CN102234682A - 基于生物条码的核酸纳米金生物传感器 - Google Patents

Abstract

本发明提供一种用于基于生物条码检测核酸的高灵敏度纳米金生物传感器。它主要通过靶核酸富集和生物条码转换实现靶核酸的信号并放大，然后通过检测条码信号而测定靶核酸浓度。它包括两个系统：1.固定了第一寡核苷酸探针的微孔板和两种寡核苷酸标记的纳米金的放大系统，最终释放出条码核酸。2.用于检测条码寡核苷酸的检测系统，包括从左到右依次固定于胶板上的样品垫、玻璃纤维、硝酸纤维素膜和吸水纸。本发明由于使用生物条码扩大了检测信号，使其具有很高灵敏度，而且制备简便、检测迅速，不需要专业的技术人员及昂贵的仪器设备，适合大批量快速筛查，适用于基层，对低浓度的靶核酸能起到很好的快速诊断作用。

Description

基于生物条码的核酸纳米金生物传感器

技术领域

本发明属于生物技术领域，涉及一种基于生物条码的核酸纳米金生物传感器制备方法。

背景技术

自从PCR方法产生，传统的基因检测技术如Northern杂交法、Southern杂交法等逐渐被其取代，它对医学诊断系统产生了革命性的突破。但是PCR除了对靶核酸扩增过程复杂耗时外，对扩增后核酸的定量方法也较狭窄，虽然后期发展的荧光定量PCR能很好的解决靶核酸的定量问题，但是它通常需要昂贵的试剂及仪器，而且要求专业技术的人员进行，而且容易污染，费时费力。

近年来出现的生物条码技术以DNA碱基严格互补配对的特性为原理，通过生物条码将对低丰度靶核酸的检测转换到按比例扩增后的条码核酸上，从而越过了核酸扩增过程，而且通过纳米技术，将DNA结合到纳米金颗粒上构成纳米颗粒基因探针，通过与条码核酸之间的互补实现纳米颗粒的组装进一步放大生物信号，使其具有与传统PCR相当的灵敏度，而且由于不需要核酸扩展，避免了一些贵重仪器的使用，最后检测结果可以通过目测而达到，整个过程操作简便，不依靠任何仪器和专业技术人员，在很短时间内就能完成检测，非常适合做基层检测及大规模流行病学筛查。

发明内容

本发明提供一种用于基于生物条码检测核酸的高灵敏度纳米金生物传感器，通过微孔板和纳米金上的探针与靶核酸形成DNA夹心，将纳米金上的条码核酸固定与孔上，再通过DTT释放生物条码实现检测信号的转换与放大，然后通过核酸纳米金生物传感器检测条码信号而测定靶核酸浓度。

本发明所述的一种基于生物条码的核酸纳米金生物传感器，其包括：

用于富集、转换并放大靶核酸信号的核酸放大装置；

用于测定靶核酸浓度的核酸检测装置；以及

液体试剂；

所述核酸放大装置包括：微孔板，其上固定有第一寡核苷酸探针；以及纳米金颗粒，其上偶联有第二寡核苷酸探针和条码寡核苷酸；所述第一寡核苷酸探针与第二寡核苷酸探针分别与靶核酸的两端序列互补，以致通过第一寡核苷酸探针-靶核酸-第二寡核苷酸探针的核酸夹心方式将纳米金颗粒固定在所述微孔板上，再通过洗涤去除未与微孔板结合的纳米金颗粒，用二硫苏糖醇释放出偶联在纳米金颗粒上的条码寡核苷酸；

所述核酸检测装置包括从左到右依次固定于胶板上的样品垫、玻璃纤维、硝酸纤维素膜和吸水纸；所述玻璃纤维上涂有纳米金标记第三寡核苷酸探针，该第三寡核苷酸探针是由巯基修饰并与胶体金偶联形成的，该第三寡核苷酸探针包含与条码寡核苷酸一端互补的核苷酸序列；所述硝酸纤维素膜上固定有两种寡核苷酸探针，为第四寡核苷酸探针和第五寡核苷酸探针，这些寡核苷酸探针是用生物素标记并与链霉亲和素偶联形成的；其中，固定于靠近吸水纸一端的第四寡核苷酸探针形成质控线，第四寡核苷酸探针与第三寡核苷酸探针互补；固定于靠近玻璃纤维一端的寡核苷酸探针第五寡核苷酸探针形成检测线，该第五寡核苷酸探针与条码寡核苷酸的另一端互补；

所述液体试剂包括：

用于裂解样品释放核酸的裂解缓冲液，其成分为：100mM Tris-HCl，pH 7.5、500mM LiCl、10mM EDTA、1％[w/v]十二烷基硫酸锂、5mM二硫苏糖醇、10U RNase抑制剂；

用于洗去微孔中未结合纳米金的洗涤液，其成分为：0.15M NaCl、0.01M磷酸缓冲液、0.1％SDS，pH 7.4；以及

用于释放结合在纳米金上条码核酸的转换液，包括：0.1M DTT、0.15MNaCl、0.01M磷酸缓冲液、0.1％SDS，pH 7.4。

根据本发明所述的核酸纳米金生物传感器的进一步特征，在所述核酸放大装置中，所述微孔板体积为100-1000mm³，板底包被第一寡核苷酸探针。

根据本发明所述的核酸纳米金生物传感器的进一步特征，在所述核酸放大装置中，所述寡核苷酸标记的纳米金颗粒的粒径在20-200nm之间。

根据本发明所述的核酸纳米金生物传感器的进一步特征，在所述核酸放大装置中，所述与靶核酸一端互补的第一寡核苷酸探针的长度为15-30nt，与靶核酸另一端互补的条码寡核苷酸的长度为20-40nt，两种核酸均在一端进行-SH修饰，第一寡核苷酸探针与条码寡核苷酸的浓度比例从1∶50到1∶200。

根据本发明所述的检测条码寡核苷酸的核酸纳米金生物传感器的进一步特征，在所述核酸检测装置中，所述质控线与检测线相距3-10mm。

根据本发明所述的检测条码寡核苷酸的核酸纳米金生物传感器的进一步特征，在所述核酸检测装置中，所述固定于胶板上的样品垫、玻璃纤维、硝酸纤维素膜和吸水纸的相邻部分彼此重叠1-5mm。

根据本发明所述的检测条码寡核苷酸的核酸纳米金生物传感器的进一步特征，在所述核酸检测装置中，所述胶体金的粒径为8-100nm。

本发明的技术原理是：包被在微孔板上的探针1与包被在纳米金上的探针2通过与靶核酸的两端互补而将连接有标签核酸的纳米金结合在孔上，通过洗涤除去为结合的金颗粒，接着用DTT将连接在其上的条码核酸释放出来，成为游离的单链核酸。然后将孔中混合液加入核酸检测系统，由于毛细作用，条码核酸随样品液一起向前运动，到达检测线时纳米金颗粒上结合的探针3与检测线上结合的探针5通过与标签核酸两端互补而聚集金颗粒形成检测线，未聚集的金颗粒继续向前移动，到达质控线处和与条码核酸互补的探针4结合而形成质控线。如果样品中没有相应的靶核酸时，检测区域不出现红线，而质控线上出现红线。因此，质控线出现红色线说明试纸条可用，而检测线出现与否是样品阴性和阳性的标准。

本发明的优点在于：本发明所述基于生物条码的核酸纳米金生物传感器具有很高灵敏度，而且制备简便、检测迅速，不需要专业的技术人员及昂贵的仪器设备，适合大批量检测，适用于基层，对低浓度的靶核酸能起到很好的快速诊断作用。本方法的检测的灵敏度很高，已达到PCR的水平，而且从上样到最后结果的出现只要1个小时左右，比常规PCR要快1小时。

具体实施方式

实施例一：本发明所述的核酸纳米金生物传感器

本发明所述的核酸纳米金生物传感器的第一个实施例的制备方法如下：

1.微孔板的包被：用去离子水溶解1OD生物素标记的DNA-探针1为100μM，探针∶链和亲霉素按1∶1的比例混合，室温下反应1小时后，用PBS稀释到10nM，包被96孔板，37℃孵育两个小时，PBST洗涤3次后37℃烘干2小时，4℃保存。

2.纳米金(胶体金)的制备：

在500ml的圆底烧瓶中加入100ml 0.01％的HAuCl4溶液，磁力搅拌加热至沸腾；然后向上述溶液中加入2ml 1％枸橼酸钠，溶液变为酒红色后，继续煮沸10min，停止加热继续搅拌15min；胶体金溶液4℃避光保存，纳米金通过520nm最大吸光度值鉴定。

3.金标核酸的制备：

(1)探针微球的制备：用100μl去离子水溶解1OD编码核酸和探针2，编码核酸∶探针2按1∶100摩尔比混合，100μl混合溶液加入到5倍体积浓缩的胶体金(40nm)溶液中，低速振荡，4℃过夜；1％的牛血清白蛋白封闭30分钟后，加入Na3PO4和1％的SDS，分别至终浓度0.01M和0.01％，在其后3天逐渐将NaCl浓度提高到0.15M；8500转/分钟离心25分钟，弃上清，沉淀用洗涤液(0.15M NaCl，0.01M sodium phosphate，0.1％SDS，pH 7.4)洗4遍后用100μl含20mM Na3PO4，1％BSA，0.25％Tween，和10％蔗糖重新悬浮，制成悬浮液。

(2)检测条码核酸胶体金的制备：用100μl去离子水溶解1OD探针3，加入到1ml 5倍体积浓缩的胶体金(20nm)溶液中，振荡均匀后4℃24小时；10％的牛血清白蛋白封闭30分钟后，加入NaCl和1％的SDS，分别至终浓度0.1M和0.01％，4℃过夜，8500转/分钟离心25分钟，弃上清，沉淀用100μl含20mM Na3PO4，5％BSA，0.25％Tween，和10％蔗糖重新悬浮，制成悬浮液。

4.样品垫的处理

玻璃纤维浸泡0.25％TritonX-100、0.05M Tris-HCl、0.15M氯化钠溶液后，37℃烘干备用。

5.金标垫的制备

将本发明制备的金标第三寡核苷酸探针涂于玻璃纤维上，37℃干燥2个小时，制成金标垫，备用。

6.生物素标记探针与链霉亲和素的偶联及偶联物的固定

用10μl浓度为100μM生物素标记的DNA-探针5，加入5μl(2mg/ml)链和亲霉素，室温下反应1小时后，采用划膜喷金仪涂于硝酸纤维素膜检测线上，37℃干燥两个小时。

DNA-探针4采用同样方法固定于质控线上。

7.胶体金试纸条的组装

将固定有寡核苷酸探针的硝酸纤维素膜、吸水纸、涂有纳米微粒标记寡核苷酸探针的玻璃纤维、样品垫依次固定于胶板上，相邻部分彼此重叠2mm，经切割成宽4mm后即得到本发明所述的核酸纳米金生物传感器。

将本发明所述的核酸纳米金生物传感器用于甲型流感病毒样品的检测方法，包括以下步骤：

1.靶核酸的提取：

1)取适量的样品于微孔中。

2)加入250μl的裂解缓冲液，反复震荡吹吸后加入50μl探针微球，轻微震荡30s，室温孵育5-10min。

3)倒扣微孔，弃去上清，加入300μl洗涤液，轻微振荡混匀10s，吸弃上清，重复两次。

4)加入100μl转换液，轻微振荡混匀后室温孵育20-40min。

2.标签核酸的检测：

取上述微孔中混合液，滴加至核酸纳米金生物传感器加样孔上，5min内观察结果。

质量控制标准：

(1)C线(质控线)出现红色的线证明纳米金生物传感器有效。

(2)T线(检测线)出现红色的线与否，是阳性阴性判别的标准。

结果判定标准：

(1)C线出现红色的线，同时T线出现红色的线，说明被检样品为阳性；

(2)C线出现红色的线，同时T线没有出现红色的线，说明被检样品为阴性；

(2)C线没有出现红色的线，说明纳米金生物传感器失效。

实施例二：本发明所述的核酸纳米金生物传感器

本发明所述的核酸纳米金生物传感器的第二个实施例的制备方法如下：

1.微孔板的包被：用100μl浓度为3nM的链和亲霉素包板，室温下反应2小时，PBST洗涤3次后加入100μl浓度为10nM生物素标记的DNA-探针1，室温反应30min，PBST洗涤3次后37℃烘干2小时，4℃保存。

2.纳米金(胶体金)的制备：

在500mL的圆底烧瓶中加入100ml 0.01％的HAuCl4溶液，磁力搅拌加热至沸腾；然后向上述溶液中加入2ml 1％枸橼酸钠，溶液变为酒红色后，继续煮沸10min，停止加热继续搅拌15min；胶体金溶液4℃避光保存，纳米金通过520nm最大吸光度值鉴定。

3.金标核酸的制备：

(1)探针微球的制备：用100μl去离子水溶解1OD编码核酸和探针2，编码核酸∶探针2按1∶100摩尔比混合，50μl混合溶液加入到500μl 5倍体积浓缩的胶体金(40nm)溶液中，低速振荡4℃过夜；用1％的牛血清白蛋白封闭30分钟后，加入NaCl，Na3PO4和1％的SDS，分别至终浓度0.15M，0.01M和0.01％，4℃过夜；8500转/分钟离心25分钟，弃上清，沉淀用洗涤液(0.15MNaCl，0.01M sodium phosphate，0.1％SDS，pH 7.4)洗4遍后用100μl含20mMNa3PO4，1％BSA，0.25％Twee糖重悬。

(2)检测标签核酸胶体金的制备：用100μl去离子水溶解1OD一定比例-SH化的编码核酸和探针2，加入到5倍体积浓缩的胶体金(20nm)溶液中，4℃24小时；10％的牛血清白蛋白封闭30分钟后，加入NaCl和1％的SDS，分别至终浓度0.1M和0.01％，4℃过夜，8500转/分钟离心25分钟，弃上清，沉淀用100μl含20mM Na3PO4，1％BSA和0.25％Tween重悬。

4.样品垫的处理

玻璃纤维浸泡0.25％TritonX-100、0.05M Tris-HCl、0.15M NaCl溶液后，37℃烘干备用。

5.金标垫的制备

将本发明制备的金标第三寡核苷酸探针涂于玻璃纤维上，室温干燥2个小时，制成金标垫，备用。

6.生物素标记探针与链霉亲和素的偶联及偶联物的固定

用去离子水溶解1OD生物素标记的DNA-探针5，加入等摩尔比的链和亲霉素，室温下反应1小时后，采用划膜喷金仪涂于硝酸纤维素膜检测线上，37℃干燥两个小时。

DNA-探针4采用同样方法固定于质控线上。

7.胶体金试纸条的组装

将固定有寡核苷酸探针的硝酸纤维素膜、吸水纸、涂有纳米微粒标记寡核苷酸探针的玻璃纤维、样品垫依次固定于胶板上，相邻部分彼此重叠2mm，经切割成宽4mm后即得到本发明所述的核酸纳米金生物传感器。

将本发明所述的核酸纳米金生物传感器用于甲型流感病毒样品的检测方法，包括以下步骤：

1.靶核酸的提取：

1)取适量的样品于微孔中。

2)加入250μl的裂解缓冲液，反复震荡吹吸后加入50μl探针微球，轻微震荡30s，室温孵育5-10min。

3)倒扣微孔，弃去上清，加入300μl洗涤液，轻微振荡混匀10s，吸弃上清，重复两次。

4)加入100μl转换液，轻微振荡混匀后室温孵育20-40min。

2.标签核酸的检测：

取上述微孔中混合液，滴加至核酸纳米金生物传感器加样孔上，5min内观察结果。

质量控制标准：

(1)C线(质控线)出现红色的线证明纳米金生物传感器有效。

(2)T线(检测线)出现红色的线与否，是阳性阴性判别的标准。

结果判定标准：

(1)C线出现红色的线，同时T线出现红色的线，说明被检样品为阳性；

(2)C线出现红色的线，同时T线没有出现红色的线，说明被检样品为阴性；

(2)C线没有出现红色的线，说明纳米金生物传感器失效。

Claims (7)

1.一种基于生物条码的核酸纳米金生物传感器，其特征在于，其包括：

用于富集、转换并放大靶核酸信号的核酸放大装置；

用于测定靶核酸浓度的核酸检测装置；以及

液体试剂；

所述核酸放大装置包括：

微孔板，其上固定有第一寡核苷酸探针；以及

纳米金颗粒，其上偶联有第二寡核苷酸探针和条码寡核苷酸；

其中，所述第一寡核苷酸探针与第二寡核苷酸探针分别与靶核酸的两端序列互补，以致通过第一寡核苷酸探针-靶核酸-第二寡核苷酸探针的核酸夹心方式将纳米金颗粒固定在所述微孔板上，再通过洗涤去除未与微孔板结合的纳米金颗粒，用二硫苏糖醇释放出偶联在纳米金颗粒上的条码寡核苷酸；

所述核酸检测装置包括从左到右依次固定于胶板上的样品垫、玻璃纤维、硝酸纤维素膜和吸水纸；

所述玻璃纤维上涂有纳米金标记第三寡核苷酸探针，该第三寡核苷酸探针是由巯基修饰并与胶体金偶联形成的，该第三寡核苷酸探针包含与条码寡核苷酸一端互补的核苷酸序列；

所述硝酸纤维素膜上固定有两种寡核苷酸探针，为第四寡核苷酸探针和第五寡核苷酸探针，这些寡核苷酸探针是用生物素标记并与链霉亲和素偶联形成的；其中，固定于靠近吸水纸一端的第四寡核苷酸探针形成质控线，第四寡核苷酸探针与第三寡核苷酸探针互补；固定于靠近玻璃纤维一端的寡核苷酸探针第五寡核苷酸探针形成检测线，该第五寡核苷酸探针与条码寡核苷酸的另一端互补；

所述液体试剂包括：

用于裂解样品释放核酸的裂解缓冲液，其成分为：100mM Tris-HCl，pH 7.5、500mM LiCl、10mM EDTA、1％[w/v]十二烷基硫酸锂、5mM二硫苏糖醇、10U RNase抑制剂；

用于洗去微孔中未结合纳米金的洗涤液，其成分为：0.15M NaCl、0.01M磷酸缓冲液、0.1％SDS，pH 7.4；以及

用于释放结合在纳米金上条码核酸的转换液，包括：0.1M DTT、0.15MNaCl、0.01M磷酸缓冲液、0.1％SDS，pH 7.4。

2.根据权利要求1所述的核酸纳米金生物传感器，其特征在于：在所述核酸放大装置中，所述微孔板体积为100-1000mm³，板底包被第一寡核苷酸探针。

3.根据权利要求1所述的核酸纳米金生物传感器，其特征在于：在所述核酸放大装置中，所述寡核苷酸标记的纳米金颗粒的粒径在20-200nm之间。

4.根据权利要求1所述的核酸纳米金生物传感器，其特征在于：在所述核酸放大装置中，所述与靶核酸一端互补的第一寡核苷酸探针的长度为15-30nt，与靶核酸另一端互补的条码寡核苷酸的长度为20-40nt，两种核酸均在一端进行-SH修饰，第一寡核苷酸探针与条码寡核苷酸的浓度比例从1∶50到1∶200。

5.根据权利要求1所述的检测条码寡核苷酸的核酸纳米金生物传感器，其特征在于：在所述核酸检测装置中，所述质控线与检测线相距3-10mm。

6.根据权利要求1所述的检测条码寡核苷酸的核酸纳米金生物传感器，其特征在于：在所述核酸检测装置中，所述固定于胶板上的样品垫、玻璃纤维、硝酸纤维素膜和吸水纸的相邻部分彼此重叠1-5mm。

7.根据权利要求1所述的检测条码寡核苷酸的核酸纳米金生物传感器，其特征在于：在所述核酸检测装置中，所述胶体金的粒径为8-100nm。