CN102262715B - Bcl-2蛋白抑制剂三维定量构效关系模型的构建方法及应用 - Google Patents
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Abstract
本发明涉及Bcl-2蛋白抑制剂三维定量构效关系模型的构建方法及应用，属于生物信息技术领域。该方法根据现有已知的小分子抑制剂，利用三维定量构效关系技术，建立Bcl-2蛋白抑制剂三维定量构效关系模型，采用分子相似性分析、分子构象优化、参数优化等技术进一步增加模型的准确性。本发明可以快速预测活性未知化合物的Bcl-2蛋白结合常数，在短时间内获取活性化合物线索，相比传统的高通量筛选技术大大提高了筛选效率，降低了成本。
Description
技术领域
本发明涉及Bcl-2蛋白抑制剂三维定量构效关系模型的构建方法及应用，具体涉及以Bcl-2蛋白为靶点的抑制剂的三维定量构效关系模型的建立及利用该模型进行快速药物筛选，属于生物信息技术领域。
背景技术
恶性肿瘤(又称癌症)是目前威胁人类健康的重大疾病，其发病率和死亡率一直以来居高不下。据世界卫生组织统计，目前全球每年有超过700万人死于癌症。为了战胜癌症，各国均投入了大量人力物力进行研究。目前临床上癌症治疗手段主要依靠细胞毒性药物，而该类药物存在着毒副作用大、选择性差、易产生耐受等缺点，因此，开发低毒、高效、成药性好的新型抗肿瘤药物已成为当前药物的研究热点。
随着人们对对细胞凋亡机制的研究，越来越多的新型抗肿瘤靶点被提出。从分子水平来看，肿瘤耐药的发生与某些功能蛋白非正常性调控细胞凋亡途径有关。调控细胞凋亡的途径有很多，其中B-细胞淋巴瘤-2(B-cell lymphoma-2，以下简称Bcl-2)蛋白家族作为重要的细胞凋亡调节因子，在线粒体凋亡通路中发挥着重要作用(参见Bcl-2 gene promoteshaemopoietic cell survival and cooperates with c-myc to immortalize pre-B cells，J.M.，et al.Nature，1998，281，1322.)。值得一提的是，Bcl-2蛋白往往仅在肿瘤细胞中高表达，这对于发现无毒或低毒的新型抗肿瘤药物有着重要意义。
迄今为止，人们在哺乳动物中发现了约25个Bcl-2蛋白家族成员，可分为三大类：即抗凋亡蛋白(Bcl-2、Bcl-xL、Bcl-W等)、促凋亡蛋白(Bax、Bak等)以及只含BH3结构域的促凋亡蛋白(Bid、Bad)(参见Solution structure of the antiapoptotic protein bcl-2，Petros，A.M.，et al.Proc.Natl.Acad.Sci.USA.，2001，98，3012)。研究发现，抗凋亡蛋白Bcl-2在肿瘤细胞中过度表达，导致癌症治疗手段无法有效诱导肿瘤细胞凋亡，从而影响肿瘤化疗和放疗的效果(参见The role of Bcl-2 family members intumorigenesis，Kirkin，V.，et al.BBA-Mol.Cell.Res.，2004，1644，229)。结构生物学研究发现，Bcl-2蛋白表现有一个细长的疏水口袋，是其与促凋亡蛋白BH3结构域结合的关键位点(参见AntimycinA mimics a cell-death-inducing Bcl-2 homology domain 3，Tzung，S.P.，et al.Nat.Cell.Biol.，2001，3，183)。从BH3结构域的模拟物出发，研究抑制Bcl-2蛋白的药物分子，将有利于阻断促凋亡蛋白与Bcl-2蛋白的结合，解决临床相关肿瘤治疗的耐药性问题。
目前，对于抑制抗凋亡Bcl-2蛋白的研究主要有三种策略：基因沉默技术(如使用反义寡核苷酸或RNAi技术)、BH3结构域模拟肽类和化学小分子抑制剂。但是研究发现，反义寡核苷酸分子在抑制Bcl-2蛋白表达的同时，由于缺乏靶向性而易产生副作用。同时，BH3结构域模拟肽亲和力较差，难以渗透进入细胞内，且对肿瘤细胞的选择性不佳。因此非肽类小分子Bcl-2抑制剂，其分子质量较低，通常具有较高的细胞渗透性，有利于提高其在体内的生物利用度，且对癌细胞具有较高的特异性。因此研究非肽类Bcl-2小分子药物已成为Bcl-2蛋白抑制剂的研究热点。其中以ABT-737为代表的一系列小分子Bcl-2蛋白抑制剂具有较高的生物活性及良好的选择性，ABT-737目前已进入II期临床研究(参见Studies Leading toPotent，Dual Inhibitors of Bcl-2 and Bcl-xL，Bruncko，M.，et al.J.Med.Chem.，2007，50，641)。
随着生物信息学的发展，计算机辅助药物设计在现代新药研发中发挥着越来越重要的作用。其中，三维定量构效关系模型(3D-QSAR)是一种借助分子的理化性质参数或结构参数，以数学和统计学手段定量研究有机小分子与生物大分子相互作用、有机小分子在生物体内吸收、分布、代谢、排泄等生理相关性质的方法。这种方法广泛应用于药物、农药、化学毒剂等生物活性分子的合理设计，在药学研究中发挥着非常重要的作用。
发明内容
本发明针对现有技术的不足，提供一种Bcl-2蛋白抑制剂三维定量构效关系模型的构建方法及应用。
本发明需要解决的技术问题是：
传统药物研究主要依靠高通量筛选进行先导化合物的发现，但是，随着组合化学的发展，已有的化合物库非常庞大，对每一种化合物进行生物学活性筛选需要耗费大量的人力、物力、财力。是本发明的目的是建立一种Bcl-2蛋白抑制剂三维定量构效关系模型，可以快速、经济的预测化合物与Bcl-2蛋白的结合能力。
本发明技术方案如下：
本发明根据现有已知的小分子抑制剂，利用三维定量构效关系技术，建立Bcl-2蛋白抑制剂三维定量构效关系模型。该方法采用分子相似性分析、分子构象优化、参数优化等技术进一步增加模型的准确性。
一种Bcl-2蛋白抑制剂三维定量构效关系模型的构建方法，包括如下步骤：
(1)根据与Bcl-2蛋白的结合能力的大小，将已知的小分子抑制剂根据生物学活性指标分为三类；每类随机选取一到两个抑制剂作为测试集，其余的组成训练集；生物学活性指标采用结合常数Ki的负对数pKi(pKi＝log Ki)，其中pKi＜7，7＜pKi＜8，pKi＞8，分别代表与Bcl-2蛋白结合结合能力弱、结合能力中等、结合能力强；
(2)根据已知Bcl-2蛋白与阳性化合物结合后的三维结构，利用分析软件获得阳性化合物的空间三维结构；将训练集和测试集中已知的小分子抑制剂的二维结构转换为三维结构，并利用阳性化合物的空间三维结构进行分子相似性分析，得到初步三维空间结构模型；经构象优化获得优化的三维空间结构模型。
(3)以步骤(2)制得的优化的三维空间结构模型的公共刚性骨架为模板进行分子叠合；用小分子探针搜寻叠合后化合物周围的力场信息；力场信息包括立体场与静电场；
(4)对步骤(3)获得的力场信息进行优化后，与训练集中的小分子抑制剂的生物学活性值进行偏最小二乘法回归，获得Bcl-2蛋白抑制剂三维定量构效关系模型。
所述步骤(2)中已知Bcl-2蛋白与阳性化合物结合后的三维结构从蛋白质数据库http://www.pdb.org/下载，该三维结构通过核磁共振解析获得；
所述步骤(2)中利用分析软件获得阳性化合物的空间三维结构是指使用SYBYL7.3(Tripos Inc.)分析Bcl-2蛋白活性位点，并抽出与阳性化合物结合的活性域的三维结构。
所述步骤(2)中的构象优化是指使用Tripos力场进行优化，加Gasteiger-Hückel电荷，能量收敛限为0.05kcal/mol，最大迭代次数为1000次。
所述步骤(4)中对力场信息进行优化后是指对率柱滤值和阈值进行调整，以交叉验证系数q2为表征模型的合理性，q2＞0.5即表示该模型具有较好的合理性，q2值越高表示分析活性的能力越强。该步骤可增加模型的合理性、消除噪声、提高分析速度。
所述构建方法还包括利用步骤(4)制得的Bcl-2蛋白抑制剂三维定量构效关系模型对测试集中小分子抑制剂活性进行分析，得到模型分析活性值，建立模型分析活性值与实际活性值的线性回归曲线，对Bcl-2蛋白抑制剂三维定量构效关系模型进行评价，同时以r2 pred衡量模型的筛选能力，r2 pred＝(SD-PRESS)，其中其中SD代表测试集生物活性值与训练集平均生物活性值的平方差的和；PRESS代表测试集生物活性分析值与实验值的平方差的和。该步骤可检验构建模型的准确性。
利用上述Bcl-2蛋白抑制剂三维定量构效关系模型的构建方法在药物快速筛选中的应用。
有益效果
本发明利用已知生物活性的Bcl-2蛋白抑制剂，采用三维定量构效关系技术，构建了合理的生物活性预测模型，可以快速预测活性未知化合物的Bcl-2蛋白结合常数，在短时间内获取活性化合物线索，相比传统的高通量筛选技术大大提高了筛选效率，降低了成本。
附图说明
图1、已知Bcl-2蛋白与阳性化合物结合后的三维结构示意图；
其中，结合位点用断线圆圈标出；
图2、已知的小分子抑制剂与阳性化合物的分子相似性分析；
图3、初步Bcl-2蛋白抑制剂三维定量构效关系模型示意图；
图4、模型分析活性值与实际活性值的线性回归曲线；
图5、实施例2中WL-276与Bcl-2蛋白结合后的三维结构示意图；
图6、利用模型分析获得的WL-276的三维构象示意图。
具体实施方式
以下实施例将有助于本领域的普通技术人员进一步理解本发明，但不以任何形式限制本发明的保护范围。
实施例1
本发明涉及利用已知的小分子抑制剂(参见Studies Leading to Potent，DualInhibitors of Bcl-2 and Bcl-xL，Bruncko，M.，et al.J.Med.Chem.，2007，50，641)构建Bcl-2蛋白抑制剂三维定量构效关系模型的方法。
该方法包括如下步骤：
(1)根据论文报道中涉及的已知的小分子抑制剂共31个，其生物学活性以结合常数Ki表示。用结合常数Ki的负对数pKi(pKi＝log Ki)，将该类抑制剂分为三类，其中pKi＜7，7＜pKi＜8，pKi＞8，分别代表与Bcl-2蛋白结合结合能力弱、结合能力中等、结合能力强。从三类中抽取26个已知的小分子抑制剂作为训练集建立预测模型，其余5个已知的小分子抑制剂作为测试集进行验证。
(2)目前已有Bcl-2蛋白与阳性化合物复合物的三维结构报道。从蛋白质数据库(http://www.pdb.org/)下载编号为2O2F的PDB文件(Bcl-2蛋白与阳性化合物的复合三维结构)，使用SYBYL7.3(Tripos Inc.)分析蛋白活性位点，选择阳性化合物的三维结构并将其抽出(见附图1)。已知的小分子抑制剂的二维结构使用Accelrys Draw 4.0(AccelrysInc.)构建，并运用Concord(SYBYL7.3，Tripos Inc.)将二维结构转换为三维结构。
以阳性化合物的三维结构为模板，使用Surflex-sim(SYBYL7.3，Tripos Inc.)搜寻已知的小分子抑制剂与阳性化合物三维结构最为相似的构象。(见附图2)搜寻获得的构象使用Tripos力场进行优化，加Gasteiger-Hückel电荷，能量收敛限为0.05kcal/mol，最大迭代次数为1000次，得到优化的三维空间结构模型。
(3)以步骤(2)得到的优化的三维空间结构模型的公共刚性骨架为模板进行分子叠合；利用CoMFA(SYBYL7.3，Tripos Inc.)进行分子力场(分子力场包括立体场和静电场)的搜寻，获得力场信息。
(4)对步骤(3)获得的力场信息通过调整柱滤值和阈值进行优化，最终选择柱滤值＝2.2kcal/mol，阈值(立体场和静电场)＝75kal/mol，将力场信息与训练集中的小分子抑制剂的生物学活性值进行偏最小二乘法回归，获得q2＝0.568的三维定量构效关系模型(见附图3)。
(5)利用步骤(4)制得的Bcl-2蛋白抑制剂三维定量构效关系模型对测试集中小分子抑制剂活性进行分析，得到模型分析活性值，建立模型分析活性值与实际活性值的线性回归曲线，对Bcl-2蛋白抑制剂三维定量构效关系模型进行评价，同时以r2 pred衡量模型的筛选能力，r2 pred＝(SD-PRESS)，其中其中SD代表测试集生物活性值与训练集平均生物活性值的平方差的和；PRESS代表测试集生物活性分析值与实验值的平方差的和，预测相关系数r2 pred＝0.568，活性预测值与实际值的线性回归(见附图4)。
实施例2
采用实施例1所述的一种构建Bcl-2蛋白抑制剂三维定量构效关系模型的方法对母核不同的Bcl-2蛋白抑制剂进行活性分析。
1.WL-276为目前新近报道的已知的小分子抑制剂，它可以有效地抑制Bcl-2蛋白，其母核结构为2-硫代-4-噻唑烷酮，与实施例1中建立模型所采用的已知的小分子抑制剂母核结构不同；
2.采用Accelrys Draw 4.0(Accelrys Inc.)构建WL-276的二维结构，并运用Concord(SYBYL7.3，Tripos Inc.)将二维结构转换为三维结构；
3.因为WL-276与已有三维结构的阳性化合物结构差异较大，为了获得与真实值更为接近的WL-276三维结构，采用分子对接程序Surflex-Dock(SYBYL7.3，Tripos Inc.)模拟WL-276与Bcl-2蛋白的结合模式(见附图5)，采用理论结合值最高的构象作为WL-276的最终构象；
4.使用实施例1中的模型对步骤3获得的WL-276三维构象进行分析(见附图6)，分析活性值pKi＝8.027(目前已报道生物活性最好的ABT-737的pKi＝9，15)，分析结果显示该化合物具有较好的Bcl-2蛋白抑制能力；生物活性测试确认了WL-276对Bcl-2蛋白的抑制能力(参见WL-276，an antagonist against Bcl-2 proteins，overcomes drug resistance andsuppresses prostate tumor growth，Wang，L.，et al.Cancer.Res.，2008，68，4377)。
Claims (2)
1.一种Bcl-2蛋白抑制剂三维定量构效关系模型的构建方法，包括如下步骤：
（1）根据与Bcl-2蛋白的结合能力的大小，将已知的小分子抑制剂根据生物学活性指标分为三类；每类随机选取一到两个抑制剂作为测试集，其余的组成训练集；生物学活性指标采用结合常数Ki的负对数pKi，其中pKi<7，7<pKi<8，pKi>8，分别代表与Bcl-2蛋白结合结合能力弱、结合能力中等、结合能力强；
（2）根据已知Bcl-2蛋白与阳性化合物结合后的三维结构，利用分析软件获得阳性化合物的空间三维结构；将训练集和测试集中已知的小分子抑制剂的二维结构转换为三维结构，并利用阳性化合物的空间三维结构进行分子相似性分析，得到初步三维空间结构模型；经构象优化获得优化的三维空间结构模型；
（3）以步骤（2）制得的优化的三维空间结构模型的公共刚性骨架为模板进行分子叠合；用小分子探针搜寻叠合后化合物周围的力场信息；
（4）对步骤（3）获得的力场信息进行优化后，与训练集中的小分子抑制剂的生物学活性值进行偏最小二乘法回归，获得Bcl-2蛋白抑制剂三维定量构效关系模型；
所述步骤（2）中利用分析软件获得阳性化合物的空间三维结构是指使用SYBYL7.3分析Bcl-2蛋白活性位点，并抽出与阳性化合物结合的活性域的三维结构；
所述步骤（2）中的构象优化是指使用Tripos力场进行优化，加Gasteiger–Hückel电荷，能量收敛限为0.05kcal/mol，最大迭代次数为1000次；
所述步骤（4）中对力场信息进行优化后是指对率柱滤值和阈值进行调整，以交叉验证系数q2为表征模型的合理性，q2>0.5即表示该模型具有较好的合理性，q2值越高表示分析活性的能力越强。
2.如权利要求1所述的构建方法，其特征在于，还包括利用步骤（4）制得的Bcl-2蛋白抑制剂三维定量构效关系模型对测试集中小分子抑制剂活性进行分析，得到模型分析活性值，建立模型分析活性值与实际活性值的线性回归曲线，对Bcl-2蛋白抑制剂三维定量构效关系模型进行评价，同时以r2 pred衡量模型的筛选能力，r2 pred=(SD-PRESS)，其中其中SD代表测试集生物活性值与训练集平均生物活性值的平方差的和；PRESS代表测试集生物活性分析值与实验值的平方差的和，该步骤检验构建模型的准确性。
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