CN102268008A - 长臂生物素标记阿普洛尔及其制备方法 - Google Patents

Abstract

本发明涉及长臂生物素标记的阿普洛尔及其制备方法。Alprenolol作为β₂-受体拮抗剂，与β₂-受体亲和力高，平衡解离常数达10 ^-9 ，其中异丙氨基和β羟基为其与β₂-受体结合的活性位点，而其中的烯丙基侧链不是与β₂-受体的结合位点，且易于活化，因此可以用来衍生，与长臂生物素连接，拟用于建立一种基于受体-配体系统的新型β₂-激动剂快速检测方法，该方法适合现场快速筛选，具有高特异性、高亲和力和高通量等特点。

Description

长臂生物素标记阿普洛尔及其制备方法

技术领域

本发明涉及一种生物素标记阿普洛尔(Alprenolol)及其制备方法，特别是一种长臂生物素标记的阿普洛尔及其制备方法。

 

背景技术

食品安全问题已经成为世界各国关注的焦点问题之一。近十年来，β₂-激动剂残留致使食物中毒的报道屡见报端，β₂-肾上腺素能兴奋剂（简称β₂-激动剂）中有一类人工合成激素类药物，如克伦特罗（Clenbuterol）,Salbutamol等，临床上用于治疗哮喘和支气管痉挛等疾病，但如提高剂量5-10倍，并长期使用，还有增强肌肉，减少脂肪的副作用，这一特点使它常被作为生长促进剂而添加到饲料中，提高家畜的瘦肉率（这些药物俗称瘦肉精）,人类在食用带有药物残留的肉类食品后，会出现肌肉震颤、心悸、头晕等中毒症状，这些药物的滥用严重危害人们的身体健康。我国农业部、卫生部和国家医药管理局共同发布的176公告中明文规定，禁止在任何饲料和动物饮水中添加使用β₂-激动剂，由此可见，我国的畜牧业生产中绝不允许使用β₂-激动剂类药物。

目前，国内外现有检测技术主要有两类，即仪器分析法和免疫分析法。仪器分析法主要有高效液相色谱法、液相色谱-质谱法、气相色谱-质谱法等检测方法，最低检测限可达1-5ng/g，具有较高灵敏度，常作为确证方法，但它们存在样品处理繁杂，检测时间长，仪器贵重，难于操作，耗费人力、物力，成本高、通量低等缺点。免疫分析法主要有酶联免疫吸附法（ELISA）。酶联免疫吸附法具有较高的检测通量，且快速简便、成本低，常用于多样品筛查，但该法常出现假阴性。由于免疫分析法是以抗原-抗体特异性反应为基础的检测方法，而一种抗体只能识别一种或少数几种抗原表位，因此注定其一次只能检测一种或者少数几种β₂-激动剂。随着现今被滥用的β₂-激动剂种类的增多，免疫分析法常出现假阴性，因此迫切需要研制β₂-激动剂类兽药多残留快速、高效检测方法，由于β₂-激动剂在体内通过与β₂-受体结合，产生一系列生理反应，因此基于受体-配体系统建立的检测技术可一次性检出所有β₂-激动剂，将其“一网打尽”，克服了现有检测方法的局限性，达到更加快速、高效的目的。

发明内容

本发明的目的之一在于提供一种长臂生物素标记的阿普洛尔(Alprenolol)，利用其与β₂-肾上腺素能受体的亲和力，即通过受体与配体检测系统，来达到检测β₂-激动剂的目的。

本发明的目的之二在于提供上述的长臂生物素标记阿普洛尔(Alprenolol)的制备方法。

为达到上述目的本发明的技术方案为：首先合成氨基阿普洛尔(Alprenolol)；再合成长臂生物素标记的阿普洛尔，其具体的反应机理如下：

①氨基Alprenolol的合成

原理：半胱胺的巯基在过硫酸胺作用下，与Alprenolol的双键发生自由加成反应，生成氨基Alprenolol。

②长臂生物素标记Alprenolol的合成：

原理：氨基Alprenolol与含有14个原子手臂的生物素羟基琥珀亚胺酯（Biotinamidohexanoyl-6-aminohexanoic acid N-hydroxysuccinimide ester，购自sigma）发生氨解反应，生成长臂生物素标记Alprenolol。

根据上述机理，本发明采用如下技术方案：

一种长臂生物素标记阿普洛尔，其特征在于该化合物的结构式为：

一种制备上述的长臂生物素标记阿普洛尔的方法，其特征在于，该方法包括如下步骤：

a．取Alprenolol盐酸盐溶于体积比为20%的乙醇水溶液中，加入0.005至0.1倍摩尔量的过硫酸胺及1至4倍摩尔量的半胱胺，在惰性气氛下，90℃水浴加热反应6小时；反应液减压蒸干， 剩余物用 pH 10.0的碳酸钠溶液溶解，再用乙酸乙酯萃取；合并有机相，减压蒸干得无色油状液体，经分离提纯得氨基Alprenolol；所述的Alprenolol盐酸盐、过硫酸胺及半胱胺的摩尔比为1：0.005:～0.1：1～4；

b．取生物素羟基琥珀亚胺酯溶于 二甲基甲酰胺中，加入步骤a制备的氨基Alprenolol，室温搅拌反应24小时；反应液经分离提纯，并减压蒸去溶剂，最终的微黄色固体，即为长臂生物素标记；所述的生物素羟基琥珀亚胺酯与氨基Alprenolol的摩尔比为1:0.8～1:4。                   

本发明制备的长臂生物素标记阿普洛尔，衍生过程利用的烯丙基，并非阿普洛尔与β₂-受体结合的活性位点，并且在阿普洛尔与生物素之间引入了14个原子的手臂，可以克服空间位阻，使长臂生物素标记阿普洛尔能同时与β₂-受体和亲和素结合 。

附图说明

图1为本发明的长臂生物素标记阿普洛尔的电喷雾电离质谱图；

    图2为本发明的长臂生物素标记阿普洛尔的高分辨率质谱。

具体实施方式

实施例一：

1、氨基Alprenolol的合成

取100mg Alprenolol盐酸盐溶于10ml 20%乙醇水溶液中，加入2mg过硫酸胺及30mg半胱胺，在氮气保护下，90℃水浴加热反应6小时。反应液减压蒸干， 20ml pH 10.0碳酸钠溶液溶解，再用10ml乙酸乙酯萃取6次。合并后，减压蒸干得无色油状液体，即为氨基Alprenolol（Rf为0.35，展开剂：氯仿：甲醇：乙酸=1:5:1，显色剂：0.1%茚三酮乙醇溶液），产率56%。

2、长臂生物素标记Alprenolol的合成

取8mg生物素羟基琥珀亚胺酯（Biotinamidohexanoyl-6-aminohexanoic acid N-hydroxysuccinimide ester）溶于0.5ml 二甲基甲酰胺中，加入5mg上述制备的氨基Alprenolol，室温搅拌反应24小时。反应液经1.5cm×20cm sephadex LH20柱子（洗脱液为氯仿：甲醇=6:4）纯化，并减压蒸去溶剂，最终的微黄色固体4.2mg，即为长臂生物素标记Alprenolol（Rf为0.83，展开剂：氯仿：甲醇：乙酸=1:5:1，显色剂：0.2%的对二甲基氨基肉桂醛的1%的硫酸-乙醇溶液），产率38%。

3、长臂生物素标记阿普洛尔的鉴定

⑴ 电喷雾电离质谱(ESI-MS)

长臂生物素标记Alprenolol理论分子量为778.45，由于分子量较大，因此不能用电子轰击质谱(EI-MS)鉴定，只能用电喷雾电离质谱(ESI-MS)鉴别其分子量，其ESI-MS谱图如图1所示。

谱图中出现两个质子峰分别为390.1和779.1，推测390.1为双质子峰[M+2]²⁺，779.1为单质子峰[M+1]¹⁺，为了证实这种推测，我们又做了了高分辨率质谱图。

⑵ 高分辨率质谱 

高分辨率质谱结果(如图2所示)表明，合成产物分子量为778.45，证实了ESI-MS谱图中390.1为双质子峰[M+2]²⁺，779.1为单质子峰[M+1]⁺，且其分子式只有两种可能性即C₃₉H₆₆N₆O₆S₂和C₄₄H₆₆N₄O₄S₂，其中C₃₉H₆₆N₆O₆S₂与预期相符合，表明合成产物长臂生物素标记Alprenolol结构正确。

Claims (2)

1.一种长臂生物素标记阿普洛尔，其特征在于该化合物的结构式为：

。

2.一种制备根据权利要求1中所述的长臂生物素标记阿普洛尔的方法，其特征在于，该方法包括如下步骤：

a．取Alprenolol盐酸盐溶于体积比为20%的乙醇水溶液中，加入0.005至0.1倍摩尔量的过硫酸胺及1至4倍摩尔量的半胱胺，在惰性气氛下，90℃水浴加热反应6小时；反应液减压蒸干， 剩余物用 pH 10.0的碳酸钠溶液溶解，再用乙酸乙酯萃取；合并有机相，减压蒸干得无色油状液体，经分离提纯得氨基Alprenolol；所述的Alprenolol盐酸盐、过硫酸胺及半胱胺的摩尔比为1：0.005:～0.1：1～4；

b．取生物素羟基琥珀亚胺酯溶于 二甲基甲酰胺中，加入步骤a制备的氨基Alprenolol，室温搅拌反应24小时；反应液经分离提纯，并减压蒸去溶剂，最终的微黄色固体，即为长臂生物素标记；所述的生物素羟基琥珀亚胺酯与氨基Alprenolol的摩尔比为1:0.8～1:4。

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