)；“动物细胞培养(Animal Cell Culture)”弗雷谢尼R.I.(Freshney R.I.)编辑(1986)；“固定化细胞和酶(Immobilized Cells and Enzymes)”IRL出版社，(1986)；“分子克隆实践指南”佩巴尔B.，(1984)和“酶学方法(Methodsin Enzymology)”第1-317卷，科学出版社；“PCR方案：方法和应用指南(PCR Protocols：A Guide To Methods And Applications)”，科学出版社，圣地亚哥(San Diego)，CA(1990)；马夏克(Marshak)等人，“蛋白质纯化和表征策略-实验室过程手册(Strategiesfor Protein Purification and Characterization-A Laboratory Course Manual)”CSHL出版社(1996)；以上所有文献均如同完全陈述于本文中一般以引用方式并入本文中。在此文件中通篇提供其它一般参考文献。其中的程序据信为业内所熟知并且提供所述程序以方便读者。其中所含所有信息都以引用方式并入本文中。

实例

现参照以下实例，其与上文说明一起以非限制性方式阐释本发明。

实例1：通过grZ-28C防止细菌附着

三种浓度50μg/ml、5μg/ml和0.5μg/ml的合成肽grZ-28C[CSFSQNKSVHSFDYDWYNVSDQADLKNC]可防止约50％的铜绿假单胞菌附着(图1)。活性与基于海葵细胞毒素活性区域的肽AbacZ17C相似。用作阴性对照肽的Abac10C是基于Abac17C的N-末端序列(无活性残基[CMFSVPFDYC])来合成。

图2表明在测试肽存在下无生长效应。

图3显示基于GPCR 137b的氨基酸序列的肽grZ35 cyc和grZ28C对铜绿假单胞菌的抗粘附活性。对于肽grZ35 cyc，代表细胞外区域的肽序列SFSQNKSVHSFDYDWYNVSDQADLKNQLGDAGYV(残基259-292)是利用C末端和N末端中的两个半胱氨酸来合成并且经S-S桥接。对于肽grZ28C，代表细胞外区域的肽序列SFSQNKSVHSFDYDWYNVSDQADLKN(残基259-284)是利用C末端和N末端中的两个半胱氨酸来合成。

图4显示肽grZ35cyc和grZ28C对铜绿假单胞菌生长的效应，表明不抑制细菌生长。此结果非常重要，因为本发明肽令人满足地显示对细菌生长几乎没有抑制。

尽管本发明已参照有限数目的实施例进行了阐述，但应了解，可对本发明做出许多变化、修改和其它应用。

Claims (19)

1.一种肽，其具有选自由以下组成的群组的序列：FDYDWY、SFDYDWY、SFDYDWYN、HSFDYDWYN、HSFDYDWYNV、VHSFDYDWYNV、VHSFDYDWYNVS、SVHSFDYDWYNVS、SVHSFDYDWYNVSD、KSVHSFDYDWYNVSD、KSVHSFDYDWYNVSDQ、NKSVHSFDYDWYNVSDQ、NKSVHSFDYDWYNVSDQA、QNKSVHSFDYDWYNVSDQA、QNKSVHSFDYDWYNVSDQAD、SQNKSVHSFDYDWYNVSDQAD、SQNKSVHSFDYDWYNVSDQADL、FSQNKSVHSFDYDWYNVSDQADL、FSQNKSVHSFDYDWYNVSDQADLK、SFSQNKSVHSFDYDWYNVSDQADLK、SFSQNKSVHSFDYDWYNVSDQADLKN、CSFSQNKSVHSFDYDWYNVSDQADLKN、CSFSQNKSVHSFDYDWYNVSDQADLKNC和FNFDWY或其组合。

2.一种组合物，其包含从动物来源分离的肽，所述肽包含选自由以下组成的群组的序列：FDYDWY、SFDYDWY、SFDYDWYN、HSFDYDWYN、HSFDYDWYNV、VHSFDYDWYNV、VHSFDYDWYNVS、SVHSFDYDWYNVS、SVHSFDYDWYNVSD、KSVHSFDYDWYNVSD、KSVHSFDYDWYNVSDQ、NKSVHSFDYDWYNVSDQ、NKSVHSFDYDWYNVSDQA、QNKSVHSFDYDWYNVSDQA、QNKSVHSFDYDWYNVSDQAD、SQNKSVHSFDYDWYNVSDQAD、SQNKSVHSFDYDWYNVSDQADL、FSQNKSVHSFDYDWYNVSDQADL、FSQNKSVHSFDYDWYNVSDQADLK、SFSQNKSVHSFDYDWYNVSDQADLK、SFSQNKSVHSFDYDWYNVSDQADLKN、CSFSQNKSVHSFDYDWYNVSDQADLKN、CSFSQNKSVHSFDYDWYNVSDQADLKNC和FNFDWY或其组合。

3.一种防止单细胞生物粘附至表面的方法，所述方法包含使所述细胞与包含从动物来源分离的肽的组合物接触，所述肽包含选自由以下组成的群组的序列：FDYDWY、SFSQNKSVHSFDYDWYNVSDQADLKN或CSFSQNKSVHSFDYDWYNVSDQADLKNC。

4.根据权利要求1至3中任一权利要求所述的肽、组合物或方法，其中所述肽无细胞毒性或细胞生长抑制活性。

5.根据权利要求1至4中任一权利要求所述的肽、组合物或方法，其中所述肽耐冻干。

6.根据权利要求1至5中任一权利要求所述的肽、组合物或方法，其中所述肽进一步能抑制细胞聚集。

7.根据权利要求3所述的方法，其中所述单细胞生物包含于生物膜中。

8.根据权利要求3所述的方法，其中所述单细胞生物选自由以下组成的群组：细菌、真菌、原生动物和古细菌。

9.根据权利要求8所述的方法，其中所述真菌包含酵母。

10.根据权利要求3所述的方法，其中所述表面选自由以下组成的群组：织物、纤维、泡沫状物、薄膜、混凝土、砖石、玻璃、金属和塑料。

11.根据权利要求3所述的方法，其中所述动物是脊椎动物。

12.根据权利要求11所述的方法，其中所述动物选自由以下组成的群组：鱼、两栖动物、鸟、爬行动物和哺乳动物。

13.根据权利要求12所述的方法，其中所述哺乳动物是人类。

14.一种医疗装置，其包含所附着的根据权利要求1或2中任一权利要求所述的肽或组合物。

15.根据权利要求14所述的医疗装置，其中所述医疗装置是体内装置。

16.根据权利要求15所述的医疗装置，其中所述医疗装置是体外装置。

17.一种处理水以防止或减少生物膜形成或过滤器污着的方法，其包含用本文的所述肽或组合物中的任一者来处理所述水。

18.一种防止或减少流体介质中的生物膜形成的方法，其包含用本文的所述肽或组合物中的任一者来处理所述流体介质。

19.根据权利要求17或18所述的方法，其中将所述经处理的水或流体介质施加至反渗透过滤器。

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